Page 1

Kungliga tekniska högskolan

Analys av reproduktionsproteiner från fjäril Projektrapport 2012-06-01

KA101X Examensarbete inom kemivetenskap 2012 Institutionen för kemi, analytisk kemi Projektgrupp 7

Handledare: Åsa Emmer I sammarbete med: Johanna Liljestrand Rönn och Maria Khinon Rokhas

Författare: Yosra Persnia Gina Norberg Beatrice Timgren Karin Fagerland

880605 881016 890512 900728

yosrasa@kth.se ginan@kth.se btimgren@kth.se kfag@kth.se


Abstract The project in question relates to reproductive proteins from Pieris Napi, a common Swedish butterfly species. The analysis was performed by capillary electrophoresis and mass spectroscopy, MALDI-TOF. To ensure good results from the analysis of the fresh butterflies, a method development was performed on old butterfly samples. Several solvents were used to determine which extraction medium was best suited for protein extraction. MilliQ-water, acetonitrile, hexafluoroisopropanol and methanol were included in the examination. All solvents were well suited as extraction medium, except acetonitrile which lacked clear signals in the electropherograms. When the method development was finished different types of proteins could be studied by the aid of the chosen extraction media. After electrophoresis on the fresh samples, it could be presured that both hydrophobic and hydrophilic proteins were present in the spermatophores. Multiple electropherograms with characteristic profiles for each solvent were obtained which indicated that different types of proteins were detected. Some similarities could be observed between the extraction from the MilliQ-water and methanol. Protein stability during a three week period was assured by regular controls with electrophoresis. Stability could be shown through similar profiles in the electropherograms from the various weeks. Since the proteins shown such stability, MALDI-TOF analysis was done on the samples after all the electrophoresis was performed. Proteins were examined in both high and low molecular fields. This ensured results in the form of spectra. The spectrum obtained from HFIP-extraction differed from the spectrum from methanol- and water extractions, indicating that hydrophobic proteins are present in the spermatophores.

1


Sammanfattning Detta projekt behandlar en analys av reproduktionsproteiner från fjärilar av arten Pieris Napi. Analysen utfördes med hjälp av kapillärelektrofores och masspektroskopi, MALDI-TOF. I början av den laborativa delen av projektet utfördes en metodbestämning på gamla fjärilar för att erhålla bra resultat från analyserna av de färska fjärilarna. Flera olika lösningsmedel provades som extraktionsmedel för att ta reda på vilka som var lämpliga att extrahera proteiner med. I undersökningen ingick MilliQ-vatten, acetonitril, hexafluoroisopropanol och metanol. Det visade sig att acetonitril inte lämpade sig som extraktionsmedel eftersom inga tydliga signaler upptäcktes i elektroferogrammen då detta användes. Resterande lösningsmedel fungerade väl att extrahera med. När metodbestämningen var klar kunde olika typer av proteiner studeras med hjälp av de olika extraktionsmedlen som ansågs lämpliga. Efter elektrofores på de färska proverna kunde det antas att både hydrofoba och hydrofila proteiner fanns i spermatoforerna. Flera elektroferogram med karaktäristiska profiler för respektive lösningsmedel erhölls. Detta tyder på att olika typer av proteiner detekterats. Dock kunde vissa likheter iakttas mellan elektroferogrammen för MilliQvatten- och metanolextraktionerna. Proteinernas stabilitet under en treveckorsperiod säkerställdes. Detta gjordes med hjälp av regelbundna kontroller på ett prov med hjälp av elektroforesanalys. Stabilitet kunde visas genom liknande profiler i elektroferogrammen från de olika veckorna. Eftersom proteinerna visade sig vara tillräckligt stabila så kunde även en MALDI-TOF analys på proverna göras efter att samtliga elektroforesanalyser utförts. Proteiner undersöktes i både de högmolekylära och de lågmolekylära områdena. Detta gav resultat i form av spektra. Spektra från HFIP-exktraktioner skiljde sig åt från spektra från metanol- och vattenextraktionerna vilket visar att hydrofoba proteiner förekommer i spermatoforen.

2


Innehållsförteckning 1. Ordlista ................................................................................................................................................ 5 2. Inledning .............................................................................................................................................. 6 2.1 Syfte ............................................................................................................................................... 6 2.2 Bakgrund ....................................................................................................................................... 6 2.2.1 Reproduktionsproteinernas snabba utveckling[4],[5] ............................................................... 6 2.2.2 Den sexuella konflikten[5] ....................................................................................................... 7 2.2.3 Arters evolution[7] ................................................................................................................... 7 2.2.4 Forskning kring spermieproteomik och populationsbiologi[6] ................................................ 8 2.2.5 Reproduktionen hos fjärilar[7] ................................................................................................. 8 3. Analysmetod för proteinsammansättning och karakterisering .......................................................... 9 3.1 Elektrofores[1] ................................................................................................................................ 9 3.2 Principer för kapillärelektrofores .................................................................................................. 9 3.3 MALDI-TOF[2]................................................................................................................................ 11 4. Material och utförande ..................................................................................................................... 12 4.1 Prov.............................................................................................................................................. 12 4.1.1 Dissekeringen ....................................................................................................................... 13 4.2 Extraktion i lösningsmedel .......................................................................................................... 13 4.2.1 Vattenlösning ....................................................................................................................... 14 4.2.2 Acetonitrillösning ................................................................................................................. 14 4.2.3 Hexafluoroisopropanollösning (HFIP) .................................................................................. 14 4.2.4 Metanol ................................................................................................................................ 15 4.3 Instrument ................................................................................................................................... 15 4.3.1 Kapillärelektrofores .............................................................................................................. 15 4.3.2 MALDI-TOF ........................................................................................................................... 19 5. Resultat från kapillärelektrofores...................................................................................................... 22 5.1 Gamla fjärilar ............................................................................................................................... 22 5.1.1 Acetonitril som extraktionsmedel ........................................................................................ 22 5.1.2 HFIP som extraktionsmedel.................................................................................................. 23 5.1.3 Metanol som extraktionsmedel ........................................................................................... 24 5.2 Färska fjärilar ............................................................................................................................... 25 5.2.1 Jämförelse mellan elektroferogram från olika exktraktioner .............................................. 25 5.2.2 Jämförelse mellan elektroferogram från olika individer ...................................................... 27 5.3 Referensfjäril ............................................................................................................................... 29 3


6. Resultat från MALDI-TOF ................................................................................................................... 30 6.1 Analys av lågmolekylära proteiner från 13 april och 24 april med DHB som matrislösning ....... 30 6.2 Analys av lågmolekylära proteiner från 17 april och 24 april med DHB som matrislösning ....... 31 6.3 Analys av lågmolekylära proteiner från 20 april och 24 april med DHB som matrislösning ....... 32 6.4 Analys av högmolekylära proteiner från 13 april och 24 april med DHB som matrislösning...... 33 6.5 Analys av högmolekylära proteiner från 17 april och 24 april med DHB som matrislösning...... 34 6.6 Analys av högmolekylära proteiner från 20 april och 24 april med DHB som matrislösning...... 35 7. Diskussion .......................................................................................................................................... 37 7. 1 Metodbestämning ...................................................................................................................... 37 7.2 Jämförelse av elektroferogram från prover med olika extraktionsmedel .................................. 37 7.3 Individjämförelse mellan elektroferogram ................................................................................. 38 7.4 Referensprovet ............................................................................................................................ 38 7.5 MALDI-TOF-spektrum och felkällor ............................................................................................. 39 8. Slutsatser ........................................................................................................................................... 40 9. Referenser ......................................................................................................................................... 42 10. Bilagor.............................................................................................................................................. 43 10.1 Elektroferogram över analyser med mesityloxid ...................................................................... 43 10.2 Elektroferogram över analyser med referensfjäril .................................................................... 44 10.3 Elektroferogram över analys med MilliQ-vatten som extraktionsmedel.................................. 44 10.3.1 Färska fjärilar ...................................................................................................................... 44 10.4 Elektroferogram över analys med acetonitril som extraktionsmedel....................................... 45 10.4.1 Gamla fjärilar ...................................................................................................................... 45 10.5 Elektroferogram över analys med metanol som extraktionsmedel.......................................... 46 10.5.1 Gamla fjärilar ...................................................................................................................... 46 10.5.2 Färska fjärilar ...................................................................................................................... 46 10.6 Elektroferogram över analys med HFIP som extraktionsmedel ................................................ 47 10.6.1 Gamla fjärilar ...................................................................................................................... 47 10.6.2 Färska fjärilar ...................................................................................................................... 48 10.7 Tabeller till MALDI-TOF-spektrum ............................................................................................. 49 10.7.1 Tabeller från analys med MALDI-TOF i det lågmolekylära intervallet............................... 49 10.7.2 Tabeller från analys med MALDI-TOF i det högmolekylära intervallet .............................. 53 10.7.3 Tabeller från analys med MALDI-TOF av lågmolekylära proteiner med DHB och DHAP ... 62

4


1. Ordlista Reproduktionsproteiner är ett samlingsnamn för en grupp av proteiner som karaktäriseras av sin snabba och adaptiva utveckling. De har olika funktioner beroende på typ, ett exempel är att binda spermien till ägget. Acps står för ”accessory gland proteins” och är en grupp proteiner som överförs till honan i sädesvätskan. Proteinet spelar en viktig roll för att gynna hanarnas chans till befruktning. Studier har visat att hanar kan justera mängden proteiner i sädesvätskan efter den upplevda konkurrensen från andra hanar. Spermatofor betecknar en kapsel som innehåller spermier. Denna förs över till honans kropp från hanen men inte genom direkt parning. Den fästs ofta på honans kropp eller på marken men tas sedan in av honan själv. Bursa är en hinna i honans bakkropp. Efter parning omsluter den spermatoforen. Signa är ett verktyg i honans bakkropp som kan liknas med en vass tand. Den används av honan för att punktera spermatoforen. Signan sitter fast tillsammans med bursan. MilliQ-vatten är helt avjoniserat vatten. Under laborationerna användes det som lösningsmedel och för sköljningar av apparatur. HFIP är en förkortning av hexafluoroisopropanol som användes som lösningsmedel under laborationerna. MeOH är en förkortning av metanol som användes som lösningsmedel under laborationerna. Elektroferogram är ett spektrum som visar absorbansen avsatt mot migrationstiden genom kapillären i kapillärelektrofores. CE-vial är en förkortning av Capillary Electrophoresis-vial. MS är en förkortning för masspektrometri. MALDI-TOF är ett instrument för masspektrometri och står för Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization-Time Of Flight. DHB är en förkortning för 2,5-dihydroxybensoesyra och är ett kristallisationsmedel som används vid analys med MALDI-TOF. DHAP är en förkortning för 2,4-dihydroxyacetofenon vilket också är ett kristallisationsmedel som används vid analys med MALDI-TOF. TFA är en förkortning av trifluoroättiksyra och används vid preparering av matrislösning för analys med MALDI-TOF.

5


2. Inledning Proteiner involverade i reproduktion är en av de proteintyper som utvecklas snabbast och studier av dessa utgör en grund för forskning om arters utveckling. Detta projekt är en del av ett större projekt på Stockholms universitet där samevolutionen mellan könen hos fjärilar studeras. Genom att kartlägga reproduktionsproteiner gynnas vidare forskning på samevolutionen. Två olika metoder tillämpades för att analysera och identifiera olika proteinertyper. Kapillärelektrofores användes för att söka efter proteiner i spermatoforen med det aktuella extraktionsmedlet. Masspektrometri användes för att analysera molekylvikterna för proteinerna. Under kapillärelektroforesanalysen utfördes extraktioner i båda hydrofila och hydrofoba lösningsmedel för att ge analysen ett bredare perspektiv. Med masspektrometri analyserades både låg- och högmolekylära proteiner var för sig för att ge en tydligare bild av proteinernas olika storleksordning. Det är även intressant att se hur proteinuppsättningen hos olika fjärilsindivider ser ut. Reproduktionsproteinerna hos flera insekter har tidigare kartlagts, dock inte hos fjärilar. Eftersom detta är ett outforskat område fick nya metoder utvecklas. För att ge utrymme för missöden under metodutvecklingen användes först fjärilar som varit nedfrysta en längre tid innan analys på färska fjärilar kunde påbörjas. Med hjälp av de nya utvecklade metoderna kunde resultat erhållas som tidigare inte upptäckts.

2.1 Syfte Syftet med projektet är att med hjälp av kapillärelektrofores studera proteinsammansättningen i spermatoforen och se om fler proteiner kan detekteras med alternativa lösningsmedel. De nya proteinerna kommer sedan att storleksbestämmas med masspektrometri, MALDI-TOF. De frågor som besvaras i denna rapport är om det finns hydrofoba proteiner i spermatoforen och hur den profilen ser ut jämfört med den för hydrofila proteiner. En annan fråga som undersöks är om individuella skillnader förekommer mellan fjärilar gällande proteinsammansättningen i spermatoforen.

2.2 Bakgrund 2.2.1 Reproduktionsproteinernas snabba utveckling[4],[5] Reproduktionsproteiner syftar till de proteiner som på något sätt är involverade i reproduktion och befruktning. Forskning har visat att reproduktionsproteiner evolverar i snabb takt jämfört med andra proteiner. Den snabba utvecklingen av proteiner som är involverade i reproduktion kan i slutändan leda till reproduktiv isolering. Det kan exempelvis innebära att två individer från samma art inte längre kan fortplanta sig framgångsrikt på grund av att genuppsättningen skiljer sig för mycket. Frågan forskare ställer sig är hur dessa proteiner bidrar till artbildning och vad det är som driver den snabba evolutionen. Forskning av reproduktionsproteinerna pågår både inom en specifik art och mellan nära besläktade arter. Mycket visar på att det finns ett tydligt mönster att reproduktionsproteiner utvecklas väldigt fort hos flera arter, men det är ännu okänt hur aminosyrorna muteras så att proteinerna förändras.

6


Reproduktionsproteinerna har visat sig ha flera viktiga funktioner. En viktig funktion är att gynna hanens förmåga att föra sin avkomma vidare genom att para sig med så många honor som möjligt, och samtidigt minska honans möjligheter att para om sig. Proteinerna är också antibakteriella och hjälper till med spermielagringen. Det finns många faktorer som forskare tror påverkar den snabba utvecklingen av reproduktionsproteiner, bl.a. spermiekonkurrens, honligt ”kryptiskt val” och sexuella konflikter. 2.2.2 Den sexuella konflikten[5] En hona kan para sig flera gånger med olika hanar och därefter göra ett så kallat ”kryptiskt val” där hon väljer att befrukta sina ägg med den hanes spermier som hon anser är bäst. Spermiekonkurrens uppstår när flera hanar parar sig med samma hona. Spermiekonkurrens kan bland annat leda till att det utvecklas spermier som mer effektivt kan penetrera ett ägg och på så sätt ge en hane fördelar i konkurrens med andra hanar. Utvecklingen av spermier som mer effektivt kan penetrera honans ägg kan i sin tur göra att det hos honor utvecklas en mer svårgenomtränglig yta på ägget. Den svårgenomträngliga ytan förhindrar bland annat polyspermi, vilket betyder att flera spermier samtidigt tränger igenom och befruktar ägget och som i sin tur skulle leda till att befruktningen misslyckas. För att penetrera ägget används proteiner som hjälper till genom antingen protolys eller upplösning av äggets yta. Andra proteiner spelar även en viktig roll då spermien ska binda vid äggets membran. Utvecklingen av dessa barriärer har stor betydelse då ägget dör om det skulle befruktas av flera spermier. Detta fenomen där de båda könen biologiskt motarbetar varandra kallas för sexuell konflikt då hanarna är intresserade av att befrukta så många honor som möjligt medan honorna är intresserade av kvalitén på spermierna. 2.2.3 Arters evolution[7] Intresset för att isolera och fastställa specifika arter och ursprung har varit stort sedan Darwin publicerat sin teori om evolutionär biologi 1859. Senare under 1900-talet har bättre analysinstrument utvecklats vilket har gett möjlighet att se in i proteinernas värld. Den art som är mest studerad är bananflugan då den har en mycket kort reproduktionstid. Det reproduktionsprotein hos honan som interagerar med hanens reproduktionsprotein tros ha identifierats av forskare och forskning på detta protein visar på att det förekommer viss selektivitet hos honan. Det verkar också som att honans proteiner utvecklas fortare i blandade grupper. Forskning visar också att hanars och honors reproduktionsproteiner utvecklas lika fort parallellt med varandra. Nästa steg i forskningen är att identifiera och karakterisera andra proteiner hos honan som deltar i befruktningen. De manliga reproduktionsproteinerna har blivit identifierade hos bl.a. bin, myggor och syrsor. Hos syrsor finns bevis på att selektivitet förekommer. Generellt vet inte forskare mycket om reproduktionsproteiner hos insekter men forskning pågår hela tiden för att identifiera nya. Reproduktionsproteinerna är viktiga att studera vid forskning på artbilning då snabb utveckling av reproduktionsproteiner resulterar i skillnader både mellan och inom arter och får konsekvenser för individen. En hypotes är att det kan vara en orsak till oförklarlig infertilitet. Forskare tror att det på grund av den snabba utvecklingen uppstått olikartade proteiner som förhindrar sammanslagningen av spermie och ägg och att det ligger bakom utvecklingen av nya arter.

7


2.2.4 Forskning kring spermieproteomik och populationsbiologi[6] Nyligen användes masspektrometri (MS) och två-dimensionell gelelektrofores (2DGel) för att klargöra Bananflugas spermieproteomik. Över 380 väsentliga spermaproteiner kunde identifieras. Mer än 90% av spermieproteomiken identifierades med MS och det tyder på att proteomet snart är helt klarlagt. Det finns många fördelar med att studera spermieproteomik. I studier rörande bananflugans spermieproteomik kan mycket information hämtas om de molekylära detaljerna i Acps. I spermier finns det ett begränsat antal proteiner som har i uppdrag att hitta ägg att smälta samman med. Dock så har proteomiken hos andra flercelliga organismer ännu inte fastställts på grund av deras komplexitet och däggdjurens spermieproteomik beräknas vara på mer än 1000 proteiner. Med MS kan ny värdefull information erhållas om proteinsammansättningarna hos respektive art. Denna tillämpning av MS skulle i princip kunna identifiera skillnader mellan proteiner som relaterar till reproduktiv isolering och artbildning. Även om ovanstående studie är fokuserad på bananflugor kan MS tillämpas på vilken organism som helst, även på fjärilar. 2.2.5 Reproduktionen hos fjärilar[7] När fjärilar fortplantar sig för hanen över spermatoforen till honan. En spermatofor är ett litet paket som innehåller spermier men även olika proteiner som hjälper till vid befruktningen. Detta sätt att överföra sperma förekommer hos ett flertal arter förutom fjärilar, exempelvis groddjur och bläckfiskar. Forskning kring samevolution lämpar sig väldigt bra för fjärilar eftersom de som inte hållits i fångenskap också är möjliga att studera. Spermatoforens skal bryts inte ner i honan utan sparas som ett litet paket i honans bakdel. På grund av den sexuella konflikten har honan utvecklat ett verktyg, signa, i sin bakdel som hon använder till att göra hål på spermatoforen. Anledningen till detta är att hon vill komma åt innehållet som bland annat innehåller näring och för att ha möjlighet att para om sig. Det har visat sig att större honor är bättre på att bearbeta spermatoforen än vad mindre honor är. Eftersom spermatoforerna inte bryts ner i honan går det att räkna antalet gånger hon parat sig. Hanen har utvecklat ett starkare skal på spermatoforen som gör den svårare att göra hål på. Så länge honan inte har bearbetat klart spermatoforen parar hon inte om sig. Ju större spermatofor desto längre tid tar det att bearbeta den. För fjärilshonan är det fördelaktigt att para sig många gånger. Forskning har visat att fjärilar av släktet Heliconius som erhållit fler spermatoforer lever längre än de som bara parat sig en gång och att de även lägger fler ägg.[8] För hanen är det ett energikrävande arbete att producera en spermatofor. Den kan utgöra upp till 15% av kroppsvikten. Förutom spermier innehåller spermatoforen även en speciell typ av proteiner, Acps, vars totala proteinsammansättning ännu inte är fastställd. Proteinerna har betydande effekter på honans livskvalitet då de påverkar både honans beteende och fysiska egenskaper. Reproduktionsproteinerna har olika sammansättning beroende på konkurrensen bland hanarna och detta är en konsekvens av att honorna parar om sig. Forskare tror att en högre konkurrens om honorna resulterar i att hanen måste prestera mer. Precis hur detta fungerar är ännu inte fastställt men detta är ett återkommande fenomen i naturen.

8


3. Analysmetod för proteinsammansättning och karakterisering 3.1 Elektrofores[1] Under elektrofores utförs en separation där hastigheter mäts hos substanser som rör sig i en lösning i ett elektriskt fält. Elektroforesen är en mycket effektiv och snabb analys. Den kräver liten mängd prov, baserar sig på enkla principer och kan varieras på många sätt för att anpassas för olika applikationer. En fördel med elektrofores är att det är möjligt att detektera ett brett storleksspann av molekyler, vilket kommer till användning vid analys av proteiner. Då det finns många olika modifikationer som kan göras för att variera separationen kan selektiviteten och analysen anpassas efter provet. Därför behövs endast små mängder av provet. Laddade substanser som rör sig genom attraherande eller repellerande krafter i ett elektriskt fält beskriver grundprinciperna för elektrofores. Detta kan utföras på olika sätt och utfördes från början i fri lösning med en pålagd spänning. På grund av att ett visst motstånd alltid förekommer i en lösning i kombination med termisk diffusion och konvektion har detta tillvägagångssätt stora begränsningar. Problemet med konvektionen kan kringgås med hjälp av att använda medier som inte är konvektiva. Ett annat alternativ är att använda en tunn kapillär eftersom användningen av de icke-konvektiva medierna kräver en lång analystid.

3.2 Principer för kapillärelektrofores Den tunna kapillären i kapillärelektrofores består ofta av smält kvarts. I detta projekt används ett mycket tunt kvartsrör som är beklätt med en platsfilm av polyimid. På detta sätt tål kapillären mer påfrestningar och böjningar då den annars är mycket spröd. En av anledningarna till att kapillärelektrofores används är att konvektionen kan minskas. De tunna kapillärerna gör att värme lätt leds bort som i sin tur minimerar konvektion i lösningen. Ett generellt system för kapillärelektrofores består av två behållare vilka vid körning har en pålagd spänning över två elektroder där den ena tjänar som anod och den andra som katod. Kapillärens ändar är nedsänkta i respektive behållare och kopplad till en detektor och dator som sedan kan uppfatta analyternas olika hastighet när de vandrar från ena sidan till den andra genom kapillären. I slutet av kapillären kan optiska detektionsmetoder uppfatta förflyttningarna genom kapillärens vägg. I kapillärelektrofores har de två behållarna ofta ett innehåll identiskt med det inuti kapillären, vilket gäller för exempelvis ”kapillär zonelektrofores” (CZE). Vid körning ersätts en utav de två behållarna med en annan behållare med provet i och den elektriska spänningen appliceras. Analyterna tvingas att röra sig från exempelvis anodsidan till katodsidan beroende på vilken behållare som ersatts med provet då separationen utförs. Mobiliteten bestäms av jonens storlek eftersom det uppstår ett friktionsmotstånd genom lösningen. Mobiliteten bestäms även utav jonens laddning och storleken på den elektriska kraften som driver jonen att förflyttas framåt.

9


Bulkflödet som uppstår i kapillären kallas elektroosmotiskt flöde, EOF. Detta uppstår på grund av att en laddning skapas på kapillärens insida som är i direkt kontakt med vätskan. På ytan av kapillärens insida bildas negativa laddningar av kiseloxid och på dessa ackumuleras hydratiserade katjoner. Detta resulterar i ett dubbelt lager av laddad lösning som ligger direkt mot kapillärens inre vägg. Ett bulkflöde, EOF, bildas vilket rör sig genom kapillären mot katoden då spänning läggs på.

Figur 1 - Schematisk bild över kapillärens uppbyggnad på insidan. Fluorosulfaktanterna bildar ett dubbellager mot kapillärens insida med de hydrofoba fosfatkedjorna mot varandra.

Figur 1 beskriver beläggningen på insidan av kapillären som användes under laborationerna. Kapillärens insida består av negativt laddad kiseloxid och när sedan bufferten spolas igenom bildas ett dubbellager. Fluorosulfaktanterna som finns i bufferten består av en hydrofil ände och en hydrofob ände. Den hydrofila änden är positivt laddad och attraheras av den negativa laddningen på kiseloxiden. De hydrofoba fosfatkedjorna läggs mot varandra och på så sätt bildas dubbellagret. En karaktäristisk egenskap för EOF är den homogena hastighetsprofilen. Nära kapillärväggen avtar hastigheten snabbt vilket beror på friktion mot lösningens yta men i övrigt är hastigheten på flödet nästintill oförändrad genom hela tvärsnittet. Det icke laminära flödet är en positiv egenskap som grundar sig i att den elektromotoriska kraften är lika stor för alla molekylerna i lösningen. I ett bulkflöde som drivs av tryck kommer trycket att variera med den inre diametern av kapillären och ett tryckfall att uppstå till följd av skjuvkrafterna. Dessa fortplantar sig genom lösningen vilket ger en ojämn fördelning och ett laminärt flöde i motsats till EOF. Fördelarna med den platta hastigshetsprofilen och EOF är att variation i fördelningen av löst ämne undviks och att nästintill alla typer av molekyler rör sig genom lösningen i samma riktning, oberoende av vilken laddning de har. Flödet går från anod mot katod under normala förhållanden. Separationen kan fortskrida då de mest positivt laddade substanserna rör sig snabbt på grund av attraktionen mot den negativa katoden och de mest negativa partiklarna kommer att röra sig långsammast då de attraheras av anoden. De neutrala substanserna kommer att röra sig med hastigheten av EOF.

10


EOF är grundläggande inom elektrofores och bestämmer uppehållstiden för lösningen i kapillären men har ingen effekt på dess selektivitet. Förhållandena för flödet kan modifieras på olika sätt med särskilda additiv som exempelvis kan ge motsatt laddning på kapillärväggens insida och på detta sätt få EOF att gå i motsatt riktning, från katod till anod som i Figur 1. Det är viktigt att ta hänsyn till kapillärens laddning vid den aktuella lösningens pH och lösningens viskositet. Genom att justera pH-värdet i lösningen kan EOF kontrolleras så att flödet inte går för snabbt eller för långsamt. Om systemet går från katod till anod kommer kan ämnena vid höga pHvärden eluera för snabbt vilket resulterar i dålig separation. Ett för lågt pH kan ge dåliga resultat eftersom risken är att lösningen protonerar både den inre kapillärväggen och substanserna så att de blir positivt laddade. I detta fall kommer då substanser att förflytta sig långsammare mot anoden. EOF påverkas också beroende på styrkan på det elektriska fältet och jonstyrkan i bufferten. Det finns olika typer av elektrofores men den variant som ska användas i detta arbete kallas ”Capillary zone electrophoresis”, CZE. Detta är den enklaste formen av elektrofores och baserar sig på ovan beskrivna principer. Skillnader i de lösta ämnenas rörelser genom kapillären bildar olika zoner som rör sig i riktning med EOF. Rörligheten påverkas av alla parametrar som förändrar laddnings- och storleksförhållandet hos analyterna.

Detektor

Ingångs behållare

Utgångs behållare

Prov

Power [V]

Figur 2 – Förenklat generellt system över kapillärelektrofores.

3.3 MALDI-TOF[2] För studier av proteomik används främst det biokemiska instrumentet MS, men 2DGel är också ett användbart verktyg. MS-baserade tekniker lämpar sig bra för kvalitativa och kvantitativa analyser av cellulär proteomik och används ofta för fastställandet av proteiner i komplexa blandningar. Dessa tekniker har blivit allt viktigare för att undersöka växters och djurs cellfunktioner. De grundläggande principerna för masspektrometri är relativt enkla. MS identifierar många peptidfragment från de proteiner som analyseras och använder denna information till att identifiera gener för att koda dem. Med tiden har tekniken utvecklats för att ge en säker identifiering av proteiner från många komplexa blandningar via deras peptidfragment. MS har hög noggrannhet vid mätning av peptidmassorna. Förhållandet mellan massa och laddning, m/z-förhållandet, bestäms med stor precision (<1 ppm i bästa fall). 11


De två tekniker som är vanligast för peptider och proteiner är MALDI-MS (Matrix-assisted laser desorption/ionization-masspektometer)[6] och ESI-MS (elektronsprayjonisering). Dessa två metoder involverar ”mjuka” joniseringstekniker. Skillnaden mellan teknikerna är på vilket sätt informationen erhålls. Båda metoderna ger joniserade peptider i gasfas och därefter mäter en mass-analysator förhållandet mellan massa och laddning, m/z. Det finns bland annat fyra typer av mass-analysinstrument som används: jonfälla, kvadrupol, TOF (Time Of Flight) och FT-ICR, (Fourier-transform jon cyklotron resonans). Dessa fyra analysinstrument är samtliga lämpliga för ekologiska och evolutionära studier, dock skiljer sig dessa i noggrannhet, känslighet och upplösning. En fördel med jonfällan är förmågan att, utöver bestämning av massa, erhålla sekvensinformation. Joner väljs ut specifikt för m/z förhållandet och splittras genom kollision med en inert gas. Processen kallas collisioninduced fragmentation (CID). De fragment massorna mäter representeras i en så kallad tandem-massa (MS/MS) spektrum. Om MS/MS-spektat har hög kvalitet kan sekvensen av den ursprungliga peptiden härledas. Den enorma komplexiteten hos proteom, tekniska aspekter samt kostnader för MS har hindrat att dessa tekniker används i stor utsträckning. Det är mycket tydligt att mer arbete måste göras i både praktiska och teoretiska analyser grundade på proteom. Inom proteomiken arbetar forskare med att standardisera metoder som redan används, samt rapportering av resultat. MS är en höggradig känslig teknik som kan framkalla enorma volymer av spektrala data som måste kunna hanteras och analyseras på rätt sätt.

4. Material och utförande 4.1 Prov De fjärilshonor som studerades i analysen är av arten Pieris napi och tillhör släktet Pieridae. I Figur 3 visas en typisk fjäril av denna art som framöver kommer att förkortas till P.napi. Fjärilshonorna odlades på laboratorium på Stockholms Universitet där de vistats i olika miljöer med olika konkurrens vad gäller fortplantningen. Vissa honor vistades i burar med lika många hanar och andra med färre. Proteinanalyser gjordes dock endast på honor som vistats i miljöer med lika antal hanar och som enbart parat sig med en hane under sin livstid. Honorna frystes omedelbart ned efter parning innan de hann bearbeta spermatoforen. Om honorna hunnit punktera spermatoforens skal skulle den genast ha tömts på proteiner och analys hade inte varit möjlig. De frysta fjärilshonorna transporterades från Stockholms Universitet och lagrades på elektroforeslaboratoriet vid Kungliga tekniska högskolan i Stockholm på institutionen för kemi, analytisk kemi.

12


Figur 3 – Rapsfjäril även kallad Pieris [3] napi (P.napi) på latin.

4.1.1 Dissekeringen Vid parning överförs en liten mängd reproduktionsproteiner från hanen till honans bakkropp i form av en spermatofor. Honan har en hinna på insidan av bakkroppen som kallas bursa i vilken spermatoforen hamnar. På bursan sitter signan fast och kan liknas med en vass tand som används av honan för att punktera spermatoforens hårda skal.

Spermatofor

Signa

Bursa

Figur 4 – Förenklad bild över spermatoforen.

Spermatoforen dissekerades för hand i direkt anslutning till att analysen utfördes. Fjärilshonan lades på en agarplatta och pincetter användes för att avlägsna vingarna. En liten sax användes för att klippa av bakkroppen. Dissektionen utfördes på fjärilar som varit frusna. De fjärilar som varit nedfrysta en längre tid var torrare än de som varit nedfrysta en kortare tid. Då bakdelen var väldigt torr kunde den blötas med det lösningsmedel som skulle användas som extraktionsmedel för att enklare få ut spermatoforen. Vid extraktionen av proteinerna avlägsnades bursan noggrant för att inte honans proteiner skulle blandas i provet. Detta gjordes med hjälp av vassa pincetter. Signan är fäst i bursan och därför kunde dessa avlägsnas tillsammans. Att den tydligt synliga signan var avlägsnad användes som en verifiering på att endast spermatoforen kvarstod. Spermatoforen överfördes till en vial och extraheras med 50 µl av det aktuella lösningsmedlet. Den tömdes på sitt innehåll genom att den krossades i vialen med hjälp av en pincett. Slutligen separerades spermatoforens hårda skalrester från övrig analyt eftersom analysintrumentet täpps till ifall provet innehåller större partiklar. Separationen utfördes olika för de tre lösningsmedlen och behandlas i avsnitten 3.2.1-4.

4.2 Extraktion i lösningsmedel De extraktionsmedel som användes var MilliQ-vatten, acetonitril, hexafluoroisopropanol (HFIP) och metanol. Dessa tre valdes för att de har olika egenskaper relativt varandra och kan lösa olika typer 13


av proteiner. Då vatten användes kunde de hydrofila proteinerna extraheras. Acetonitril och metanol är molekyler som är medelpolära, vilket löser både hydrofila och hydrofoba proteiner. Med hexafluoroisopropanol kunde de hydrofoba proteinerna extraheras. Genom att använda extraktionsmedel med olika egenskaper kunde en bredare uppfattning om vilka proteiner som finns erhållas. Det var viktigt att samma mängd, 50 µl, används vid varje extraktion. Detta för att proverna skulle ha samma koncentration för att sedan kunna jämföras.

Figur 5 - Vatten

Figur 6 - Acetonitril

Figur 7 – Hexafluoroisopropanol (HFIP)

Figur 8 - Metanol

4.2.1 Vattenlösning För att blanda provet ordentligt användes en ”IKA® MS 3”, vilket är en skakapparat för vialer med rundgående rörelse, se Figur 9. Provet skakades med 2500 varv/minut i 15 minuter. Efter omskakning flyttades vialen till en centrifug för att få ner spermatoforens skalrester till botten. Centrifugen som användes heter ”Biofuge pico” och ställdes in på 3000 varv/minut i 10 minuter, se Figur 10. I centrifugen kunde vialen lämnas med öppet lock. Detta för att minimera risken att skaka om provet när locket öppnas igen, men även för att undvika tryckförändringar som kan göra att prov skvätter ut. 4.2.2 Acetonitrillösning Med acetonitril som lösningsmedel användes samma metod som för vattenlösningen, fram till centrifugeringen. Eftersom acetonitril är en flyktig kemikalie behövde locket på vialen vara stängt för att förhindra avdunstning. 4.2.3 Hexafluoroisopropanollösning (HFIP) Provet blandades på samma sätt som ovanstående lösningsmedel med en ”IKA® MS 3”. På grund av att HFIP har andra fysikaliska egenskaper så sjönk inte spermatoforens skalrester till botten och detta medförde att provet behövde filtreras. I och med detta kunde inte samma centrifug som innan användas. Istället användes en ”Eppendorf Concentrator 5301” där vakuum kunde kopplas på, se Figur 10. Provet fördes över till ett milliporfilter och tvättades med 20 µl ren HFIP innan den sattes ner i centrifugen på 13 000 varv/minut i 10 minuter. Eftersom HFIP också är en flyktig kemikalie var locket på vialen stängd. Därefter upprepades tvättningen och centrifugeringen en gång till för att se till att så mycket prov som möjligt passerade filtret. Ett milliporfilter är en vial utrustad med ett filter vars uppgift är att samla upp skalresterna från spermatoforen och endast släppa igenom proteinerna samt lösningsmedlet. När provet centrifugerats plockades filtret bort och vätskan som var kvar avdunstades i samma maskin som innan. Detta utfördes i rumstemperatur och i vakuum tills all vätska försvunnit. Därefter tillsattes 50 µl ren HFIP till provet för att det skulle ha så lika koncentrationer som möjligt i jämförelse med alla andra prover. 14


4.2.4 Metanol Med metanol som lösningsmedel användes samma metod som för acetonitril.

Figur 9 - Skakmaskinen IKA® MS3 som användes till att skaka om proverna.

Figur 10 - Till vänster: Centrifugen ”Biofuge pico” som användes till att centrifugera prover extraherat med MilliQ-vatten, metanol och acetonitril. TIll höger: Vakuum-centrifugen ”Eppendorf Concentrator 5301” som användes till att centrifugera prover extraherade med HFIP.

Vid de tre första laborationstillfällena på färska fjärilar utfördes endast analys på vatten- och metanolextraktioner och vid ett fjärde tillfälle utfördes analyserna av samtliga HFIP-extraktioner.

4.3 Instrument 4.3.1 Kapillärelektrofores

. Figur 11 - Bild över utrustningen på laboratioriet. Till vänster: Kapillärelektroforesinstrumentet. Till höger: Dator som styr utrustningen och samlar mätvärden från kapillärelektroforesen.

Inuti instrumentet i Figur 11 sitter en kassett som kapillären är lindad inuti. I utgångsläget är kapillärens ändar i varsin fosfatbuffert (FC-buffert). FC-bufferten består av 50 ml FC134 (300µg/ml), 20 ml KH2PO4, 30 ml MilliQ-vatten och tillreddes den 19 januari 2012 utav Johanna Liljestrand Rönn. Luftbubblor bildas lätt i bufferten och kan finnas i kapillären vilket kan försämra den elektriska kontakten genom hela systemet. Den optiska detektorn utgörs av en deuteriumlampa som kan ställas in efter önskad våglängd. Innan en analys kan påbörjas måste lampan värma upp systemet till ca 25°C, detta för att det ska vara möjligt att jämföra de olika analyserna efteråt. Det är viktigt att alla analyser utförts under samma förhållanden.

15


Innan analys av prov kunde genomföras behövde instrumentet förberedas genom att kapillären spolades igenom. Först spolades kapillären med MilliQ-vatten för att skölja bort de utfällningar som kan uppstå då förhållandet i kapillären är väldigt surt. En annan anledning är att skölja bort rester som ligger kvar från tidigare analyser. Efteråt spolades kapillären med FC-buffert för att återställa den sura miljön och stabilisera pH-värdet. Nedan följer en sammanfattning av de startrutiner som användes inför varje labbtillfälle. Preparering av instrument och referens 1. Rengöring av instrumentet med MilliQ-vatten i 10 minuter. 2. Sköljning av systemet med FC-buffert i 15 minuter. 3. Kontroll av spänning över FC-buffert. En spänning på 20 kV läggs på systemet för att kontrollera att baslinjen för strömmen hålls stabil och konstant runt 11,5-12 µA i ca 5 minuter. Detta för få ett jämnt EOF vid körning. Om kontakt saknas kan det betyda att luftbubblor i systemet har försämrat den elektriska kontakten. 4. Analys av referens bestående av 5 µl mesityloxid i knappt 250 µl MilliQ-vatten, Acetonitril eller HFIP. Mesityloxiden ska ge en markant topp efter ca 10-11 minuter, vilket verifierar att systemet är pålitligt. Mesityloxiden är neutral och rör sig genom kapillären med EOF. Efter preparering av instrumentetet och godkänd referens, kunde fjärilsprovet köras. Ett förinställt program användes där kapillären först spolades med FC-buffert i 3 minuter. Därefter injicerades provet in i kapillären under en pålagd spänning på 20 kV. Strömmen som uppstod låg mellan 10-12 µA beroende på lösningsmedel då de har olika konduktivitet. Efter injektionen återgick systemet till utgångsläget där kapillärändarna var nedsänkta i FC-buffertarna. Varje analys tog totalt ca 34 minuter. Under förloppet ritade programmet en online-kurva med axlarna absorbans mot migrationstid. Topparna kunde avläsas i direkt anslutning till detektionen. Med tiden försämrades dubbellagret i kapillären och detta resulterade i att baslinjen på elektroferogrammet blev väldigt brusig vilket gjorde att små toppar inte upptäcktes. När detta sker måste kapillären beläggas om och detta gjordes genom att filtrerad natriumhydroxid (NaOH) och MilliQ-vatten spolades genom systemet. NaOH och MilliQ-vatten filtreras för att undvika stopp i kapillären som kan orsakas av utfällningar från natriumhydroxiden. Vätskorna kan även innehålla dammpartiklar som inte kan ses med blotta ögat vilka också kan orsaka stopp. Vid spolning med 1 M NaOH avlägsnades dubbellagret från kapillärens insida helt. Resterna från den 1 M natriumhydroxiden sköljdes bort med 0,1 M NaOH innan systemet spolades igenom med MilliQvatten. MilliQ-vattnet sköljde bort resterande 0,1 M NaOH i kapillären. Slutligen genomfördes en spolning med FC-buffert som återställde dubbellagret och stabiliserade pH-värdet igen. Ny beläggning i kapillären 1. 1 M NaOH spolas genom systemet i 15 minuter. 2. 1 M NaOH späddes med MilliQ-vatten till 0,1 M NaOH som spolades genom systemet i 30 minuter. 3. MilliQ-vatten spolades genom systemet i 10 minuter. Efter att ovanstående genomförts måste kapillären vila ett antal timmar för att jämvikt ska hinna inställa sig. Detta för att dubbellagret ska hinna stabiliseras. 16


Mer ingående om systemkontroll Innan proverna kunde analyseras behövde systemet kontrolleras för att få giltiga profiler. Genom att låta ett prov med känd profil detekteras bevisades att systemet fungerade korrekt då profilerna för kontrollen var lika och gav signal vid samma migrationstid. Nedan i Figur 12 åskådliggörs sex elektroferogram för mesityloxidprover från olika tillfällen.

Figur 12 - Vattenprov med mesityloxid för kontroll av systemets repeterbarhet. Datum för försöken i fallande ordning: 22 mars, 10 april, 10 april, 17 april, 20 april, 24 april.

I Figur 12 visas profilen för ett prov med 5 µl mesityloxid i ca 250 µl MilliQ-vatten. Profilerna ser lika ut och migrationstiden är ungefär lika varje gång, ca 10-11 min. Under projektets gång gjordes två förändringar i systemet. Kapillärens insida belades om med nytt dubbellager och nya laddningar den 16 april och byttes även ut strax efter, den 23 april. De tre första profilerna i bilden är gjorda innan dessa förändringar, de två därefter (17 april och 20 april) gjorda med nybelagd kapillär och den sista profilen är gjord efter bytet till en helt ny kapillär. Den absoluta standardavvikelsen beräknades för mesityloxidproverna enligt (1), √

̅

̅

̅

(1)

där sabs är den absoluta standardavvikelsen, ̅ är medelvärdet av migrationstiden, xn är respektive migrationstid och n är antalet mätvärden. Därefter beräknades den relativa standardavvikelsen, srel, enligt (2) för att se om värdet var mindre än fem. Är så fallet kan systemet anses som tillförlitligt. ̅

(2)

17


Beräkningsexempel Tabell 1 - Tabellen visar migrationstiderna som detekterades för mesityloxid vid olika anlalystillfällen

Migrationstider [min] 10.684 11.035 10.924 10.268 10.478 10.589 10.793 10.796 10.880 11.110 10.852 10.838

Enligt (3) beräknas medelvärdet av migrationstiderna. ̅

(3)

Enligt (1) beräknas standardavvikelsen. √

(4)

Den relativa standardavvikelsen beräknades enligt (2). (5) Beräkningar ovan verifierar att systemet är tillförlitligt då 2,704<5. En ytterligare verifiering att systemet stämmer kan avgöras genom att beräkna den relativa standardavvikelsen på en specifik topp. Dessa beräkningar gäller referensfjärilens elektroferogram i Figur 21 på den topp som detekteras efter ca 17 minuter. Beräkningsexempel Tabell 2 - Tabellen visar migrationstiderna som detekterades för referensfjärilen vid olika anlalystillfällen under en period på tre veckor.

Migrationstider [min] 17.575 17.494 17.449 17.878

18


Enligt (6) beräknades medevärdet av migrationstiderna. ̅

(6)

Den absoluta standardavvikelsen beräknades enligt (1). √

(7)

Därefter beräknades den relativa standardavvikelsen enligt (2). (8) Proverna kan anses stabila då 0.212<5. 4.3.2 MALDI-TOF Två stycken koncentreringsplattor användes, den ena kallas för ”AnchorChip” (Bruker Daltonics®) och är den kommersiella varianten.[10] Den andra kallas för silikonplatta då den var manuellt belagd med glycerol och silikon. AnchorChip-plattan rengjordes genom att först tvättas med kranvatten och diskmedel, därefter med metanol. AnchorChip-plattan sänktes ner i en behållare innehållande 50% MilliQ-vatten och 50% metanol som i sin tur sänktes ned i ett ultraljudsbad i 15 minuter för att avlägsna alla orenheter. Därefter plockades plattan upp och tvättades ytterligare en gång med metanol och lades på tork. Båda koncentreringsplattorna applicerades med en MALDI-matris bestående av acetonitril, 0,1% trifluroättiksyra (TFA) samt kristallisationsmedlena 2,5-dihydroxybensoesyra (DHB) för koncentrationsplattan och 2,4-dihydroxyacetofenon (DHAP) för silikonplattan. DHAP:en användes till proverna med HFIP och den lämpar sig bra för hydrofoba proteiner. Till AnchorChip-plattan tillreddes matrisen med 5 mg/ml DHB, men efter ett försök ökades mängden till 7 mg/ml, sedan 10 mg/ml då kristallisationen blev för dålig efter applicering på plattan. För analys av prover som extraherats med MilliQ-vatten och metanol användes 7 mg/ml. För analys av prover som extraherats med HFIP användes 10 mg/ml. På silikonplattan användes 10 mg/ml DHAP. DHB respektive DHAP löstes upp i en 1:2-blandning av acetonitril och 0,1% TFA-lösning. 0,1% TFAlösning tillreddes genom att blanda 1 µl 99% TFA-lösning med 1000 µl MilliQ-vatten. Därefter blandades 333 µl acetonitril med 666 µl 0,1% TFA för att totalt få 1 ml. Lösningen sögs upp med en micropipett och sprutades ut på ett vågskepp med uppvägd DHB respektive DHAP och blandades runt innan det sögs upp igen till en vial. Silikonplattan användes speciellt för HFIP:n på grund av dess låga ytspänning. Silikonet på plattan hindrar HFIP:n att spridas ut vilket ger finare kristaller och mindre utspritt prov. Silikonplattan som användes var gammal då inget nytt silikon fanns att tillgå till att preparera nya plattor. Detta kan i sin tur bidra till att resultatet blir sämre då silikon lätt drar till sig föroreningar som kan orsaka brus på spektrumet. Matrislösningen applicerades i droppar om 0,5 µl på markerade punkter på de båda koncentreringsplattorna och fick sedan kristallisera. Medan matrislösningen kristalliserade rengjordes proverna som skulle appliceras på plattan. Detta gjordes med en metod som kallas ZipTip. En ZipTip är en spets till en micropipett och innehåller en packning vars funktion är att binda proteinerna och släppa igenom orenheter. Det var nödvändigt att använda ZipTip för att få renare prover och ett tydligt spektrum vid analys med MALDI. Nedan följer alla steg hur ett av proverna förbereddes med ZipTip. 19


Förberedelse av prov till MALDI 1. Fem stycken vialer förbereddes; 20 µl acetonitril tillsattes till vial ett, 20 µl 0,1% TFA tillsattes till vial två och fyra, 5 µl 1:2-blandning av acetonitril och 0,1% TFA tillsattes till vial fem. Vial tre är CEvialen som innehåller provet med fjärilsproteiner som användes vid kapillärelektroforesen. Innehållet i vialen avdunstades helt innan 20 µl av 0,1%TFA tillsattes. De flesta hade avdunstat vid förvaringen, men de som fortfarande hade lite extraktionsmedel kvar kördes i vakuumcentrifugen tills all vätska hade avlägsnats. 2. I första steget blötlades ZipTip-pipetten genom att 10 µl acetonitril pumpades in och ut genom pipetten fyra gånger. 3. I det andra steget jämviktades ZipTip-pipetten genom av 10 µl 0,1% TFA pumpades in och ut genom pipetten fyra gånger. 4. I det tredje steget pumpades det upplösta fjärilsprovet in och ut genom pipetten tio gånger för att se till att proteinerna fastnade ordentligt i packningen. 5. I det fjärde steget tvättades ZipTip-pipetten på överflödiga orenheter genom att pumpa 10 µl 0,1% TFA in och ut två gånger. 6. I det femte och sista steget pumpades 5 µl av 1:2-blandningen av acetonitril och 0,1% TFA in och ut genom pipetten tio gånger. Detta gjorde att proteinerna som tidigare suttit fast i packningen lossnade och hamnade i den femte vialen. 0,5 µl av de ZipTip-behandlade proverna placerades ut ovanpå den tidigare utlagda MALDI-matrisen. Varje prov placerades ut på tre punkter, detta för att ha fler analysområden om någon punkt inte skulle kristallisera bra. Förutom fjärilsproverna placerades även standardlösningar av högmolekylära peptider och lågmolekylära peptider ut. Dessa behövdes för att kalibrera systemet, men behövde inte ZipTip-behandlas. De högmolekylära peptiderna var insulin, cytokrom C och apomyoglobin. De lågmolekylära peptiderna var glufibrinopeptid, neurotensin, substans p och angiotensin I. En annan anledning till att både lågmolekylära och högmolekylära standarder användes var att både tunga och lätta proteiner existerar i fjärilarna och hamnar på olika delar av spektrumet. När alla prover och standarder placerats ut fick även dessa kristallisera. När allt hade kristalliserat fördes plattorna var för sig in i MALDI. För att kalibrera systemet användes två standardlösningar, en för lågmolekylära proteiner och en för högmolekylära proteiner. Kalibrering för högmolekylera peptider gjordes i samband med att tyngre proteiner skulle detekteras och kalibrering för lågmolekylära peptider gjordes i samband med analys av de lättare proteinerna. Syftet var att hitta peptiderna i standarderna och ha som referens till fjärilsproverna. När kalibreringen för lågmolekylära peptider var klar bestrålades fjärilsproverna med en laser för intervallet ca 1000-6000 kDa. De skjutningar som gav lågt brus och en intensitet över 500 sparades. Varje skjutning motsvarade 20-30 skott och totalt gjordes upp till 500 skjutningar. Detta för att flera skjutningar gav ett bättre resultat då kvadratsummorna av alla dem lades ihop till ett spektrum. Därefter upprepades samma procedur för tyngre proteiner i intervallet 1000-11000 kDa efter att ha kalibrerat för den högmolekylära standarden. Figur 13 och Figur 14 visar en uppställning av de instrument som användes för masspektrometri på laboratioret.

20


Figur 13 - Masspektrometern MALDI-TOF.

Figur 14 - Till vänster: Skärm som visar en förstorad bild av det kristalliserade provet på MALDI-plattan. Till höger: Dator som styr utrustningen samt samlar data från MALDI-TOF.

21


5. Resultat från kapillärelektrofores För att kontrollera att lösningsmedlen var lämpliga att extrahera proverna med gjordes tester på fjärilar som legat i frysen en längre tid. Detta för att inte slösa på de färska fjärilarna utifall lösningsmedlen inte skulle extrahera proteinerna bra.

5.1 Gamla fjärilar Prover på gamla fjärilar gjordes för att bestämma vilka lösningsmedel som var lämpliga att använda i vidare studier. Således utarbetades metoden för analys under de tre första veckorna på laboratoriet. 5.1.1 Acetonitril som extraktionsmedel

Figur 15 - Profiler från prover på gamla fjärilar med acetonitril-extraktioner

I Figur 15 är två extraktioner med acetonitril gjorda på två olika fjärilar vid samma tillfälle, den 23 mars. Profilerna visar inga tydliga toppar från fjärilsproteiner, endast systemtoppar utan värde för undersökningen.

22


5.1.2 HFIP som extraktionsmedel

Figur 16 - Profiler från ren HFIP och prover med HFIP-extraktioner

Överst i Figur 16 är ett rent prov av HFIP analyserat för att se om HFIP påverkar profilens utseende med egna toppar. Det syns tydligt att HFIP har karaktäristiskt utseende. De två understa profilerna i bilden är från analys av två gamla fjärilar extraherade med HFIP. Profilerna är till viss del lika varandra men hamnar olika på tidskalan. Detta kan bero på att lösningsmedlet har en inverkan på systemet vad gäller strömmen då det har en sämre ledningsförmåga. Dock kan två extratoppar i fjärilsproverna identifieras efter det typiska HFIP-mönstret. De två fjärilsprovsprofilerna erhölls från två olika individer gjorda vid två separata tillfällen, den 30 mars i mitten samt 29 mars längst ner.

23


5.1.3 Metanol som extraktionsmedel

Figur 17 - Profiler från ren MeOH och prover med MeOH-extraktioner

Överst i Figur 17 visas en profil från ett rent metanolprov för att se vilka toppar lösningsmedlet ger upphov till. Lösningsmedlet gav inte upphov till några tydliga toppar förutom systemtoppar. I profilerna från fjärilsextraktionerna syns tydligt ett flertal toppar som kan vara intressanta för undersökningen. De två profilerna från fjärilsproverna är från två olika individer gjorda vid samma tillfälle, den 10 april. Profilerna mellan de två individerna skiljer sig åt, en extratopp som saknas i den nedersta profilen syns i den mittersta.

24


5.2 Färska fjärilar 5.2.1 Jämförelse mellan elektroferogram från olika exktraktioner Prover från nio olika individer analyserades. Dessa fjärilar kommer från likartade förhållanden vad gäller konkurrens, där lika många honor som hanar vistats tillsammans. Överst i vardera figur visas elektroferogram av prover extraherade med MilliQ-vatten, i mitten profiler från metanolextraktioner och nederst profiler från prover där HFIP använts.

Figur 18 - Första profilerna erhållna av prover från färska fjärilar, extraherade med tre olika lösningsmedel (MilliQ-vatten, MeOH och HFIP)

I Figur 18 visas profiler av proteiner från vatten- och metanolextraktioner gjorda den 13 april och HFIP-extraktionsprofil från den 24 april.

25


Figur 19– Andra gångens erhållna profiler av prover från färska fjärilar, extraherade med tre olika lösningsmedel (MilliQvatten, metanol och HFIP)

I Figur 19 visas profiler av proteiner från vatten- och metanolextraktioner gjorda den 17 april och HFIP-extraktionsprofil från den 24 april.

Figur 20 - Tredje erhållna profilerna av prover från färska fjärilar, extraherade med tre olika lösningsmedel (MilliQvatten, metanol och HFIP).

I Figur 20 visas profiler av proteiner från vatten- och metanolextraktioner gjorda den 17 april och HFIP-extraktionsprofil från den 24 april.

26


5.2.2 Jämförelse mellan elektroferogram från olika individer Efter jämförelse mellan profiler från extraktioner med olika lösningsmedel så jämfördes elektroferogram från olika individer där samma extraktionsmedel använts.

Figur 21 - Elektroferogram från tre olika fjärilindivider extraherade med MilliQ-vatten utförda den 13 april, 17 april och 20 april.

Figur 22 – Elektroferogram från tre olika fjärilindivider extraherade med metanol utförda den 13 april, 17 april och 20 april.

27


Figur 23 – Elektroferogram från tre olika fjärilindivider extraherade med HFIP samtliga utförda den 24 april.

28


5.3 Referensfjäril

Figur 24 – MilliQ-vattenextraktion, fjärilsprov 2 från den 20 mars 2012. Förändring över 3 veckors tid med sista analys den 10 april 2012.

I Figur 24 visas flera elektroferogram för ett av de fjärilsprover som extraherats med vatten den 20 mars, fjärilsprov 2. Elektroferogrammen utfördes under tre veckor. De två översta elektroferogrammen utfördes samma vecka och de två resterande under de efterföljande veckorna. Utifrån detta kunde profilerna jämföras och förändringar i proverna tolkas.

29


6. Resultat från MALDI-TOF Spektra nedan visar analys med MALDI-TOF från fjärilsprover med tre olika extraktionsmedel. Spektra nedan skiljer sig från varandra då proteinerna löser sig olika bra i de olika lösningsmedlen. Analyserna som gjordes på det lågmolekylära området detekterade proteiner med molekylvikt mellan 1000-6000 kDa. Analyserna som gjordes på det högmolekylära området detekterade proteiner med molekylvikt mellan 1000-11000 kDa.

6.1 Analys av lågmolekylära proteiner från 13 april och 24 april med DHB som matrislösning Figur 25 har MilliQ-vatten som extraktionsmedel, Figur 26 har metanol som extraktionsmedel och Figur 27 har HFIP som extraktionsmedel.

x104

Intens. [a.u.]

Intens. [a.u.]

Extraktionerna med MilliQ-vatten och metanol är från den 13 april och extraktionen med HFIP är från den 24 april. Sifforna som markerar topparna motsvarar molekylvikten för proteinerna och åskådliggörs tydligare i Tabell 3, Tabell 6 och Tabell 9 under Bilaga 9.7.1.

x104

5165.511

3.0

1926.093

2.5

3

2.0

2 1118.682

1.5 4578.846 2054.964

1.0 3726.156

5114.856

1 3006.276

0.5

3391.733

0.0

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

0

5500 m/z

Intens. [a.u.]

Figur 25 - MALDI-analys på fjärilsprov extraherat med MilliQvatten från 120413. Punkt O4 på koncentrationsplattan. x104

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

m/z

Figur 26 - MALDI-analys på fjärilsprov extraherat med metanol från 120413. Punkt H14 på koncentrationsplattan.

2986.488

5

1950.244

3118.269

1826.234

1818.259

4

3

2 632.375

1451.730

1795.279

1

1133.066 5077.347 922.381

1734.597 2298.796

1594.636

776.484

5700.644

3176.106 2660.063

3638.359 3886.848

5298.343

4660.019

0 1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

5500

5500 m/z

Figur 27 - MALDI-analys på fjärilsprov extraherat med HFIP från 120424. Punkt A3 på koncentrationsplattan.

30


6.2 Analys av lågmolekylära proteiner från 17 april och 24 april med DHB som matrislösning Figur 28 har MilliQ-vatten som extraktionsmedel, Figur 29 har metanol som extraktionsmedel och Figur 30 har HFIP som extraktionsmedel.

Intens. [a.u.]

Intens. [a.u.]

Extraktionerna med MilliQ-vatten och metanol är från den 17 april och extraktionen med HFIP är från den 24 april. Sifforna som markerar topparna motsvarar molekylvikten för proteinerna och åskådliggörs tydligare i Tabell 4, Tabell 7 och Tabell 10 under Bilaga 9.7.1. x104

x104

1118.800

2.5

2059.545

3 2.0

1.5

2 818.491

1098.527

1.0 2218.245

942.218

1

5119.201 1926.227

1605.392 3782.997

2420.775

5219.639

0.5

3280.181

3044.748 3921.357

0

0.0 1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

5500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

5500 m/z

m/z

Intens. [a.u.]

Figur 28 - MALDI-analys på fjärilsprov extraherat med MilliQvatten från 120417. Punkt D14 på koncentrationsplattan.

x104

Figur 29 - MALDI-analys på fjärilsprov extraherat med metanol från 120417. Punkt J13 på koncentrationsplattan.

1922.676

1796.741

3 3045.548 2092.430

5081.495

1372.450

5686.547

2

2909.997 5285.006

1133.365 2209.620

1 776.775

1567.008 1781.013

3219.008 4646.975

2846.587

2239.247

3872.753 4064.684 3639.240 3511.068

2718.681

4158.225

0 1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

5500 m/z

Figur 30 - MALDI-analys på fjärilsprov extraherat med HFIP från 120424. Punkt C3 på koncentrationsplattan.

31


6.3 Analys av lågmolekylära proteiner från 20 april och 24 april med DHB som matrislösning Figur 31 har MilliQ-vatten som extraktionsmedel, Figur 32 har metanol som extraktionsmedel och Figur 33 har HFIP som extraktionsmedel.

x104

Intens. [a.u.]

Intens. [a.u.]

Extraktionerna med MilliQ-vatten och metanol är från den 13 april och extraktionen med HFIP är från den 24 april. Sifforna som markerar topparna motsvarar molekylvikten för proteinerna och åskådliggörs tydligare i Tabell 5, Tabell 9 och Tabell 11 under Bilaga 9.7.1.

2060.441

1926.294

5000

1.5 4000 5130.517

3000

1089.709

1.0

1586.324

3010.137

2000 2624.120

3392.162

3044.877

0.5

2218.821

1000

3586.251

0.0

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

0

5500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

5500

m/z

Intens. [a.u.]

Figur 31- MALDI-analys på fjärilsprov extraherat med MilliQvatten från 120420. Punkt F15 på koncentrationsplattan. x105

m/z

Figur 32 - MALDI-analys på fjärilsprov extraherat med metanol från 120420. Punkt L15 på koncentrationsplattan.

2987.279

1.2 3119.040

1922.536

1.0

1451.998

0.8

0.6

3147.959

1792.619

5066.337

1133.269

0.4 5198.157 1594.961

701.648

0.2

1733.677

861.491

2082.403 4935.747

3150.828 999.373

1283.243

5702.073

2225.282

5284.030 2659.902

3888.302

4662.471 4917.983

5314.732

0.0 1000

2000

3000

4000

5000 m/z

Figur 33 - MALDI-analys på fjärilsprov extraherat med HFIP från 120424. Punkt E3 på koncentrationsplattan.

32


6.4 Analys av högmolekylära proteiner från 13 april och 24 april med DHB som matrislösning Figur 34 har MilliQ-vatten som extraktionsmedel, Figur 35 har metanol som extraktionsmedel och Figur 36 har HFIP som extraktionsmedel.

x104

Intens. [a.u.]

Intens. [a.u.]

Extraktionerna med MilliQ-vatten och metanol är från den 13 april och extraktionen med HFIP är från den 24 april. Sifforna som markerar topparna motsvarar molekylvikten för proteinerna och åskådliggörs tydligare i Tabell 12, Tabell 15 och Tabell 18 under Bilaga 9.7.2. x104

5175.937

4

1919.907

4

3

10362.837

5423.070

3

5175.771 4940.231 5434.711

2 2 5426.205

5463.185 1079.176 2987.449

1

5496.727

1 10686.030 4587.056 3367.384

3728.522

10350.608

2048.178

9954.469

0

0 1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

m/z

Intens. [a.u.]

Figur 34 - MALDI-analys på fjärilsprov extraherat med MilliQvatten från 120413. Punkt O5 på koncentrationsplattan.

x104

m/z

Figur 35 - MALDI-analys på fjärilsprov extraherat med metanol från 120413. Punkt H14 på koncentrationsplattan.

1942.280 2982.599

6

5

4 5084.054

5707.605

3

2

1361.725

4662.295

1

9525.254 10479.190

0 1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

11000 m/z

Figur 36 - MALDI-analys på fjärilsprov extraherat med HFIP från 120424. Punkt A3 på koncentrationsplattan.

33


6.5 Analys av högmolekylära proteiner från 17 april och 24 april med DHB som matrislösning Figur 37 har MilliQ-vatten som extraktionsmedel, Figur 38 har metanol som extraktionsmedel och Figur 39 har HFIP som extraktionsmedel.

Intens. [a.u.]

Extraktionerna med MilliQ-vatten och metanol är från den 13 april och extraktionen med HFIP är från den 24 april. Sifforna som markerar topparna motsvarar molekylvikten för proteinerna och åskådliggörs tydligare i Tabell 13, Tabell 16 och Tabell 19 under Bilaga 9.7.2. Intens. [a.u.]

x104

x104

2051.169

1919.697

5 1104.357

1.25

5073.598 5175.816

4 1.00 5445.129 10481.198 3026.339

3 0.75 10773.540 2408.933

2

5453.479

0.50 3757.380 10141.904

5497.489

4746.686 10334.178

1 0.25

10052.979

3504.831

10009.887 9873.235 9670.142

0

0.00 1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

1000

10000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000 m/z

m/z

Figur 38 - MALDI-analys på fjärilsprov extraherat med metanol från 120417. Punkt J13 på koncentrationsplattan.

Intens. [a.u.]

Figur 37 - MALDI-analys på fjärilsprov extraherat med MilliQvatten från 120417. Punkt D14 på koncentrationsplattan.

x104

1914.168 5697.256

4

5089.588

3

3042.712

2 2203.387 1362.265

4652.170

1

3874.663

10354.355 9541.075 8933.165

0 1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000 m/z

Figur 39- MALDI-analys på fjärilsprov extraherat med HFIP från 120424. Punkt C3 på koncentrationsplattan.

34


6.6 Analys av högmolekylära proteiner från 20 april och 24 april med DHB som matrislösning Figur 40 har MilliQ-vatten som extraktionsmedel, Figur 41 har metanol som extraktionsmedel och Figur 42 har HFIP som extraktionsmedel.

x104

Intens. [a.u.]

Intens. [a.u.]

Extraktionerna med MilliQ-vatten och metanol är från den 13 april och extraktionen med HFIP är från den 24 april. Sifforna som markerar topparna motsvarar molekylvikten för proteinerna och åskådliggörs tydligare i Tabell 14, Tabell 17 och Tabell 20 under Bilaga 9.7.2. x104

5089.242

1920.528

6

2.5 5313.609

5

2.0 4

1.5 3

5172.220

10290.224 3026.004

1.0 2

4636.829 3368.241

4397.985

0.5

1

1367.882

10307.834 9949.256

0.0

0 4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

m/z

Intens. [a.u.]

Figur 40 - MALDI-analys på fjärilsprov extraherat med MilliQvatten från 120420. Punkt F13 på koncentrationsplattan.

x105

m/z

Figur 41 - MALDI-analys på fjärilsprov extraherat med metanol från 120420. Punkt L13 på koncentrationsplattan.

2982.128

1942.156

5071.483

1.0

0.8

0.6

0.4 1440.731

0.2 5711.139

6007.935 10351.111

8062.656

0.0 1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000 m/z

Figur 42 - MALDI-analys på fjärilsprov extraherat med HFIP från 120424. Punkt E3 på koncentrationsplattan.

35


6.7 Analys av lågmolekylära proteiner från HFIP den 24 april med DHB respektive DHAP som matrislösning applicerad på silikonplatta Figurerna till vänster i alla nedanstående bilder motsvarar ett HFIP-prov där DHB använts som kristallisationsmedel. Figurerna till höger motsvarar ett HFIP-prov där DHAP använts som kristallisationsmedel. Figurerna nedan visar hur de olika kristallisationsmedlen påverkar hur bra proteinerna detekteras beroende på hur bra de kristalliserats på koncentreringsplattan. Som åskådliggörs i figurerna nedan fungerade DHB bättre då dessa spektrum gav starkare signaler för proteiner men genrellt samma signaler erhölls som vid användning av DHAP.

x104

Intens. [a.u.]

Intens. [a.u.]

Figur 43 och Figur 44 motsvarar HFIP prov 1 som extraherades den 24 april. Molekylvikterna för figurerna finns tabellerade under Tabell 21 respektive Tabell 22 under Bilaga 9.7.3. Observera att Figur 43 visar ett bredare intervall med 11000 kDa istället för 6000 kDa som resterande bilder. x104

5703.463

4

1957.779

2.0 1830.662

3004.905

1952.020

1.5

3

2736.747 1798.960 1122.148

1447.358

1.0

2

1239.206

5810.144 1277.108 3803.646

5181.454 2093.015

0.5

1 2362.962 4667.412

1593.523

2365.037

3023.081

9499.013 10446.296

2207.971 3936.092

2523.117

4515.207

3281.033

0

5181.149

5962.620

4854.460

0.0 2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

11000

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

5500

6000

m/z

m/z

Figur 43 - MALDI-analys på fjärilsprov HFIP 1 vilket extraherades med HFIP datumet 120424. Punkt H18 på silikonplattan med kristallisationsmedel DHB.

Figur 44 - MALDI-analys på fjärilsprov HFIP 1 vilket extraherades med HFIP datumet 120424. Punkt L20 på silikonplattan med kristallisationsmedel DHAP.

x104 5

Intens. [a.u.]

Intens. [a.u.]

Figur 45 och Figur 46 motsvarar HFIP prov 2 som extraherades den 24 april. Molekylvikterna för figurerna finns tabellerade under Tabell 23 respektive Tabell 24 under Bilaga 9.7.3. 1923.238

2093.155

5809.879

3000

4

1372.031

2500

2000

3

3048.228

1500

5694.915 2182.267

2

2877.669

5088.095

1000

2210.457

1173.756 1539.013

1781.090

2912.309

1117.849

1155.966

1445.549

3221.783

1277.100

1

1927.853

2815.721

2240.219

2364.765

4652.777

0 1000

3935.622

1734.735

500 3877.086 3642.680

2605.523

5271.946

4515.544

3070.629

0 1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

5500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

5500

m/z

Figur 45 - MALDI-analys på fjärilsprov HFIP 2 vilket extraherades med HFIP datumet 120424. Punkt I18 på silikonplattan med kristallisationsmedel DHB.

6000 m/z

Figur 46 - MALDI-analys på fjärilsprov HFIP 2 vilket extraherades med HFIP datumet 120424. Punkt M19 på silikonplattan med kristallisationsmedel DHAP.

36


x104

Intens. [a.u.]

Intens. [a.u.]

Figur 47 och Figur 48 motsvarar HFIP prov 2 som extraherades den 24 april. Molekylvikterna för figurerna finns tabellerade under Tabell 25 respektive Tabell 26 under Bilaga 9.7.3. x104

1923.167

6

1873.646

2.0

2989.924

5 2020.116 1782.001

2067.285

1.5

2064.182

4 3122.018

3

1.0 1688.463 2077.514 2155.429

1688.027

1122.057

2 1447.246 5073.880

0.5

1117.752

1

1261.712

1451.785 2171.201

3023.239

3153.853

2262.944

5710.907

2226.364 3892.655

5169.033

4669.042

0 1000

5826.769

0.0 1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

5500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

5500

6000

m/z

Figur 47 - MALDI-analys på fjärilsprov HFIP 3 vilket extraherades med HFIP datumet 120424. Punkt J18 på silikonplattan med kristallisationsmedel DHB.

m/z

Figur 48 - MALDI-analys på fjärilsprov HFIP 3 vilket extraherades med HFIP datumet 120424. Punkt N19 på silikonplattan med kristallisationsmedel DHAP.

7. Diskussion 7. 1 Metodbestämning Bedömningen att acetonitril skulle uteslutas som extraktionsmedel i undersökningen grundades på att de extra toppar som fanns i fjärilsprovet men inte i blankprovet var opålitliga. Dessa kan inte räknas som resultat eftersom de ligger före EOF. Relevanta toppar syns efter EOF på tidsskalan då det är väldigt osannolikt att negativt laddade föreningar existerar i en sur miljö. Flödet i systemet är från katod till anod och detta gör att de toppar som syns först på tidsskalan är negativt laddade analyter då dessa attraheras starkast till anoden. Eftersom acetonitil fungerade dåligt som extraktionsmedel testades metanol som ett ytterligare extraktionsmedel. Metanol är medelpolärt vilket gör att det löser både hydrofoba och hydrofila proteiner.

7.2 Jämförelse av elektroferogram från prover med olika extraktionsmedel När metodbestämningen var klar skulle tre stycken analyser på färska fjärilar per laborationstillfälle genomföras. Proverna skulle vara extraherade med tre olika lösningsmedel för att få en större spridning på de olika extraktionsmetoderna under projektets gång. Om samtliga tester med exempelvis vattenextraktioner skulle genomföras vid samma tillfälle skulle förhållandena för denna typ av extraktion bli annorlunda gentemot en annan extraktionsmetod som genomförs vid ett senare tillfälle. Dock utfördes inte analyserna som planerat på grund av tidsbrist, stopp i kapillären och bruten kapillär. Vissa likheter kunde iakttas mellan de olika profilerna från de färska fjärilsproverna, en tydlig signal efter ca 15 min för vatten- och metanolextraktionen. Detta är troligen en typ av proteiner som löser sig bra i de båda extraktionsmedlen. Denna signal finns möjligen även i HFIP-provet men detta kan inte säkerställas och är svårt att bestämma utifrån dessa profiler då den svagare strömmen i HFIPproverna gör att elektroferogrammet till viss del blir förskjutet.

37


Vid första tillfället med analyser på färska fjärilar gjordes HFIP-extraktionerna dock på gamla fjärilar för att alla gruppdeltagare inte hunnit ta del av metodutförandet och skulle testa detta för att lära sig tekniken. Vid det andra tillfället av färskfjärilsanalyser förlorades strömmen i systemet efter metanolprovsanalysen, vilket berodde på ett stopp i kapillären. Stoppet berodde förmodligen på att NaOH inte hade filtrerats då en ny beläggning av kapillären skulle göras. Inför detta tillfälle gjordes en ny beläggning eftersom resultaten vid tillfället innan hade blivit brusiga. Problemet löstes med hjälp av en högtrycksspruta innehållande MilliQ-vatten. Dessutom kapades sammanlagt ca 2 cm av kapillären vid ändarna för att orenheter kunde ha fastnat där vid kontakt med luften. Detta gjorde analystiden något kortare. Vid det tredje tillfället förlorades strömmen igen efter den första HFIPprovsanalysen och kunde inte återfås. En spricka upptäcktes i kapillären vid detektionsfönstret och kapillären byttes ut mot en ny. Vid det fjärde tillfället utfördes samtliga tre HFIP-provsanalyser med den nya kapillären. Det tidigare HFIP-resultatet uteslöts då det inte repeterats. Orsaken till att kapillären gick av vid detektionsfönstret är inte säkerställd men kan bero på att spänningar uppstått och fortplantat sig genom kapillären då denna plockades ut för spolning vid stoppet. Kapillären är extra känslig vid detektionsfönstret eftersom ingen skyddande polyimid finns här. Den avlägsnas för att lampan ska kunna lysa igenom och detektera proteinerna. Att vissa av elektroferogrammen blir brusigare beror dels på att kapillärens insida behöver stabiliseras, att den har blivit påverkad av de olika lösningsmedlen, och dels att strömmen är instabil. Ibland behöver kapillären beläggas om så att ett nytt dubbellager av laddningar formas på kapillärväggens insida. De färska fjärilsproverna uppvisade starkare och tydligare signaler i elektroferogrammen i jämförelse med de gamla fjärilsproverna. Intensiteten på topparna i elektroferogrammet för gamla prover med metanolextraktion ligger som mest på ca 80 mAU i jämföresle med signaler från de färska proverna med samma extraktion som ligger på strax över 200 mAU som mest. Detta betyder att de toppar från färska fjärilarna är mer än dubbelt så starka och att fjärilarna är känsliga för lagring en längre tid. Signalerna var också många fler i de färska proverna och mer separerade från varandra.

7.3 Individjämförelse mellan elektroferogram I Figur 21, Figur 22 och Figur 23 finns de tre olika elektroferogrammen från olika individer som extraherats med samma lösningsmedel samlade. För varje typ av extraktion visas en karaktäristisk profil med undantag för små skillnader mellan individer. Mönstrena är lika mellan individerna för metanol och MilliQ-vattenextraktionerna men topparna varierar i storlek. HFIP-elektroferogrammen är väldigt olika varandra vilket kan bero på att olika proteiner passerat genom millipore-filtret vid prepareringen av provet. I det mittersta elektroferogrammet från Figur 23 syns fler toppar än för de andra två som bara har några enstaka. Ytterligare en profil med så pass många toppar som det mittersta elektroferogrammet erhölls och visas i Bilaga 9.6.2 överst i Figur 58 men har uteslutits från rapporten eftersom kapillären gick sönder strax efter analysen. I och med detta kunde repeterbarhet inte kontrolleras. Många analyser av HFIP gjordes med erhållen karaktäristisk profil men var många gånger förskjuten i tid i förhållande till varandra. Detta kan bero på de egenskaper som HFIP har. HFIP har väldigt låg elektrisk ledningsförmåga och låg ytspänning vilket kan ha inverkat på injektionen av provet i kapillären.

7.4 Referensprovet Referensprovet visas i Figur 24. Ett av fjärilsproverna som extraherades med vatten, fjärilsprov 2 från den 20 mars, kontrollerades kontinuerligt med elektrofores över en treveckorsperiod. Detta gjordes 38


för att kontrollera att proteinerna höll sig intakta och var stabila i tre veckor. Eftersom masspektrometri skulle göras på proverna när alla elektroforesanalyser var klara så var det extra viktigt att veta att proverna var oförändrade över tid. Profilerna ser väldigt lika ut, enligt Figur 24, med undantag för de första två topparna som efter en tid går ihop allt mer till en högre, smal topp. Slutsatsen kan dras att proteinerna i samtliga prov förblir relativt oförändrade under denna period och kan analyseras i MALDI mot projektets slut. En kommentar är att provet vid den sista analysen, i bilden motsvarande den sista profilen, hade hunnit torka och därför tillsattes en ytterligare mängd vatten för blöta upp det. Provet innehöll en väldigt liten mängd MillQ-vatten vilket hade avdunstat. Detta visar på att proteinerna håller sig intakta även efter uttorkning och att detta inte gör en stor skillnad vid vidare analys. En profil över det uttorkade provet innan tillsats av vatten finns i Bilaga 9.2 Figur 48.

7.5 MALDI-TOF-spektrum och felkällor Topparna på spektra från MALDI-analyserna skiljer sig från varandra beroende på vilket extraktionsmedel som användes. Många av topparna är återkommande för alla lösningsmedel men i olika intensitet beroende på hur väl proteinerna har löst sig i de olika extraktionsmedlen. En stor topp förekommer i alla spektrum runt 5000 kDa men varierar i intensitet. Det kan bero på som tidigare nämnts att just det proteinet löser sig olika bra i de olika lösningsmedlen men det kan också vara individberoende. Spektra som visar analys i det lågmolekylära intervallet av fjärilsprover som extraherats med MilliQ-vatten skiljer sig från varandra trots att samma lösningsmedel använts. Det kan bero på att proteinerna som finns i honan varierar i mängd beroende på spermatoforens storlek. Större spermatofor innehåller mer protein vilket genererar en topp med högre intensitet. En annan anledning till att spektrum för olika fjärilsindivider ser olika ut, trots att samma lösningsmedel använts, är den mänskliga faktorn. Alla prover har ZipTip-behandlats men det är omöjligt att göra exakt lika varje gång vilket innebär att vissa prover får med sig mer protein än andra. Detta bidrar till att koncentrationerna av proteinerna varierar i de olika proverna. Det är även svårt att preparera punkter på koncentreringsplattorna lika eftersom matrislösningen och proven appliceras för hand. Dropparna kan bli olika stora på koncentreringsplattan och kristalliserar därför olika bra vilket bidrar till att spektra blir olika. En annan felkälla är att MALDIplattorna har preparerats av olika personer. All analys med MALDI genomfördes inte på samma dag vilket ger olika förhållanden som luftfuktighet och temperatur. När analysen på silikonplattan skulle utföras hade proverna med HFIP avdunstat vilket innebar att proverna behövde ZipTip-behandlas ytterligare en gång. Proverna blir sämre varje gång de ZipTip-behandlas eftersom koncentrationen av protein minskar för varje gång. Detta gör att profilerna i slutändan skiljer sig då de innehåller olika mycket protein. Vid MALDI-analys med DHAP var silikonplattan en stor felkälla. Silikonlagret på denna platta var preparerat tidigare men en nypreparerad platta är att föredra. Inget nytt silikon fanns att tillgå och därför användes denna där vissa delar av plattan redan var använd. Det området som användes vid analysen var oanvänt men resultatet kan fortfarande ha påverkats då silikon lätt drar till sig orenheter som orsakar extra toppar i spektrumet. En konsekvens av att plattan inte var nypreparerad var att glycerolet, som ska fungera som en mall för brunnar till provet, hade flutit ut en aning och gjorde att dessa punkter var olika stora. Detta gör det svårare att jämföra de olika proverna eftersom förhållandena för punkterna på koncentreringsplattan var olika. Generellt åskådliggörs vid jämförelse av DHB och DHAP på silikonplatta att DHB verkade fungera bättre som 39


kristallisationsmedel då det blev ett spektrum men starkare signaler. Detta beror antagligen på att proverna med DHB kristalliserade bättre. I övrigt har profilerna liknande utseende, dock verkar den topp runt 5800 kDa vara i högre koncentration med DHAP än med DHB, se Figur 46. Analyser i det högmolekylära området gjordes med gränserna strax under 1000 kDa och 11000 kDa. Detta spann inkluderar det lågmolekylära området på ca 1000 kDa till 6000 kDa. Det var dock nödvändigt att göra en lågmolekylär analys också eftersom spektra för de högmolekylära analyserna inte var anpassade efter låg molekylvikt vilket skapar ett oönskat brus i början av spektrumet. Trots den dåliga upplösningen i början av spektrumet analyserades hela intervallet från 1000 kDa till 11000 kDa. Anledningen till detta var att få en helhetsbild över hela spektrumet trots att kalibreringen lämpade sig bäst för tyngre proteiner. Vid analyserna av proteiner i det högmolekylära området ser profilen för HFIP annorlunda ut i förhållande till profilerna med MilliQ-vatten och metanol. Topparna med fjärilsprov extraherat med MilliQ-vatten respektive metanol ser ganska lika ut vilket tyder på att tyngre proteiner löser sig ungefär lika bra i de två hydrofila extraktionsmedlen. Spektrumen för HFIP-extraktionerna har en extra topp som inte förekommer för de två andra lösningsmedlsextraktionerna. Denna förekommer vid 9500 kDa, se Figur 36 och Figur 39. Ytterligare en topp syns väldigt starkt i HFIP-profilerna men inte i vatten och ligger vid 3000 kDa. Denna finns även i metanolprofilerna men med svagare signal. Detta tyder på att det finns hydrofoba proteiner som löser sig i ett hydrofobt lösningsmedel men inte i ett hydrofilt. Men denna tolkning är osäker eftersom två av HFIP-extraktionerna var dåliga vilket syns på att det var så få toppar i elektroferogrammen. Detta åskådliggörs i det översta och det nedersta elektroferogrammet i Figur 23. Vissa av topparna som fanns i vatten gav tydligare signal med metanolextraktion men syntes bäst i extraktionerna med HFIP. Två signaler syntes bäst med MilliQ-vattenextraktion och gav utslag vid 5000-5500 kDa samt 10000-10500 kDa. Den första toppen av dessa två verkar vara hydrofil eftersom den även gav utslag i spektra för metanolproverna men inte i spektra för HFIP-proverna. Den senare toppen vid strax efter 10000 kDa verkar finnas i samtliga spektra och var i två fall av tre betydligt starkare i spektra från vattenproverna. Analyser i det lågmolekylära området gjordes med gränserna 1000 kDa och 6000 kDa. Utifrån analyser med MALDI-TOF i det lågmolekylära området verkar fler lågmolekylära proteiner vara hydrofoba då många toppar med bra upplösning erhölls i spektrum från HFIP-extraktion. Samtliga spektrum med lågmolekylär analys hade bättre upplösning än de från högmolekylär analys. Topparna var smalare och mer väldefinierade men gav utslag vid samma ungefär samma molekylvikter som för högmolekylär analys.

8. Slutsatser Slutsatserna av mesityloxidprofilerna i Figur 12 är att systemet inte förändrats avsevärt efter modifieringar i instrumentet. Systemet verkar fungera korrekt och analyser av samtliga prover är jämförbara. Två modifieringar gjordes; nybeläggning av kapillär samt utbyte av kapillär. En större bild av en mesityloxidprofil finns att se i Bilaga 9.1 Figur 47. Enligt resultaten från analys med extraktion i MilliQ-vatten på de gamla fjärilsproverna lämpade sig MilliQ-vatten bra som extraktionsmedel. Detta var ett väntat resultat eftersom denna metod hade använts tidigare i försök som ingått i andra projekt.

40


Acetonitrilen visade sig inte vara ett lämpligt extraktionsmedel. Signalerna som erhölls vid elektroforesen verkade enbart vara utslag från acetonitrilen då blankprov med acetonitril var näst intill identiskt med fjärilsprovet. Extraktionen med HFIP var inte idealisk men fungerade och gav ett fåtal trovärdiga toppar. Därför bestämdes att arbetet med HFIP i vidare försök skulle fortskrida på färska fjärilar. Metanol som lösningsmedel lämpade sig bra och gav flera intressanta toppar som antingen kan vara vattenlösliga eller fettlösliga. Elektroferogrammen gjorda på referensfjärilen under tre veckors tid visade att proteinerna verkade vara stabila och förändrades inte avsevärt. Detta låg till underlag för att analys med MALDI skulle kunna genomföras vid slutet av projektet när alla elektroforesanalyser var gjorda. Då den sista analysen av referensfjärilen med elektrofores skulle genomföras hade provet torkats ut vid förvaringen, men visade sig vara relativt oförändrat efter uppblötning med MilliQ-vatten. Utifrån detta kunde slutsatsen dras att proverna lämpade sig för ytterligare analys med MALDI. Detta eftersom lösningsmedlet inför MALDI-analysen avdunstats från proverna vilka sedan blöttes upp igen med 0.1% TFA så att en känd koncentration kunde erhållas. Utifrån elektroferogrammen och MALDI-spektra från de färska proverna visades tydligt att olika profiler erhållits. För respektive lösningsmedel gavs en profil med ett karaktäristiskt mönster som påvisade att olika typer av proteiner lyckats extraheras. Slutsatsen är att både hydrofoba och hydrofila kunde utvinnas och granskas. En annan iakttagelse är att profilerna skiljer sig mellan individer vilket tyder på att olika proteinsammansättning förekommer mellan olika spermatoforer. MALDI-TOF analyser visade att proteiner i både det högmolekylära och lågmolekylära områdena förekommer. Slutsatsen är att det finns både hydrofila och hydrofoba proteiner som är högmolekylära i spermatoforen. Karaktäristiska utseenden erhölls för respektive extraktionsmedel. Två signaler verkade vara från hydrofoba proteiner eftersom de existerade i spektrumen från HFIPoch metanolprov men inte i de från MilliQ-vatten extraktioner. Dessa hittades i vid 3000 kDa samt 9500 kDa. En särskilt stark signal vid 5200 kDa verkade vara hydrofil eftersom den fanns med i spektrum för MilliQ-vattenextraktioner men inte i de från HFIP-extraktioner. Denna topp existerar även i spektrum från metanolextraktioner men är svagare. Alltså finns det hydrofoba toppar vid 3000 kDa och 9500 kDa i spektrum från högmolekylär ananlys samt en hydrofil topp vid 5200 kDa. För analysen med MALDI-TOF av lågmolekylära proteiner förekommer två starka signaler vid 1850 kDa och 3000 kDa från hydrofoba proteiner. Denna slutsats kunde göras eftersom de gav bäst signal i spektrum från HFIP- och metanolextraktioner. Fler toppar visades i spektrum för HFIP-extraktioner än för de med MilliQ-vatten och metanol. Detta ledde till slutsatsen att fler av de lågmolekylära proteinerna i spermatoforen är hydrofoba.

41


9. Referenser 1. Henk H. Lauer & Gerard P. Rozing, “High performance Capillary Electrophoresis”, 2nd edition, Agilent Technologies, GE (2009), 2-16, 34-36, avläst 2012.03.28 2. Spermatofor. http://www.ne.se/lang/spermatofor, Nationalencyklopedin, hämtad 2012-0301 3. Nathaniel L Clark, Jan E Aagaard & Willie J Swanson, “Evolution of reproductive proteins from animals and plants”, Reproduction review, 131 (2006), 11-22 4. Leslie M. Turner & Hopi E. Hoekstra, “Causes and consequences of the evolution of reproductive proteins”, Int. J. Dev. Biol., 52 (2008), 769-780 5. TL Karr, ” Application of proteomics to ecology and population biology”, Heredity, 100 (2008), 200–206 6. Johanna Liljestrand Rönn, “Evolution of female mating behaviour and sperm competition in butterflies”, Project plan 7. Márco Zikán Cardoso & Lawrence E. Gilbert, “A male gift to its partner? Cyanogenic glycosides in the spematophore of longwinged butterflies (Heliconius)” , Naturwissenschaften, 42(2007), http://resources.metapress.com/pdfpreview.axd?code=9747357v2317l072&size=largest, hämtad 2012-02-29 8. Theres Redeby, Johan Roeraade, Åsa Emmer, ”Simple fabrication of a structured matrixassisted laser desorption/ionization target coating for increased sensitivity in mass spectrometric analysis of membrane proteins”, Wiley InterSience (2004), avläst 2012.05.06 9. Bruker Daltonics GmbH, “AnchorChipTM Technology Revision 3”, Germany, Copyright 2009

42


10. Bilagor 10.1 Elektroferogram över analyser med mesityloxid

Figur 49- Analys av mesityloxid från olika datum i kapillärelektrofores.

Figur 50- Analys av mesityloxid i kapillärelektrofores.

43


10.2 Elektroferogram över analyser med referensfjäril

Figur 51- Analys av referensfjäril i kapillärelektrofores.

Dessa elektroferogram som visas i Figur 51 är från analys av referensprovet och är kompletterande till Figur 24. Underst visas det uttorkade provet som inte gav några bra signaler. Överst visas samma prov fast uppblött igen vilket gav önskad profil.

10.3 Elektroferogram över analys med MilliQ-vatten som extraktionsmedel 10.3.1 Färska fjärilar

Figur 52 - Analys av fjärilsprotein i MilliQ-vatten med kapillärelektrofores.

44


Alla prover kördes två gånger. I Figur 52 visas den upprepade körningen som kompletterar elektroferogrammen med vattenextraktioner överst i Figur 18, Figur 19 och Figur 20.

10.4 Elektroferogram över analys med acetonitril som extraktionsmedel 10.4.1 Gamla fjärilar

Figur 53 - Analys av fjärilsprotein i acetonitril med kapillärelektrofores

Mindre lyckade försök med acetonitrilextraktioner åskådliggörs i Figur 53.

45


10.5 Elektroferogram över analys med metanol som extraktionsmedel 10.5.1 Gamla fjärilar

Figur 54 - Analys av gammalt fjärilsprotein i metanol med kapillärelektrofores

I Figur 54 visas den upprepade körningen som kompletterar Figur 17. 10.5.2 Färska fjärilar

Figur 55- Analys av färskt fjärilsprotein i metanol med kapillärelektrofores

46


I Figur 55 visas den upprepade körningen som kompletterar elektroferogrammen med metanolextraktioner i mitten av Figur 18, Figur 19 och Figur 20.

10.6 Elektroferogram över analys med HFIP som extraktionsmedel 10.6.1 Gamla fjärilar

Figur 56- Analys av gammalt fjärilsprotein i HFIP med kapillärelektrofores

I Figur 56 och Figur 57 visas mindre lyckade elektroferogram med HFIP-extraktioner med förskjutningar i migrationstider eller luft i kapillären som utgörs utav en hög smal topp.

Figur 57 - Analys av gammalt fjärilsprotein i HFIP med kapillärelektrofores

47


10.6.2 Färska fjärilar

Figur 58 - Analys av färskt fjärilsprotein i HFIP med kapillärelektrofores

I Figur 58 visas överst en ensam körning av ett HFIP-extraherat prov som inte kunde köras igen på grund av bruten kapillär. De tre understa elektroferogrammen som visas kompletterar med en ytterligare körning av de som visas underst i Figur 18, Figur 19 och Figur 20.

48


10.7 Tabeller till MALDI-TOF-spektrum 10.7.1 Tabeller fr책n analys med MALDI-TOF i det l책gmolekyl채ra intervallet. Tabell 3 - Tabell till Figur 25. Analyserat med MALDI: 120504, punkt: O4, kristallisationsmedel: DHB. Extraktionsmedel: MilliQ-vatten, extraherat 12.04.13.

m/z

SN

Quality Fac.

Res.

Intens.

Area

[mAU]

2054.964 3726.156 4578.846 5067.778 5077.276 5154.073 5165.511

12.5 6.3 6.8 14.3 7.6 8.5 21.2

2317 236 854 1868 109 730 397

1109 3101 1498 1383 2707 1827 3080

m

4641.00 1760.98 1453.95 2081.75 1400.56 1074.87 3188.70

a

23170 8339 20323 37921 12238 15258 25523

Tabell 4 - Tabell till Figur 28. Analyserat med MALDI: 120503, punkt: D14, kristallisationsmedel: DHB. Extraktionsmedel: MilliQ-vatten, extraherat 12.04.17.

m/z

SN

Res.

Intens. [mAU]

694.746 818.491 942.218 1098.527 1099.494 1170.164 1605.392 2059.545 2061.746 2098.093 2099.058 2105.112 2218.245 2420.775 2458.435 3280.181 3782.997 3800.236 5115.078 5131.276 5203.332 5219.639

10.3 15.2 7.3 18.7 6.9 6.8 12.2 84.5 20.8 5.4 6.2 22.5 14.1 9.8 7.8 4.0 16.5 9.6 6.1 12.2 5.3 12.6

4855 4637 7104 4924 5015 6773 4511 3325 3095 4255 3025 2976 1380 1635 2811 2114 1457 2169 5171 4180 5460 4745

7473.75 10340.48 4722.79 10755.85 3988.77 3766.95 5232.25 28242.00 6768.26 1792.17 2063.14 7084.94 3465.18 2354.37 2135.29 448.84 1356.54 783.95 385.81 633.86 317.24 742.19

Area m

a

1529 2778 1005 4448 1725 1177 4635 57865 14916 2370 3846 16578 16065 10844 6156 2567 15030 6070 1784 3639 1425 3852

49


Tabell 5 - Tabell till Figur 31. Analyserat med MALDI: 120503, punkt: F15, kristallisationsmedel: DHB. Extraktionsmedel: MilliQ-vatten, extraherat 12.04.20.

m/z

SN

Quality Fac.

Res.

Intens. [mAU]

694.834 797.438 884.080 1002.934 1089.709 1547.983 1586.324 2060.441 2218.821 2624.120 2995.272 3010.137 3586.251 5130.517

12.7 11.4 12.3 4.7 7.7 7.3 7.6 28.1 3.0 7.5 3.1 13.0 3.6 9.0

89 84 196 43 91 122 181 6357 129 1567 285 6557 204 215

4204 4619 3804 6262 4445 4375 3745 1300 2179 1046 2010 1187 3013 2245

10009.65 8593.58 9011.88 3271.77 5012.68 3950.31 4071.34 9655.37 1238.85 1935.22 715.59 2286.31 632.38 921.41

Area m

a

2366 2267 3275 884 2103 3206 4112 44093 3568 16567 3777 21669 2903 9850

Tabell 6 - Tabell till Figur 26. Analyserat med MALDI: 120503, punkt: H14, kristallisationsmedel: DHB. Extraktionsmedel: Metanol, extraherat 12.04.13.

m/z

SN

Quality Fac.

Res.

Intens. [mAU]

876.739 1054.258 1080.470 1118.682 1836.873 1871.487 1909.818 1926.093 1930.191 1939.352 1964.419 3006.276 3044.681 3065.187 3103.581 3391.733 5114.856 5203.683 5219.418

4.7 8.4 30.1 6.6 5.5 34.6 9.7 76.9 18.8 27.3 22.5 16.5 17.0 11.2 7.2 6.3 19.1 13.2 17.3

37 159 1560 74 75 18248 533 31481 2640 7411 10672 3043 6470 1304 526 1196 245 184 308

3840 4635 3521 5284 4822 2814 3624 2526 2299 2703 3378 1822 2200 1937 2983 2626 4365 5387 4555

2608.59 4625.73 15536.15 3414.22 2383.29 14688.96 4038.51 31973.03 7532.11 11300.87 9205.96 2763.47 2535.81 1612.82 1210.41 821.85 1304.33 956.76 1229.28

Area m

a

921 1779 8684 1285 2411 28500 6246 73451 19174 24018 16413 16152 12960 9293 4624 4081 7292 4382 6646

50


Tabell 7 - Tabell till Figur 29. Analyserat med MALDI: 120503, punkt: J13, kristallisationsmedel: DHB. Extraktionsmedel: Metanol, extraherat 12.04.17.

m/z

SN

Quality Fac.

Res.

Intens. [mAU]

860.792 876.872 889.018 892.973 1054.297 1080.530 1118.800 1871.624 1916.112 1926.227 1974.249

5.4 10.8 11.7 7.1 8.2 43.9 8.1 8.0 3.2 14.2 4.4

35 650 604 74 262 43480 302 850 33 3540 106

6728 4459 4407 4577 5067 3214 5245 2594 4154 2538 1798

2998.29 5993.93 6506.94 3958.94 4308.75 21940.68 3952.98 2547.73 988.37 4417.30 1334.22

Area m

a

598 1868 2094 1277 1590 14046 1556 5213 1259 10005 3723

Tabell 8 - Tabell till Figur 32. Analyserat med MALDI: 120503, punkt: L15, kristallisationsmedel: DHB. Extraktionsmedel: Metanol, extraherat 12.04.20.

m/z

SN

Quality Fac.

Res.

Intens. [mAU]

1926.294 1964.610 3044.877 3241.271 3392.162 3430.703

13.5 5.9 3.7 4.6 5.6 4.3

6129 2856 300 643 726 600

2016 2500 3229 1663 2170 1857

3131.55 1384.07 490.90 419.64 513.75 341.50

Area m

a

8595 3242 1651 3044 3020 2451

Tabell 9 - Tabell till Figur 27. Analyserat med MALDI: 120504, punkt: A3, kristallisationsmedel: DHB. Extraktionsmedel: HFIP, extraherat 12.04.24.

m/z

SN

Quality Fac.

Res.

Intens. [mAU]

612.391 613.424 614.371 614.987 616.003 629.396 630.360 631.366 632.375 667.541 676.525 690.700 702.449 776.484 845.378

6.2 4.6 8.6 24.1 11.4 7.3 50.4 18.4 6.0 3.1 3.5 4.0 4.2 3.9 10.0

2604 2706 2690 2390 3136 3428 2769 2799 2760 2653 3053 3533 3085 3895 3565

2092.00 1553.00 2893.00 8086.00 3814.00 2434.00 16828.00 6143.00 2004.00 1049.00 1171.00 1318.00 1384.00 1292.50 3295.00

Area m

a

450 409 547 2247 684 661 4079 1562 447 256 151 282 262 244 829 51


846.369 861.352 883.288 922.381 923.385 924.379 961.315 999.201 1005.249 1085.177 1086.179 1108.102 1109.179

4.6 4.7 4.4 16.6 9.1 3.8 4.7 3.0 3.6 4.6 3.1 3.5 3.4

3257 4591 3736 3523 3464 3750 3584 3537 4355 5026 4227 3820 4594

1504.00 1547.00 1449.00 5447.00 2998.00 1255.00 1537.00 990.00 1154.00 1480.75 1000.75 1133.50 1110.00

421 286 269 1565 897 330 422 296 260 273 281 310 292

Tabell 10 - Tabell till Figur 30. Analyserat med MALDI: 120504, punkt: C3, kristallisationsmedel: DHB. Extraktionsmedel: HFIP, extraherat 12.04.24.

m/z

SN

Quality Fac.

Res.

Intens. [mAU]

615.080 616.051 630.502 631.511 776.775 777.740 883.672 1005.483 1006.490 1133.365 1134.393 1135.379 1166.614 1174.444 1198.380 1199.408 1250.406 1251.380 1285.532 1286.502 1312.378 1313.329 1372.450 1373.438 1374.357 1449.390 1450.281 1452.154 1453.119

9.4 4.0 12.5 5.9 8.3 3.1 4.0 7.1 4.3 9.7 7.0 3.1 4.2 3.1 4.1 3.2 4.6 3.5 7.7 5.2 3.3 4.2 27.6 22.6 8.5 5.0 5.3 7.7 6.5

1790 1840 2206 2220 1846 1492 1893 2356 2463 2228 2240 2025 2373 2425 2268 2548 2168 2297 2308 2142 2431 2463 2286 2431 1930 1953 2240 2214 2408

9339.00 3947.00 12431.00 5896.00 7878.00 2967.00 3696.00 6132.00 3763.00 7814.50 5617.50 2519.50 3323.00 2412.00 3202.00 2475.00 3489.00 2670.00 5761.00 3897.00 2425.00 3116.00 19596.00 16057.00 6045.00 3455.00 3600.00 5253.00 4440.00

Area m

a

3747 1564 4045 1991 2883 1461 1605 2251 1669 4301 3401 1470 1657 1264 1555 1223 2083 1534 3355 2486 1397 1848 11551 9331 4344 2248 2369 3687 2879 52


Tabell 11 - Tabell till Figur 33. Analyserat med MALDI: 120504, punkt: E3, kristallisationsmedel: DHB. Extraktionsmedel: HFIP, extraherat 12.04.24.

m/z

SN

Quality Fac.

Res.

Intens. [mAU]

612.491 613.503 615.039 616.042 629.462 630.434 631.436 632.470 674.447 697.638 701.648 702.621 754.559 756.546 774.523 790.506 827.495 844.438 845.488 846.485 847.494 861.491 862.472 863.503 864.525 865.525 883.487 899.414 915.405

6.0 3.9 16.2 6.7 6.6 32.4 14.3 4.7 3.3 5.4 7.0 3.3 3.1 3.2 3.5 5.7 4.4 4.4 17.9 9.8 3.6 22.1 12.6 5.8 5.5 3.3 3.2 3.5 3.5

2204 1806 1971 2467 2912 2719 2860 2602 2211 2298 3050 3308 3090 4088 3319 3720 3599 3557 3943 3855 4134 3573 3936 4178 3624 3980 2728 4473 3444

4242.50 2774.50 11471.50 4731.50 4621.50 22812.50 10039.50 3313.50 2295.50 3800.50 4903.50 2328.50 2175.00 2268.00 2450.00 3992.00 3095.00 3088.00 12603.00 6940.00 2539.00 15547.00 8912.00 4061.00 3875.00 2325.00 2236.00 2454.00 2489.00

Area m

a

1277 879 3468 1413 1184 6087 2689 893 675 1088 1238 656 590 524 620 969 784 953 3136 1848 675 4233 2260 1079 1087 567 655 593 646

10.7.2 Tabeller från analys med MALDI-TOF i det högmolekylära intervallet

Tabell 12 - Tabell till Figur 34. Analyserat med MALDI: 120503, punkt: O5, kristallisationsmedel: DHB. Extraktionsmedel: MilliQ-vatten, extraherat 12.04.13.

m/z

SN

Quality Fac.

Res.

Intens. [mAU]

618.991 2048.178 3728.522 3752.906

4.3 5.6 10.6 4.1

154 168 218 186

8786.75 2260.00 4029.75 1556.25

Area m

a

42518 28427 77170 32172 53


3787.967 4398.043 4587.056 4981.264 4994.316 5006.689 5081.894 5175.937 5212.013 5272.727 5305.837 5310.508 5385.886 5407.168 5423.070 5434.711 5449.068 9927.880 9954.469 10087.100 10151.204 10182.948 10250.845 10362.837 10495.975 10628.648 10686.030

4.0 4.1 12.1 7.3 7.4 7.5 84.5 120.0 56.7 18.0 31.3 32.0 6.9 5.5 6.3 7.0 6.8 5.0 11.1 9.1 13.7 13.3 32.2 421.5 109.5 15.0 4.6

211 199 214 131 142 78 150 141 96 196 105 142 179 204 189 215 266 389 303 181 155 267 239 305 217 500 681

1515.00 1591.75 4557.00 2399.00 2426.00 2457.00 27300.00 37976.00 17802.00 5569.00 9571.00 9780.00 2066.00 1651.00 1852.25 2057.00 2005.75 335.75 744.75 610.75 918.75 894.75 2155.75 28079.75 7313.75 1003.75 305.75

32968 36132 104752 51039 27407 40734 821063 1283696 443896 109599 172154 143299 23713 8523 15564 26970 16879 6701 14782 10008 36924 16185 31128 995612 331899 13323 4427

Tabell 33 - Tabell till Figur 37. Analyserat med MALDI: 120503, punkt: D14, kristallisationsmedel: DHB. Extraktionsmedel: MilliQ-vatten, extraherat 12.04.17.

m/z

SN

Quality Fac.

Res.

Intens. [mAU]

2094.201 2207.990 2246.244 2408.933 2446.057 3757.380 3770.173 3794.176 3806.242 4746.686 4977.396 4982.962 5002.393 5011.042 5029.221

14.2 7.4 3.0 6.3 4.6 8.2 7.3 5.9 3.8 3.8 5.5 5.9 5.2 5.1 7.1

138 191 177 191 192 175 146 166 188 259 170 195 231 176 108

6666.50 3294.25 1331.50 2575.25 1889.50 2726.75 2444.75 1953.75 1250.75 930.50 1236.75 1327.75 1168.75 1158.75 1605.75

Area m

a

105562 38383 15425 36120 27956 47013 38372 29553 8632 17450 7844 10517 9126 9314 32272 54


5042.839 5053.034 5088.030 5108.733 5125.831 5175.816 5213.389 5234.449 5246.908 5277.829 5288.569 5309.296 5344.731 5378.628 5405.664 5438.897 5445.129 5459.307 9670.142 9873.235 9967.207 10009.887 10052.979 10083.151 10141.904 10231.895 10271.154 10286.163 10315.723 10347.857 10386.641 10481.198 10517.818 10540.867 10553.152 10585.041 10591.949 10615.630 10649.253 10716.497 10773.540 10823.447 10960.185 10975.407

7.2 7.7 26.1 16.5 19.5 43.2 25.4 19.2 18.4 18.3 18.0 31.9 16.6 9.5 7.4 6.2 6.5 5.4 5.4 4.3 6.1 9.8 9.3 9.2 15.5 14.1 16.9 19.3 26.9 61.0 48.1 139.6 93.9 70.6 69.6 72.7 74.0 108.3 69.5 37.4 20.9 13.0 4.1 3.1

163 149 134 111 128 126 114 130 105 104 160 145 138 134 157 296 212 291 300 575 355 332 318 362 300 309 245 257 303 216 141 221 204 212 131 156 200 214 187 228 335 670 1166 1297

1629.75 1754.75 5921.75 3737.75 4416.75 9791.75 5745.75 4340.75 4171.75 4150.75 4074.75 7226.75 3757.75 2151.50 1674.75 1406.50 1468.50 1223.00 340.25 268.00 379.00 607.00 574.00 566.00 950.00 868.00 1035.00 1182.00 1639.00 3710.00 2930.00 8483.00 5693.00 4268.00 4213.00 4392.00 4468.00 6532.00 4186.00 2252.00 1260.00 781.75 244.75 184.00

13332 26672 143279 37928 91510 294533 139774 50545 63073 75058 42035 214608 84496 31195 17075 9384 12408 15524 10555 3524 7166 13351 12107 8872 35379 11715 11970 16191 35253 117264 91801 274503 147972 50800 89002 90165 43813 206103 110727 41314 17622 12169 2498 1594

55


Tabell 44 - Tabell till Figur 40. Analyserat med MALDI: 120503, punkt: F13, kristallisationsmedel: DHB. Extraktionsmedel: MilliQ-vatten, extraherat 12.04.20.

m/z

SN

Quality Fac.

Res.

Intens. [mAU]

4397.985 4636.829 4939.487 4956.752 4987.788 5046.361 5089.242 5104.569 5125.168 5178.849 5295.865 5313.609 5325.300 9924.582 9949.256 10082.388 10092.041 10113.489 10146.025 10163.599 10172.650 10206.068 10218.988 10234.730 10262.511 10307.834 10347.148 10372.832 10437.826 10480.314

3.8 4.1 3.0 3.1 8.4 8.9 38.2 28.3 14.9 30.5 4.8 5.8 5.6 3.1 5.3 3.6 3.6 3.4 3.6 4.6 5.3 7.0 8.0 8.3 14.4 18.4 14.1 9.2 5.5 3.5

178 247 157 171 134 85 171 167 108 172 170 114 127 480 275 379 318 324 467 440 449 286 378 216 233 203 230 524 322 572

2566.50 2702.00 1973.00 2039.00 5471.00 5823.00 24840.00 18392.00 9632.00 19479.00 2985.00 3582.00 3470.50 216.00 368.00 245.00 250.00 231.00 248.00 312.00 359.00 473.00 544.00 566.00 973.00 1240.00 946.00 618.00 367.00 233.00

Area m

a

55178 60414 40239 26445 100130 75798 461412 260616 230233 347665 40023 71434 63277 2849 8982 5092 4124 4087 3792 3367 5837 5325 7113 10654 33453 43957 28443 11900 5510 2577

Tabell 15 - Tabell till Figur 35. Analyserat med MALDI: 120503, punkt: H14, kristallisationsmedel: DHB. Extraktionsmedel: Metanol, extraherat 12.04.13.

m/z

SN

Quality Fac.

Res.

Intens. [mAU]

1079.176 1831.405 1864.854 1888.573 1904.504 1919.907 1959.455 1998.158

4.1 3.8 19.3 3.7 8.8 44.7 14.8 7.2

166 153 191 108 125 146 138 121

7325.00 3125.25 15902.25 3027.25 7249.25 36797.25 12195.25 5909.25

Area m

a

55481 41669 179927 31920 74134 435628 215091 41712 56


2009.818 2013.588 2033.619 2052.230 2081.250 2987.449 3011.144 3026.712 3045.190 3062.249 3085.114 3102.623 3120.801 3144.143 3149.497 3156.773 3160.546 3180.553 3195.660 3239.969 3246.511 3367.384 3370.614 4915.995 4928.665 4940.231 4948.989 4955.883 4974.117 5074.592 5086.186 5131.216 5175.771 5204.895 5295.456 5308.865 5426.205 5441.638 5451.021 5463.185 5474.241 5496.727 5506.878 5514.463 5522.762 10153.584 10176.094 10203.603

7.2 6.9 7.2 8.0 4.4 15.0 6.1 14.5 14.8 7.6 11.9 6.6 7.6 6.6 6.3 6.2 6.3 5.7 4.7 3.2 3.3 3.1 3.1 3.1 3.3 3.8 4.4 4.9 6.6 54.2 49.7 31.1 60.5 41.7 23.4 23.1 6.5 6.3 6.1 5.3 5.3 4.2 3.6 3.4 3.4 4.3 5.1 7.0

85 99 123 92 86 178 109 145 111 150 110 97 97 158 130 170 138 92 132 54 95 262 219 229 241 205 204 69 172 149 110 65 104 75 79 96 190 161 201 139 214 207 299 234 283 509 504 208

5904.25 5694.25 5941.25 6579.25 3647.25 9023.25 3685.00 8726.25 8918.75 4577.75 7152.75 3955.75 4547.75 3973.75 3810.75 3704.75 3783.75 3422.75 2807.75 1923.75 1959.75 1891.75 1864.75 1147.00 1234.75 1391.75 1630.75 1813.75 2427.75 19555.75 17922.75 11181.75 21758.75 14975.75 8425.75 8310.75 2333.00 2263.75 2207.25 1921.75 1890.25 1522.50 1291.25 1234.50 1208.50 256.00 305.00 415.00

54261 58457 65068 130770 58570 159887 46904 126451 163132 57044 152085 34849 87505 29961 29577 9807 39849 66749 50575 12721 22726 11685 14413 12392 13420 13310 12791 17817 27512 417412 286500 168888 538678 251364 143376 112481 28322 23038 24791 19830 19116 12716 10880 10479 10100 3767 4791 5612 57


10232.515 10242.665 10259.885 10350.608 10388.807 10437.690 10445.214 10480.712 10670.591

9.4 11.6 14.0 91.9 39.8 25.4 25.6 27.5 4.1

221 470 164 276 266 435 48 234 505

560.00 690.00 828.00 5389.00 2328.00 1481.00 1493.00 1603.00 235.00

8615 7565 15259 204196 39842 10417 14317 45332 4360

Tabell 56 - Tabell till Figur 38. Analyserat med MALDI: 120503, punkt: J13, kristallisationsmedel: DHB. Extraktionsmedel: Metanol, extraherat 12.04.17.

m/z

SN

Quality Fac.

Res.

Intens. [mAU]

1055.675 1069.140 1081.269 1104.357 1169.035 1241.410 1685.980 1779.580 1866.445 1910.410 1919.697 1950.012 1965.902 2010.404 2036.957 2075.886 2988.040 3026.339 3060.374 3086.844 3123.765 3155.385 3504.831 4953.523 4988.936 5032.647 5073.598 5112.890 5167.357 5203.680 5295.528 5453.479 5497.489

5.6 4.0 19.9 20.5 6.4 8.3 4.0 5.0 20.6 15.4 25.2 3.3 9.1 13.4 17.7 3.2 20.6 22.1 12.1 5.3 5.3 4.3 3.3 4.7 5.8 12.7 78.1 34.5 59.7 39.0 17.3 7.3 3.0

123 105 126 138 108 136 169 175 178 136 133 127 121 142 162 111 180 123 121 130 103 118 216 142 163 87 244 124 101 76 124 164 264

11088.50 7840.00 39034.25 40334.50 12648.50 16340.50 7572.00 9279.25 37919.50 28369.50 46199.50 6142.50 16697.50 24562.50 32541.50 5821.50 25271.75 27064.75 14778.75 6478.75 6387.75 5093.75 3566.25 2593.50 3155.50 6874.50 41825.50 18367.50 31600.50 20580.50 9025.50 3644.50 1507.00

Area m

a

103472 60618 385553 355447 116703 164643 86841 104051 463330 243467 569947 41865 312928 373104 428969 92136 462822 711491 338469 71764 137098 109819 64983 51315 35774 155808 1035538 511070 1335842 717624 135182 103393 18927 58


10334.178

79.0

322

10313.00

349270

Tabell 17 - Tabell till Figur 41. Analyserat med MALDI: 120503, punkt: L13, kristallisationsmedel: DHB. Extraktionsmedel: Metanol, extraherat 12.04.20.

m/z

SN

Quality Fac.

Res.

Intens. [mAU]

598.419 1367.882 1866.702 1920.528 1961.633 2014.690 2036.299 2075.207 2987.393 3026.004 3061.124 3100.455 3121.178 3219.571 3258.168 3368.241 3409.504 4981.194 5002.288 5046.162 5078.707 5129.014 5172.220 10243.426 10290.224 10335.048

4.5 4.1 14.0 51.2 16.7 11.6 13.6 4.5 15.3 19.9 10.5 4.0 4.0 8.0 3.1 6.9 6.2 4.5 5.8 10.6 23.7 43.1 44.5 90.7 119.6 89.0

93 134 151 126 115 76 89 98 147 116 109 143 95 168 157 185 181 234 123 77 103 99 94 204 159 144

7701.50 4666.50 15211.00 55762.00 18121.00 12628.00 14841.00 4872.00 14242.00 18796.50 9949.50 3774.50 3725.50 7216.50 2741.50 5967.50 5370.50 2660.50 3415.50 6158.50 13684.50 24674.50 25220.50 17447.75 23024.75 17115.75

Area m

a

50243 45555 210029 708948 262486 311429 250870 82303 270250 518185 241761 40128 69176 128180 57125 124918 102631 34871 57573 124626 367868 828373 924526 626813 964938 676909

Tabell 68 - Tabell till Figur 36. Analyserat med MALDI: 120504, punkt: A3, kristallisationsmedel: DHB. Extraktionsmedel: HFIP, extraherat 12.04.24.

m/z

SN

Quality Fac.

Res.

Intens. [mAU]

592.134 1361.725 1440.775 1859.033 1913.801 1927.093 1942.280 2004.189 2030.911

5.3 4.8 4.9 12.3 25.4 23.3 25.7 8.3 8.3

83 121 196 178 112 114 139 170 163

20609.50 11697.00 11584.50 26976.00 55828.00 51140.00 56486.00 18318.00 18331.00

Area m

a

156620 132205 91749 319501 708701 585470 844505 229950 246864 59


2046.187 2060.321 2075.196 2906.370 2982.599 3041.282 3116.218 3174.592 4437.931 4662.295 5070.470 5084.054 5172.693 5216.186 5306.565 5698.043 5707.605 5833.103 9388.373 9525.254 9663.557 10349.621 10479.190 10611.879

3.9 3.4 3.6 3.3 32.6 32.5 4.2 4.0 3.1 4.8 23.2 29.3 25.2 7.7 6.8 28.5 29.3 5.6 5.1 13.2 4.4 4.7 11.0 9.1

101 100 133 180 195 194 142 151 214 145 211 172 161 126 141 138 147 124 273 286 222 294 317 372

8618.00 7381.00 7980.00 5691.25 56466.25 55197.25 7067.25 6622.25 4252.50 6250.50 25849.50 32624.50 27384.50 8273.50 7129.00 28542.25 29392.00 5559.50 1344.00 3345.50 1093.50 983.50 2260.50 1846.50

95778 90324 101185 106244 1049115 1042513 159693 122022 73531 203789 364251 988516 804356 132399 154200 511266 780993 117317 37432 108092 38173 29836 68714 51198

Tabell 79 - Tabell till Figur 39. Analyserat med MALDI: 120504, punkt: C3, kristallisationsmedel: DHB. Extraktionsmedel: HFIP, extraherat 12.04.24.

m/z

SN

Quality Fac.

Res.

Intens. [mAU]

618.225 1362.265 1859.952 1914.168 1926.941 2027.586 2046.876 2203.387 2907.516 2985.514 3042.712 3216.608 3874.663 4438.533 4652.170 5050.366 5089.588 5100.624

4.6 6.5 3.7 21.8 7.6 6.7 4.3 3.0 3.3 8.4 12.5 4.3 3.7 4.3 5.1 3.7 21.8 19.8

171 182 211 192 117 169 138 188 170 214 227 232 235 257 252 131 193 171

12599.00 10662.50 6356.75 38071.50 13347.50 11843.50 7583.50 5364.75 5700.00 14374.00 21163.00 6875.75 5401.50 6494.50 7285.75 4622.50 26806.50 24172.50

Area m

a

50477 87082 57410 392713 131814 152774 88102 71970 101592 230538 374760 99798 92137 132266 143273 166063 525278 312660 60


5178.322 5187.493 5253.624 5292.818 5697.256 5832.872 8933.165 9541.075 9678.084 10354.355

16.5 15.6 4.5 5.6 35.4 5.6 5.3 11.1 4.2 31.7

182 97 128 143 288 190 329 170 305 424

19746.50 18562.50 5335.50 6535.50 38552.25 6087.50 1048.50 1875.50 690.50 4209.75

372800 287279 108348 159240 938931 186602 20898 27397 18590 122429

Tabell 20 - Tabell till Figur 42. Analyserat med MALDI: 120504, punkt: E3, kristallisationsmedel: DHB. Extraktionsmedel: HFIP, extraherat 12.04.24.

m/z

SN

Quality Fac.

Res.

Intens. [mAU]

1416.093 1440.731 1584.591 1858.059 1902.195 1913.514 1926.310 1942.156 2003.320 2030.220 2045.355 2059.315 2074.322 2982.128 3015.291 3086.199 3098.425 3116.023 3146.749 3173.758 4917.523 4934.074 4949.753 4964.684 5040.793 5071.483 5160.325 5206.885 5239.724 5293.815 5711.139 6007.935

3.1 7.1 5.6 22.8 18.6 29.1 28.4 29.4 10.0 8.1 7.0 6.0 5.4 46.5 40.9 3.0 3.8 8.6 7.4 3.0 3.8 4.7 4.4 4.5 11.0 71.1 51.1 16.1 9.5 9.2 8.6 3.7

200 201 208 163 167 86 93 126 147 116 106 103 143 170 192 99 129 112 118 108 166 140 151 127 59 243 223 104 81 133 271 295

10026.50 23072.75 17708.00 68823.25 56190.25 87772.25 85705.25 88758.25 30252.25 24532.25 21253.25 18179.25 16312.75 105748.00 93025.00 6841.00 8601.00 19295.00 16478.00 6742.00 5231.00 6369.00 5936.00 6159.00 14990.00 96506.00 67975.00 21071.00 12453.00 11892.00 10447.00 4010.25

Area m

a

78911 175192 144631 906991 405370 1258649 1085394 1313607 412337 365564 255115 232115 223217 2041856 1676153 121442 95702 415330 368810 105246 70277 113522 76214 98404 577090 2296645 2138304 623799 380083 364723 261772 86748 61


8062.656 10351.111

3.0 7.0

256 297

1770.50 2193.25

44758 54569

10.7.3 Tabeller fr책n analys med MALDI-TOF av l책gmolekyl채ra proteiner med DHB och DHAP

Tabell 81 - Tabell till Figur 43. Analyserat med MALDI p책 silikonplatta: 120508, punkt: H18, kristallisationsmedel: DHB. Extraktionsmedel: HFIP, extraherat 12.04.24.

m/z

SN

Quality Fac.

Res.

Intens. [mAU]

1884.390 1939.172 1952.020 1966.772 2028.553 2056.017 2362.962 2928.728 3004.905 3062.544 3743.810 3803.646 3892.194 4453.789 4667.412 5088.481 5125.493 5145.677 5181.454 5313.834 5703.463 5752.081 5793.966 5801.183 5811.523 5835.556 9360.464 9466.441 9499.013 9607.055 9640.982 10315.400 10446.296 10577.028

6.1 17.1 19.1 17.7 3.9 4.4 3.2 3.8 24.0 22.9 5.9 8.2 3.7 3.6 4.3 11.0 4.0 4.3 12.0 5.6 50.1 12.2 4.3 4.4 4.7 6.8 5.7 3.9 16.9 3.1 6.5 6.8 15.3 10.5

169 127 111 142 152 135 202 189 197 189 222 218 145 188 160 136 151 243 161 219 159 136 386 303 128 166 277 331 239 893 309 364 397 442

9702.75 27134.75 30227.75 28077.75 6132.75 7033.75 4650.25 5290.50 33356.50 31342.50 7545.50 10272.50 4440.50 3993.00 4212.00 9184.50 3291.50 3541.50 9715.50 4499.00 39792.50 9537.50 3294.50 3434.50 3632.00 5280.50 1279.00 857.50 3706.50 658.50 1398.50 1328.50 2919.50 1979.50

Area m

a

118271 292908 358678 354797 68310 112189 46485 93680 612030 595149 134814 207385 107650 67480 96708 353485 47420 52096 212277 72607 1500681 157047 17155 29060 44080 117660 30510 19335 136604 10998 33310 41508 90292 46511

62


Tabell 92 - Tabell till Figur 44. Analyserat med MALDI p책 silikonplatta: 120508, punkt: L20, kristallisationsmedel: DHAP. Extraktionsmedel: HFIP, extraherat 12.04.24.

m/z

SN

Quality Fac.

Res.

Intens. [mAU]

969.686 981.858 983.960 985.910 1033.668 1034.723 1040.002 1046.928 1047.916 1050.011 1061.157 1073.379 1074.371 1075.379 1086.551 1096.805 1097.829 1098.806 1107.009 1108.005 1112.026 1113.023 1122.148 1123.177 1124.186 1125.190 1144.535 1145.543 1146.610 1156.003 1157.014 1160.808 1161.868 1162.865

4.2 3.4 3.5 5.0 3.4 4.1 4.8 5.6 3.0 4.3 4.2 13.1 8.3 3.3 3.2 18.7 12.7 4.3 7.1 4.5 5.4 3.9 31.3 20.5 7.5 3.5 6.3 4.4 4.0 8.6 6.5 5.6 4.1 3.1

4751 2311 2411 3224 2623 4464 3638 4198 2870 5426 2911 5481 4688 3010 2649 4997 5860 4981 4560 3390 5312 5439 5055 4995 4619 4241 4245 4249 3182 4473 4818 4560 2915 2228

1693.00 1363.00 1422.00 2034.00 1352.50 1654.50 1929.50 2215.50 1206.50 1691.50 1676.00 5165.50 3249.50 1283.50 1257.50 7311.50 4945.50 1669.50 2752.50 1755.50 2083.50 1531.50 12124.50 7943.50 2907.50 1348.50 2441.50 1690.50 1541.50 3296.50 2490.50 2148.50 1575.50 1171.50

Area m

a

471 486 493 536 463 503 703 493 393 449 447 1352 955 361 483 2033 1316 571 1008 572 566 448 3279 2277 930 455 763 531 538 987 767 624 690 454

Tabell 103 - Tabell till Figur 45. Analyserat med MALDI p책 silikonplatta: 120508, punkt: I18, kristallisationsmedel: DHB. Extraktionsmedel: HFIP, extraherat 12.04.24.

m/z

SN

Quality Fac.

Res.

Intens. [mAU]

985.089 986.085 1004.691 1060.795

5.0 4.1 3.9 3.4

3774 2936 4497 3175

6001.00 4883.00 4636.00 3994.00

Area m

a

1935 2032 1079 1549 63


1075.705 1093.788 1102.728 1117.849 1118.829 1132.682 1133.690 1146.751 1147.736 1173.756 1174.748 1193.039 1197.718 1249.900 1250.887 1273.939 1284.988 1285.969 1286.949 1311.823 1312.820 1313.823 1372.031 1373.020 1374.003 1374.959 1449.009 1449.992 1451.900 1452.893

4.2 3.3 3.2 7.7 4.3 7.6 5.8 5.7 3.5 7.0 4.5 3.2 3.5 5.6 4.2 3.6 9.7 7.6 3.0 6.6 7.1 3.4 32.4 26.2 11.8 4.3 3.7 3.2 5.3 4.3

3901 2982 3976 4199 3880 4024 4011 4204 2661 3957 3750 2913 3395 3857 4311 3073 3688 3877 3324 4121 3411 2726 3623 3658 3615 3183 2664 2629 3280 3795

4952.75 3926.50 3810.50 9056.50 5118.50 8931.00 6784.00 6674.50 4073.50 8248.50 5238.50 3748.50 4115.50 6446.00 4852.00 4203.00 11174.00 8726.00 3483.00 7616.00 8144.00 3958.00 36877.00 29822.00 13394.00 4938.00 4093.00 3618.00 5878.00 4814.00

1580 1459 1220 2999 1987 2950 2324 2280 1434 2791 1962 1924 1778 2536 1624 1599 4169 3418 1599 2767 3518 1933 15441 13114 6103 2453 2027 2099 2798 2410

Tabell 114 - Tabell till Figur 46. Analyserat med MALDI p책 silikonplatta: 120508, punkt: M19, kristallisationsmedel: DHAP. Extraktionsmedel: HFIP, extraherat 12.04.24.

m/z

SN

Quality Fac.

Res.

Intens. [mAU]

968.421 983.969 1039.943 1155.966 1156.942 1272.056 1273.061 1277.100 1365.849 1366.845 1444.533 1445.549

3.2 3.8 3.2 6.8 4.4 3.7 3.7 3.0 5.7 4.7 7.0 7.1

3840 2732 2809 3426 6142 3328 3309 3020 2911 3292 3195 3696

376.00 449.00 363.50 746.00 486.00 393.00 395.00 322.00 588.00 485.00 707.00 712.00

Area m

a

79 153 137 210 141 115 175 117 278 238 317 283 64


1560.913 1561.891 1564.692 1733.798 1734.735 1735.754 1850.366 1851.395 1927.853 1928.934 2024.501 2226.326 2314.677 2364.765 2605.523 2877.669 2895.713 2903.853 2942.689 3070.629 3301.634 3935.622

3.5 4.4 3.4 4.4 4.7 3.6 3.9 3.1 6.2 3.2 3.2 3.6 3.4 4.0 3.6 16.8 3.1 5.2 4.1 3.2 3.1 7.7

2927 2970 7347 4216 4566 3402 7369 3638 3374 3436 3666 5128 3807 4171 4462 2763 6074 5558 4859 10369 4865 4928

325.00 412.00 318.00 378.00 399.00 307.00 314.00 249.00 487.00 255.00 246.00 261.00 245.00 283.50 246.00 1109.00 204.00 341.00 269.00 209.50 195.00 455.00

193 194 121 136 201 136 116 140 191 187 139 129 168 154 161 952 116 242 246 51 137 341

Tabell 125 - Tabell till Figur 47. Analyserat med MALDI p책 silikonplatta: 120508, punkt: J18, kristallisationsmedel: DHB. Extraktionsmedel: HFIP, extraherat 12.04.24.

m/z

SN

Quality Fac.

Res.

Intens. [mAU]

982.996 983.990 984.981 985.981 986.958 987.962 1006.992 1007.979 1008.972 1039.970 1046.743 1107.732 1117.752 1118.739 1119.769 1132.603 1133.624 1190.937 1191.943 1192.932

5.9 12.3 21.0 16.8 7.7 3.2 5.1 6.5 3.5 3.1 3.4 3.2 14.5 8.5 3.5 5.1 4.0 4.5 9.3 10.5

4255 4393 4513 4463 3840 3296 3425 3622 2765 4064 2541 4582 3896 4294 2541 4446 3969 5236 4919 4718

4621.00 9577.00 16367.00 13046.00 5978.00 2452.00 3966.00 5082.00 2719.00 2431.50 2647.50 2512.50 11381.50 6656.50 2758.50 3995.50 3139.50 3541.00 7358.00 8286.00

Area m

a

1422 3272 5266 4554 2410 954 1580 2107 1348 730 1054 713 3755 2118 1188 1137 1158 1080 2314 2810 65


1193.919 1269.872 1270.887 1360.887 1371.911 1377.881 1378.890 1400.910 1426.889 1427.891 1428.906 1451.785 1452.791 1453.815

5.5 3.1 3.5 3.8 3.3 4.6 3.1 3.2 6.4 5.4 3.2 10.2 7.2 3.6

4742 4320 3064 4343 4502 4526 4526 5105 5011 4886 4189 4565 4221 3667

4342.00 2448.00 2783.00 3042.50 2659.00 3684.00 2521.00 2595.00 5115.00 4378.00 2602.00 8245.00 5802.00 2909.00

1533 1054 1251 1047 901 1269 811 1032 1703 1434 1072 2955 2310 1224

Tabell 136 - Tabell till Figur 48. Analyserat med MALDI p책 silikonplatta: 120508, punkt: N19, kristallisationsmedel: DHAP. Extraktionsmedel: HFIP, extraherat 12.04.24.

m/z

SN

Quality Fac.

Res.

Intens. [mAU]

969.573 970.553 979.729 980.719 981.777 985.794 986.802 1002.067 1008.156 1009.175 1018.326 1079.357 1080.384 1081.394 1082.400 1091.592 1096.698 1097.690 1106.946 1107.924 1111.901 1122.057 1123.067 1124.078 1144.422 1145.448 1146.521 1147.524

7.3 3.6 7.7 4.4 4.4 13.4 8.3 4.1 3.3 3.2 4.0 4.7 3.8 3.6 3.1 4.2 4.8 3.6 7.3 3.7 4.1 18.3 10.5 4.3 11.4 8.5 5.2 3.9

4501 2261 3932 2407 3027 3839 4079 2177 3063 3645 4242 2927 4869 2795 3101 5700 3611 4189 3475 2575 3293 4574 3944 3291 4062 4713 2458 2921

2661.00 1301.00 2826.00 1620.00 1604.00 4882.00 3017.00 1476.00 1209.50 1164.50 1446.00 1677.50 1349.50 1282.50 1098.50 1502.50 1707.50 1279.50 2600.50 1320.50 1434.50 6454.50 3717.50 1521.50 3987.50 2989.50 1813.50 1354.50

Area m

a

750 484 821 541 523 1527 959 507 343 419 478 597 421 516 336 402 518 436 1065 684 467 1955 1359 568 1387 896 793 486 66


1150.564 1160.689 1161.710 1183.035 1261.712 1262.702

3.1 7.1 6.3 3.7 3.6 3.5

3170 3565 2931 2809 2730 2731

1088.50 2474.50 2194.50 1273.50 1219.50 1198.50

301 979 817 402 509 566

67

Analys av reproduktionsproteiner från fjäril  

Kandidatexamensrapport med en analys av reprodutionsproteiner från fjärilshonor utförda med mass-spektrometri och kapillärelektrofores. Anal...

Read more
Read more
Similar to
Popular now
Just for you