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25ª REUNIÓN DEL GRUPO DE TRABAJO SOBRE ANÁLISIS Y TOXICIDAD DE LAS PROLAMINAS Fellbach-Stuttgart (Alemania), 29 Septiembre - 01 Octubre 2011 El grupo de trabajo sobre análisis y toxicidad de las prolaminas (WGPAT) se creó en 1985 con el objetivo de coordinar las investigaciones relacionadas con la detección de gluten en los alimentos y con las repercusiones de esta proteína en los pacientes celíacos. El grupo está formado por investigadores, empresas que elaboran alimentos sin gluten y laboratorios que desarrollan sistemas de detección de gluten en alimentos o de diagnóstico. Un año más, ACM ha estado presente para poder ofrecerte los últimos avances sobre estos temas. A continuación resumimos lo más destacado de esta vigésimo quinta reunión.

Estudios sobre la detección de gluten en alimentos La Dra. Renate van Eckert (Nueva Zelanda) presentó un experimento en el que se comparaba la capacidad de tres anticuerpos (Ac) para detectar la toxicidad del gluten en alimentos: el anticuerpo 401.21 (Skerrit & Hill, 1990), proporcionado por el laboratorio australiano Vital Diagnostics, el anticuerpo PN3 (Ellis et al, 1998), facilitado por el grupo del Prof. Paul Ciclitira de Londres, y el anticuerpo R5 (Sorell et al, 1988), proporcionado por el laboratorio español Operón. Para ello se utilizó una muestra de gluten estándar denominada gliadina PWG, que contiene una mezcla de gliadinas de 28 variedades de trigo. El experimento consistió en separar, mediante una técnica de electroforesis bidimensional, las distintas fracciones proteicas de gluten (gliadinas alfa,

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gamma y omega; y gluteninas de alto y bajo peso molecular) para averiguar después cuáles de ellas eran detectadas por cada anticuerpo. Para visualizar la distribución real de las distintas fracciones proteicas una vez separadas se utilizó una sustancia fluorescente (Cy3) unida a los péptidos del gluten, y para valorar la capacidad de cada anticuerpo para detectar esas mismas fracciones se marcó cada anticuerpo con otra sustancia fluorescente (Cy5). Comparando las zonas de fluorescencia Cy3 con las zonas de fluorescencia emitida por cada anticuerpo marcado con Cy5 se pudo comprobar qué fracciones eran reconocidas y cuáles no. Así, se puso de manifiesto que el Ac 401.21 detecta principalmente gluteninas de alto peso molecular, el Ac PN3 reconoce específicamente las gliadinas alfa, y el Ac R5 se une preferentemente a las gliadinas alfa y gamma. Por tanto, el nivel de toxicidad revelado por cada anticuerpo depende de cuál sea la fracción predominante en la muestra que se esté analizando, y ello explica las discrepancias observadas históricamente cuando se empleaba cualquiera de estos anticuerpos para detectar gluten en alimentos. Actualmente, el único anticuerpo aceptado internacionalmente para analizar la toxicidad del gluten en alimentos es el Ac R5. El Dr. Peter Köhler (Alemania) presentó otro estudio comparativo que está en desarrollo. En este caso, se trataba de evaluar la eficacia de dos variantes de la técnica ELISA basada en el Ac R5 para detectar gluten en alimentos: la de tipo sándwich y la de tipo competitivo. Los tests evaluados fueron proporcionados por el laboratorio R-Biopharm. En el estudio participaron 16 laboratorios y cada uno de ellos tuvo que analizar, por duplicado, 15 muestras de diferente procedencia: 8 contenían gluten intacto y 7 gluten parcialmente hidrolizado. Entre las muestras del primer grupo figuraba harina de maíz contaminada con trigo y pan elaborado con cantidades variables de almidón de trigo, y en el segundo grupo había cerveza de sorgo con prolaminas de cebada parcialmente degradadas y sirope de almidón. A la vista de los resultados preliminares, cabe destacar que con la técnica ELISA tipo sándwich, la dilución de la muestra influye en el resultado, que subestima el contenido de gluten hasta en un 50% cuando no se diluye antes de ser analizada. En el caso de la técnica ELISA tipo competitivo, el principal contratiempo ha sido que se observan grandes discrepancias entre las dos medidas realizadas con cada muestra. Se comprueba, en cualquier caso, que el tipo sándwich detecta mejor el gluten intacto, mientras que el tipo competitivo es el idóneo para detectar gluten parcialmente hidrolizado. Richard Fielder (Reino Unido) presentó un test de análisis de gluten en alimentos, AgraQUANT® Procedure, desarrollado por los Laboratorios Romer y que está basado en el anticuerpo G12 que, mediante la técnica ELISA, reconoce el fragmento proteico más tóxico del gluten de trigo, conocido como péptido 33-mer de la gliadina alfa 2. Este test ha sido calibrado con el estándar de referencia, la gliadina PWG, y tiene capacidad para detectar entre 4 y 200 partes por millón (ppm) de gluten. Actualmente se están realizando pruebas de validación en diversos laboratorios europeos. El test incluye un procedimiento de extracción de gluten de la muestra que dura 2 horas, a las que hay que sumar 1 hora más para la detección del gluten extraído. Se ha utilizado ya para evaluar la toxicidad de diferentes variedades de avena en colaboración con la Universidad de Sevilla y el CSIC, mostrando que, mientras que algunas variedades son tóxicas, otras podrían ser toleradas por los celíacos. La Dra. Päivi Kanerva (Finlandia) mostró los resultados del análisis de gluten realizado en muestras de avena y de trigo sarraceno utilizando el anticuerpo R5. De las 5 muestras de avena analizadas (semillas con cáscara, semillas con cáscara calentadas, harina, copos y salvado), sólo el salvado de avena superaba las 20 ppm de gluten, tal vez debido a que su contenido proteico total es elevado en comparación con las otras muestras. En cuanto al trigo sarraceno, ninguna de las muestras analizadas (semillas, semillas calentadas, harina, etc.) contenía más de 20 ppm de

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gluten, salvo las semillas calentadas, que contenía en torno a las 500 ppm de gluten. Por ahora no han encontrado explicación a este hallazgo, aunque sospechan que el elevado contenido en polifenoles en dicha muestra puede explicar este resultado anómalo. La Dra. Ilva Sjögren Bolin (Suecia) presentó un estudio encaminado a evaluar si la cantidad de gluten ingerida por personas que siguen correctamente la dieta sin gluten está por debajo de los límites aceptados como tolerables, inferiores a 100 mg totales de gluten al día según unos investigadores o inferiores a 50 mg diarios según otros. Para ello, seleccionó a tres personas no celíacas y reemplazó su dieta normal por una dieta equivalente sin gluten durante 4 semanas. Para comparar posibles diferencias entre sexos, seleccionó un varón y una mujer de hábitos sedentarios, y este varón fue comparado a su vez con otro físicamente activo, para detectar posibles diferencias según la demanda energética de cada uno. La cantidad de gluten presente en los alimentos de la dieta sin gluten implantada en cada caso se calculó con el anticuerpo R5; también se valoró el contenido en nutrientes como la fibra, el hierro o el ácido fólico, que suelen ser deficitarios en las dietas sin gluten. Los resultados mostraron que, en los 3 casos, la ingesta diaria total de gluten era aceptable y que únicamente el sujeto físicamente activo se acercaba al límite máximo permitido de 50 mg de gluten al día, debido probablemente al mayor consumo de productos ricos en hidratos de carbono. Se detectó, además, un déficit de hierro y ácido fólico en el caso de la mujer.

Estudios sobre aspectos clínicos El Prof. Paul Ciclitira (Reino Unido) dedicó su intervención a hablar del tratamiento de los pacientes afectados por enfermedad celíaca refractaria que llegan a su consulta. Esta complicación de la EC se diagnostica cuando los pacientes no mejoran, o bien recaen, a pesar de seguir la dieta sin gluten y cuando otras posibles causas de no mejoría han sido descartadas. Entre ellas destacan la enfermedad inflamatoria intestinal, el sobrecrecimiento bacteriano, la intolerancia a la lactosa y las infecciones intestinales, además del seguimiento incorrecto de la dieta sin gluten. La EC refractaria tipo 1 se trata con una combinación de prednisolona y azatioprina, y su pronóstico es favorable. La EC refractaria tipo 2, en cambio, tiene peor pronóstico y entre un 40% y un 58% de los pacientes fallecen en menos de 5 años. En general, el 75% de los afectados no sobrevive, independientemente de los tratamientos experimentales a los que son sometidos, y la principal causa de muerte en estos casos es el linfoma intestinal de células T. El Prof. Ciclitira recomienda tratar a los pacientes con EC refractaria tipo 2 con prednisolona y azatioprina ya que, según su experiencia, su pronóstico es bueno. En cualquier caso, atribuye estos resultados a que los pacientes referidos probablemente se encuentran en fases tempranas de la EC refractaria tipo 2. Como curiosidad, destaca que la proteína HLA-DQ8 es más frecuente en estos pacientes que en la población general o que en los celíacos no refractarios. En lo relativo a los nuevos criterios de diagnóstico de la EC elaborados por la Sociedad Europea de Gastroenterología, Hepatología y Nutrición Pediátrica (ESPGHAN), el Dr. Thomas Mothes (Alemania) comentó el problema que puede suponer diagnosticar la EC sin hacer biopsia cuando los valores de anticuerpos son elevados. Según los nuevos criterios, si dichos valores superan en 10 veces el límite máximo del rango de normalidad, existiendo síntomas y genética compatible con EC, la biopsia puede ser evitada. Sin embargo, la mayoría de los tests de anticuerpos no son capaces de detectar con precisión valores tan elevados. El Dr. Detlef Schuppan (Alemania) se centró en la capacidad que tienen los cereales con gluten para activar la respuesta inmunológica innata, incluso en pacientes que no cumplen los criterios de EC, ya que o no tienen genética de riesgo, o tienen valores negativos de anticuerpos en sangre

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o su biopsia no muestra atrofia de vellosidades, a pesar de lo cual sufren síntomas digestivos que mejoran al retirar el gluten de la dieta. Diversos estudios demuestran que el gluten puede no activar mecanismos inmunológicos específicos, pero sí innatos: proliferan células como los macrófagos y las células dendríticas, aumentan los niveles de mediadores inmunológicos como la interleuquina 15, aumenta la permeabilidad intestinal y se ponen en marcha fenómenos de citotoxicidad que destruyen las células epiteliales intestinales. Una molécula clave en estos procesos innatos es el receptor TLR4. Continuando con los mecanismos patogénicos de la EC, la Dra. Margaret Dunne (Irlanda) comentó la posible implicación de algunos tipos celulares de la inmunidad innata, como los linfocitos T tipo gamma-delta o las células MAIT (linfocitos T invariantes asociados a la mucosa intestinal). Mencionó, además, la ausencia de modificaciones en la mucosa intestinal en respuesta al consumo de avena. Y el Dr. Fernando Chirdo (Argentina) expuso el posible papel del receptor CXCR3 y su ligando CXCL10, ambos elevados en la mucosa intestinal durante la fase activa de la EC. Su expresión aumenta en condiciones de inflamación (en presencia de interferón gamma y del factor de necrosis tumoral alfa) y se ve potenciada por la presencia conjunta del péptido de gliadina p31-43 y de interleuquina 15 en los celíacos, pero no en sujetos sanos. Por último, en este apartado, la Dra. Astrid Kruizinger presentó un estudio sobre el riesgo que tienen los pacientes celíacos de sufrir alguna alteración como consecuencia de su exposición al gluten. Señaló que es importante realizar estudios clínicos para determinar el verdadero límite de tolerancia de los celíacos y realizar encuestas para detectar las causas de consumo de gluten, así como analizar la cantidad de gluten que contienen los productos etiquetados como “sin gluten”. Concluyó que las consecuencias negativas del consumo de gluten no se deben a la dieta sin gluten en sí misma, sino a otros factores, como son la contaminación cruzada o las comidas fuera de casa. En cualquier caso, estima que el riesgo de sufrir efectos adversos derivados de la exposición al gluten es inferior al 0.5%.

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El gluten en la industria alimentaria: nuevas terapias Las terapias alternativas abordadas por el grupo de trabajo están relacionadas con la reducción de la toxicidad del gluten en los alimentos que lo contienen o bien con la búsqueda de cereales con poca toxicidad para elaborar productos sin gluten. El Dr. Jussi Loponen (Finlandia) repasó la utilidad del gluten en la industria alimentaria: aporta viscoelasticidad a las masas, retiene agua durante la preparación de la masa, retiene gas durante la fermentación y proporciona el agua que captura el almidón durante la panificación. Diversos tratamientos pueden reducir la toxicidad del gluten, aunque con diferente efectividad. Se sabe que el empleo de especies bacterianas del género Lactobacillus acidifica las masas favoreciendo la despolimerización y proteólisis de las gluteninas de alto peso molecular, además de activar las propias enzimas proteolíticas del cereal. Por otro lado, está demostrado que en la masa fermentada de centeno se reduce la toxicidad en un 20%, y esta reducción alcanza el 90% si el centeno es malteado. Aún así, el nivel de gluten residual sigue siendo elevado, siendo necesario el empleo de tratamientos enzimáticos adicionales que logren rebajar el nivel de gluten por debajo de las 20 ppm. Entre las enzimas propuestas para este fin se encuentra el extracto crudo de papaya, la enzima POP de la bacteria Flavobacterium meningosepticum, la enzima PEP del hongo Aspergillus niger o bien combinaciones de varias enzimas, como EP-B2 (PEP + enzima de cebada) o la enzima glutenasa (POP + EP-B2). El uso de la enzima transglutaminasa tisular, que favorece la solubilidad y emulsificación en las masas, no se aconseja porque incrementa la toxicidad de los péptidos del gluten, a pesar de que los tests de análisis de gluten disponibles no son capaces de detectarlos. También se empiezan a considerar las enzimas de los propios cereales con gluten en germinación. Según la Dra. Theresa Schwalb, el empleo de estos cereales como materia prima puede ser útil siempre que se controlen las condiciones de germinación, ya que la actividad de estas enzimas se ve afectada por el pH, la temperatura, el periodo de incubación y el tiempo de almacenamiento. En cualquier caso, se debe verificar que el contenido en gluten se ha reducido hasta límites aceptables. La técnica de cromatografía líquida de alta presión (HPLC, high pressure liquid chromatography) permite cuantificar el gluten antes y después de la germinación. Por su parte, el Dr. Luud Gilissen (Holanda) está seleccionando, de entre cientos de variedades de trigo, aquellas que tienen menor toxicidad, para después evaluar sus propiedades panificables y los posibles efectos adversos en los potenciales consumidores. Además, está probando, junto con la industria panadera, 15 variedades de avena para elaborar pan sin gluten, ya que la demanda de productos basados en avena está aumentando y según diversos estudios la mayoría de los celíacos la toleran. Finalmente, la Dra. Elke Arendt (Irlanda) habló acerca de sus investigaciones sobre la utilidad de cereales sin gluten, como el arroz y el maíz, y de pseudocereales, como el trigo sarraceno, la quinoa y el sorgo, como materia prima para elaborar productos de panadería sin gluten. La evaluación del contenido nutricional y calidad sensorial de estos productos es, sin embargo, poco alentadora, por lo que se hace necesario adoptar estrategias que mejoren su calidad. Entre ellas figura el empleo de hidrocoloides, como la goma guar, que retienen más agua, favorecen que el pan adquiera mayor volumen y permiten que se mantenga en buen estado durante más tiempo. También se utilizan actividades enzimáticas existentes en bacterias lácticas o incluso hongos que degradan el componente proteico aportando mayor volumen, reduciendo la dureza y mejorando la textura, la calidad nutricional y la vida media de los panes.

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Aspectos legales Hertha Deutsch (Austria) recordó que a partir del 1 de enero de 2012 debe estar implantando el Reglamento Europeo (CE) 41/2009 sobre el etiquetado de productos aptos para personas con intolerancia al gluten, según el cual todo producto que sea etiquetado como “sin gluten” no debe contener más de 20 mg de gluten por kg de producto (20 ppm), entre otras consideraciones. Por otro lado, comentó que la espiga barrada, símbolo aceptado internacionalmente como distintivo de “sin gluten”, puede ser registrado a través de un organismo de acreditación unificado europeo. De este modo, una empresa que elabora productos sin gluten en un país de la Unión Europea (UE) puede comercializarlo en cualquier otro país de la UE utilizando el símbolo sin necesidad de registrarlo en cada país de exportación.

Juan Ignacio Serrano Vela Investigación y Formación

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