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VIII ENCONTRO DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

2008

Universidade de Fortaleza

Volume 1 Número 1

20 a 22 de Outubro de 2008

ISSN 1808-8449

Utilização de Óleos Vegetais na Produção de Biosurfactantes por Cepas de Pseudomonas aeruginosa e Burkholderia gladioli. Karla Maria Catter(1), Danielle Ferreira de Oliveira(2), Regine Helena Silva dos Fernandes Vieira(3), Maria Izabel Florindo Guedes(4) Carlucio Roberto Alves(5). E-mail do autor: kmcatter@yahoo.com.br Palavras-chave: Óleos Vegetais, Biosurfactante, Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia gladioli

Resumo Biosurfactante são polímeros que formam micelas que se acumulam na interface entre líquidos de diferentes polaridades, possui estrutura molecular com grupos hidrofílicos e hidrofóbicos que exibem propriedades como adsorção, detergência (GOUVEIA, 2003) e atuam como dispersante e/ou solubilizante de compostos orgânicos (LIMA, 1998). Podem ser empregados na indústria de petróleo, têxtil (FIECHTER, 1992), de cosméticos, indústria farmacêutica, de óleos minerais (BOGNOLO, 1999), de alimentos (DESAI e BANAT, 1997) e na biorremediação de locais contaminados com metais pesados tóxicos como urânio, cádmio e chumbo (SAMPAIO NETA, 2007). Dentre as vantagens da utilização do biosurfactante em relação ao surfactante sintético podemos citar melhor adaptação a variação de pH, mudança de temperatura e salinidade, força iônica, menor toxicidade e biodegradabilidade por se tratar de produto biológico, utilização de resíduos agroindustriais que seriam descartados para barateamento de produção do biosurfactante e descontaminação de mananciais, além de poder ser produzido in situ (VICTORINO, 2006). Para avaliar a produção de biosurfactante foram realizados teste colapso da gota, tensão superficial e pH para as cepas de Pseudomonas aeruginosa e Burkholderia gladioli durante as 72h de experimento. As cepas foram introduzidas em meio de sais minerais (MM) com 2% e 5% de óleo de fritura para adaptação do microrganismo ao substrato utilizado. Obtivemos ótimos resultados para as duas cepas, demonstrando ser possível a utilização de óleos vegetais para produção de biosurfactante. Não só para baratear o processo de produção, como também dar um destino aos óleos usados.

Introdução Surfactante possui estrutura molecular com grupos hidrofílicos e hidrofóbicos que exibem propriedades como adsorção, formação de micelas, detergência (GOUVEIA, 2003) e atuam como dispersante e/ou solubilizante de compostos orgânicos (LIMA, 1998). Os compostos de origem microbiana que exibem propriedades surfactantes diminuem a tensão superficial e possuem alta capacidade emulsificante, são denominados biosurfactantes ou tensoativos e consistem em subprodutos metabólicos de bactérias, fungos e leveduras (SILVA, 2006). A produção de surfactante a partir de microrganismos vivos possibilita vantagens em relação aos surfactantes sintéticos, estando envolvidos em vários ramos da indústria e do comércio. Na indústria farmacêutica o surfactante pode ser utilizado para melhorar a função pulmonar (BOGNOLO, 1999), na de cosméticos podem em formulações de produtos devido a sua compatibilidade com a pele (LANG, 2002), na de alimentos tem um papel importante na formação da consistência e textura, bem como na dispersão de fase e na solubilização de aromas (DESAI e BANAT, 1997), na petroquímica na produção de petróleo ou incorporados em formulações de óleos lubrificantes (BANAT, 1991) e na biorremediação de locais contaminados com metais pesados tóxicos como urânio, cádmio e chumbo (SAMPAIO NETA, 2007). Comparados aos surfactantes não biogênicos, os biosurfactantes têm maior tolerâncias à variação de pH, temperatura e salinidade, são mais seletivos, menos tóxicos, biodegradáveis, existindo ainda a possibilidade de serem produzidos in situ pelos microrganismos, que utilizaria os contaminantes orgânicos como substrato para crescimento (MULLIGAN, 2001). A Biorremediação é um processo no qual organismo vivo, normalmente plantas ou microrganismos, são utilizados tecnologicamente para remover ou reduzir (remediar) poluente no ambiente (GAYLARDE, 2005; AUSTRY e ELLIS, 1992). Métodos de biorremediação têm recebido publicidade ISSN 1808-8449

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favorável como tecnologia promissora no tratamento de impactos de hidrocarbonetos no meio ambiente (VAN LOOSCHECHT, 1990; RAHMAN, 2002). Do ponto de vista do desenvolvimento sustentável, é importante que as substâncias liberadas no ambiente sejam biodegradáveis, a fim de limitar potenciais danos e acúmulo de substâncias recalcitrante, bem como preservando e protegendo a riqueza e diversidade das espécies (HEALY, 1996). Dentre os materiais que representam riscos de poluição ambiental e, por isso, merecem atenção especial, figuram os óleos vegetais usados em processos de fritura por imersão (COSTA NETO e ROSSI,1999). O óleo de cozinha despejado no esgoto polui cerca de um milhão de litros d’água, é também apontado por contribuir na ocorrência de enchentes, devido causarem a impermeabilização dos leitos e terrenos próximos de mananciais, além danificar a tubulação de esgoto da casa e encarecer em até 45% o tratamento da água. O desenvolvimento de processos mais baratos e o uso de matérias-primas de baixo custo (manipueira, soro de leite, melaço, óleo lubrificante usado, entre outros) (NITSCHKE e PASTORE, 2003) é que irão determinar a viabilidade da produção em larga escala, uma vez que o gasto com substrato representa entre 10 % a 30% do custo total. O Objetivo deste trabalho é produzir biosurfactante utilizando como substrato óleos vegetais usados em frituras por imersão. Dessa forma, proporcionando um destino a essas substâncias, contribuindo para redução da poluição e barateamento do processo de produção do biosurfactante.

Metodologia Os microrganismos As bactérias utilizadas foram cedidas pelo Laboratório de Microbiologia do pescado e ambiental do Instituto de Ciências do Mar (Labomar) da Universidade Federal do Ceará. As linhagens foram isoladas de sedimento do Mangue do Rio Cocó região de Sabiaguaba- CE e identificadas através de “kits” 20E e 20NE do sistema API da BioMérieux e provas bioquímicas complementares. Para caracterização morfológica das cepas isoladas foi utilizado o método de coloração de Gram em lâminas observadas em microscópio óptico. As cepas utilizadas foram Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) e Burkholderia gladioli (B. gladioli), nas quais eram mantidas em estufa B.O.D. a 23ºC em Ágar Triptona Soja – TSA (Merck). Pré – inóculo As cepas de P. aeruginosa e B. gladioli foram cultivadas em Caldo Infusão de Cérebro e Coração – BHI (Merck) sendo distribuídos 50 ml para “Erlenmeyers” de 125 ml de capacidade, incubados “overnight” sob agitação em orbital a 150 rpm a 35º C (Tecnal TE- 420) resultando em uma cultura com 10 6 UFC/ ml que foi utilizada como pré – inóculo. Fase de Adaptação Em “Erlenmeyers” de 125 mL contendo 50 mL de BHI foram adicionados (1%) do pré – inóculo e (5%) do óleo de fritura. Deixados para crescer por 24 h, em “shaker 150 rpm a 35 ºC. Transcorrido o período de incubação, os microrganismos foram repicados em Ágar TSA e incubados em estufa bacteriológica por 24h a 37 ºC. Em seguida, foi preparado um inóculo de 108 UFC / mL equivalente ao tubo 0,5 da Escala de McFarland (NCCLS, 2000). Produção do Biosurfactante A produção do biosurfactante foi feito em “Erlenmeyers” de 250 mL, contendo 1% do inóculo em 100 mL do meio de sais minerais (MM): K2HPO4 0,5 g; KH2PO4 0,5 g; MgSO4. 7H2O 0,2 g; CaCl2. 2H2O 0,1 0,002 g; NH4.NO3 0,5 g em 1.000mL de água destilada (VOLPON, 1992), g; NaCl 0,1g; FeCl3. 6H2O suplementado com 2% de glicose e o pH ajustado para 7,0 ± 0,2. Foi acrescido a este meio óleo de fritura (óleo de soja da marca Soya proveniente de fritura de salgado de estabelecimento comercial) nas concentrações de 2% e 5%, em duplicata. As amostras foram incubadas em “shaker” a 150 rpm por 72 h à 35ºC. A cada 24 horas as culturas foram retiradas e os seguintes testes foram realizados: Teste do Colapso da Gota, Índice de Emulsificação, Tensão superficial e medição de pH. Como controle negativo foi utilizado meio de cultura (MM) sem inóculo tratado nas mesmas condições.

Teste qualitativo do colapso da gota


O potencial das cepas em utilizar óleos vegetais como fonte de carbono e produzirem biosurfactantes foram analisados através do teste qualitativo do colapso da gota (BODOUR; MILLER– MAIER, 1998). Os experimentos foram realizados em Erlenmeyers de 125 mL contendo meio de sais minerais e óleo de fritura (2% e 5%) e 1% do inóculo com turbidez equivalente ao tubo 0,5 da Escala de McFarland. Os Erlenmeyers foram colocados em shaker 150 rpm à 35ºC até 72 horas de ensaio. Tensão Superficial A tensão superficial foi determinada no líquido metabólico livre de células, utilizando a método Du Noüy através do emprego do tensiômetro KRÜSS K6 com anel de platina (CHA, 2008; DOPIERALA e PROCHASKA; 2008). O teste consiste em medir a tensão sofrida pelo anel, que fica na extremidade de uma haste flexível, ele é colocado sobre a superfície da amostra e pressionado contra esta até que ele sofra repulsão. Como comparativo de redução da tensão foi utilizada como controle, meio de sais minerais acrescido de óleo de fritura (2% e 5%) mais inóculo, sendo as células retiradas imediatamente através de centrifugação (12.000 rpm por 10 min à 10ºC). O tensiômetro foi calibrado com água destilada encontrando valores iguais para suas medidas entre 70 a 72 mN/m. A tensão superficial do branco, isto é, meio de sais minerais sem inóculo foi 68,5 ± 0,6 em média.

Medição do pH O pH do líquido metabólico livre de células das cepas em estudo foi medido com 24h, 48h e 72h através do pHmetro Hanna pH 211. Como medida de pH para o meio de sais minerais (MM) foram encontrados valores 7,0 ± 0,2.

Resultados e Discussão Teste qualitativo do colapso da gota A cada 24h do experimento foi avaliada o diâmetro da gota até completados as 72 h do experimento e encontrado os seguintes valores para as cepas testadas. Constatamos que as cepas de P. aeruginosa 2%, B. gladioli 5% 24 h com células e P. aeruginosa 2% e 5% 72 h após centrifugação não houve mudança no diâmetro da gota. Indicativo de que não produziram biosurfactante suficiente para romper a gota. Para as demais cepas é visível que todas as concentrações do óleo testadas sofreram o colapso da gota, resultando no total rompimento da tensão sofrida pelo óleo e ocasionando o aumento do diâmetro da gota. Podemos concluir com isso que houve redução da tensão superficial, uma vez que, houve o colapso da gota. O método do colapso da gota é um método convenientemente rápido para separar microrganismos produtores de surfactantes, está baseado na capacidade do surfactante em desestabilizar a gotícula do líquido em uma superfície oleosa e está relacionado também com a tensão de espalhamento (JAIN, 1991). Tabela 1 – Colapso da gota transcorridos 72 h do experimento com e sem células COLAPSO DA GOTA COM 72 HORAS DO EXPERIMENTO Amostras

Com células

Sem células

24h

48h

72h

24h

48h

72h

Água deionizada

-

-

-

-

-

-

P. aeruginosa– 2%

-

+

+

+

+

-

P. aeruginosa – 5%

+

+

+

+

+

+

B. gladioli – 2%

+

+

+

+

+

+

B. gladioli – 5%

-

+

+

+

+

+


Legenda: (-) a bolha formada manteve-se igual ao controle negativo - água deionizada; (+) a bolha formada sofreu aumento no diâmetro, quando comparada com o controle. O teste foi realizado com células e com meio livre de células (sem células). Tensão superficial As leituras foram feitas nos tempos de 24 h, 48 h e 72 h para as cepas de P. aeruginosa 2% e 5% e B. gladioli 2% e 5%. Para que o surfactante produzido seja considerado de boa qualidade ele deve reduzir nas primeiras 24 h até 50% da sua tensão ou em 72 h 40% em todas as cepas constatamos diminuição da tensão superficial variando em torno de 21,3% para o menor valor e 58,9% para o maior valor. Passadas 24 h do início do experimento a cepa que apresentou melhor resultado foi Pseudomonas aeruginosa 2% chegando a reduzir em até 55,01% a tensão superficial total (branco), mesmo não podendo avaliá-la durante todo o processo, devido à quebra de tubo de Falcon no tempo de 48 h, podemos observar no tempo de 72 h que esta cepa continuou a produzir surfactante chegando a reduzir 58,9% da tensão do meio. A Diminuição da tensão superficial é um dado importante, pois nos permite avaliar com precisão a produção de biosurfactante. Quadro 1- gráfico de redução da tensão superficial.

Tensão Superficial (%)

120 100 80 P. aeruginosa– 2%

60

P. aeruginosa – 5% 40

B. gladioli – 2%

20

B. gladioli – 5%

0 0

24

48

72

Tempo (horas)

Medição do pH Os valores de pH decresceram nas 24 h iniciais de experimento e mantiveram-se na faixa de pH entre 3,0 e 4,0 até o final do experimento. Esses mesmos resultados foram constatados nas pesquisas de CARVALHO et al (2008). Os valores de pH entre 6,0 e 8,0 são mais favoráveis a ação desses microrganismos, porém a queda dos valores de pH provavelmente ocorra em conseqüência da produção de intermediários ácidos que se formam durante o processo (LEAHY e COLWELL, 1999). Temos então, um


comparativo de redução do pH inicial do meio MM, antes e após inoculação do microrganismo em tempos diferentes. Como mostrado no Quadro 2. Quadro 2 – Medição do pH do líquido metabólico das cepas bacterianas.

Gráfico 1 – Medição do pH do líquido metabólico das cepas  bacterianas  8 pH

6 Pseudomonas – 2%

4

Pseudomonas – 5%

2

Burkholderia  – 2%

0 to

t24

t48

t72

Burkholderia  – 5%

Tempo em horas

Para todas as cepas obtivemos bons resultados na produção de surfactante biológico. Podemos então concluir que a produção de surfactante está relacionada à diminuição da tensão superficial, conseqüentemente, a mudança da conformação da gota, redução do pH. A cepa Pseudomonas aeruginosa apresentou excelentes resultados na concentração de 2% do óleo de fritura, enquanto que a Burkholderia gladioli apresentou excelentes resultados na concentração de 5% do óleo de fritura. Demonstrando assim que as cepas se adaptaram bem ao substrato utilizado.

Conclusão A utilização dos óleos vegetais como substrato para crescimento de microrganismo e produção de biosurfactante mostrou-se eficazes. É possível reutilizar óleo de fritura na produção de biosurfactante, evitando assim o descarte deste material em pia que possivelmente iria poluir mananciais, impermeabilizar o solo e obstruir as tubulações de esgoto, como também é de extrema importância para a indústria no barateamento da produção. Essa é uma pesquisa bastante promissora, pois busca conhecer o comportamento do microrganismo na natureza e posterior aplicação, esse mesmo caminho é hoje seguido por vários pesquisadores. Futuramente planejamos identificar e isolar o surfactante produzido por essas cepas e testá-lo puro.

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manipuera

in

natura

Resposta

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Agradecimentos A Fundação Cearense de Apoio a Pesquisa (FUNCAP) pelo apoio financeiro.


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