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Ponto inferior – anticorpos de coelho para IgM humano.

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HAV IgM

Código: 60457002 Versão: 457/P5

A Placa Reveladora tem 6 fileiras (A-F) de 12 cavidades, cada fileira contendo reagentes prontos para uso em diferentes etapas do ensaio. O teste é realizado por etapas, movendo-se o Pente de fileira a fileira com incubação em cada etapa. Antes de iniciar o teste, amostras de soro ou plasma são prédiluídas a 1:50 e adicionadas ao diluente nas cavidades da fileira A da Placa Reveladora. O Pente é então inserido nas cavidades da fileira A. O IgM humano será capturado pelos anticorpos antiIgM nos pontos inferiores dos dentes do Pente (Figura 1). Os componentes não ligados são removidos por lavagem na fileira B. Na fileira C, os anticorpos anti-HAV IgM capturados nos dentes reagirão com antígenos HAV. Simultaneamente, os antígenos HAV também se ligarão aos anticorpos anti-HAV no ponto superior (Controle Interno). Na fileira D, os antígenos HAV ligados reagirão com os anticorpos monoclonais anti-HAV marcados com fosfatase alcalina (FA). Na fileira E, os componentes não ligados são removidos por lavagem. Na fileira F, a fosfatase alcalina ligada irá reagir com componentes cromogênicos. Os resultados são visíveis como pontos cinza azulados na superfície dos dentes do Pente.

Formato: 3 x 12 testes

O kit ImmunoComb® II HAV IgM é um teste para a determinação qualitativa de anticorpos IgM para o vírus de hepatite A (HAV) em soro ou plasma humano. Podem ser realizados trinta e seis testes om um kit.

Introdução A hepatite A é uma doença freqüente em humanos, causada pelo vírus da hepatite A (HAV). Após um período de incubação de 1440 dias, a infecção por HAV geralmente se manifesta por icterícia, devido à inflamação aguda do fígado e concentrações elevadas de bilirrubina no sangue. Não foram reportados casos de infecção crônica. A hepatite A é endêmica em todas as partes do mundo. Sua epidemiologia é acentuadamente influenciada pelo nível local de saneamento e higiene. A transmissão ocorre por via fecal-oral. Um alto nível de vírus (até 108 unidades infecciosas por grama) é excretado nas fezes alguns dias antes da manifestação dos sintomas clínicos ou icterícia. A disseminação do vírus é, então, facilitada através do contato direto ou através do consumo de água ou alimentos contaminados. A profilaxia bem sucedida da hepatite A é atualmente obtida por imunização passiva com imunoglobulinas anti-HAV humanas. Além disso, foram recentemente desenvolvidas vacinas para HAV. Diversas causas de origem viral (ex. vírus da hepatite B e hepatite C) ou não virals podem induzir a hepatite. Conseqüentemente, o diagnóstico da infecção por HAV baseado apenas nos sintomas clínicos e na avaliação bioquímica das funções hepáticas, é muito difícil. Entretanto, o imunodiagnóstico permite a identificação do agente etiológico. Anticorpos IgM para HAV são produzidos no estágio inicial da infecção por HAV e persistem durante a fase aguda da doença. A detecção do anti-HAV IgM usando o kit ImmunoComb® II HAV IgM permite um diagnóstico confiável de infecção aguda de HAV.

Princípio do Teste

O teste ImmunoComb® II HAV IgM é um ensaio imunoenzimático (EIA) em fase sólida, baseado no princípio de imunocaptura. A fase sólida é um pente com doze projeções (“dentes”). Cada dente é sensibilizado em duas posições: Ponto superior – anticorpo monoclonal para o vírus da hepatite A (Controle Interno). 457/P5

Figura 1. Princípio do Teste O kit inclui um Controle Positivo (anti-HAV IgM) e um Controle Negativo, para serem incluídos em cada ensaio. Ao término do teste, o dente usado com o Controle Positivo deve mostrar 2 pontos cinza-azulados. O dente usado com o Controle Negativo deve mostrar o ponto superior e/ ou nenhum ponto inferior ou um ponto bem claro. O ponto superior deve também aparecer em todos os outros dentes, para confirmar se o kit está funcionando adequadamente e se o teste foi realizado corretamente.

Conteúdo do Kit Pentes O kit contém 3 Pentes de plástico. Cada Pente tem 12 dentes, um dente para cada teste (Figura 2). Cada dente está sensibilizado com duas áreas reativas: Ponto superior – anticorpo monoclonal para o vírus da hepatite A (Controle Interno). Ponto inferior – anticorpos de coelho para o IgM humano.

Figura 2. Pente Os pentes são fornecidos em embalagens de alumínio, contendo dessecante. Placas Reveladoras O kit contém 3 Placas Reveladoras, cobertas por folhas de alumínio.

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Cada Placa Reveladora (Figura 3) contém todos os reagentes necessários para o teste. A Placa Reveladora consiste de 6 fileiras (A-F) de 12 cavidades cada.

Preparando o Teste Trazer todos os componentes, pentes, reagentes e amostras à temperatura ambiente e realizar o teste a 370C.

O conteúdo de cada fileira é:

Preparando a Placa Reveladora 1. Incubar a Placa Reveladora em uma incubadora a 370C por 45 minutos. 2. Cobrir a bancada de trabalho com papel absorvente para ser descartado como resíduo bioinfectante ao final do teste. 3. Misturar os reagentes agitando a Placa Reveladora. Nota: Não remover a folha de alumínio da Placa Reveladora. Furar a cobertura de alumínio usando a ponteira descartável da pipeta ou o perfurador, somente quando for indicado, nas instruções do teste.

Fileira A Fileira B Fileira C Fileira D Fileira E Fileira F

Diluente de amostra Solução de lavagem Antígeno HAV Anticorpo monoclonal anti-HAV marcado com fosfatase alcalina Solução de lavagem Solução substrato cromogênico contendo 5-bromo4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP) e azul de nitrotetrazolium (NBT)

Figura 3. Placa Reveladora Controle Positivo – 1 frasco (tampa vermelha) de 0,2 ml de plasma humano inativado pelo calor, contendo anticorpos IgM para HAV. Controle Negativo – 1 frasco (tampa verde) de 0,2 ml de plasma humano, inativado pelo calor, negativo para anticorpos para HAV. Diluente da amostra – 1 frasco (tampa branca) de 20 ml de diluente. Perfurador – para a perfuração da folha de alumínio que cobre as cavidades da Placa Reveladora.

Preparando o Pente Precaução: Para assegurar o funcionamento correto do teste, não tocar nos dentes do pente. 1. Rasgar o saco de alumínio do Pente na extremidade marcada. Remover o Pente. 2. O Pente e a Placa Reveladora podem ser utilizados total ou parcialmente. Para usar parte de um Pente: a. Determinar quantos dentes são necessários para testar as amostras e controles. Você precisa de um dente para cada teste. Cada dente mostra o número “57” do código do kit, para permitir a identificação dos dentes destacados. b. Dobrar e quebrar o Pente verticalmente ou cortar com a tesoura (veja Figura 4) para destacar o número necessário de dentes (nº de testes incluindo 2 controles). c. Retornar a parte não utilizada do Pente para a embalagem de alumínio (com o dessecante). Fechar bem a embalagem, por exemplo, com um clips, para manter seco. Armazenar o Pente na caixa original do kit de 2 – 8ºC para uso posterior.

Segurança e Precauções • •

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Este kit é somente para uso diagnóstico in vitro. Todos os materiais de origem humana usados na preparação do kit foram testados e considerados não reativos para antígeno de superfície da hepatite B, anticorpos para o vírus da hepatite C e anticorpos para HIV. Como nenhum teste pode garantir completamente a ausência de contaminação viral, todas as soluções de referência e amostras humanas devem ser manipuladas como potencialmente infectantes. Usar luvas cirúrgicas e avental. Seguir os procedimentos aceitos para laboratório para trabalhar com soro ou plasma. Não pipetar com a boca. Descartar todas as amostras, Pentes, Placas Reveladoras e outros materiais utilizados com o kit como resíduo bioinfectante. Não misturar reagentes de lotes diferentes. Não usar o kit após o vencimento.

Armazemamento do Kit

Armazenar o kit em sua embalagem original de 2 - 80C. Nestas condições, o kit permanecerá estável até a data de validade do rótulo. Não congelar o kit.

Manipulação de Amostras Tanto o soro como plasma podem ser testados. As amostras podem ser armazenadas por 7 dias de 2 - 8 ºC antes do teste. Para armazenar por mais de 7 dias, congelar as amostras a –20 ºC ou inferior. Centrifugar as amostras de soro após descongelamento. Testar o sobrenadante. Evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento.

Procedimento do Teste Material Necessário • Pipetas de precisão e ponteiras descartáveis para dispensar 10 µL, 25 µL e 490 µL. • Tesoura. • Cronômetro ou relógio de laboratório. • Microtubos

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Figura 4. Quebrando o Pente Instruções do Teste Pré-diluição de Amostras e Controles 1. Para cada amostra e controle, dispensar 490 µL do diluente de amostra em um microtubo. 2. Para cada microtubo, adicionar 10 µL de uma amostra ou do Controle Positivo ou Controle Negativo fornecidos com o kit. Misturar enchendo e esvaziando a solução diversas vezes. Captura de Anticorpos (Fileira A da Placa Reveladora) Nota: Realizar a incubação a 37ºC. Os passos de lavagem devem ser realizados a temperatura ambiente (22 – 26ºC). 3. Pipetar 25 µL de uma amostra pré-diluída. Perfurar a cobertura de alumínio de uma cavidade da fileira A da Placa Reveladora com a ponteira da pipeta ou com o perfurador e dispensar a amostra no fundo da cavidade. Misturar enchendo e esvaziando a solução repetidamente. Descartar a ponteira da pipeta. 4. Repetir o passo 3 para as outras amostras pré-diluídas, e os dois controles pré-diluídos. Usar uma nova cavidade da fileira A e trocar a ponteira para cada amostra ou controle. 5. a) Inserir o Pente (o lado impresso de frente para você) nas cavidades da fileira A contendo as amostras e controles. Misturar: Retirar e inserir o Pente das cavidades várias vezes. b) Deixar o Pente na fileira A e incubar por 2 horas a 37ºC. Ajustar o cronômetro. Próximo ao final das 2 horas, perfurar a cobertura da fileira B usando o perfurador. Não abrir mais cavidades que o necessário. c) Ao final das 2 horas, retirar o Pente da fileira A. Absorver o líquido residual nas pontas dos dentes, em papel absorvente limpo. Não tocar a superfície frontal dos dentes. Primeira lavagem (Fileira B) 6. Inserir o Pente nas cavidades da fileira B. Agitar: Retirar e inserir vigorosamente o Pente nas cavidades pelo menos 10 segundos para obter uma lavagem apropriada. Repetir a 2


agitação várias vezes no período de 2 minutos; neste intervalo perfurar as coberturas da fileira C. Após 2 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual, como no passo 5c. Reação antígeno-anticorpo (Fileira C) 7. Inserir o Pente nas cavidades da fileira C. Agitar como no passo 5a. Incubar a Placa Reveladora com o Pente por 30 minutos (ajustar o cronômetro) a 37ºC. Perfurar as coberturas da fileira D. Após 30 minutos, retirar o Pente a absorver o líquido residual. Ligação do Conjugado (Fileira D) 8. Inserir o Pente nas cavidades da fileira D. Agitar. Incubar a Placa Reveladora com o Pente por 20 minutos (ajustar o cronômetro) a 37ºC. Perfurar as coberturas da fileira E. Após 20 minutos, retirar o Pente a absorver o líquido residual. Segunda Lavagem (Fileira E) 9. Inserir o Pente nas cavidades da fileira E. Agitar repetidamente durante 2 minutos, como no passo 6. Perfurar as coberturas da fileira F. Após 2 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual. Reação de Cor (Fileira F) 10. Inserirr o Pente nas cavidades da fileira F. Agitar. Incubar a Placa Reveladora com o Pente por exatamente 10 minutos (ajustar o cronômetro) a 37ºC. Após 10 minutos retirar o Pente. Reação de Parada (Fileira E) 11. Inserir o Pente novamente na fileira E. Após 1 minuto retirar o Pente e deixar secar ao ar livre. Descarte do lixo Descartar as Placas Reveladoras, ponteiras de pipetas, diluente de amostra, microtubos, papel absorvente e luvas usados, como lixo bioinfectante.

Armazenamento da parte não utilizada do kit Placa Reveladora Se todas as cavidades da Placa Reveladora não foram utilizadas, podem ser guardadas para uso posterior: • Selar as cavidades utilizadas com fita adesiva, de forma a evitar respingos, mesmo que a Placa Reveladora tenha sido esvaziada. Outros materiais do kit: • Retornar o restante das Placas Reveladoras, Pentes, perfurador, controles e instruções de uso ao kit. Armazenar de 2 - 8ºC.

Resultados dos Testes Validação Para confirmar o correto funcionamento do teste e demonstrar que os resultados são válidos, as quatro condições abaixo devem ser cumpridas (veja Figura 5). 1. O Controle Positivo deve produzir dois pontos no dente do Pente. 2. O sinal no ponto inferior do Controle Positivo deve ser no mínimo 25 quando medido utilizando-se o programa 91 do refletômetro CombScanTM (aproximadamente igual à segunda escala de cores, começando-se da esquerda, se obtido usando o CombScanTM). 3. O Controle Negativo deve produzir um ponto superior (Controle Interno). O ponto inferior não irá aparecer ou aparecerá bem fraco, não afetando a interpretação dos resultados. 4. Cada amostra testada deve produzir um ponto superior (Controle Interno). Se alguma destas quatro condições não for cumprida, os resultados são inválidos e as amostras e controles devem ser retestados.

Controle Positivo

Controle Negativo

Figura 5. Validação dos testes. Interpretação Qualitativa dos Resultados Interpretação Visual

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Resultados Inválidos

Comparar a intensidade do ponto inferior do dente de cada amostra com o ponto inferior no dente do Controle Positivo (Figura 6). • •

Um ponto com intensidade maior ou igual a do Controle Positivo indica a presença de anticorpos IgM anti-HAV. Nenhum ponto ou um ponto com intensidade menor que a do Controle Positivo deve ser considerada como resultado negativo.

≤ Controle Negativo

Controle Positivo

Amostra

Presença de anticorpos IgM para HAV

Figura 6. Resultado dos Testes Leitura no Equipamento O refletômetro do CombScantm (veja o Manual de Uso do Combscan para instruções detalhadas) permite uma leitura rápida e objetiva da intensidade da cor dos pontos no ImmunoComb. Ler os resultados como absorbância relativa usando o programa # 92 do CombScan, determinando a leitura do ponto inferior digitando “1” quando aparecer a mensagem “pontos: 1,2,3” na tela. • Leitura de amostras igual ou maior que 850 indica a presença de anticorpos IgM para HAV. • Leitura de amostras entre 750 e 850 deve ser considerada como resultado indeterminado. Uma segunda amostra deve ser coletada e testada após uma semana. • Leitura de amostras inferior a 750 indica um resultado negativo. Documentação dos resultados Como a cor desenvolvida no Pente é estável, os pentes podem ser guardados para documentação.

Limitações

O kit ImmunoComb® II HAV IgM é um teste de triagem. Os resultados do teste indicativos que a amostra é reativa para anticorpos IgM para HAV não devem ser considerados como diagnóstico para infecção por hepatite A . Os resultados dos testes devem ser avaliados em conjunto com todos os sintomas, históricos clínicos e outros testes laboratoriais realizados para o paciente.

Características de Desempenho* A) Painel de Desempenho A sensibilidade e a especificidade do kit do ImmunoComb II HAV IgM foram avaliados em um painel de 300 amostras de soro, em comparação com um ensaio de referência anti-HAV IgM IMx. Os resultados estão resumidos na Tabela 1. Tabela 1. Resultados dos testes Ensaio de Referência Positivo Negativo

ImmunoComb II HAV IgM Positivo Negativo 99 1 1 199

Foram calculadas as seguintes características de desempenho: • Sensibilidade – 99.0% • Especificidade – 99.5% B) Soroconversão A capacidade do kit ImmunoComb® II HAV IgM para detectar precocemente a soroconversão de HAV IgM foi avaliada em um painel de soroconversão com 5 membros obtidos da Boston Biomédica, Inc (BridgeWater, MA, USA) de um único individuo com anti-HAV IgM RIA como ensaio de referência. Ambos os testes detectaram anti-HAV IgM nos soros números 3 e 4, mas não mais no soro número 5. Anti-HAV IgG foi detectado nas amostras 3 a 5 . Os resultados mostram 100% de correlação com o RIA. * Informação detalhada disponível mediante solicitação.

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Produzido por: ORGENICS LTD. P.O.Box 360, Yavne 70650 - ISRAEL Registro e Distribuição: ORGENICS DO BRASIL LTDA. Alameda dos Ubiatans, 257 - Planalto Paulista 04070-030 São Paulo - SP CNPJ : 01.767.606/0001-10 Atendimento ao consumidor SAC: (11) 5589-4622 FAX: (11) 5581-3279 e-mail: orgenics@uol.com.br Uso exclusivo para diagnóstico "in vitro" Registro ANVISA nº 10348680016 Resp. Técnico : Wellington Staduto Braga da Silva CRF-SP 13020 CONSERVAR ENTRE 2 - 8ºC

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Resumo dos principais procedimentos do Teste

Resumo do Procedimento de Teste As instruções resumidas abaixo são para usuários experientes do kit ImmunoComb II HAV IgM. (Para instruções detalhadas, por favor, veja o texto completo) 1. Incubar a Placa Reveladora em uma incubadora a 37ºC por 45 minutos. 2. Pré-diluir 10 µL de cada amostra ou controle misturando com 490 µL de diluente de amostra. 3. Dispensar 25 µL de cada amostra ou controle pré-diluídos nas cavidades da fileira A da Placa Reveladora. 4. Inserir o Pente na fileira A e continuar como descrito na Tabela 1. Tabela 1. Resumo do Procedimento do Teste Etapa Captura de anticorpo

Fileira A

Proceder como a seguir Misturar; incubar 2 horas a 37ºC; absorver

Lavagem

B

Agitar; incubar 2 minutos; absorver.

Reação antígeno-anticorpo

C

Misturar; incubar 30 minutos a 37ºC; absorver.

Ligação do conjugado

D

Agitar; incubar 20 minutos a 37ºC; absorver.

Lavagem

E

Agitar; incubar 2 minutos; absorver.

Reação de cor

F

Misturar; incubar 10 minutos a 37ºC.

Reação de parada

E

Incubar 1 minuto; secar ao ar livre.

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