Page 1

UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI PADOVA

FACOLTA’ DI FARMACIA DIPARTIMENTO DI SCIENZE FARMACEUTICHE CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN CHIMICA E TECNOLOGIA FARMACEUTICHE

TESI DI LAUREA

SINTESI DI INIBITORI DI CK2

RELATORE : CHIAR.MO PROF. GIUSEPPE ZAGOTTO

LAUREANDA : ERICA TESCARI

ANNO ACCADEMICO 2010-2011


II


Nulla si crea, nulla si distrugge, tutto si trasforma. (A. Lavoisier)

III


IV


SOMMARIO 1.

INTRODUZIONE ............................................................................................ 3 1.1.

CHINASI ............................................................................................................ 5

1.2.

CASEIN CHINASI ............................................................................................. 8

1.3.

CASEIN CHINASI 2 ........................................................................................ 10

1.3.1. CARATTERISTICHE STRUTTURALI DELLA CK2............................................. 10 1.3.1.1. STRUTTURA DELLE SUBUNITÀ CATALITICHE (α/α′) ................................ 11 1.3.1.2. STRUTTURA DELLA SUBUNITÀ REGOLATORIA β ..................................... 12

1.4.

RUOLO BIOLOGICO DELLA CK2................................................................ 13

1.4.1. 1.4.2. 1.4.3.

1.5.

SVILUPPO DI POTENZIALI INIBITORI DI CK2 ......................................... 17

1.5.1. 1.5.2.

2.

3.

4.

SOPRAVVIVENZA DELLA CELLULA ................................................................... 14 CK2 E TUMORI ........................................................................................................... 15 CK2 E VIRUS ................................................................................................................ 16

ULTIMI SVILUPPI (2009-2010-2011) ........................................................................ 29 TRIALS CLINICI ......................................................................................................... 31

SCOPO DEL LAVORO E OBIETTIVI ........................................................... 33 2.1.

SCOPO DEL LAVORO ................................................................................... 35

2.2.

OBIETTIVI ...................................................................................................... 36

MATERIALI E METODI ............................................................................... 39 3.1.

ABBREVIAZIONI ........................................................................................... 41

3.2.

MATERIALI .................................................................................................... 43

DISCUSSIONE DEI RISULTATI .................................................................. 45 4.1. 4.1.1. 4.2. 4.2.1. 4.3. 4.3.1. 4.4. 4.4.1.

SCHEMA DI SINTESI 1................................................................................................... 47 RAZIONALE DELLO SCHEMA DI SINTESI 1 ...................................................... 49 SCHEMA DI SINTESI 2................................................................................................... 54 RAZIONALE DELLO SCHEMA DI SINTESI 2 ...................................................... 56 SCHEMA DI SINTESI 3................................................................................................... 58 RAZIONALE DELLO SCHEMA DI SINTESI 3 ...................................................... 60 SCHEMA DI SINTESI 4................................................................................................... 64 RAZIONALE DELLO SCHEMA DI SINTESI 4 ...................................................... 66

4.5.

DISCUSSIONE DEI DATI BIOLOGICI .......................................................... 72

4.6.

CONCLUSIONI ............................................................................................... 73

1


5.

PROCEDURE SPERIMENTALI ................................................................... 75 5.1.

SCHEMA 1 ....................................................................................................... 77

5.2.

SCHEMA 2 ....................................................................................................... 85

5.3.

SCHEMA 3 ....................................................................................................... 91

5.4.

SCHEMA 4 ....................................................................................................... 99

BIBLIOGRAFIA..................................................................................................111

2


1. INTRODUZIONE

3


4


1.1. CHINASI Le chinasi sono enzimi che catalizzano il trasferimento di un gruppo fosfato terminale di una molecola di ATP, o più raramente di GTP, ad un substrato proteico (Schrenk & Snaar Jagalska, 1999). La fosforilazione induce nella proteina delle modificazioni strutturali, che si traducono in segnali di attivazione o di inibizione della stessa. Questo processo è di natura reversibile e tale condizione è garantita dalla presenza di altri enzimi, le fosfatasi, che catalizzano la reazione inversa (fig. 1).

Fig. 1. Rappresentazione schematica della reversibilità dell’azione chinasi-fosfatasi.

La fosforilazione proteica reversibile svolge un ruolo essenziale nella regolazione di numerose funzioni cellulari comuni a tutti gli eucarioti come, ad esempio, il controllo del ciclo cellulare (Pinna & Meggio, 1997), il trasporto intracellulare di proteine (Jans & Hubner, 1996) e il metabolismo energetico (Ingebritsen & Cohen, 1983). Le protein chinasi regolano tutti questi processi attraverso la fosforilazione di proteine substrato in risposta a stimoli precisi, come quelli indotti da ormoni, fattori di crescita, neurotrasmettitori ed antigeni (Beck, Weigel, & Edwards, 1992). Questi recettori possono regolare l'attività di protein chinasi e fosfatasi attraverso la modulazione della concentrazione citoplasmatica di secondi messaggeri, quali cAMP, che a sua volta regola la protein chinasi A (PKA) (Walsh & Van Patten, 1994) e il sistema Ca2+/diacilglicerolo, che attiva la protein chinasi C (PKC) (Nishizuka, 1995).

5


L’importanza dei processi di fosforilazione e defosforilazione nel controllo dei principali processi cellulari si riflette nell’elevato grado di conservazione che è possibile riscontrare nelle strutture delle protein chinasi e in quelle delle principali cascate regolatorie. Numerosi studi hanno posto in evidenza l'importanza dell'equilibrio dell'attività delle chinasi e delle fosfatasi, per una corretta funzionalità cellulare; si è infatti verificato come lo sbilanciamento di questi sistemi ricopra un ruolo nell’insorgenza di patologie. Infatti, oltre 400 malattie umane, tra cui il diabete, alcune malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer (Selkoe, 1997) (Perez, Gil, & Martinez, 2010) e il morbo di Parkinson (Guerra & Issinger, 2008), l’artrite reumatoide, molte neoplasie (leucemie e linfomi) e malattie virali, sono imputabili a livelli anomali di fosforilazione (Cohen, 2001). Nel genoma del lievito Saccharomyces cerevisiae (fig. 2), le chinasi rappresentano una grande famiglia: 121 su 6144 geni di questo microorganismo (circa il 2%) codificano per delle protein chinasi. Nel moscerino Drosophila melanogaster (fig. 3), 319 su 13338 geni codificano per protein chinasi; nel nematode Caenorhabditis elegans (fig. 4), sono 437 su 18366 i geni che codificano per queste proteine. Secondo una stima approssimativa, circa un terzo delle proteine di mammifero contengono un gruppo fosfato legato covalentemente.

(2)

(3)

(4)

Fig. 2-4. 2 - Saccharomyces cerevisiae; 3 - Drosophila melanogaster; 4 - Caenorhabditis elegans

6


Dagli studi riguardanti i genomi di lievito e di nematode, si ipotizzava che vi fossero non meno di 1000 protein chinasi e 500 protein fosfatasi impegnate nella fosforilazione delle proteine umane. Invece, state codificate in tutto circa 550 chinasi nel genoma umano, divise in oltre 57 famiglie e corrispondenti al 2.8% del genoma (fig. 5) (Venter, et al., 2001).

Fig. 5. Distribuzione delle funzioni molecolari dei geni umani.

Le protein chinasi si distinguono in tre grosse famiglie in base all’AA fosforilabile (Hunter, 1991): 1. Serina/Treonina protein chinasi; utilizzano come accettore del fosfato il gruppo alcolico della serina e/o della treonina. 2. Tirosina protein chinasi; catalizzano la fosforilazione del gruppo fenolico della tirosina. 3. Dual-specificity protein chinasi; fosforilano i residui di Ser/Thr e di Tyr Solo una piccola parte, tuttavia, delle interazioni funzionali di queste proteine è stato scoperto (Venter, et al., 2001).

7


1.2. CASEIN CHINASI In letteratura, il primo esempio di enzima riportante l’attività chinasica è stato riportato nel 1954 da Burnett e Kennedy mediante esperimenti condotti su fegato di ratto utilizzando la caseina come substrato fosforilabile (Burnett & Kennedy, 1954); in seguito si dimostrò che quella stessa attività era presente in molti altri tessuti. Tale attività fu attribuita a un enzima che venne indicato come “casein-chinasi” o “fosvitinchinasi”, il quale si distinse per la sua preferenza in vitro verso substrati acidi (tra cui appunto la caseina del latte e la fosvitina del tuorlo d’uovo), rispetto a quelli basici quali istoni e protammine (Hutti, Jarrell, Chang, Abbott, Storz, & Toker, 2004). Solo nel 1969 si scoprì che l’attività era attribuibile a due enzimi distinti (Pinna, Baggio, Moret, & Siliprandi, 1969), che furono denominati Casein Chinasi 1 e Casein Chinasi 2 (CK1 – CK 2). Nonostante la caseina, come la fosvitina, sia un substrato ideale per saggiarne l’attività, essa non è tuttavia fisiologica. La caseina costituisce il vero substrato fisiologico solamente nella protein chinasi denominata G-CK (Golgi Casein Kinase) (Lasa, Marin, Meggio, & Pinna, 1996) Il termine casein chinasi, quindi, indica tre diverse classi di protein chinasi, distinte per struttura, localizzazione e funzione: 1. Casein Chinasi 1 (CK1). 2. Casein Chinasi 2 (CK2). 3. Casein Chinasi della ghiandola mammaria (G-CK: Golgi Casein Kinase).

La numerazione di CK1 e CK2 è una convenzione che deriva dai primi lavori su tali enzimi, e fa riferimento all’ordine di eluizione da una colonna di dietilaminoetilcellulosa (DEAE-cellulosa) usata durante il loro processo di purificazione. (Baggio, Pinna, Moret, & Siliprandi, 1970). Queste due chinasi sono state trovate essere ubiquitarie e agiscono su un numero elevato di enzimi e proteine non catalitiche coinvolte in moltissime funzioni cellulari (Lasa, Marin, & Pinna, 1997). La casein chinasi (G-CK) è una chinasi tessuto specifica, localizzata a livello delle membrane dell’apparato del Golgi nella ghiandola mammaria. La sua funzione è quella di fosforilare le proteine del latte appena sintetizzate, delle quali la caseina è la principale componente (Duncan, Wilkinson, & Burgoyne, 2000). Recentemente è stato dimostrato che anche nell’apparato di Golgi del fegato, della milza, e, in minor grado,

8


del rene e del cervello di ratto, è presente una protein chinasi, biochimicamente indistinguibile dalla G-CK di ghiandola mammaria, il cui ruolo fisiologico, tuttavia, è ancora oggetto di importanti studi (Lasa, Marin, & Pinna, 1997). Le principali caratteristiche dei tre enzimi sono riportate nella tabella 1. In particolare è possibile osservare che: 1. CK1 e CK2 sono profondamente diverse: CK1 è un monomero di PM compreso tra 34 e 55 KDa; CK2 è un tetramero costituito da due subunità catalitiche α/α’ e due subunità regolatorie β (questa struttura eterotetramerica è rara tra le protein chinasi) (Litchfield, 2003). I due enzimi fosforilano le stesse proteine in siti diversi. Tra i substrati fisiologici riconosciuti da entrambe ricordiamo la RNA-polimerasi,

l’acetil-CoA-carbossilasi,

la

glicogeno

sintetasi

e

il

fibrinogeno. 2. CK1 e G-CK sono in grado di utilizzare come donatore di fosfato solo ATP, mentre la CK2 può utilizzare quasi con la stessa efficienza sia ATP che GTP. La CK2 richiede la presenza di cationi bivalenti (soprattutto magnesio, ma anche manganese e cobalto). È stato osservato che, in presenza di ioni magnesio, l’affinità è maggiore per l’ATP rispetto al GTP, mentre è vero il contrario in presenza di ioni manganese. È possibile che i complessi di coordinazione ATPMg2+ e GTP-Mn2+, rispetto alle altre combinazioni, assumano la conformazione ottimale tale da occupare in maniera idonea il sito di legame del donatore di fosfato. 3. CK2 è insensibile alla staurosporina (fig. 6), uno dei più potenti inibitori competitivi per l’ATP delle protein chinasi (Meggio, et al., 1995).

Fig. 6. Struttura della staurosporina (Streptomyces staurosporeus)

9


PROPRIETÀ

G-CK

CK1

CK2

Distribuzione

ghiandola mammaria

ubiquitaria

ubiquitaria

Massa molecolare

400

25-60

120-150

Struttura

monomero

monomero

oligomero (eterotetramero)

ATP

ATP (Km=22 µM)

ATP (Km=4-15 µM)

Cosubstrato

Ser

Ser/Thr

Residui fosforilati

Ser

GTP (Km=7-40 µM)

Tab.1. Caratteristiche delle tre diverse casein chinasi a confronto

1.3. CASEIN CHINASI 2 La protein chinasi CK2 è un enzima pleiotropico ed ubiquitario individuato in tutti gli organismi eucarioti finora esaminati (Pinna, 1997). È costitutivamente attiva e indipendente da secondi messaggeri ed eventi fosforilativi (Meggio & Pinna, 2003).

1.3.1. CARATTERISTICHE STRUTTURALI DELLA CK2 La CK2 è un oloenzima tetramerico (fig. 7) composto da due subunità catalitiche α e da due subunità regolatorie β (di 26 kDa circa); sono state identificate due isoforme della subunità catalitica, α e α’ rispettivamente di 44 e 38 kDa, quindi in vivo esistono i complessi α2β2, αα’β2 e α’2β2. e le subunità possono esistere sia come aggregato oppure isolate. L’oloenzima è a forma di farfalla: la parte centrale, tra i monomeri catalitici, è occupata dal dimero della subunità regolatoria; i monomeri β sono in contatto con i monomeri α i quali, invece, non si toccano. La specificità nei riguardi del GTP sembrerebbe in parte dovuta alla presenza dei due residui Val166 e Ile174, che in altre chinasi risultano quasi invariabilmente sostituiti da Ala e Phe. Il notevole ingombro di Val e Ile rispetto ad Ala e Phe, potrebbe spiegare

10


anche l’insensibilità della CK2 alla staurosporina, e la maggiore suscettibilità ai derivati alogenati del benzimidazolo e del benzotriazolo (Meggio, Shugar, & Pinna, 1990) (Ssyszka, Grakowski, Felczak, & Shugar, 1995).

Fig. 7. Struttura tetramerica dell’oloenzima della CK2, sono evidenziate le strutture α e β

1.3.1.1.

STRUTTURA DELLE SUBUNITÀ CATALITICHE (α/α′)

La descrizione dettagliata delle diverse regioni della subunità catalitica, è stata eseguita per la prima volta con la definizione della struttura della subunità α della CK2 del cereale Zea mays (il comune granturco) (fig. 8) (Niefind, Guerra, Pinna, Issinger, & Schomburg, 1998). Una caratteristica unica della CK2 è rappresentata dalla regione N-terminale (fig. 6); questa porzione sembra avere un ruolo chiave nella stabilizzazione della conformazione attraverso l’unione dei due lobi, formando così dei contatti ben definiti, principalmente con il segmento di attivazione.

11


Fig 8. Struttura della subunità α di Zea mays

1.3.1.2.

STRUTTURA DELLA SUBUNITÀ REGOLATORIA β

Diverse considerazioni devono essere prese per quanto riguarda la subunità β di CK2. Questa regione è di per sé inattiva, ma riveste un ruolo assolutamente unico e importante per la funzionalità del tetrametro enzimatico, il cui assemblaggio avviene a partire dalla formazione di un suo dimero (Graham & Litchfield, 2000). Il tetramero fosforila con più efficienza, rispetto alla singola subunità catalitica, la maggior parte dei substrati e per alcuni di essi la presenza di CK2β è indispensabile. Per altri substrati come la calmodulina ad esempio, invece, la presenza di CK2β ha un effetto inibitorio (Marin, Meggio, & Pinna, 1999) (Ruzzene, Brunati, Sarno, Marin, Donella, & Pinna, 2000) . Il monomero della subunità β è costituito da 215 aminoacidi ed è organizzato in due

domini: dominio I e dominio II (Chantalat, et al., 1999). Il primo è interamente ad αelica e comprende la regione N-terminale; il secondo è costituito da foglietti β antiparalleli nei quali uno ione Zn2+ viene coordinato tetraedricamente e comprende la regione C-terminale, responsabile della dimerizzazione (fig. 9).

12


Fig. 9. Struttura del dimero CK2β. Si evidenziano gli atomi di Zn2+ coordinati dai residui glicinici.

1.4. RUOLO BIOLOGICO DELLA CK2 Abbiamo più volte ripetuto che la CK2 è una proteina pleiotropica, coinvolta in parecchi e spesso fondamentali percorsi metabolici, nei quali ha, molte volte, un ruolo chiave (ciò è evidenziato dal lungo elenco in espansione di substrati fosforilabili in vivo ed in vitro (Meggio & Pinna, 2003)); spesso tali substrati sono degli enzimi, la cui regolazione risulta cruciale in numerose vie metaboliche. Molti studi hanno suggerito come questo enzima giochi un ruolo chiave in parecchie fasi della regolazione cellulare; alcune ipotesi sostengono che CK2, sia fondamentale per la sopravvivenza della cellula, nonché essere implicata fermamente in processi quali la crescita di cellule sane e di cellule cancerose (Ahmed, Gerber, & Cochet, 2002). Tale enzima inoltre sembra implicato in processi quali la sintesi di tRNA e rRNA (Ghavidel & Schultz, 2001), l’apoptosi (Ahmad K. , Wang, Unger, Slaton, & Ahmedc, 2008), la trasformazione cellulare (Ahmed, Gerber, & Cochet, 2002) e nella regolazione della NADPH ossidasi (Kim, Jung, Niizuma, & Chan, 2009).

13


1.4.1. SOPRAVVIVENZA DELLA CELLULA La produzione di entrambe le subunità (catalitica e regolatoria) della CK2 è essenziale per la sopravvivenza cellulare: infatti, in Saccharomyces cerevisiae, l’interruzione dei geni che codificano per la subunità catalitica della CK2, risulta letale (Padmnabha, 1990). CK2 α’ nel topo maschio è prodotta soprattutto nella fase finale della spermatogenesi, e l’interruzione del gene che la codifica aumenta il numero di cellule apoptotiche nei testicoli, causando l’infertilità dell’animale (Xu, Rich, & Seldin, 1998). È evidente a questo punto la potenziale relazione tra CK2 e attività antiapoptotica e, di conseguenza, tra elevata attività di CK2 e “anormale” proliferazione cellulare. Tra tutti i numerosi substrati fosforilati da questa chinasi (tab. 2), tre meritano un cenno particolare e sono: calmodulina, Rev ed il fattore eIF2β (Meggio & Pinna, 2003). La calmodulina è una proteina chiave nella regolazione Ca2+-dipendente di molti enzimi (tra cui varie protein chinasi). Essa rappresenta un substrato unico per la CK2, in quanto la sua fosforilazione è strettamente legata alla struttura della chinasi: infatti, mentre la subunità catalitica isolata è in grado di fosforilare la calmodulina, la CK2 eterotetramerica risulta del tutto incapace di farlo se non in presenza di composti di natura policationica come la polilisina e gli istoni che inducono un’ottima attività (Marin, Meggio, & Pinna, 1999) (Arrigoni, et al., 2004).

Rev è una delle proteine virali dell’HIV; al contrario della calmodulina, si è rivelato un ottimo substrato solo per la forma oligomerica di CK2 suggerendo, per la prima volta, che anche la subunità β di CK2 potesse essere coinvolta nelle fasi di riconoscimento del substrato. La terza proteina, il fattore eIF2β, è uno dei componenti dell’eIF2 che interviene nelle fasi iniziali della sintesi proteica durante la formazione di complessi con il GTP e con il Met-tRNA.

14


Enzimi coinvolti nella sintesi di acidi nucleici

Enzimi chiave nelle vie metaboliche

RNA-polimerasi 1 e 2

Glicogeno sintetasi

DNA-polimerasi 1 e 2

Acetil CoA-carbossilasi

Dna-ligasi

Ornitina decarbossilasi Fattori della sintesi proteica

Enzimi coinvolti nella traduzione del segnale Calmodulina

eIF-2

Protein chinasi C

eIF-3

Recettore dell’insulina

eIF-5 Fattori di trascrizione, oncogeni

Recettore di IGF-2

e soppressori tumorali

Recettore delle LDL Sinaptogamina

c-Jun

Sintassina

c-Fos Proteine del citoscheletro

c-Myc p-53

Tubulina

Proteine nucleari e nucleolari

Miosina Spectrina

Proteine nucleari di matrice

Troponina C

nucleolina Tab.2. Alcuni substrati della CK2

1.4.2. CK2 E TUMORI Da tempo è noto che la CK2 è coinvolta nel processo di divisione cellulare: la sua concentrazione risulta essere particolarmente elevata nei tessuti in rapida proliferazione come le cellule embrionali e la sua presenza è necessaria affinché il ciclo cellulare passi dalla fase G1 alla fase S e dalla fase G2 alla fase M (Blanquet, 2000). Inoltre in molti tumori umani esaminati la concentrazione e la attività di CK2 risultano essere aumentate (Guerra & Issinger, 1999) (Pinna, 2002). Il ruolo centrale della CK2 nella genesi dei tumori è confermato dall’osservazione che l’introduzione del gene per la CK2α in topi transgenici, che porta alla sovraespressione della subunità catalitica α induce l’insorgenza di leucemie (Pepperkok, Lorenz, Ansonge, & Pyperin, 1994). Risulta evidente che l’evoluzione della neoplasia sia direttamente proporzionale all’attività di CK2; per esempio l’attività di CK2 è elevata nelle cellule leucemiche umane (Peña, Itarte, Domingo, & Cusso, 1983). Si ritiene, quindi, che CK2 possa rappresentare un potenziale bersaglio per la ricerca di farmaci anti-neoplastici (Ahmad K. , Wang, Slaton, Unger, & Ahmed, 2005) .

15


1.4.3. CK2 E VIRUS La CK2 risulta anche essere coinvolta nella fosforilazione di proteine virali (tra le proteine fosforilate fisiologicamente dalla CK2, almeno 40 sono di origine virale) (Guerra & Issinger, 1999) (Ivanov, et al., 2003) (Meggio & Pinna, 2003). Il virus, essendo privo di chinasi proprie, sfrutta la CK2 della cellula ospite per fosforilare le proteine necessarie alla replicazione virale e alla progressione dell’infezione (Gurel, et al., 2008). Tra le proteine virali substrato della CK2 si possono annoverare la proteina Rev espresse da HIV (Meggio, Marin, Boschett, Sarno, & Pinna, 2001), le proteine del citomegalovirus (Alvisi, Jans, Guo, Pinna, & Ripalti, 2005), le oncoproteine E7 del papilloma virus e Large T del virus SV40 (Allende & Allende, 1995), che possono indurre la trasformazione neoplastica nell’ospite. Tenendo conto di queste evidenze, si ritiene che la CK2 possa rappresentare un importante bersaglio farmacologico, e che lo sviluppo di nuovi inibitori sempre piÚ efficaci e selettivi possa portare a nuovi farmaci utili nella terapia antitumorale e antivirale (Sarno, et al., 2002).

16


1.5. SVILUPPO DI POTENZIALI INIBITORI DI CK2 La CK2 rappresenta una delle protein chinasi maggiormente studiate come bersaglio molecolare; il sito di legame del nucleotide (ATP o GTP) presenta alcuni elementi di peculiarità che in alcuni casi sono stati proposti come spiegazione razionale di marcata selettività per alcune molecole attive (Cozza, Bortolato, & Moro, 2009). Gli inibitori di CK2 possono essere schematicamente divisi in cinque diversi gruppi : 1. Inibitori ATP-competitivi 2. Inibitori che si legano in parte ad una tasca allosterica 3. Inibitori che si legano in modo specifico ad una tasca allosterica vicina al sito di legame dell’ATP 4. Inibitori substrato-competitivi 5. Inibitori allosterici che si legano ad una tasca non correlata con i siti di legame dell’ATP o del substrato La maggiore parte degli inibitori appartiene al gruppo di tipo 1, mentre nessun inibitore di tipo 2 e 3 è noto finora (Cozza, Meggio, & Moro, 2011). Le più rappresentative classi del gruppo 1 sono (Sarno, et al., 2011): o Derivati polifenolici (Antrachinoni, Flavonoidi, Cumarine) o Derivati polialogenati dell’acido cinnamico e dell’acido benzoico o Derivati polialogenati del benzotriazolo e del benzimidazolo

Punto di partenza per i derivati polifenolici condensati è stato l’emodina (principio attivo estratto dal Rheum palmatum). Da uno studio computazionale su un modello umano ottenuto per omologia dalla struttura cristallografica di CK2α di Zea mays (De Moliner, et al., 2003), sono stati sviluppati nuovi inibitori quali l’MNA e l’MNX. Tali derivati hanno dimostrato un interessante incremento dell’attività inibitoria; il composto denominato DAA, infine, ha esibito l’attività inibitoria più alta fra questi (Meggio, et al., 2004) (Chilin, Battistutta, Bortolato, Cozza, Zanatta, & Poletto, 2008) (tab. 3).

17


Struttura O

OH

Nome

OH

IC50 ÂľM su nCK2 a 20ÂľM [ATP]

Emodina (1,3,8-Triidroissi-6-metil-

HO

CH3

1,3

antrachinone)

O O

OH

OH

MNX (1,8-Diidrossi-4-nitro-xanthen-9-

O

0,4

one)

NO2 O

OH

OH

MNA (4,5-Diidrossi-1-nitro-

0,3

antrachinone) NO2

O

OH

O

NH2

DAA (1,4-Diamino-5,8-diidrossi-

0,3

antrachinone) OH

NH2

O

CH3

DBC

Br

(3,8-dibromo-7-idrossi-4HO

O

O

0,1

metilcromen-2-one)

Br CH3

NBC (8-idrossi-4-metil-9-nitro-benzo[g]

HO

O

O

0,3

cromen-2-one)

NO2

O

Br Br

TBCA OH

Br

acido (E)-3-(2,3,4,5-Tetrabromo-

0,11

fenil)-cinnamico Br

Br Br

O OH

Acido 3,4,5-Tribromo-benzoico

0,64

Br Br

Tab. 3. Inibitori di CK2

18


Struttura Cl

Nome

IC50 (ÂľM) su nCK2 a 20 ÂľM [ATP]

NH N

Cl H2 HO C

DRB 23

O

(dicloro-ribofuranosil-benzimidazolo)

OH OH

Br

H

Br

N

Br

N

N

TBB

0,60

(4,5,6,7-Tetrabromo-1H-benzotriazolo)

Br

Br

K25

Br

H N

Br

N

N

Dimetil-(4,5,6,7-tetrabromo-1H-ben

0,14

zoimidazol-2-il)-ammina

Br

Br H N

Br

K37 S

N

Br

0,25 4,5,6,7-Tetrabromo-2-metilsulfanil

Br

-1H-benzoimidazolo Br

K44

Br

N

N

5,6,7,8-Tetrabromo-1-metil-2,3-diidro-1H-

N

Br

0,74

benzo[d]imidazo[1,2-a]imidazolo

Br

IQA N

acido (5-oxo-5,6-diidro-indolo N H

O

O

0,30

[1,2-a]chinazolin- 7-il) acetico

HO

Tab. 4. Inibitori di CK2

19


Più recentemente sono stati individuati il DBC e alcuni suoi derivati (tab. 3) con struttura cumarinica (Meggio, et al., 2004). Dall’apertura dell’estere ciclico della cumarina è stata successivamente sviluppata una serie di acidi cinnamici E/Z polibromurati, e fra questi il TBCA si è dimostrato essere il migliore (Pagano, et al., 2007). Successivamente si è passati ad una semplificazione della struttura molecolare, progettando una serie di acidi benzoici e derivati dell’acido salicilico polibromurati (Pagano, et al., 2007). Il gruppo di sintesi del professor Kazimierczuk (Università di Varsavia, Polonia), apportando delle modifiche strutturali al DRB, ha ottenuto il TBB (Pagano, et al., 2004) (tab. 4). Recentemente, le proprietà inibitorie del TBB sono state migliorate attraverso la sintesi di nuovi derivati, alcuni dei quali mostrano selettività uguale al loro progenitore, ma una maggiore efficacia. È il caso di K25, K37 e K44 (Battistutta, Mazzorana, Sarno, Kazimierczuk, Zanotti, & Pinna, 2005) (Zawada, Wolniak, Kazimierczuk, & Wawer, 2009). Utilizzando lo scaffold benzimidazolico come punto di partenza per tentare di raggiungere anche l’esterno della tasca di legame per l’ATP, sono stati sintetizzati una serie di nuovi inibitori. Lo scopo ultimo di questa strategia è stato quello di riuscire a disegnare inibitori capaci di interagire contemporaneamente con la tasca dell’ATP e con la zona di legame del substrato proteico. La TBB-propil-diammina e la TBB-etildiammina (fig. 10) possiedono un’ammina terziaria terminale facilmente sfruttabile per legare catene carbossilate attraverso un legame ammidico (fig. 11). I risultati biochimici ottenuti dai derivati GZ (tab. 5-6) dimostrano che questi composti mantengono una discreta attività sulla CK2 che si attesta intorno a 0.2-0.3 µM (lavoro non pubblicato, risultati preliminari da internato di tesi A. Bertamini, 2010) Br

Br Br

Br

N NH N H

Br

N NH

NH 2

NH 2

N H

Br Br

Br

(a)

(b)

. Fig. 10. (a) TBB-propil-diammina (IC50 = 0.12 µM, lavoro non pubblicato, risultati preliminari da internato di tesi M. Fortuna, 2010). (b) TBB-etil-diammina.

20


Fig. 11. Formazione legame ammidico con relativo allungamento della catena laterale.

Composto

Struttura

Nome

IC50 ÂľM su nCK2 a 20 ÂľM [ATP]

Br Br

H N

Br

N

H N

Acido 4-osso-4-[3[4,5,6,7tetrabromo-1Hbenzimidazol-2amino]propolamino]butanoic o

Br HN O

GZ1 O

0,22

O

Br Br

N

Br

N H

NH Br

GZ2

HN HOOC

O

Acido 4-osso-4-[3-[4,5,6,7tetrabromo-1Hbenzimidazol-2amino]propilamino]but-2enoico

0,30

Br Br

H N

Br

N

H N

Br HN

GZ3

O

Acido 5-osso-5-[3-[4,5,6,7tetrabromo-1Hbenzimidazol-2amino]propilamino]pentanoic o

0,21

O O Br Br

H N

Br

N

H N

Br

GZ4

HN O O

Acido 2-[2-osso-2-[3[4,5,6,7-tetrabromo-1Hbenzimidazol-2amino]propilamino]etossi]ac etico

0,23

O O

Tab. 5. test biologici in vitro per i derivati GZ a struttura TBB-propil-diammina.

21


Composto

Struttura

Nome

IC50 ÂľM su nCK2 a 20 ÂľM [ATP]

Acido 4-osso-4-[3[4,5,6,7tetrabromo-1Hbenzimidazol-2amino]etilamino]butanoico

0,24

Br Br

N

Br

N H

NH NH

Br O

GZ5 OH O

Br Br

N NH N H

Br

NH

Br O

GZ6

HO

Acido 4-osso-4-[3-[4,5,6,7tetrabromo-1Hbenzimidazol-2amino]etilamin]but-2enoicp

0,26

O

Br Br

N

Br

N H

NH NH

Br O

GZ7

Acido 5-osso-5-[3-[4,5,6,7tetrabromo-1Hbenzimidazol-2amino]etilamino]pentanoico

0,34

O OH

Br Br

N

Br

N H

NH

GZ8

NH

Br O O

Acido 2-[2-osso-2-[3[4,5,6,7-tetrabromo-1Hbenzimidazol-2amino]etilamino]etossi]aceti co

0,24

O OH

Tab. 6. test biologici in vitro per i derivati GZ a struttura TBB-etil-diammina.

22


Altri potenti inibitori di CK2 di origine naturale sono l’acido ellagico e i suoi derivati (Cozza, et al., 2006) (Ghosal, 1990) (tab. 7). L’ acido ellagico è un inibitore competitivo dell’ATP che va ad occupare una regione di “binding”” tra lobo N-terminale N e C-teminale teminale dell’enzima (fig. 12-13),, in modo simile a TBB e ad altri composti polifenolici (Cozza, et al., 2006). 2006)

Fig. 12.. Rappresentazione della CK2 eterotetramero con l’acido ellagico legato al sito attivo della ATP.

Fig. 13. Docking dell’acido ellagico legato al sito attivo della subunità α di CK2 (Cozza, et al., 2006).

23


Struttura

Nome

IC50 µM su nCK2 a 20 µM [ATP]

Acido Ellagico

0,04

Acido Flavellagico

2

Monolattone dell'acido ellagico

0,2

Monolattone dell'acido flavellagico

2,2

OH O

O

OH

O

O

HO OH

OH O

O

OH

OH HO

O

O

OH OH O

O

HO

OH

OH OH

OH O

O

OH OH

HO

OH OH

Tab. 7. Inibizione di protein chinasi da parte di acido ellagico e derivati

La

peculiarità

dell’acido

ellagico

risiede

nella

sua

capacità

di

legare

contemporaneamente sia la regione “hinge” che la porzione legante il fosfato nel sito per l’ATP, caratteristica per il momento unica (Cozza, et al., 2006). Secondo questa ipotesi, infatti,l’ossidrile in posizione 4 (fig. 14) dell’acido ellagico interagisce con il gruppo carbonilico del Glu114 nella “hinge region”; questa è la stessa regione che interagisce con l’adenina quando l’ATP si lega al sito attivo di CK2. I gruppi ossidrilici nelle posizioni 3’ e 4’ interagiscono con il gruppo carbossilico di Asp175 attraverso un doppio legame ad idrogeno. Inoltre, le interazioni idrofobiche con Val53, Val66, Phe113, Met163 e Ile174 contribuiscono significativamente a stabilizzare il complesso acido ellagico-CK2 (Cozza, et al., 2006).

24


Fig.14. Acido Ellagico

Al contrario, il carbonile del gruppo lattonico dell’acido flavellagico si distribuisce nelle vicinanze dell’ossigeno carbonilico di Glu 144. Questa posizione sfavorevole e la perdita di un legame ad idrogeno tra Glu144 e gruppo ossidrilico spiegano la diminuzione di attività (IC50=2 µM) rispetto all’ acido ellagico, che presenta in questa regione 2 legami ad idrogeno di due gruppi OH con gruppi carbonilici di Glu144 e Val66. Dal lato opposto i gruppi ossidrilici interagiscono con Asp175 e Lys68 (legame intermolecolare ione-dipolo); in più una molecola d’acqua forma legami ad idrogeno con due ossidrili. Il monolattone dell’acido flavellagico presenta un ossidrile in più rispetto quello dell’acido ellagico. La IC50 misurata per questo composto è inferiore rispetto quella della del monolattone dell’acido flavellagico (in press, G.Cozza, Università di Padova). L’urolitina è un dibenzopiranone e quindi un monolattone rispetto all’acido ellagico che presenta però solo due gruppi ossidrilici. In letteratura sono riportate quattro isoforme di urolitina (Bialonska, Kasimsetty, Khan, & Ferreira, 2009) (fig. 15). Il docking (effettuato presso il laboratorio di modellistica molecolare del Prof. Stefano Moro) mostra la posizione dell’urolitina A nella tasca catalitica di CK2 di Zea mays in relazione al composto DBC (fig. 16). Tale composto aveva dimostrato un’ottima attività e quindi può essere un utile confronto.

25


Fig. 15. Isoforme di urolitina

Fig.16. Docking dell’urolitina A (in giallo) sovrapposto al cristallo di DBC (in verde).

Si osserva che l’urolitina è in grado di formare un legame ad idrogeno anche all’altra estremità, mentre il DBC è legato solo da un lato della tasca catalitica. È quindi capace di “ancorarsi” anche alla “hinge region”, caratteristica della CK2. Poiché però la IC50 della DBC è 0.10 µM e quella dell’ urolitina A è 0.39 µM, deve essere persa qualche interazione.

26


Il sito catalitico è una zona basica e polare e quindi favorevole alla presenza di gruppi acidi o in grado di stabilire legami ad idrogeno; ad esempio l’IQA (tab. 4) posiziona proprio in questa zona il proprio gruppo carbossilico. Nel caso dell’urolitina, invece, l’ossigeno del gruppo fenolico si comporta da donatore di legami ad idrogeno come accade anche nel caso della DBC. A questo punto si può dire che l’urolitina rappresenta il derivato dell’acido ellagico con il minor numero di ossidrili che mantiene comunque una buona attività. È stata quindi valutata presso il laboratorio del prof. Meggio del Dipartimento di Biochimica dell’ Università di Padova l’effettiva attività inibitoria nei confronti di CK2 dei derivati urolitinici sintetizzati precedentemente (tab. 8).

Molecola

Nome

UROLITINA A

IC50 µM su nCK2 a 20 µM [ATP]

0,39

3,8-diidrossi-6H-dibenzo[b,d]piran-6-one

UROLITINA A MONOMETILETERE

3,47

3-idrossi-8-metossi-6H-dibenzo[b,d]piran-6one UROLITINA A DIMETILETERE 3,8-dimetossi-6H-dibenzo[b,d]piran-6-one

>40

2,4,7,9-TETRANITRO UROLITINA A 3-idrossi-8-metossi-2,4,7,9-tetranitro-6H-

>40

dibenzo[b,d]piran-6-one

27


2,4-DINITRO UROLITINA A MONOMETILETERE

3,05

3-idrossi-8-metossi-2,4-dinitro-6Hdibenzo[b,d]piran-6-one

2,4-DINITRO UROLITINA A 3,8-diidrossi-2,4-dinitro-6H-

0,6

dibenzo[b,d]piran-6-one

2-NITRO UROLITINA A MONOMETILETERE 2 3-idrossi-8-metossi-2-nitro-6Hdibenzo[b,d]piran-6-one

3-IDROSSI-4-NITRO-6H-

0,3

DIBENZO[B,D]PIRAN-6-ONE

4-NITRO UROLITINA A MONOMETILETERE

0,015

3-idrossi-8-metossi-4-nitro-6Hdibenzo[b,d]piran-6-one Tab. 8. IC50 di alucni derivati urolitinici

28


1.5.1. ULTIMI SVILUPPI (2009-2010-2011) Sono di seguito elencati una serie di inibitori CK2 risultanti dai più recenti studi riportati in letteratura; i seguenti composti sono stati sintetizzati da gruppi di ricerca diversi da quelli dell’Università di Padova. •

Emateina (Hung, et al., 2009)

L’emateina (fig. 17) è un composto naturale presente in Caesalpinia sappan, un’erba medicinale orientale. L’IC50 di questo composto risulta essere di 0.55 µM. Si tratta di un inibitore ATP non competitivo il cui meccanismo d’azione non è ancora chiaro (Cozza, Meggio, & Moro, 2011).

Fig. 17. Emateina.

AMR (Ramos, et al., 2010)

Si tratta di un derivato del naftalene (fig. 18a) a cui sono stati aggiunti due anelli furanici dotati entrambi di gruppi carbossilici (fig. 17c). Il derivato del naftalene in fig. 17b è, invece, risultato inattivo. L’IC50 dell’AMR è risultata essere di 200 nM. Docking molecolare in fig. 19.

Fig. 18. (a) 2,7-diidrossinaftalene; (b) 2,6-diidrossinaftalene; (c) AMR.

29


Fig.19. Docking dell’AMR legato al sito attivo della subunità α di CK2.

Pirimido[4,5-c]quinolina derivati (Pierre, et al., 2011)

Sono stati sintetizzati una serie di composti derivanti dalla struttura riportata in fig. 20. L’IC50 media risulta essere di circa 10 nM. Questi composti hanno una struttura che deriva dal CX-4945 (fig. 21), il primo inibitore di CK2 utilizzato in un trial clinico.

Fig.20. Scaffold dei pirimido[4,5-c]quinolina derivati.

30


1.5.2. TRIALS CLINICI Recentemente un inibitore di CK2 ATP competitivo è stato sperimentato in fase clinica I come antitumorale (Pierre, et al., 2011): Si tratta del CX-4945 (fig. 21), progettato da Cylene Pharmaceuticals per il trattamento del mieloma multiplo, del tumore al seno, della malattia di Castlaman e dei tumori solidi avanzati (clinicaltrials.gov). Questo composto risulta avere una IC50 = 1 nM (Pierre, et al., 2011). Durante il trial in fase I il 20% dei pazienti valutati hanno mostrato una stabilizzazione della malattia per almeno 16 settimane, il 67% di questi pazienti sono rimasti in studio per almeno sei mesi. Questi risultati stabiliscono che CX-4945, è un promettente agente terapeutico (Cylene Pharmaceuticals). La fase I del trial è iniziata nel Febbraio 2009 negli Stati Uniti (Arizona, Colorado e Texas), la formulazione è di tipo orale e attualmente partecipano 55 pazienti; si stima che questa fase dello studio terminerà del Dicembre 2011. (clinicaltrials.gov).

Fig. 21. (a) CX-4945 legato alla subunità α di CK2 (Ferguson, et al., 2011). (b) Struttura del CX-4945.

31


32


2. SCOPO DEL LAVORO E OBIETTIVI

33


34


2.1. SCOPO DEL LAVORO Nell’introduzione è stato evidenziato il ruolo fondamentale che ricopre la CK2. È importante ricordare come questo enzima sia coinvolto in reazioni chiave della sopravvivenza cellulare (punto 1.4 del presente testo), per questo è protagonista nell’insorgenza di patologie quali, ad esempio, i tumori. È necessario inibire la CK2 in quanto esiste una stretta relazione tra un’elevata attività di questo enzima e un’anormale proliferazione cellulare (Unger, Davis, Slaton, & Ahmed, 2004). Questo lavoro è inserito in un contesto di sintesi di derivati il cui scopo è approfondire le conoscenze riguardanti lo spazio sterico ed elettronico della cavità catalitica dell’enzima. La ricerca è stata indirizzata verso la sintesi di potenziali inibitori bifunzionali (questo termine sta ad indicare la capacità del presunto inibitore di interagire contemporaneamente con la tasca dell’ATP e con la zona di legame del substrato proteico) schematizzati in fig. 22: .

Fig. 22. Bifunzionalità di un inibitore CK2.

35


2.2. OBIETTIVI L’obiettivo ultimo di questo lavoro di tesi è stato la sintesi di nuovi inibitori di CK2. Sono state progettate delle strategie di sintesi per i seguenti composti (tab. 9):

COMPOSTO

STRUTTURA

a

b

c

Tab. 9. Composti obiettivo di questo lavoro di tesi.

36


Il composto a è un derivato dell’urolitina A; le strutture ad esso correlate hanno una IC50 di 4,5 µM (fig. 3a) e 0,026 µM (fig. 3b) sulla CK2 (lavoro non pubblicato, risultati preliminari da internato di tesi A. Bertamini, 2010). La presenza di un alogeno permette di esplorare lo spazio sterico ed elettronico della cavità catalitica in modo più approfondito. Gli aspetti da considerare relativamente al bromo sono: 1. Aspetto elettronico; Br è un atomo tipicamente elettronegativo. 2. Aspetto sterico; la sua presenza comporta un notevole ingombro sterico. 3. Lipofilia; modifica la logP aumentando la lipofilia del composto a cui è legato, può dare legami idrofobici. Il composto in fig. 23a è risultato avere un’attività inferiore al suo derivato in fig. 23b; questo è dovuto alla presenza di un metile in posizione 4 che difficilmente permette la formazione di interazioni idrofobiche con il sito di legame per l’ATP. Al contrario, il composto in fig. 23b, è risultato essere attivo grazie alla presenza del Br. Il composto a (tab. 9) presenta in posizione 4 un bromometile. È stato ipotizzato che tale gruppo impedisca il legame inibitore-enzima in quanto caratterizzato da un notevole ingombro sterico. Il composto, quindi, dovrebbe risultare inattivo.

(a)

(b)

Fig.23.(a) 4-metil urolitina A; (b) 4-bromo urolitina A.

Il composto b è un derivato della TBB-propil-diammina consecutivo alla serie GZ1-4. Si è voluto allungare ulteriormente la catena laterale inserendo due gruppi carbossilici terminali in grado di favorire l’interazione inibitore-enzima: si è supposto che avvenga un’interazione con l’Asp presente nel sito di legame per il substrato. Il composto c è un N-derivato dell’urolitina A: all’azoto presente nella struttura triciclica è legato un benzile. E’ stato ipotizzato che la presenza di tale sostituente impedisca l’accesso al sito per il legame dell’ATP a causa di un elevato ingombro sterico. Il composto, quindi, dovrebbe risultare inattivo.

37


38


3. MATERIALI E METODI

39


40


3.1. ABBREVIAZIONI °C Ac2O AIBN AlCl3 Ar BBr3 BPO Br C CCl4

gradi centigradi anidride acetica azobisisobutirnitrile cloruro di alluminio aromatico tribromuro di boro perossido di benzoile bromo carbonio tetracloruro di carbonio

CDCl3

cloroformio deuterato

CH3COOH

acido acetico

CHCl3 Cu CuCl CuI CuSO4 Da DCC DCM DCU dd δ DIEA DMAP DMF Eq Et2O

cloroformio rame cloruro di rame ioduro di rame solfato di rame dalton N,N′-Dicicloesilcarbodiimmide diclorometano N,N’-Dicicloesilurea doppietto di doppietti chemical shift N,N-diisopropiletilamina 4-(dimetilamino) piridina dimetilformammide equivalenti etere etilico

Et3N EtOAc g H H2O HCl Hz J K2CO3

trietilammina etilacetato grammi idrogeno acqua acido cloridrico Hertz costante di accoppiamento carbonato di potassio

41


KOH m Me MeOH mg ml mmol Na2SO4 NaCl NaHCO3 NaOAc NaOH NBS NH3

idrossido di potassio multipletto metile metanolo milligrammi millilitri millimoli solfato di sodio cloruro di sodio bicarbonato di sodio acetato di sodio idrossido di sodio N-bromosuccinimmide ammoniaca

NH4OAc NMR Nu Pd Pd(OAc)2 PM PPh3 ppm RF s Sn SOCl2 t T TBT THF TLC

acetato di ammonio risonanza magnetica nucleare nucleofilo palladio palladio acetato peso molecolare trifenilfosfina parti per milione fattore di ritenzione singoletto stagno cloruro di tionile tripletto temperatura tributilstagno tetraidrofurano cromatografia su strato sottile

42


3.2. MATERIALI

Reagenti: Sono stati usati reagenti: Sigma Aldrich, Fluka senza ulteriori purificazioni. Solventi: Sono stati usati solventi delle ditte Sigma Aldrich, Fluka. Solventi deuterati: Sono stati utilizzati solventi deuterati della ditta Aldrich. Fasi stazionarie per cromatografia su colonna: E’ stato utilizzato gel di silice Silica Gel 60 (230-400 Mesh) della Fluka. Lastre per TLC: Sono state usate lastre con supporto in vetro Silica Gel 60 F254 della Merck KGaA e lastre con supporto in alluminio Silica Gel.

METODI E STRUMENTAZIONE

Spettrometria di massa Gli Spettri di Massa sono stati eseguiti utilizzando lo strumento Applied Biosystems 5220 basato sulla tecnica ESI-TOF.

Misure di Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) Gli spettri NMR 1H e

13

C sono stati ottenuti alla temperatura T 298 K sciogliendo i

campioni in solventi deuterati anidri lavorando in atmosfera inerte di azoto al fine di evitare contaminazioni da H2O. Lo strumento utilizzato è lo spettrometro NMR Bruker Avance III, operante alle frequenze-base di 400 MHz sul nucleo 1H e 100 MHz sul nucleo

13

C. I valori di

chemical shift sono dati in unità δ riferiti alla posizione del segnale del tetrametilsilano quale standard interno (δ=0).

43


44


4.

DISCUSSIONE DEI RISULTATI

45


46


4.1.

SCHEMA DI SINTESI 1

Sintesi di 4-(bromometil)-3,8-diidrossi-6H-benzo[c]cromen-6-one Metodo A (4-BROMOMETIL UROLITINA A)

O

OH

HO

OH

O

28

27

1. K2CO3, acetone, comp. 30 (benzilbromuro), reflusso 50째C

Br2, CH3COOH Reflusso 100째C O

OH

Br

HO

O

O

31

29

comp. 29, comp. 31, DCC,DMAP T ambiente O Br

O

O

O

32 NaOAc, Pd(OAc)2, PPh3, reflusso 130째C , atm N2

47


O

O

O

O

33 Bromurazione con iniziatore radicalico BPO/AIBN

O

O

O

O

Br

34

1. Sblocco benzile: idrogenazione 2. Sblocco metile BBr3

OH

HO

O

O

Br

22

48


4.1.1. RAZIONALE DELLO SCHEMA DI SINTESI 1 La procedura di sintesi è iniziata con la preparazione degli intermedi base per la formazione

dello

scheletro

dell’urolitina.

L’acido

2-bromo-5-metossibenzoico

(composto 29) è stato sintetizzato tramite bromurazione in posizione orto al carbossile dell’acido 3-metossibenzoico (composto 27). Per facilitare la successiva bromurazione del composto 33 e, alla stesso tempo permettere l’esterificazione per la formazione del composto 32, è stato benzilato un unico idrossile del 2-metilresorcinolo (composto 28) tramite l’utilizzo di benzilbromuro. Facendo reagire gli intermedi così ottenuti (composti 29 e 31) è stato sintetizzato il composto 32: è stata effettuata un’attivazione dell’acido 2-bromo-5-metossibenzoico con DCC (esterificazione di Steglich). Lo step successivo ha previsto la chiusura dell’anello centrale con una reazione Pd-catalizzata avvenuta a 130°C e sotto atmosfera di azoto (reazione di Heck). La bromurazione del composto 33 è stata tentata con due diversi iniziatori radicalici: BPO e AIBN in CCl4 e utilizzando un equivalente di NBS come “donatore di Br”. Entrambe le reazioni non hanno dato esito positivo. Pertanto non è stato possibile sintetizzare il composto 34 e il suo derivato finale sbloccato (4-bromometil-urolitina A).

49


Lo schema di sintesi 1 è stato caratterizzato da due reazioni chiave: •

Esterificazione di Steglich (Neises & Steglich, 1978)

Reazione di Heck (Beletskaya & Cheprakov, 2000)

L’esterificazione di Steglich prevede l’utilizzo di DCC come agente di coupling e la DMAP come catalizzatore per la formazione di un estere a partire da un acido carbossilico e un alcol. La DCC e l’acido carbossilico formano l’intermedio Oacilisourea, questa reazione permette l’attivazione dell’acido con relativo aumento della sua reattività (fig. 24).

Fig. 24. Formazione della O-acilisourea.

Con l’aggiunta dell’alcol all’acido carbossilico attivato, si ha la formazione dell’estere e del sottoprodotto DCU (fig. 25). La presenza di DMAP è essenziale come catalizzatore per promuovere efficientemente la formazione dell’estere.

Fig. 25. Formazione dell’estere (e DCU).

50


La reazione di Heck si colloca subito dopo la formazione dell’estere ed è responsabile della chiusura dell’anello centrale dell’urolitina. In questa reazione si ha la sostituzione del gruppo R di un alo-alchene (o di un alo-arene) con un H di un alchene (H vinilico) (Brown, Foote, Iverson, & Anslyn, 2011). Si tratta di una reazione palladio-catalizzata: la forma più comune di Pd utilizzata è il Pd(II)- acetato che viene complessato in situ da PPh3. Il meccanismo di reazione è di tipo ossido-riduttivo, dove il Pd(II) viene ridotto a Pd(0) formando un complesso con due molecole di ligando (PPh3) in questo modo (fig.26):

Fig. 26. In alto: formazione del complesso del Pd(0) per riduzione del Pd(II). In basso: il complesso Pd(0)PPh3 reagisce con un alo-arene.

Il fine di questa reazione consiste nella formazione di un legame C-C che, nella reazione svolta in questo lavoro di tesi, ha permesso il coupling del composto con l’ottenimento della classica struttura triciclica dell’urolitina.

51


Altre reazioni di formazione di legami C-C catalizzate da metalli di transizione sono la reazione di Hurtley (Aalten, Koten, Riethorst, & Stamlc, 1989) e la reazione di Stille (Stille, 1986). In questo lavoro di tesi è stata utilizzata la reazione di Heck per i seguenti motivi: o La reazione di Hurtley prevede l’utilizzo di Cu(II) e NaOH. Tale metodo ha dimostrato avere una resa minore rispetto a quella di Heck: infatti il Pd(OAc)2 è un catalizzatore più stabile termodinamicamente e il Pd2+ coordina in modo più efficace la nuvola π dell’anello aromatico. o La reazione di Stille prevede l’utilizzo di organo-stannici. Tali composti hanno una preparazione complessa e sono tossici per l’ambiente; sono dannosi in particolar modo per i molluschi (Haggera, Depledgeb, & Gallowaya, 2005) e si depositano nei tessuti biologici di pesci e mammiferi (Harino, Fukushima, & Kawai, 2000).

Per la strategia di sintesi della 4-bromometilurolitina A è stato necessario proteggere gli ossidrili degli starting materials 27 e 28 in previsione della successiva reazione di bromurazione del composto 33. La protezione è stata effettuata a monte delle reazioni chiave: come prodotti sono stati ottenuti gli intermedi acido 2-bromo-5metossibenzoico (composto 29) e 3-metossibenzil-2-metilfenolo (composto 31). La necessità di effettuare la protezione prima delle reazioni di esterificazione e di coupling si spiega anche con l’esempio della mono-benzilazione del 2-metilresorcinolo: è stata eseguita prima dell’esterificazione in quanto, a causa delle condizioni di reazione (la presenza di K2CO3 porta ad un ambiente basico), l’estere si sarebbe potuto idrolizzare (Bronsted, 1928).

52


Facendo un quadro generale dello schema di sintesi 1 si può dire che i suoi punti critici sono stati: o Benzilazione del 2-metilresorcinolo (resa 18%) o Reazione di Heck (sensibile calo di resa che avrebbe potuto incidere sull’intero processo di sintesi) o Bromurazione del metile in posizione 4 (non riuscita) Le motivazioni che possono spiegare la non riuscita bromurazione del metile in posizione 4 sono probabilmente l’ingombro sterico e la densità elettronica dell’anello: a causa della presenza del sostituente aromatico (benzile) diminuisce l’efficienza dell’addizione radicalica di bromo (fig. 27).

Fig. 37. Raffigurazione schematica della zona ad alta densità elettronica.

La mancata bromurazione del composto 33 è avvalorata dal fatto che in entrambi i tentativi con i due diversi iniziatori radicalici (BPO/AIBN), lo spettro NMR evidenziava la presenza del picco a δ 2,45 ppm (s, 3H) caratteristico del metile in posizione 4: l’eventuale bromurazione avrebbe comportato un segnale con chemical shift più elevato.

53


4.2.

SCHEMA DI SINTESI 2

Sintesi di 4-(bromometil)-3,8-diidrossi-6H-benzo[c]cromen-6-one Metodo B (4-BROMOMETIL UROLITINA A)

HO

OH

28 1. NaOAc ,Ac2O, reflusso 2. NaHCO3

comp. 30, K2CO3 , acetone 50째C

O

O O

O

O

O

38

35

Bromurazione con iniziatore radicalico AIBN

AIBN, NBS, CCl4, reflusso

O

O O

O

O

O Br

Br

39

36 Deacetilazione

Idrogenazione

HO

OH

Br

37

54


O

OH

Br HO

OH

Br

O

37

29

Come Metodo A

OH

HO

O

O

Br

22

55


4.2.1. RAZIONALE DELLO SCHEMA DI SINTESI 2 Lo schema di sintesi 2 consiste in una strategia alternativa al precedente metodo di sintesi della 4-bromometil urolitina A. Date le difficoltà incontrate nella bromurazione del metile in posizione 4 del composto 33, è stata progettata una via di alogenazione per modificare direttamente lo starting material 2-metiresorcinolo. L’obiettivo è stato quello di anteporre la bromurazione alla reazione di esterificazione. Il metodo A e il metodo B differiscono solamente nella parte iniziale del processo; infatti, l’unica reazione della precedente strategia in cui sono state incontrate difficoltà non aggirabili è stata la formazione del composto 34 (bromurazione). Per facilitare tale bromurazione sono stati protetti entrambi gli ossidrili (fig. 28) del 2metilresorcinolo:

Fig. 28. Protezione OH.

Sono state utilizzate due tipologie di protezione: o Acetilazione (fig. 29)

O

HO

OH CH3

O

O

O

O

O

O

O

CH3 Br

28

35

36

Fig.29. Protezione e bromurazione del 2-metilresorciolo

56


L’acetilazione del 2-metilresorcinolo è stata effettuata con NaOAc e Ac2O a reflusso per tutta la notte. Una volta purificato il composto di-acetilato è stata eseguita la bromurazione del metile in posizione 2: la reazione ha previsto l’utilizzo dell’iniziatore radicalico AIBN e del “donatore” di bromo NBS; è stato così ottenuto il composto 36. Il successivo sblocco degli acetili è stato tentato con sette diverse procedure, ma in nessun caso è stato ottenuto il composto 37. In generale, la deprotezione del composto avrebbe previsto l’idrolisi dell’estere e la successiva acidificazione per la formazione degli ossidrili.

o Benzilazione (fig. 30)

Fig. 30. Benzilazione del 2-metilresorcinolo.

La benzilazione del 2-metilresorcinolo è stata effettuata con benzilbromuro come per il composto 31 ma ottenendo la doppia sostituzione degli ossidrili. La successiva bromurazione del composto 38 ha avuto esito negativo: la causa di ciò è data dal consistente ingombro sterico; infatti la presenza dei due benzili ha reso difficile l’attacco del bromo (altro atomo con notevole ingombro sterico).

57


4.3.

SCHEMA DI SINTESI 3 Sintesi di acido (S)-2-(4-osso-4-(3-(4,5,6,7-tetrabromo-1H-

benzo[d]imidazol-2-amino)propilamino)butanammido)pentandioico O

NH 2 O

O

O

O

O O

41

40

1.DIEA, T ambiente 2. HCl

O

OH

CH 2 CH 2 O NH O

O

O

O

42

Br Br

DCC, DIEA, comp. 12 T ambiente

N NH

NH2

N H

Br Br

12

58


Br Br

O

N

O

NH

H N

N H

Br

O

H N

O

CH 2

Br

CH 2

43 O

O

1. NaOH 1M, T ambiente 2. HCl 10% v/v

Br Br

O

N

O

NH

H N

N H

Br

OH

H N

O

CH 2

Br

CH 2

23 O

OH

59


4.3.1. RAZIONALE DELLO SCHEMA DI SINTESI 3 La sintesi è iniziata con la reazione tra anidride succinica (composto 41) e acido glutammico cloridrato (composto 40, i gruppi carbossilici in posizione 1 e 5 sono protetti da etili). Il composto così ottenuto è stato fatto reagire con il composto 12 per la formazione di un nuovo legame ammidico: in questo caso è stato necessario attivare l’acido carbossilico del composto 42 con DCC e la reazione è avvenuta a temperatura ambiente. Il successivo sblocco dei gruppi etilici avrebbe dovuto portare alla formazione del composto 23, ma è stato possibile isolare solamente il mono-derivato (composto 44 - GZ9) (fig. 31a-b).

Fig. 31. In alto: mono-sblocco tipo 1. Al centro: mono-sblocco tipo 2. In basso: sblocco totale.

60


La reazione tra composto 40 e 41 ha comportato l’apertura dell’anello dell’anidride ad opera di un nucleofilo (fig. 32): O

O

O

Nu

NuH

Nu O

O

O

O

O

H

O

Fig. 32. Apertura anello anidride succinica.

In questo caso il nucleofilo è l’azoto dell’acido glutammico che possiede un doppietto libero per l’attacco. La reazione è stata condotta in presenza di DIEA in quantità tale da neutralizzare l’HCl liberatosi (fig. 33).

Fig. 33. Utilizzo della DIEA nella reazione.

La formazione del composto 43 è stata caratterizzata dall’attivazione l’acido carbossilico con DCC (fig. 34-35). Il composto 42 reagisce con la DCC con lo stesso meccanismo descritto per l’esterificazione di Steglich.

Fig. 34. N,N’-Dicicloesilcarbodiimide (DCC).

61


Fig. 35. Reazione tra R-NH2 e acido attivato da DCC.

La formazione del sottoprodotto DCU (fig. 36) non ha permesso l’isolamento del prodotto puro e pertanto ha reso complicato il calcolo della resa; non è stato possibile, anche per le esigue quantità di prodotto, purificare il residuo. La DCU viene in genere rimossa tramite filtrazione, ma le sue tracce sono state difficili da eliminare. In questo caso, il crudo di reazione è stato purificato mediante cromatografia flash, ma le tracce non sono state rimosse.

Fig. 36. N,N’-Dicicloesilurea (DCU).

Per questo tipo di reazione non potevano essere utilizzate altre strategie di attivazione dell’acido; l’uso di SOCl2 avrebbe potuto rendere troppo “violento” l’ambiente di reazione portando all’idrolisi dell’estere formatosi nelle precedente fase di sintesi.

Lo sblocco del composto 43 ha previsto l’idrolisi dell’estere in ambiente alcalino; con la successiva acidificazione è stato ottenuto il gruppo carbossilico.

62


Tramite successiva cristallizzazione con CHCl3/n-esano è stato possibile purificare il composto 44. Dall’analisi di massa di tale composto è stata evidenziata la presenza del solo composto monosbloccato, come già precedentemente menzionato. La motivazione potrebbe risiedere nella quantità di NaOH utilizzata: le moli di NaOH (0,05 mmol) sono minori di quelle necessarie (0,06 mmol); nonostante la presenza dell’83% delle moli necessarie alla reazione, però, non è stata comunque evidenziata la formazione del composto di-sbloccato.

Considerata la minima quantità di prodotto ottenuta (2,5 mg) si è optato per l’immediato test biochimico senza ulteriori analisi di caratterizzazione. Per questo motivo non è stato possibile determinare quale dei due esteri si sia sbloccato. È lecito ipotizzare, quindi, come il prodotto sia una miscela di composti aventi il medesimo peso molecolare, ma con la porzione carbossilica libera in diverse posizioni.

63


4.4.

SCHEMA DI SINTESI 4 Sintesi di 5-benzil-3,8-diidrossifenantridin-6(5H)-one Br

OH

O

NH2

O

47

29

1. SOCl2, reflusso 150째C 2. Et3N

Br

O

N H

O

48

K2CO3, Pd(OAc)2, PPh3 DMF, reflusso 200-250째C

O

O

N

O

49

64


1-dodecantiolo, AlCl3 T ambiente

OH

HO

N

O

24

65


4.4.1. RAZIONALE DELLO SCHEMA DI SINTESI 4 La procedura per la sintesi dell’N-derivato dell’urolitina A si è articolata in tre passaggi per giungere al composto 24. Inizialmente si sono fatti reagire gli starting materials (composto 29 e composto 47) per la formazione del legame ammidico: l’attivazione dell’acido è stata effettuata con SOCl2 in ambiente anidro a 150°C. Tramite una reazione domino, il composto 48 così ottenuto, è stato fatto reagire con Pd(OAc)2, PPh3 e K2CO3 in DMF a 200-250°C. Il prodotto di tale reazione è stato sbloccato a livello dei metossili con AlCl3 in 1-dodecantiolo: è stata isolata e purificata l’urolitina N-benzilata.

L’acido 2-bromo-5-metossibenzoico e la benzilammina hanno partecipato alla formazione dell’ammide: a differenza dei casi riportati nelle altre sintesi di questo lavoro, è stato utilizzato SOCl2 (cloruro di tionile) per attivare l’acido. Questo composto inorganico converte gli acidi carbossilici in cloruri acilici (fig. 37):

Fig. 37. Azione del cloruro di tionile.

La fig. 37 evidenzia la formazione di HCl come sottoprodotto a partire da SOCl2; questa acidificazione è stata neutralizzata con Et3N. Il cloruro acilico ha un gruppo uscente migliore dell’acido carbossilico: avviene quindi un attacco nucleofilo da parte dell’azoto della benzilammina sul carbonio carbonilico. Si ottiene così il composto 48. La fase critica di questa strategia di sintesi è stata la reazione domino necessaria per la formazione del composto 49; è stato possibile utilizzare questo metodo in quanto il composto che si voleva ottenere era un composto simmetrico. Per prodotti non simmetrici si sarebbe dovuta utilizzare la strategia di sintesi riportata nello schema 1.

66


Una reazione domino è un processo che coinvolge due o più trasformazioni di legame (solitamente C-C) che avvengono nelle stesse condizioni di reazione senza l’aggiunta di ulteriori reagenti o catalizzatori, e in cui il risultato di reazioni concatenate è la conseguenza del passaggio precedente (Tietze, 1996). La classificazione delle reazioni domino si basa sull’intermedio generato nel primo step di reazione. Sono stati riconosciuti vari tipi di reazioni domino (Atta-ur-Rahman, 2008) (Tietze, 1996), i più significativi sono: o Reazioni domino cationiche o Reazioni domino anioniche o Reazioni domino radicaliche o Reazioni domino pericicliche o Reazioni domino enzimatiche o Reazioni domino catalizzate da metalli di transizione La prima reazione domino di un prodotto presente in natura è stata eseguita da Schöpf e Robinson (Robinson, 1917) (Schopf, Lehmann, & Arnold, 1937): da una miscela di succindialdeide, metilamina e acido acetondicarbossilico è stato ottenuto il tripinone biciclico (alcaloide precursore dell’atropina) (fig.38). H3C O

N H

H2N-Me HO

OH

H O

O

O

O

O

Fig. 38. Sintesi del tropi none.

La sintesi del composto 49 ha previsto una reazione domino di coupling Pd-catalizzata in cui si sono formati in concomitanza legami C-C e legami C-N (si tratta quindi di una reazione domino catalizzata da metalli di transizione).

67


Il Pd(OAc)2 in presenza di PPh3 forma il complesso Pd(0)(PPh3)2 visto in fig. 27. Attraverso la transmetallazione, il Pd si inserisce fra l’atomo di bromo e l’anello aromatico dell’acido 2-bromo-5-metossibenzoico; ottenendo, quindi, l’unione di due molecole di acido. Grazie all’ambiente basico (K2CO3) e all’alta temperatura si ottiene il coupling: l’atomo di C aromatico diviene meno elettrondenso a causa della dislocazione della carica, ciò permette la sostituzione nucleofila aromatica. In più, in base alla temperatura, si ha la decomposizione dell’intermedio con liberazione di Nbenzilformammide. Questo meccanismo non è riportato in letteratura ed è stato ipotizzato secondo la fig. 39. Il vantaggio dell’utilizzo di una reazione domino sta nel fatto che questa è una reazione one pot in cui il primo prodotto che si forma ha una struttura tale da subire, nelle stesse condizioni di reazione, un’ulteriore reazione e così via. Il meccanismo che sta alla base della reazione effettuata è lo stesso della reazione di Heck. Dai vantaggi della reazione domino però nascono anche alcuni dei suoi problemi: la consecutività delle reazioni non può essere controllata come in una normale reazione di Heck e l’ambiente di reazione influenza l’andamento dell’intero processo e non di un singolo step. Proprio per quanto riguarda l’ambiente di reazione, sono stati incontrati dei problemi nella definizione delle condizioni ideali in cui svolgere la domino. La reazione in questione è stata tentata in due differenti condizioni: in THF a 150°C (metodo A) e in DMF a 200-250°C (metodo B). Con il metodo A si sono potuti isolare sia il composto 49 che il composto 50, quest’ultimo altro non è che l’intermedio non decomposto della reazione domino. Con il metodo B, al contrario,si riporta la sola presenza del composto 49 come prodotto. La spiegazione a questa differenza è data dalla temperatura di reazione: il THF e la DMF sono solventi con temperatura di ebollizione rispettivamente di 65-67°C e 153°C; la DMF, quindi, permette di raggiungere temperature di reazione più alte del THF. La decomposizione spontanea necessaria per la trasformazione del composto 50 nel composto 49 è, quindi, temperatura-dipendente: con il metodo B tale reazione è avvenuta in modo completo.

68


Br PH H N

Pd

O PH O

(Ph3 P) 2 Pd 2+ Br H N O O

2

O O N H

R

O

H N O H

H

O

H2

O O N H

N O O

O

N O O

Fig. 39. Meccanismo domino ipotetico.

69


Con la determinazione della resa è stato possibile fare un ulteriore confronto tra i due metodi: con il metodo A la resa è stata del 12%, mentre con il metodo B è stata ottenuta una resa del 56% nettamente superiore alla precedente.

Ottenuto il composto 49 è stato necessario sbloccare gli ossidrili precedentemente bloccati tramite etossilazione a livello dell’acido 2-bromo-5-metossibenzoico. L’utilizzo di eteri per proteggere gli idrossili è una pratica molto utilizzata nelle sintesi organiche. Il metodo più comune per sbloccare dei metossili consiste nell’utilizzo di acidi di Lewis come BBr3 o AlCl3. Sono state incontrate delle difficoltà in questa fase della strategia di sintesi; infatti sono stati effettuati vari tentativi di sblocco per arrivare al composto 24. Un elenco generale è di seguito riportato: - BBr3 in benzene anidro (McOmie, Watts, & West, 1968) - BBr3 in DCM anidro (Punna, Meunier, & Finn, 2004) - AlCl3 in etanditiolo (Inaba, Umezawa, Yusa, Mihashi, & H.Itokawa, 1987) - AlCl3 in 1-dodecantiolo (Kale, Shinde, Sonar, Shingate, Kumar, & Ghosh, 2010) Tutti i tentativi di sblocco effettuati con BBr3 hanno dato esito negativo: infatti è stato visto come il tribromuro di boro causi la debenzilazione di N-benzil e O-benzil gruppi (Paliakov & Strekowski, 2004). Nelle varie prove effettuate, ne è stata fatta una direttamente sull’ammide (composto 48) con AlCl3 in etanditiolo; quest’ultimo si prestava come solvente e reattivo. Questa strategia ha dato esito positivo ed è quindi stata adattata allo sblocco del composto 49: è stato utilizzato 1-dodecantiolo al posto dell’etanditiolo perché quest’ultimo era difficile da manipolare dato il suo forte cattivo odore. Relativamente al meccanismo di sblocco, il metile può diventare un buon gruppo uscente tramite attivazione con un acido di Lewis (AlCl3); il gruppo uscente (fig.40) si lega al nucleofilo (tiolo) e, successivamente con agitazione in H2O, si ha la trasformazione del metossile in ossidrile.

70


Fig. 40. Sblocco metossile con AlCl3 ed etanditiolo.

71


4.5. DISCUSSIONE DEI DATI BIOLOGICI Il composto 44 (GZ9) è stato testato presso il laboratorio di G. Cozza del Dipartimento di Biochimica dell’Università di Padova; è stata valutata l’attività inibitoria dei composti sintetizzati rispetto alla CK2. Il test ha mostrato la seguente attività espressa come IC50 ([ATP]= 20 µM che corrisponde alla Km della CK2 nei confronti dell’ATP): IC50 = 31 µM Si ipotizza che l’attività molto più alta rispetto ai derivati GZ 1-8 (0.2-0.3 µM) sia dovuta al fatto che questo composto è solo in parte sbloccato. Dagli esperimenti di docking effettuati da G. Cozza (Università di Padova) su entrambe le varianti (fig. 31ab) si è visto che l’estere rimasto è troppo ingombrante e non agevola l’aggancio del composto all’enzima. Tale osservazione è confermata dal comportamento analogo del TBCA: questo è un composto molto attivo (0.11 µM), ma diventa inefficace se al posto dell’acido è presente un estere (>40 µM) (Pagano, et al., 2007).

Il composto 24 è in fase di testing presso il laboratorio sopra citato. Non è pertanto possibile fornire i dati della sua attività. Dai precedenti risultati ottenuti da composti simili (caratterizzati da un elevato ingombro sterico) si ipotizza, come già esposto al punto 2.2 del presente lavoro di tesi, che il composto risulterà inattivo: il sostituente benzilico dovrebbe impedire l’accesso al sito per il legame dell’ATP.

72


4.6. CONCLUSIONI Riassumendo i risultati ottenuti: o Non è stata sintetizzata la 4-bromometilurolitina A. Sono state ideate due diverse strategie di sintesi ma entrambe sono risultate essere inconcludenti; nel metodo A non è stata portata a termine la bromurazione del metile in posizione 4 del composto 33, mentre nel metodo B alternativo non è stato ottenuto il 2bromometilrsorcinolo. o Per quanto riguarda il derivato della TBB-propil-diammina, nella reazione di sblocco per ottenere il composto finale è stato possibile isolare solamente il mono-derivato GZ9 (composto 44). Tale composto è risultato avere una IC50 di 31 µM sulla CK2; la sua attività bassa è probabilmente dovuta alla presenza dell’estere che crea ingombro sterico e non facilita l’interazione inibitoreenzima. o L’N-derivato benzilato dell’urolitina A (composto 24) è stato sintetizzato tramite una reazione domino che ha permesso di aumentare la resa totale del processo. Attualmente i test biochimici su tale composto sono ancora in corso.

Concludendo, le procedure di sintesi utilizzate in questo lavoro hanno portato all’ottenimento di un solo composto dei tre prefissati, ma sono state utili per l’ideazione di nuove strategie da utilizzare in lavori futuri. Infatti, visto l’interesse generale sull’argomento trattato, si può ipotizzare che nel futuro prossimo saranno continuate le attività di ricerca di nuovi inibitori di CK2. Con il metodo domino testato in questo lavoro sarà possibile sintetizzare più facilmente nuovi derivati urolitinici simmetrici; sarà inoltre possibile risolvere il problema di resa bassa che si aveva con i metodi precedenti (reazione di Hurtley e reazione di Heck). È stato anche possibile formulare una nuova strategia di sblocco di eteri (in presenza di Nbenzili). Questo “bagaglio” di reazioni testate potrà essere uno strumento di sostegno e confronto per chi dovrà sintetizzare composti simili.

73


74


5. PROCEDURE SPERIMENTALI

75


76


5.1. SCHEMA 1 SINTESI DI ACIDO 2-BROMO-5-METOSSIBENZOICO

HO

O

Br

O

29

prodotto

MASSA VOLUME (mg) (ml)

reagente

PM

27

152,15

687,00

Br2

159,81

72,00

0,23 6,90

H2O

4,60 231,05

densità

4,50

CH3COOH

29

MOLI (mmol)

625,00

4,50

Eq. 1,00

3,11

1,00

2,70

PROCEDIMENTO: Il composto 27 (687 mg) è stato posto in un pallone in presenza di 4,5 ml di CH3COOH sotto agitazione. A parte è stata preparata una soluzione di Br2 (0,23 ml), H2O (4,6 ml)e i rimanenti 2,4 ml di CH3COOH, la quale è stata aggiunta goccia a goccia alla prima soluzione e portata a riflusso. A reazione terminata la soluzione è diventata limpida, è stata posta in ghiaccio per ottenere un precipitato. Quest’ultimo è stato filtrato sotto vuoto e lavato con H2O e metanolo, è stato poi posto in stufa. Sono stati ottenuti 625 mg del composto 29 puro; resa 60%.

77


CARATTERIZZAZIONE:

Formula bruta: C8H7O3Br HO

O

Br

H3

CH3 H1

O H2

Spettro 1H-NMR δ (CDCl3): 7,59 (d, J = 9 Hz, 1H, H1), 7,51 (d, J = 3 Hz 1H, H3), 6,94 (dd, J = 3 Hz, J = 9 Hz, 1H, H2), 3,84 (s, 3H, OMe).

M/Z teorica (M-1, Br79) 228,9506 (M-1, Br81) 230,9486 M/Z trovata (M-1, Br79) 228,9485 (M-1, Br81) 230,9468

% I n te n s i ty

Mariner Spec /3:4 (T /0.17:0.26) ASC[BP = 229.0, 11838] 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 228.13428

228.9485

229.1440 228.94926

1.2E +4

230.9468

231.1435

229.9515 229.76424

230.57923

231.5154

231.39421

231.9465

0 232.20919

Mass (m /z)

% In te n s i ty

ISO:C8H7O3Br - (H) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 228

228.9506

230.9486

229.9540 229

100

231.9520

230

231

232

0 233

Mass (m /z)

78


SINTESI DI 3-METOSSIBENZIL-2-METILFENOLO

HO

O

31

prodotto

reagente

PM

MASSA (g)

28

124,14

3,72

30

171,03

K2CO3

138,21

VOLUME (ml)

1,19 2,76

acetone

30,00

DMF

95,00

31

214,26

1,41

MOLI (mmol)

densità

Eq.

30,00

1,00

10,00

0,33

20,00

0,50

5,33

PROCEDIMENTO: (Suzuki, Okada, Arai, & Awaji, 2001) Al composto 28 (3,72 g) posto in un pallone, è stato aggiunto K2CO3 (2,76 mg) e acetone (30 ml) sotto agitazione; successivamente è stato aggiunto il composto 30 (1,19 ml) lasciando tutta la notte a riflusso a 50°C. La reazione è stata monitorata tramite TLC n-esano/EtOAc 4:1, una volta terminata sono stati aggiunti 30 ml di una soluzione 2N di NaOH ed è stata effettuata una

79


estrazione con EtOAc; la fase organica è stata lavata con H2O e con una soluzione satura di NaCl, poi è stata anidrificata con Na2SO4 per poi filtrarla e portarla a secco.

La TLC sulla soluzione ottenuta dopo la filtrazione ha rivelato la presenza di due macchie: RFx1= 0,68 (monosostituito) RFx2= 0,4 (disostituito) E’ stata isolata la macchia X1 tramite colonna cromotografica n-esano/EtOAc 4:1; resa 18%.

CARATTERIZZAZIONE:

Formula bruta: C14H14O2

Spettro 1H-NMR δ (CDCl3): 7,51-7,33 (m, 6H, HAr), 7,05 (t, J= 8,2 Hz, 1H, H1), 6,54 (dd, J= 29,9 Hz, J= 8,0 Hz, 2H, HAr), 5,10 (s, 2H, CH2), 2,22 (s, 3H, CH3).

80


SINTESI DI 3-(BENZILOSSI)-2-METILFENIL 2-BROMO-5METOSSIBENZOATO O Br

O

O

O

32

reagente

PM

MASSA (mg)

31

214,26

468,30

2,18

1,00

29

231,05

500,00

2,16

0,99

DCC

490,20

2,38

1,09

DMAP

52,80

0,43

0,20

DCM prodotto

32

VOLUME (ml)

MOLI (mmol)

densità

Eq.

22,00 427,28

741,00

1,74

PROCEDIMENTO: (Enkvist, et al., 2006) A una sospensione del composto 31 (468,3 mg), DCC (490,2 mg) e DMAP (52,8 mg) in DCM (11 ml) anidro è stata aggiunta una soluzione del composto 29 (500 mg) in DCM (11 ml) e la reazione è stata posta sotto N2 e agitata a temperatura ambiente per tutta la notte. L’eventuale precipitato (DCU) che si è formato viene filtrato e la soluzione rimasta è stata purificata tramite colonna cromatografica toluene/EtOAc 9:1. Sono stati ottenuti 741 mg del composto 32 puro; resa 81%.

81


CARATTERIZZAZIONE:

Formula bruta: C22H19O4Br H H

O

H

CH3 Br

H H

H H

H O

O

O

CH3 H

H H

Spettro 1H-NMR δ (CDCl3): 7,65 (d, J= 8,8 Hz, 1H, HAr), 7,62 (d, J= 3,1 Hz, 1H, HAr), 7,52-7,35 (m, 5H, HAr), 7,25 (t, J= 8,1 Hz, 1H, HAr), 7,01 (dd, J= 8,8 Hz, J= 3,1 Hz, 1H, HAr), 6,90 (d, J= 8,2 Hz, 2H, HAr), 5,16 (s, 2H, CH2), 3,89 (s, 3H, OCH3), 2,26 (s, 3H, CH3-Ar).

82


SINTESI DI 3-(BENZILOSSI)-8-METOSSI-4-METIL-6HBENZO[C]CROMAN-6-ONE O

O

O

O

33

reagente

PM

MASSA (mg)

32

427,28

741,00

1,74

1,00

Pd(OAc)2

224,51

39,00

0,17

0,10

PPh3

262,30

91,30

0,35

0,20

NaOAc

285,50

285,50

3,48

2,00

DMF prodotto

33

VOLUME (ml)

MOLI (mmol)

densità

Eq.

25,00 346,12

189,00

0,55

PROCEDIMENTO: (Enkvist, et al., 2006) Ad una soluzione di Pd(OAc)2 (39 mg) e PPh3 (91,3 mg) in DMF anidra (10 ml) è stata aggiunta una sospensione del composto 32 (741 mg) e NaOAc in DMF anidra (15 ml) in un pallone a 3 colli. La reazione è stata posta sotto agitazione a 130°C per tutta la notte sotto atmosfera di azoto. Successivamente è stata fatta un’estrazione con EtOAc/H2O, si è anidrificato con Na2SO4 e il solvente è stato rimosso sotto vuoto. Il composto è stato purificato mediante cristallizzazione con DCM/n-esano. Sono stati ottenuti 189 mg del composto 33 puro; resa 31,6%.

83


CARATTERIZZAZIONE:

Formula bruta: C22H18O4 H H

O

H

CH3

H H

H

H O

O

O

CH3 H

H H

Spettro 1H-NMR δ (CDCl3): 7,96 (d, J= 8,9 Hz, 1H, HAr), 7,81-7,76 (m, 2H, HAr), 7,52-7,33 (m, 6H, HAr), 6,95 (d, J= 8,8 Hz, 1H, HAr), 5,21 (s, 2H, CH2), 3,96 (s, 3H, OCH3), 2,45 (s, 3H, CH3-Ar).

84


5.2. SCHEMA 2

SINTESI DI 2,6-DIACETOSSITOLUENE

O

O

O

O

35

prodotto

reagente

PM

MASSA (g)

VOLUME (ml)

MOLI (mmol)

28

124,14

2,00

16,12

1,00

NaOAc

285,50

0,03

0,30

0,02

Ac2O

102,09

35

208,00

densità

Eq.

10,00 2,81

13,50

PROCEDIMENTO: (Peet, Dickerson, Abdallah, Daly, & Ukena, 1988) Una soluzione del composto 28 (2 g), NaOAc (30 mg) e Ac2O (10 ml) è stata posta a riflusso tutta la notte e monitorata con TLC toluene/EtOAc 4:1. A reazione completa è stato inserito del ghiaccio nel pallone sotto agitazione fino al suo scioglimento ottenendo una soluzione gialla, successivamente è stata fatta un’estrazione con Et2O (10 ml per 2 volte) e dei lavaggi con una soluzione di NaHCO3 fino a scomparsa dell’effervescenza (eliminazione di eventuale Ac2O in eccesso). La soluzione è stata anidrificata con Na2SO4, filtrata e fatta evaporare sotto vuoto fino ad ottenere un liquido giallo-arancione; questo residuo è stato distillato sotto vuoto e poi lasciato a raffreddare

85


fino alla formazione dei cristalli, i quali sono stati lavati con H2O e messi in stufa ad asciugare (bisogna fare attenzione a non eccedere con la temperatura in quanto i cristalli rifondono a 42-43,°C, è stata mantenuta una temperatura minore di 30°C). Sono stati ottenuti 2,81 g del composto 35 puro; resa 83,8%.

CARATTERIZZAZIONE:

Formula bruta: C11H12O4 H2 H1

H3

O

O

O

O

Spettro 1H-NMR δ (CDCl3): 7,24 (t, J= 8,1 Hz, 1H, H2), 6,97 (d, J= 8,2 Hz, 2H, H1-2), 2,35 (s, 6H, COOCH3), 2,03 (s, 3H, ArCH3).

86


SINTESI DI 3-(ACETILOSSI)-2-(BROMOMETIL)FENIL ACETATO

O

O

O

O

Br

36

reagente

PM

MASSA (g)

35

208,00

1,74

8,36

1,00

NBS

178,00

1,58

8,88

1,06

0,10

CCl4

prodotto

VOLUME (ml)

MOLI (mmol)

densità

Eq.

25,00

AIBN

164,21

0,14

0,85

36

287,10

0,27

0,95

PROCEDIMENTO: (Lawson, et al., 2009) Il composto 35 (1,74 g), AIBN (140 mg) e NBS (1,58 g) sono stati posti in un pallone con CCl4 (25 ml) e il tutto è stato lasciato a riflusso per circa 3 ore (TLC toluene/EtOAc 95:5) fino a reazione completa; è stato filtrato il precipitato formatosi (derivato della NBS) ed estratto la soluzione con EtOAc/H2O (la fase organica è quella gialla inferiore). Dopo anidrificazione con Na2SO4, filtrazione ed evaporazione del solvente, il composto è stato cristallizzato con Et2O. Sono stati ottenuti 0,27 g del composto 36 puro; resa 11%.

87


CARATTERIZZAZIONE:

Formula bruta: C11H11O4Br H2 H1

H3

O

O

O

O

Br

Spettro 1H-NMR δ (CDCl3): 7,39 (t, J= 8,1 Hz, 1H, H2), 7,08 (d, J= 8,2 Hz, 2H, H1-2), 4,40 (s, 2H, ArCH2Br), 2,40 (s, 6H, COOCH3).

88


SINTESI DI 1-((3-(BENZILOSSI)-2ETILFENOSSI)METIL)BENZENE

O

O

38

reagente

PM

MASSA (g)

28

124,14

1,00

benzilbromuro 171,03 K2CO3

128,00

2,14 2,22

acetone prodotto

38

VOLUME (ml)

MOLI (mmol)

densità

Eq.

8,00

1,00

18,00

2,25

16,00

2,00

10,00 304,38

1,78

5,86

PROCEDIMENTO: (Suzuki, Okada, Arai, & Awaji, 2001) In un pallone sono stati posti il composto 28 (1 g), K2CO3 (2,22 g), benzilbromuro (2,14 ml) e acetone (10 ml) lasciando il tutto sotto agitazione a 50°C per tutta la notte. Dopo raffreddamento ed eventuale filtrazione è stato evaporato il sovente, successivamente è stata aggiunta acqua ed è stata fatta un’estrazione con Et2O; dopo anidrificazione e filtrazione, il solvente è stato evaporato. Sono stati ottenuti 1,78g del composto 38; resa 73,2%.

89


CARATTERIZZAZIONE:

Formula bruta: C21H20O2

H2 H1

H3

O

O

Spettro 1H-NMR δ (CDCl3): 7,51-7,33 (m, 10H, C6H5), 7,12 (t, J= 8,3 Hz, 1H, H2), 6.,65 (d, J= 8,3 Hz, 2H, H1-3), 5,12 (s, 4H, OCH2Ar), 2,28 (s, 3H, CH3).

90


5.3. SCHEMA 3 SINTESI DI ACIDO (S)-4-(1,5-DIETOSSI-1,5DIOSSOPENTAN-2-AMINO)-4-OSSOBUTANOICO

O

OH

CH2 CH2 O NH O

O

O

O

42

reagente

PM

MASSA (mg)

40

239,70

1000,00

4.17

1,00

41

100,07

425,00

4.17

1,00

DIEA

129,25

1887,50

THF prodotto

42

VOLUME (ml)

2.50

MOLI (mmol)

14.58

densità

0.755

Eq.

3,50

50,00 303,00

605,00

1,99

PROCEDIMENTO: (Jursic & Patel, 2005) In un pallone è stato solubilizzato il composto 40 (1 g) in THF anidro (15 ml) e DIEA (2,5 ml); a parte, in un altro pallone, è stata preparata una soluzione del composto 41

91


(425 mg) in THF anidro (35 ml). Sotto agitazione e a temperatura ambiente la seconda soluzione è stata aggiunta alla prima con un imbuto gocciolatore in 10-15 minuti; la reazione è stata lasciata in agitazione per 18 ore e monitorata con TLC CHCl3/MeOH 8:2 in fosfomolibdato. Successivamente, il precipitato è stato eliminato per filtrazione e il solvente è stato eliminato per evaporazione a pressione ridotta. Quindi, è stata aggiunta H2O e acidificato con HCl 37% fino a raggiungere pH 1-2. Con un’estrazione con EtOAc è stato eliminato l’eventuale glutammico non reagito, la fase organica è stata anidrificata e portata a secco (si ottiene un liquido). Sono stati ottenuti 0,605g del composto 42 puro; resa 46,28%.

CARATTERIZZAZIONE:

Formula bruta: C13H21NO7

Spettro 1H-NMR δ (CDCl3): 4,51 (t, J= 8,1 Hz, 1H, OCOCHNH), 4,27-4,09 (m, 4H, HCHR), 2,72 (t, J= 7,1 Hz, 2H, HCHR), 2,41-2,28 (m, 6H, HCHR), 1,17 (t, J= 7,8 Hz, 6H, HCHR).

92


% In te n s i ty

Mariner Spec /3:5 (T /0.18:0.36) ASC[BP = 304.2, 97257] 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 303.0

304.1510

9.7E+4

305.1558 304.6206 304.3708 303.8

305.3706

304.9489 304.6

305.4

305.6041

306.1581 0 307.0

306.2

Mass (m/z)

% I n te n s ity

ISO:C13H21NO7 + (H)1 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 303.0

304.1391

100

305.1423 306.1443 303.8

304.6

305.4

0 307.0

306.2

Mass (m/z)

M/Z teorica (M+1) 304,1391 M/Z trovata (M+1) 304,1510

93


SINTESI DI (S)-DIETIL 2-(4-OSSO-4-(3-(4,5,6,7TETRABROMO-1H-BENZO[D]IMIDAZOL-2AMINO)PROPILAMINO)BUTANAMIDO)PENTANEDIOATO

Br Br

O

N

O

NH

H N

N H

Br

O

H N

O

CH 2

Br

CH 2

O

O

43

reagente

PM

MASSA (mg)

12

505,88

100,00

1,98

1,00

42

304,00

66,21

0,22

1,00

DCC

206,33

45,39

0,22

1,10

DIEA

129,25

302,00

DCM prodotto

43

VOLUME (ml)

0,04

MOLI (mmol)

0,22

densità

0.755

Eq.

1,10

60,00 791,12

20

0,025

PROCEDIMENTO: Il composto 42 (66,21 mg), DCC (45,39 mg) e DCM anidro (20 ml) sono stati inseriti in un pallone e posti a 0°C. A parte è stata preparata una soluzione del composto 12 (100 mg) in DCM anidro (40 ml) e DIEA (0,04 ml); questa soluzione è stata gocciolata

94


nel pallone, sotto agitazione e a temperatura ambiente per tutta la notte (è stato lasciato nel bagno di ghiaccio che si è riscaldato a temperatura ambiente durante la notte). La reazione è stata monitorata con TLC CHCl3/MeOH 9:1. Con filtro a pieghe è stata filtrata l’eventuale DCU formatasi e la soluzione rimasta è stata portata a secco; il residuo è stato purificato attraverso colonna cromatografica CHCl3/MeOH 9:1 – RF 0,49. Sono stati ottenuti 20 mg di prodotto: questi comprendono il composto 43 e una parte di DCU che non è stato possibile eliminare.

CARATTERIZZAZIONE:

Formula bruta: C23H29Br4N5O6

Mariner Spec /5:7 (T /0.35:0.53) A SC [B P = 791.9, 21252] 791.8672

100

2.1E+4

225.1965

90 80 70

% In te ns ity

793.8716 60

789.8710

50 40 30 20

449.3862

10 0

795.8702

548.7744 158.0847 0

318.1650 285.8

588.7753

713.9750

571.6

983.9564 857.4

0 1429.0

1143.2

Mass (m /z)

Picco (M+1) 791,8678 composto 18 Picco (M+1) 225,1965 DCU

95


% I n te n s i ty

Mariner Spec /5:6 (T /0.35:0.44) ASC[BP = 791.9, 21056] 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 787.0

791.8678

2.1E +4

793.8719

789.8716

792.8656 787.8815

790.8757

792.2864

788.9005 789.6

794.8695 794.2621

793.2499

792.2

795.8703 796.8758

794.8

0 800.0

797.4

Mass (m /z)

% I n te n s i ty

ISO:C23H29Br4N5O6 + (H)1 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 787.0

791.8886

100

793.8868

789.8905

792.8914 790.8934

787.8924

794.8895

795.8856

788.8954 789.2

796.8878 791.4

793.6

795.8

0 798.0

Mass (m /z)

M/Z teorica (M+1) 791,8886 M/Z trovata (M+1) 791,8678

96


SINTESI DI ACIDO (S)-5-ETOSSI-5-OSSO-4-(4-OSSO-4-(3(4,5,6,7-TETRABROMO-1H-BENZO[D]IMIDAZOL-2AMINO)PROPILAMINO)BUTANAMMIDO)PENTANOICO Br Br

O

N

O

NH

H N

N H

Br

O(CH2CH 3)

H N

O

CH 2

Br

CH 2

44 O

prodotto

reagente

PM

MASSA (mg)

43

791,12

20,00

VOLUME (ml)

0,03

MeOH

1,50

NaOH

0,05

44

763,00

2,5

MOLI (mmol)

densità

O(H)

Eq. 1,00

0,003

PROCEDIMENTO: (Mondal, Ghosh, & Verma, 2010) In un pallone sono stati posti i 20 mg (43 + DCU) ottenuti nello step precedente con MeOH (1,5 ml) e NaOH 1M (0,05 ml): il tutto è stato lasciato sotto agitazione a temperatura ambiente per 3 ore ottenendo una soluzione gialla. Questa è stata evaporata per eliminare MeOH e sono poi stati aggiunti pochi ml di H2O; dopodiché la soluzione è stata acidificata con HCl 10% v/v ed è stata fatta un’estrazione con DCM. La fase organica è stata lavata con una soluzione satura di NaCl; dopo anidrificazione,

97


filtrazione ed evaporazione del solvente, è stato ottenuto il composto 44 e DCU. Il composto 44 è stato purificato solubilizzando il residuo in un minimo di CHCl3 e versando un volume molto maggiore di n-esano, dopo circa 1 ora la formazione dei cristalli è completa e questi vengono isolati per centrifugazione. Sono stati ottenuti 2,5 mg del composto 44 puro. Quantità iniziale di composto 12: 1,98mmol Quantità ottenuta di composto 44: 0,0033 mmol Resa 0,17%

CARATTERIZZAZIONE:

Formula bruta: C21H25Br4N5O6

% I n te n s i ty

Mariner Spec /8:9 (T /0.60:0.69) ASC[BP = 322.0, 423] 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 758.0

763.8734

289.3

765.8771

761.8783

759.8805

762.8747 763.3170

760.9226 761.6

764.8759 764.6373 765.5083

766.8573

767.8903

765.2

768.7878 768.8

769.6543

771.6576

772.9472 772.4

773.8806

774.8742

0 776.0

Mass (m /z)

% I n te n s i ty

ISO:C21H25Br4N5O6 + (H)1 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 758.0

763.8572

100

761.8591

765.8554

764.8601 759.8611

762.8620

766.8581

760.8640 761.6

767.8541 768.8564

765.2

768.8

772.4

0 776.0

Mass (m /z)

M/Z teorica (M+1) 763,8572 M/Z trovata (M+1) 763,8734

98


5.4. SCHEMA 4

SINTESI DI N-BENZIL-2-BROMO-5METOSSIBENZAMMIDE

Br

O

N H

O

48

prodotto

reagente

PM

MASSA (g)

27

239,00

2,00

SOCl2

118.97

47

107,15

0,93

Et3N

101,19

5,23

VOLUME (ml)

0,95

7,20

DMF

poche gocce 0,60

13,00

Eq. 1,00

1,63

1,50

0,73

6,00

0,38

220,00

320,18

densità

8,66

DCM

48

MOLI (mmol)

51,71

1,87

99


PROCEDIMENTO: (Furuta, Kitamura, Hashimoto, Fuji, Tanaka, & Kan, 2007) •

FASE 1: ATTIVAZIONE ACIDO

Il composto 27 (2 g) è stato posto in un pallone con DCM anidro (120 ml), SOCl2 (0,95 ml) e alcune gocce di DMF a 150°C per circa 3 ore fino a scomparsa del composto di partenza (TLC DCM/MeOH 4:1, il campione è stato preparato con l’aggiunta di EtOH che produceva un estere in situ). Il tutto è stato lasciato raffreddare a temperatura ambiente e poi messo in bagno di ghiaccio, sono stati aggiunti 6 ml di Et3N sotto agitazione ottenendo una soluzione marrone. •

FASE 2: FORMAZIONE AMMIDE

È stata preparata una soluzione del composto 47 in DCM anidro (100 ml) e Et3N (1,2 ml); questa è stata gocciolata con apposito imbuto nel pallone della fase 1 in bagno di ghiaccio. La reazione è stata lasciata sotto agitazione tutta la notte e monitorata con TLC CHCl3/MeOH 8:2. Successivamente, la soluzione è stata portata a secco e con colonna cromatografica è stato isolato il composto con RF 0,82 (con altre 2 impurezze troppo vicine per separarle); il residuo è stato cristallizzato con CHCl3/n-esano, filtrato con bukner e lavato con n-esano e acqua. Sono stati ottenuti 597 mg del composto 48 puro (cristalli giallo-marroni); resa 21,5%.

100


CARATTERIZZAZIONE:

Formula bruta: C15H14BrNO2

Spettro 1H-NMR δ (CDCl3): 7,48 (d, J= 9,2 Hz, 1H, H1), 7,44-7,33 (m, 5H, HAr), 7,17 (d, J= 3,1 Hz, 1H, H2), 6,85 (dd, J= 8,8 Hz, J= 3,1 Hz, 1H, H3), 6,34 (s, 1H, NH), 4,69 (d, J= 5,7 Hz, 2H, CH2), 3,83 (s, 3H, OMe).

% In te n s ity

Mariner Spec /4:4 (T /0.31:0.31) ASC[B P = 320.0, 3104] 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 319.32218

320.0349

3103.5

322.0291

320.2724

320.5258

321.0499

322.2775

321.6579

320.38768

321.45317

322.6160

323.0444

322.51866

323.5294

324.0349

323.58415

0 324.64965

Mass (m /z)

% I n te n s ity

ISO:C15H14BrN O2 + (H)1 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 319.32218

320.0281

322.0262

100

321.0313

323.0293 324.0320

320.38768

321.45317

322.51866

323.58415

0 324.64965

Mass (m /z)

M/Z teorica (M+1, Br79) 320,0281 (M+1, Br81) 322,0262 M/Z trovata (M+1, Br79) 320,0349 (M+1, Br81) 322,0291

101


SINTESI DI N-BENZIL-2-BROMO-5IDROSSIBENZAMMIDE

51

prodotto

reagente

PM

MASSA (mg)

VOLUME (ml)

48

320,18

20,00

0,06

1,00

AlCl3

133,34

316,68

2,38

38,00

etanditiolo

94,20

6720,00

51

306,15

4,60

6,00

MOLI (mmol)

0,07

densità

1,12

Eq.

1,10

0,02

PROCEDIMENTO: (Inaba, Umezawa, Yusa, Mihashi, & H.Itokawa, 1987) Il composto 48 (20 mg) è stato posto in un pallone con AlCl3 (316,68 mg) ed etanditiolo (6 ml); il tutto è stato lasciato sotto agitazione a temperatura ambiente. La reazione è stata monitorata con TLC CHCl3/MeOH 9:1. A reazione completata è stata inserita dell’acqua nel pallone e, dopo vigorosa agitazione, è stata fatta un’estrazione con EtOAc; la fase organica è stata anidrificata e portata a secco sotto pressione ridotta. Il residuo liquido ottenuto è stato purificato mediante colonna cromatografica CHCl3/MeOH 9:1 – RF 0,54 e cristallizzato con CHCl3/n-esano. Sono stati ottenuti 4,6 mg del composto 51 puro; resa 24%.

102


CARATTERIZZAZIONE:

Formula bruta: C14H12BrNO2

Spettro 1H-NMR δ (CDCl3): 7,46-7,31 (m, 6H, HAr), 7,23 (d, J= 3,1 Hz, 1H, H1), 6,81 (dd, J= 8,7 Hz, J= 3,1 Hz, 1H, H2), 6,44 (s, 1H, NH), 5,92 (s, 1H, OH), 4,68 (d, J= 5,6 Hz, 2H, CH2).

% I n te n s ity

Mariner Spec /3:3 (T /0.17:0.17) ASC[B P = 306.0, 24031] 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 303.58627

305.9967

303.9977

304.2189

305.0017 304.88169

2.4E+4

307.0010

306.2072 306.17711

308.0030 307.47254

308.76796

0 310.06338

Mass (m /z)

% I n te n s ity

ISO:C14H12BrNO2 - (H) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 303.58627

303.9979

305.9959

100

305.0011

306.9991 308.0018

304.88169

306.17711

307.47254

308.76796

0 310.06338

Mass (m /z)

M/Z teorica (M-1, Br79) 303,9979 (M-1, Br81) 305,9959 M/Z trovata (M-1, Br79) 303,9977 (M-1, Br81) 305,9967

103


SINTESI DI 5-BENZIL-3,8-DIMETOSSIFENANTRIDIN6(5H)-ONE

HN C

O

O

O

N

O

50

49

PROCEDIMENTO A: (Furuta, Kitamura, Hashimoto, Fuji, Tanaka, & Kan, 2007) (Donati, Michel, Tillequin, & Porée, 2010) reagente

PM

MASSA (mg)

48

320,18

111,00

0,35

1,00

K2CO3

138,21

144,00

1,04

3,00

Pd(OAc)2

224,50

3,87

0,02

0,05

PPh3

262,29

9,10

0,03

0,10

THF prodotto

VOLUME (ml)

MOLI (mmol)

densità

Eq.

20,00

49

345,39

14,00

0,04

50

479

6

0,01

104


In un pallone sono stati inseriti il composto 48 (111 mg), K2CO3 (144 mg), Pd(OAc)2 (3,87 mg), PPh3 (9,10 mg) e THF anidro (20ml). E’ stato portato a riflusso a 150°C sotto agitazione in atmosfera di azoto (TLC n-esano/EtOAc 7:3). Dopo circa 4 ore la soluzione è stata portata a secco (nonostante la presenza del composto di partenza), è stata fatta un’estrazione con DCM/H2O e lavaggi con una soluzione satura di NaCl. La fase organica è stata anidrificata ed evaporata a pressione ridotta. Il residuo è stato purificato tramite colonna cromatografica n-esano/EtOAc 7:3: RF composto 21 – 0,34 RF composto 22 – 0,47 RF composto 23 – 0,16 Sono stati ottenuti 14 mg del composto 49 (resa 11,7%) e 6 mg del composto 50 (resa 3,61%). Sono stati recuperati inoltre 66 mg del composto 48 non reagiti.

PROCEDIMENTO B: (Donati, Michel, Tillequin, & Porée, 2010) reagente

PM

MASSA (mg)

48

320,18

1000,00

3.13

1,00

K2CO3

138,21

1340,00

9.73

3,10

Pd(OAc)2

224,50

79,50

0.35

0,11

PPh3

262,29

185,50

0.71

0,22

DMF prodotto

49

VOLUME (ml)

MOLI (mmol)

densità

Eq.

40,00 345,39

310,00

0,89

105


In un pallone a due colli sono stati sono stati introdotti il composto 48 (1,0 g), K2CO3 (1,34 g), Pd(OAc)2 (79,5·mg,), PPh3 (185,5·mg) e DMF anidro (40 ml) mantenendo il tutto sotto agitazione e sotto atmosfera di N2. La miscela di reazione è stata quindi riscaldata a 200-250°C per 4 ore e monitorata tramite TLC n-esano/EtOAc 7:3, raffreddata a temperatura ambiente, estratta in DCM/H2O e lavata con una soluzione satura di NaCl. La fase organica è stata anidrificata con Na2SO4, evaporata a pressione ridotta ed il residuo è stato purificato via colonna cromatografia n-esano/EtOAc 7:3. Sono stati ottenuti 310 mg del composto 49 puro (solido bianco); resa 56%.

CARATTERIZZAZIONE COMPOSTO 49:

Formula bruta: C22H19NO3 H H

O

H

CH3

H H H3C O

N

O H

H

H2C

H

H

H H

Spettro 1H-NMR δ (CDCl3): 8,13 (d, J= 8,8 Hz, 1H, HAr), 8,12 (d, J= 8,8 Hz, 1H, HAr), 8,02 (d, J= 2,8 Hz, 1H, HAr), 7,4 (dd, J= 2,8, J= 8,8 Hz, 1H, HAr), 7,3-7,2 (m, 5H, HAr), 6,87 (dd, J= 2,4, J= 8,8 Hz, 1H, HAr), 6,83 (d, J= 2,4 Hz, 1H, HAr), 5,67 (s, 2H, CH2), 3,99 (s, 3H, OMe), 3,78 (s, 3H, OMe).

106


Spettro 13C-NMR δ (CDCl3): 162,18 (C=O), 159,84 (CH), 158,8 (CH), 137,66 (CH), 136,65 (CH), 128,83 (CH), 128,79 (C), 127,75 (C), 127,24 (CH), 126,62 (CH), 126,5 (C), 125,31 (C), 123,94 (C), 122,94 (CH), 122,81 (C), 113,24 (C), 109,39 (CH), 109,27 (CH), 101,13 (CH), 55,67 (CH3), 55,36 (CH2), 46,84 (CH3).

% In te n s ity

Mariner Spec /8:9 (T /0.60:0.69) ASC[B P = 346.2, 1299] 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 345.49229

346.1461

1299.2

346.3972 346.01918

347.1560 346.5930

347.3387

346.54608

347.07297

347.6674 347.59987

347.8413

0 348.12676

Mass (m /z)

% In te n s ity

ISO:C 22H19NO3 + (H )1 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 345.49229

346.1438

100

347.1471

346.01918

346.54608

347.07297

347.59987

0 348.12676

Mass (m /z)

M/Z teorica (M+1) 346,1438 M/Z trovata (M+1) 346,1461

107


CARATTERIZZAZIONE COMPOSTO 50:

Formula bruta: C30H26N2O4

% I n te n s i ty

Mariner Spec /4:4 (T /0.26:0.26) ASC[BP = 320.0, 1443] 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 478.61980

479.2101

749.8

481.2253

480.2176 479.5187

482.2289 480.5289

479.9466

479.79408

481.5367

480.8297 480.96836

481.7612

482.4903 482.14264

482.8777

483.2207 483.31692

483.5012

484.0712

0 484.49120

Mass (m /z)

% I n te n s i ty

ISO:C30H26N2O4 + (H)1 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 478.61980

479.1965

100

480.1998

481.2027 479.79408

480.96836

482.14264

483.31692

0 484.49120

Mass (m /z)

M/Z teorica (M+1) 479,1965 M/Z trovata (M+1) 479,2101

108


SINTESI DI 5-BENZIL-3,8-DIIDROSSIFENANTRIDIN6(5H)-ONE

24

reagente

PM

MASSA (mg)

49

345,39

50,00

0,14

1,00

AlCl3

133,34

733,00

5,50

39,00

1-dodecantiolo 202,40 prodotto

24

317,34

VOLUME (ml)

MOLI (mmol)

densità

Eq.

2,00 20,00

0,06

PROCEDIMENTO: (Kale, Shinde, Sonar, Shingate, Kumar, & Ghosh, 2010) Il composto 49 (50 mg) è stato posto in un pallone con AlCl3 (733,00 mg) ed 1dodecantiolo (2 ml); il tutto è stato lasciato sotto agitazione a temperatura ambiente. La reazione è stata monitorata con TLC CHCl3/MeOH 9:1. A reazione completata è stata inserita dell’acqua nel pallone e, dopo vigorosa agitazione, è stata fatta un’estrazione con EtOAc; la fase organica è stata anidrificata e portata a secco sotto pressione ridotta. Il residuo liquido ottenuto è stato purificato mediante colonna cromatografica CHCl3/MeOH 9:1 e cristallizzato con CHCl3/n-esano. Sono stati ottenuti 20 mg del composto 24 puro; resa 45%.

109


CARATTERIZZAZIONE: Formula bruta: C20H15NO3

Spettro 1H-NMR δ (acetone): 8,88 (br, 2H, OH), 8,23 (d, J= 8,7 Hz, 1H, HAr), 8,16 (d, J= 8,7 Hz, 1H, HAr), 7,97 (d, J= 3,0 Hz, 1H, HAr), 7,3-7,2 (m, 6H, HAr), 6,83 (d, J= 2,3 Hz, 1H, HAr), 6,79 (dd, J= 8,5 Hz, J= 2,3 Hz, 1H, HAr),5,62 (s, 2H, CH2).

% In te ns ity

Mariner Spec /5:6 (T /0.35:0.44) A SC [B P = 633.2, 12448] 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 315.47300

316.0881

1.2E +4

316.3173 315.97840

316.5328

317.0938

316.7370

316.48380

316.98920

317.3245 317.49460

0 318.00000

Mass (m /z)

% In te n s ity

ISO:C 20H 15N O3 - (H ) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 315.0

316.0979

100

317.1012 318.1040 315.8

316.6

317.4

318.2

0 319.0

Mass (m /z)

M/Z teorica (M-1) 316,0881 M/Z trovata (M-1) 316,0979

110


BIBLIOGRAFIA Aalten, H. L., Koten, G. V., Riethorst, E., & Stamlc, C. (1989). Inorganic Chemistry , 28 (22), 41404146. Ahmad, K., Wang, G., Slaton, J., Unger, G., & Ahmed, K. (2005). Anti-Cancer Drugs , 16, 1037-1043. Ahmad, K., Wang, G., Unger, G., Slaton, J., & Ahmedc, K. (2008). Adv Enzyme Regul. , 48, 179–187. Ahmed, K., Gerber, D. A., & Cochet, C. (2002). Trends Cell. Biol. , 12, 226-230. Allende, J., & Allende, C. (1995). FASEB J. , 9, 313-323. Alvisi, G., Jans, D., Guo, J., Pinna, L., & Ripalti, A. (2005). Traffic , 6, 1002–1013. Arrigoni, G., Marin, O., Pagano, M., Settimo, L., Paolin, B., Meggio, F., et al. (2004). Biochemistry , 43, 12788–12798. Atta-ur-Rahman. (2008). Studies in Natural Products Chemistry (Vol. 35). Baggio, B., Pinna, L. A., Moret, V., & Siliprandi, N. (1970). Biochem. Biophys. Acta , 212, 515-517. Battistutta, R., Mazzorana, M., Sarno, S., Kazimierczuk, Z., Zanotti, G., & Pinna, L. A. (2005). Chem. Biol. , 12, 1211-1219. Beck, C. A., Weigel, L. N., & Edwards, D. P. (1992). Molecular Endocrinology , 6, 607-20. Beletskaya, I., & Cheprakov, A. (2000). Chem. Rev. , 100, 3009-3066. Bialonska, D., Kasimsetty, S. G., Khan, S. I., & Ferreira, D. (2009). J.Agric.Food Chem. , 57, 1018110186. Blanquet, P. R. (2000). Progress in Neurobiology , 60, 211-246. Bronsted, J. N. (1928). Chem. Rev. , 5 (3), 231–338. Brown, W., Foote, C., Iverson, B., & Anslyn, E. (2011). Organic Chemistry (6 ed.). Buech, G., & Weinreb, S. (1971). JACS , 93, 746–752. Burnett, G., & Kennedy, E. P. (1954). J. Biol. Chem. , 211, 969-980. Casado, A., & Espinet, P. (1998). J. Am. Chem. Soc. , 120, 8978-8985. Chantalat, L., Leroy, D., Filhol, O., Nueda, A., Benitez, M., Chambaz, E., et al. (1999). EMBO J. , 18, 2930-2940. Chilin, A., Battistutta, R., Bortolato, A., Cozza, G., Zanatta, S., & Poletto, G. (2008). J. Med. Chem. , 51, 752–759. clinicaltrials.gov. (s.d.). identifier: NCT00891280. Tratto da http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00891280?term=NCT00891280&rank=1 Cohen, P. (2001). Eur. J. Biochem. , 268, 5001-5010. Cozza, G., Bonvini, P., Zorzi, E., Poletto, G., Pagano, M. A., Sarno, S., et al. (2006). J Med. Chem. , 49, 2363-2366.

111


Cozza, G., Bortolato, A., & Moro, S. (2009). Medicinal Research Reviews , 30. Cozza, G., Meggio, F., & Moro, S. (2011). Current Medicinal Chemistry , 18, 2867-2884. Cylene Pharmaceuticals. (s.d.). Tratto da http://www.cylenepharma.com/newsroom/cylene-presentsencouraging-clinical-data-oral-ck2-inhibitor-asco De Moliner, E., Moro, S., Sarno, S., Zagotto, G., Zanotti, G., Pinna, L., et al. (2003). J. Biol.Chem. , 278, 1831–1836. Dixon, D., Sethumadhavan, D., Benneche, T., Banaag, A., Tius, M., Thakur, G., et al. (2010). J. Med. Chem. , 53, 5656–5666. Donati, L., Michel, S., Tillequin, F., & Porée, F. (2010). Org. Lett. , 12, 156-158. Duncan, J., Wilkinson, M., & Burgoyne, R. (2000). Biochem J. , 350, 463–468. Enkvist, E., Lavogina, D., Raidaru, G., A.Vassa, Viil, I., Lust, M., et al. (2006). J.Med.Chem. , 49, 71507159. Fanta, P. (1974). Synthesis , 9-21. Ferguson, A., Sheth, P., Basso, A., Paliwal, S., Gray, K., Fischmann, T., et al. (2011). FEBS Letters , 585, 104–110. Furuta, T., Kitamura, Y., Hashimoto, A., Fuji, S., Tanaka, K., & Kan, T. (2007). Org.Lett. , 9, 183-186. Ghavidel, A., & Schultz, M. C. (2001). Cell. , 106, 575-584. Ghosal, S. (1990). Pure & Applied Chemistry , 62, 1285-1288. Graham, K., & Litchfield, D. (2000). J. Biol. Chem. , 275, 5003–5010. Guerra, B., & Issinger, O. (1999). Electrophoresis , 20, 391-408. Guerra, B., & Issinger, O. (2008). Current Medicinal Chemistry , 15, 1870-1886. Gurel, Z., Ronni, T., Ho, S., Kuchar, J., Payne, K., Turk, C., et al. (2008). J. Biol. Chem. , 283, 82918300. Haggera, J., Depledgeb, M., & Gallowaya, T. (2005). Marine Pollution Bulletin , 51, 811-816. Han, X., Stoltz, B., & Corey, E. (1999). J. Am. Chem. Soc. , 121, 7600-7605. Harino, H., Fukushima, M., & Kawai, S. (2000). Arch. Environ. Contam. Toxicol. , 39, 13-19. Haslam, E., Makinson, G., Naumann, M., & Cunningham, J. (1964). J. Chem. Soc. , 2137. Hung, M., Xu, Z., Lin, Y., Mao, J., Yang, C., Chang, P., et al. (2009). BMC Cancer , 9. Hunter, T. (1991). Methods in Enzymology , 200, 3-37. Hutti, J., Jarrell, E., Chang, J., Abbott, D., Storz, P., & Toker, A. (2004). Nature Methods. 1, 27–29. Inaba, T., Umezawa, I., Yusa, M., Mihashi, S., & H.Itokawa. (1987). J.Org.Chem. , 52, 2957. Ingebritsen, T. S., & Cohen, P. (1983). Science , 221, 331-338.

112


Ivanov, K., Puustinen, P., Gabrenaitea, R., Vihinena, H., Rönnstrand, L., Valmua, L., et al. (2003). The Plant Cell , 15, 2124-2139. Jans, D. A., & Hubner, S. (1996). Physiol. Rev. , 76 (3), 651-685. Jursic, B., & Patel, P. (2005). Tetrahedron , 61, 919-926. Kale, B., Shinde, A., Sonar, S., Shingate, B., Kumar, S., & Ghosh, S. (2010). Tetrahedron Letters , 51, 3075–3078. Kim, G., Jung, J., Niizuma, K., & Chan, P. (2009). J Neurosci. , 29, 14779–14789. Lasa, M., Marin, O., & Pinna, L. A. (1997). Eur. J. Biochem. , 243, 719-725. Lasa, M., Marin, O., Meggio, F., & Pinna, L. A. (1996). FEBS Lett. , 382, 149-152. Lawson, E., Luci, D., Ghosh, S., Kinney, W., Reynolds, C., Qi, J., et al. (2009). J. Med. Chem. , 52, 7432–7445. Litchfield, D. W. (2003). Biochem. J. 369, 1-15. Marin, O., Meggio, F., & Pinna, L. (1999). Biochem. Biophys. Res. Commun. , 256, 442-446. McOmie, J., Watts, M., & West, D. (1968). Tetrahedron , 24, 2289. Meggio, F., & Pinna, L. (2003). FASEB J. , 17, 349-368. Meggio, F., Donella Deana, A., Ruzzene, M., Brunati, A. M., Cesaro, L., Guerra, B., et al. (1995). Eur. J. Biochem. , 234, 317-322. Meggio, F., Marin, O., Boschett, M., Sarno, S., & Pinna, L. A. (2001). Molecular and Cellular Biochemistry , 227, 145–151. Meggio, F., Pagano, M. A., Moro, S., G., Z., Ruzzene, M., Sarno, S., et al. (2004). Biochemistry , 43, 12931-12936. Meggio, F., Shugar, D., & Pinna, L. (1990). Eur. J. Biochem. , 187, 89-94. Mondal, S., Ghosh, S., & Verma, S. (2010). Tetrahedron Letters , 51 (5), 856-859. Morgan, B., Mulrooney, C., O’Brien, E., & Kozlowski, M. (2010). J. Org. Chem. , 75, 30–43. Neises, B., & Steglich, W. (1978). Angew. Chem. Int. , 17, 522–524. Niefind, K., Guerra, B., Pinna, L. A., Issinger, O., & Schomburg, D. (1998). Embo J. , 17, 2451-2462. Nishizuka, Y. (1995). 9, 484-496. Padmnabha, R. (1990). Mol. Cell. Biol. , 10, 4089-4099. Pagano, M. A., Andrzejewska, M., Ruzzene, M., Sarno, S., Cesaro, L., Bain, J., et al. (2004). J. Med Chem. , 47, 6239-6247. Pagano, M. A., Poletto, G., Di Maria, G., Cozza, G., Ruzzene, M., Sarno, S., et al. (2007). Chembiochem , 8, 129-139. Paliakov, E., & Strekowski, L. (2004). Tetrahedron Letters , 45, 4093–4095.

113


Peet, N., Dickerson, G., Abdallah, A., Daly, J., & Ukena, D. (1988). J . M e d . C h e m . , 31, 2034-2039. Peña, J. M., Itarte, E., Domingo, A., & Cusso, R. (1983). Cancer Res. , 43, 1172-1175. Pepperkok, R., Lorenz, P., Ansonge, W., & Pyperin, W. (1994). J. Biol. Chem , 269, 6986-6991. Perez, D. I., Gil, C., & Martinez, A. (2010). Med. Research Reviews . Pierre, F., Chua, P., O’Brien, S., Siddiqui-Jain, A., Bourbon, P., Haddach, M., et al. (2011). J. Med. Chem. , 54, 635–654. Pierre, F., O’Brien, S., Haddach, M., Bourbon, P., Schwaebe, M., Stefan, E., et al. (2011). Bioorg. Med. Chem. Lett , 21, 1687–1691. Pinna, L. A. (1997). Int. J. Biochem. Cell. Biol. , 29, 551-554. Pinna, L. A. (2002). Journal of Cell Science , 115, 3873-3876. Pinna, L. A., & Meggio, F. (1997). Prog Cell Cycle Res. , 3, 77-97. Pinna, L. A., Baggio, B., Moret, V., & Siliprandi, N. (1969). Biochem. Biophys. Acta , 178, 199-201. Punna, S., Meunier, S., & Finn, M. (2004). Org. Lett. , 6 (16), 2777–2779. Ramos, M., Prudent, R., Moucadel, V., Sautel, C., C.Barette, Lafanechère, L., et al. (2010). FASEB J. , 24. Robinson, R. (1917). Chem. Soc. , 111, 762. Ruzzene, M., Brunati, A., Sarno, S., Marin, O., Donella, A., & Pinna, L. (2000). Eur J Biochem. , 267, 3065–3072. Sarno, S., Moro, S., Meggio, F., Zagotto, G., Benb, D. D., Ghisellini, P., et al. (2002). Pharmacology & Therapeutics , 93, 159–168. Sarno, S., Papinutto, E., Franchin, C., Bain, J., Elliot, M., Meggio, F., et al. (2011). Current Topics in Medicinal Chemistry , 11 (11), 1340-1351. Schopf, C., Lehmann, G., & Arnold, W. (1937). Angew. Chem. , 50, 779. Schrenk, W., & Snaar Jagalska, B. (1999). Biochimica et Biophysica Acta , 1449, 1-24. Selkoe, D. (1997). Science , 275, 630-631. Ssyszka, R., Grakowski, N., Felczak, K., & Shugar, D. (1995). Biochem. Biophys. Res. Commun. , 208, 418-424. Stille, J. (1986). Angewandte Chemie Int. Ed. , 25, 508–524. Suzuki, T., Okada, C., Arai, K., & Awaji, A. (2001). J. Heterocyclic Chem. , 38, 1409. Tian, H., Vogel, R., Amic, L., Tamagnan, G., & Baldwin, R. (2006). J Label Compd Radiopharm , 49, 1247–1258. Tietze, L. (1996). Chem.REv. , 96, 115-136. Unger, G., Davis, A., Slaton, J., & Ahmed, K. (2004). Current Cancer Drug Targets , 4, 77-84.

114


Venter, J. C., Adams, M., Myers, E., Li, P., Mural, R., Sutton, G., et al. (2001). Science , 291, 1304-1351. Walsh, D. N., & Van Patten, S. M. (1994). FASEB J. , 8, 1227-1236. Xu, X., Rich, E. S., & Seldin, D. C. (1998). Genomics , 48, 79-86. Ye, J., Abiman, P., Crossley, A., Jones, J., Wildgoose, G., & Compton, R. (2010). Langmuir , 26 (3), 1776–1785. Zawada, K., Wolniak, M., Kazimierczuk, K., & Wawer, I. (2009). J. of Mol. Struct. , 918, 174–182.

115


116


RINGRAZIAMENTI: Un ringraziamento particolare al Prof. Zagotto, a Riccardo e a Francesca per aver fatto di questo periodo di tesi un’esperienza unica, grazie per i vostri preziosi aiuti. Grazie anche ai miei colleghi di laboratorio Martina, Giovanni, Arianna ed Alessandro: ho passato momenti bellissimi, etanditiolo a parte, anche nelle fasi “buie” delle mie sintesi (so che potete capirmi). Un altro ringraziamento speciale ai miei genitori, che mi hanno sostenuta in questi cinque anni, senza di voi forse non ce l’avrei fatta. Grazie anche ai miei nonni…grazie a tutti quelli che hanno creduto in me. “Ultimo ma non ultimo” grazie alle mie amiche nonché compagne di corso Elisa, Elena ed Anna, per aver rallegrato mattine, pomeriggi e serate di questi ultimi cinque anni. Ed ora…che la festa abbia inizio.

117


Sintesi di inibitori di CK2 - Synthesis of CK2 inhibitors  

Graduation thesis - Padua University (Italy)

Advertisement
Read more
Read more
Similar to
Popular now
Just for you