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EFECTO DE LAS CONDICIONES DE AGITACIĂ“N Y AIRACIĂ“N EN LA PRODUCCIĂ“N DE GIBERELINAS POR G. fujikuroi, EN UN CULTIVO TETRAFASICO MICELAR Ma. de la Luz X. Negrete RodrĂ­guez, M. D. GonzĂĄlez Llanes, F. R. Reyes GarcĂ­a, Eleazar M. Escamilla Silva Departamento de IngenierĂ­a QuĂ­mica, Instituto TecnolĂłgico de Celaya Av. TecnolĂłgico y A. GarcĂ­a Cubas S/N. Celaya, Guanajuato, 38010, MĂŠxico. Resumen Las giberelinas (GAs) son hormonas promotoras del crecimiento, presentes en las plantas superiores y que tienen efecto en todas las etapas del crecimiento; desde la germinaciĂłn hasta la senescencia. En la actualidad estĂĄn identificadas y caracterizadas 126 GAs en plantas y caldos de cultivo de hongos y bacterias, pero sĂłlo una tercera parte presentan actividad biolĂłgica; las mĂĄs importantes son GA1, GA3, GA4, GA7. La giberelina GA3, tambiĂŠn llamada ĂĄcido giberĂŠlico, es la mĂĄs representativa de las biolĂłgicamente activas. En la producciĂłn de GAs es determinante el estudio de parĂĄmetros de proceso como el pH, la temperatura, el tipo de propelas, la velocidad de agitaciĂłn y el suministro de gas permiten establecer las mejores condiciones de crecimiento del hongo para la biosĂ­ntesis de GAs, y asĂ­ obtener la mayor productividad del bioproceso

IntroducciĂłn La fermentaciĂłn con microorganismos filamentosos, en biorreactores con agitaciĂłn mecĂĄnica es compleja, debido a que con el incremento de la biomasa en el curso del cultivo se afecta la hidrodinĂĄmica y la transferencia de oxĂ­geno [5,6,8]; estos aspectos son particularmente importantes en el cultivo de hongos filamentosos ya que tanto la generaciĂłn de biomasa como la producciĂłn de diversos metabolitos dependen de ĂŠstos factores, como consecuencia de la disminuciĂłn de la transferencia de masa, la productividad para el metabolito de interĂŠs se ve disminuida [3,6,7]. Al incrementar la velocidad de agitaciĂłn se puede mejorar la transferencia de oxĂ­geno y disminuir los problemas de mezclado, sin embargo, tambiĂŠn se incrementa la energĂ­a suministrada y la frecuencia a la que el microorganismo circula por la regiĂłn del impulsor. En la regiĂłn cercana al impulsor, los esfuerzos de corte son mayores que en la regiĂłn cercana a la pared del biorreactor, este gradiente se incrementa con el aumento de la biomasa. Entonces, las limitaciones en el mezclado y en la transferencia de oxĂ­geno aumentan a medida que transcurre el tiempo de cultivo, debido al aumento de la viscosidad aparente. El incremento de la viscosidad aparente tambiĂŠn es resultado de la interacciĂłn entre las delgadas, largas y ramificadas hifas del hongo [1]. El aumento en los esfuerzos de corte, puede provocar la fragmentaciĂłn de las hifas, lo que puede afectar negativamente la productividad del metabolito de interĂŠs. MetodologĂ­a Se estableciĂł un aceite vegetal como Ăşnica fuente de carbono, que presentĂł mayor producciĂłn de GAs. Posteriormente se estudiaron diferentes condiciones hidrodinĂĄmicas mediante la aplicaciĂłn de un diseĂąo experimental fraccionado completo, de donde se seleccionĂł el arreglo de propelas a usar, la velocidad de alimentaciĂłn del gas de alimentaciĂłn y la velocidad de agitaciĂłn. Teniendo optimados estos parĂĄmetros se realizĂł el cultivo a dos pH superiores.

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Establecida la fuente de carbono, las condiciones de agitaciรณn/aireaciรณn y el pH de cultivo que reportaron la mayor productividad de GA3, se realizaron cultivos ahora a velocidades de agitaciรณn superiores (mayor energรญa suministrada). En cada uno de los bloques de experimentos mencionados se analizรณ el efecto de las condiciones de cultivo en el crecimiento de G. fujikuroi, la biosรญntesis de GA3, GA4 y GA7 y productividad de GA3. La estrategia experimental seguida en este trabajo se muestra en la Tabla 1. Las condiciones de cultivo asรญ como la formulaciรณn del medio de cultivo se presentan para cada bloque de experimentos.En la Tabla 2 se presentan los niveles para los factores estudiados. Tabla 1: Estrategia de experimentaciรณn.

Selecciรณn de la fuente de carbono Aceite de arroz Aceite de girasol Aceite de soya Aceite de cรกrtamo

Efecto de la velocidad de la Efecto de la agitaciรณn/aeraciรณn Efecto del PH agitaciรณn Factor A: Arreglo de propelas 3R y 2RM PH de 3.5 500 rpm Factor B: Vel. de agitaciรณn, 500 y 600 rpm PH de 4.5 600 rpm Factor C : Flujo de gas, 0.5 y 1.0 vvm PH de 5.5 700 rpm 800 rpm 900rpm

Tabla 2. Niveles para los factores estudiados en el efecto de la velocidad de agitaciรณn/aireaciรณn sobre la producciรณn de GAs.

Factor

Nivel 1 Nivel 2

A-arreglo de propelas

3R

2RM

B-velocidad de agitaciรณn, rpm 500

600

C-flujo de gas (aire), vvm

1.0

0.5

Se empleรณ un diseรฑo experimental factorial completo 23,usando dos tipos de arreglo de propelas: Uno con tres propelas Rushton y otro con dos Rushton y una marinera. La velocidad de agitaciรณn se trabajรณ a 500 y 600 rpm y el flujo de aire fue de 0.5 y 1.0 vvm. Resultados y discusiรณn Las fuentes y concentraciรณn de los diferentes nutrientes en el medio de cultivo se establecieron a partir de trabajos [2,4]. Los aceites vegetales, como el aceite de linaza, de girasol, de oliva y de algodรณn, estรกn reportados como una buena opciรณn en la producciรณn de GAs, ya que reportaron incrementos del 300 al 559% en el rendimiento de GAs; con respecto al uso de sacarosa como fuente de carbono. El incremento en el rendimiento de GAs se atribuye a que los aceites son inertes a la represiรณn catabรณlica por carbono y a que favorecen la disponibilidad de acetil-CoA [9]; pero tambiรฉn a que pueden comportarse como vectores de oxรญgeno, favoreciendo la concentraciรณn de oxรญgeno disuelto en el medio de cultivo.

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La Figura1 muestra las curvas de crecimiento de G. fujikuroi obtenidas con los diferentes aceites empleados como รบnica fuente de carbono; las cuales no presentaron la fase de adaptaciรณn, debido a que el medio de cultivo empleado estuvo limitado por nitrรณgeno.

Figura 1. Cinรฉtica de crecimiento de G. fujikuroi empleando aceites vegetales

La biomasa acumulada en la fase de balance (I) fue muy similar (10-14 g l-1) con los aceites de cรกrtamo, girasol y arroz, pero inferior con el aceite de soya. La mรกxima biomasa en la etapa de almacenamiento (II) mostrรณ relaciรณn con la composiciรณn de รกcidos grasos saturados de los diferentes aceites, lo anterior se muestra en la Figura 2. El aceite de arroz, que tiene con la mayor composiciรณn de รกcidos grasos saturados, reportรณ la menor biomasa y los aceites con menor composiciรณn de estos รกcidos grasos reportaron la mayor biomasa; esto se atribuye a que los รกcidos grasos insaturados presentan mayor facilidad en su transporte a las cรฉlulas que los รกcidos grasos saturados.

Figura 2. Mรกxima biomasa lograda con cada uno de los aceites vegetales y su relaciรณn con la composiciรณn de A.G.S. A.G.S-รกcidos grasos saturados A.G.M-รกcidos grasos mono-insaturados, A.G.P.-รกcidos grasos poli-insaturados.

La etapa de mantenimiento (III), es la de mayor interรฉs en el cultivo para la producciรณn, ya que es donde se presenta la producciรณn de GAs; el aceite de arroz presentรณ la etapa de mantenimiento mรกs larga. La etapa de disminuciรณn de la biomasa (IV) se presentรณ con el aceite de cรกrtamo y el aceite de soya, y el que รฉsta etapa se presente, es indicaciรณn de que las reservas de carbohidratos y lรญpidos se han agotado o no fueron suficientes para mantener la biomasa y por lo tanto la biosรญntesis de GAs se verรก afectada. Las curvas de crecimiento obtenidas fueron bien descritas por el modelo de Gompertz, con coeficientes de correlaciรณn mayores a 0.99 y sin tendencia en las grรกficas de dispersiรณn. El modelo

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de Gompertz con dos parรกmetros fue adecuado para describir las curvas de crecimiento, sin embargo, cuando se presentรณ disminuciรณn en la biomasa el modelo de Gompertz con tres parรกmetros presentรณ mejor correlaciรณn, por lo que se decidiรณ trabajar con รฉl para describir las cinรฉticas de crecimiento de G. fujikuroi en el desarrollo de รฉste trabajo. Las encontradas con los diferentes aceites fueron de 1.37x10-2 a 3.45x10-2 h-1, la menor la reportรณ el aceite de soya y la mayor el aceite de arroz. Las curvas de crecimiento obtenidas se presentan en la Figura 3. La mรกxima biomasa obtenida en los cultivos realizados con el arreglo de propelas 3R fue superior, independientemente de la velocidad de agitaciรณn y aireaciรณn a la encontrada en los cultivos realizados con el arreglo de propelas 2RM. En promedio, los cultivos con las propelas 2RM reportaron 15 g l-1 de biomasa mรกxima, con una desviaciรณn estรกndar de 1.54, mientras que las fermentaciones con las propelas 3R reportaron 20.81 g l-1 de biomasa mรกxima, con una desviaciรณn estรกndar de 1.64. La biomasa mรกxima promedio de los cultivos realizados fue de 17.91 g l-1,con desviaciรณn estรกndar de 4.10.

Figura 3. Cinรฉticas de crecimiento de G. fujikuroi bajo diferentes condiciones de agitaciรณn/aireaciรณn (diseรฑo 2 3)

El anรกlisis de varianza de la mรกxima biomasa reportรณ que el arreglo de propelas fue el รบnico factor significativo, con confianza de 95%. En la Figura 4a se muestra la grรกfica de superficie de respuesta para la productividad en funciรณn del arreglo de propelas y velocidad de agitaciรณn. Donde se observรณ que el arreglo de propelas 3R a 600 rpm incrementรณ la productividad. La Figura 4b muestra la superficie de respuesta de la productividad en funciรณn del arreglo de propelas y del flujo de aire, donde se observรณ que el arreglo 3R y el flujo de 1 vvm de gas favorecieron la productividad. La Figura 4c muestra la superficie de respuesta de la productividad en funciรณn de la velocidad de agitaciรณn y el flujo de aire, en esta grรกfica se observรณ que 600 rpm y 1 vvm de aire incrementaron la productividad.

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Figura 4. Superficie de respuesta para la productividad de GA3 en funciรณn: a) del arreglo de propelasy de la velocidad de agitaciรณn, b) del arreglo de propelas y del flujo de aire, y c)de la velocidad de agitaciรณn y del flujo de aire.

El anรกlisis estadรญstico sobre la productividad de GA3 mostrรณ que el arreglo de propelas 3R, la mayor velocidad de agitaciรณn, 600 rpm, y de aireaciรณn, 1 vvm, favoreciรณ la productividad. Los diferentes experimentos generaron como ya se mencionรณ diferentes condiciones de suministro de oxรญgeno, pero ademรกs las diferentes condiciones de operaciรณn influyeron en la dispersiรณn de la fase orgรกnica (aceite vegetal) en el medio de fermentaciรณn. Conclusiones Se encontrรณ una relaciรณn inversa entre la composiciรณn de รกcidos grasos saturados de los diferentes aceites estudiado con la mรกxima biomasa lograda; el aceite de arroz que presenta la mayor composiciรณn de รกcidos grasos saturados, reportรณ la menor biomasa. El medio de cultivo formulado para estudiar la producciรณn de GA3, empleando como รบnica fuente de carbono diferentes aceites vegetales, reportรณ las mรกs altas concentraciones de GA3 con aceite de arroz y con aceite de cรกrtamo. El cultivo con aceite de arroz reportรณ la mayor productividad de GA3; ademรกs, tambiรฉn reportรณ uno de los mรกs bajos rendimientos y productividades para GA7. El cultivo con aceite de cรกrtamo reportรณ la segunda mayor productividad para GA3, pero la mayor

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para GA7. Reformulando el medio de cultivo se logrĂł incrementar la productividad de GA3 empleando aceite de arroz como Ăşnica fuente de carbono. Las diferentes condiciones hidrodinĂĄmicas estudiadas no presentaron un claro efecto sobre la . En general, la mĂĄxima biomasa obtenida fue mayor con el arreglo de propelas 3R que con el arreglo de propelas 2RM. Sin embargo, sĂ­ se observĂł un claro efecto en la producciĂłn de GA 3, los cultivos con el arreglo de propelas 3R reportaron las mayores productividades de GA3. El arreglo de propelas 3R (D/d=3), 600 rpm y 1 vvm de gas (aire) reportĂł la mayor productividad de GA3. SĂłlo el cultivo a 600 rpm mostrĂł un efecto en la . Al incrementar la velocidad de agitaciĂłn (energĂ­a suministrada) se favoreciĂł la disminuciĂłn del tiempo en que se alcanzĂł la mayor concentraciĂłn de GA3. Referencias 1. Cui YQ, van der Lans R.G.J.M. y K.Ch.A.M. Luyben. Effect of agitation intensities on fungal morphology of submerged fermentation.Biotechnology and Bioengineering, (1997). 2.Escamilla-Silva, E. M., Dendooven, L., Uscanga-Reynell, J.A., Monroy-RamĂ­rez, A.I., GonzĂĄlez-Alatorre, G. y M. M. de la Torre.Morphological development and gibberellin production by different strain of Gibberellafujikuroi in shake flask and biorreactor. World Journal of Microbiology and Biotechnology, (1999). 3. Galindo, E., Velasco, D. y A. SĂĄnchez. ReologĂ­a y mezclado de caldos de fermentaciĂłn de alta viscosidad. Fronteras en BiotecnologĂ­a y BioingenierĂ­a. (1996). 4. GĂşzman, G. Y. “ObtenciĂłn de giberelinas utilizando diversas fuentes de carbonoâ€?. Tesis de Licenciatura en IngenierĂ­a QuĂ­mica. ITC. Celaya, Guanajuato. MĂŠxico.(2000). 5. Kossen, N.W.F., The morphology of filamentous fungi. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnoogy, (2000). 6. Papagianni, M., Fungal morphology and metabolite production in submerged micelial processes. Biotechnology Advances, (2004. 7. PatiĂąo, V. M., “Establecimiento de un proceso de fermentaciĂłn sumergida para la producciĂłn de ĂĄcido giberĂŠlico a nivel laboratorio y su escalamiento a planta pilotoâ€?. Tesis de MaestrĂ­a en BiotecnologĂ­a. Instituto de BiotecnologĂ­a, UNAM, Cuernavaca, Morelos. (1995). 8. Riley G.L., Tucker K.G., Paul G.C. y C.R. Thomas. Effect of biomass concentration and mycelial morphology on fermentation broth rheology.Biotechnology and Bioengineering, (2000). 9. Tudzynski, B y K. Holter., Gibberellin biosynthetic pathway in Gibberellafujikuroi: evidence for gene cluster. Fungal Genetics and Biology,(1998).

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Mezclado en reactores de tipo tanque