Page 1

MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE

MEDICINSKI FAKULTET RIJEKA Braće Branchetta 20 Rijeka

MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERKULOZE

Kolegij: Laboratorijska dijagnostika tuberkuloze Voditeljica kolegija: prof.dr.sc. Brigita Tićac, dr.med.

II. godina MLD izvanredni Rijeka, svibanj 2014.


MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE

Sadržaj 1. UVOD .................................................................................................................................................. 3 1.1. TUBERKULOZA I KLINIČKE MANIFESTACIJE ................................................................................... 3 1.1.1. EPIDEMIOLOGIJA.................................................................................................................... 4 1.1.2. PATOGENEZA ......................................................................................................................... 4 1.2 MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS (taksonomija. morfologija, patogenost) ................................... 6 1.3 NACIONALNI NAPUTAK ZA SUZBIJANJE TUBERKULOZE U RH......................................................... 8 2. MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERKULOZE ................................................................................ 13 2.1. PRIKUPLJANJE,TRANSPORT I POHRANJIVANJE UZORKA ............................................................... 13 Opća načela uzimanja uzoraka ....................................................................................................... 13 2.2 MIKROBIOLOŠKA OBRADA UZORKA ............................................................................................ 15 2.2.1 PRIPREMA UZORKA .............................................................................................................. 16 2.2.2 MIKROSKOPSKA PRETRAGA ................................................................................................... 17 2.2.2.1. Dokazivanje prisutnosti bacila tuberkuloze u mikroskopskim preparatima obojenim po Ziehl-Neelsenu ............................................................................................................................... 19 2.2.3 KULTIVACIJA.......................................................................................................................... 21 2.2.3.1. Čvrste podloge .............................................................................................................. 22 2.2.3.2. Tekuće podloge............................................................................................................. 24 2.2.3.3.Testovi ispitivanja osjetljivosti na antituberkulotike ....................................................... 28 2.2.4. DETEKCIJA ANTIGENA .......................................................................................................... 29 2.2.5. MOLEKULARNA DIJAGNOSTIKA TUBERKULOZE ..................................................................... 31 2.3. PPD-TEST .................................................................................................................................... 33 2.4 IGRA ( interferon-gamma release assay )...................................................................................... 35 QuantiFERON – TB Gold In – Tube .............................................................................................. 35 2.4.2 Opis postupka ....................................................................................................................... 36 Literatura ............................................................................................................................................. 39

2


MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE

1. UVOD 1.1. TUBERKULOZA I KLINIČKE MANIFESTACIJE Tuberkuloza je zarazna bolest koju uzrokuje Mycobacterium tuberculosis (Kochov bacil) od koje su bolovali i ljudi u pred povijesno doba, a pronađena je i na skeletu egipatskih mumija koje datiraju čak i do 3000 godina prije Krista. Kulminacija zaraze tuberkulozom odvijala se tijekom 17-og i 18-og stoljeća. Najveće zasluge u borbi protiv tuberkuloze pripadaju Robertu Kochu koji je 24. ožujka 1882. godine objavio otkriće uzročnika tuberkuloze, pa se po njemu uzročnik tuberkuloze još naziva i Kochov bacil.

Mycobacterium tuberculosis tipično zahvaća pluća ali može zahvatiti i druge organe kao što su mozak, bubrezi i kosti. Prenosi se kapljičnim putem, zrakom, kihanjem i kašljanjem. U većini slučajeva bolest je asimptomatska i latentna, ali u jednom od oko 10 slučajeva napreduje u aktivnu bolest. Neliječena TBC dovodi do smrti u više od 50% bolesnika. Klasični simptomi aktivne TBC infekcije su kronični kašalj s hemoptizom (krvavi iskašljaj), vrućica, noćno znojenje i mršavljenje. Tuberkuloza se još naziva i sušica upravo zbog toga što bolesnici gube tjelesnu masu. Za postavljanje dijagnoze koriste se radiološke slike pluća, mikroskopske pretrage tjelesnih tekućina i mikrobiološki uzgoj uzročnika bolesti. U liječenju tuberkuloze koriste se antibiotici - antituberkulotici: streptomicin, pirazinamid, etambutol, izonijazid i rifampicin. Sredinom dvadesetog stoljeća u liječenje se uvodi i kemoterapija. Prevencija se provodi cijepljenjem djece cjepivom BCG (Calmette-Guerin) koje je obavezno u Republici Hrvatskoj. Iako se smatralo da je tuberkuloza pobijeđena bolest, krajem 70-ih i 80-ih godina dvadesetoga stoljeća javlja se ponovno suočavanje sa tuberkulozom zbog pojave virusa HIV-a koji dovodi do gubitka imunosti, te su takvi bolesnici izuzetno podložni razvijanju tuberkuloze. Tuberkuloza je još uvijek najčešća zarazna bolest u svijetu. Prema podacima SZO-a jedna trećina svjetske populacije zaražena je Mycobacterium tuberculosis, najvećim dijelom na području Azije. 24. ožujak obilježava se kao svjetski dan borbe protiv tuberkuloze. LITERATURA:

hr.wikipedia.org/wiki/sušica,

skripta prof.dr.sc. Brigite Tićac

KRISTINKA MRVOŠ

3


MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE

1.1.1. EPIDEMIOLOGIJA

Mycobacterium tuberculosis je obligatni uzročnik bolesti u ljudi. Čovjek je jedini prirodni domaćin, bolest se prenosi s bolesne na zdravu osobu udisanjem inficiranog aerosola koji nastaje pri govoru, kašljanju i kihanju. Aerosol može nastati i tijekom indukcije iskašljaja, liječenja, bronhoskopije ili rukovanjem inficiranim uzorcima u bolnici i laboratoriju. Najugroženije su osobe u prisnom kontaktu s oboljelima, naročito djeca. Tuberkuloza ostaje jedna od najsmrtonosnijih bolesti u svijetu, zahvaća znatan dio svjetske populacije. Procjenjuje se da se svake godine pojavi oko 8-9milijuna novih slučajeva i približno 2-3 milijuna osoba umire. Veliki broj slučajeva bolesti javlja se kod osoba zaraženih HIV infekcijom stoga je najveća stopa incidencije tuberkuloze u subsaharskoj Africi gdje je prevalencija HIV infekcije vrlo visoka. 1.1.2. PATOGENEZA U većini slučajeva primarna infekcija s bacilima tuberkuloze dogodi se jednom u životu. Studije su pokazale da 10% inficiranih osoba razvija aktivni oblik bolesti tijekom života. Razvoj bolesti u prvih 1-2 godine nakon infekcije nazivamo primarnom tuberkulozom. Primarna tuberkuloza naziva se i prvotnom infekcijom ili dječjom tuberkulozom a označava infekciju u nesenzibiliziranom domaćinu. Mjesto prve infekcije naziva se Ghonovo žarište, i najčešće je smješteno subpleuralno iznad ili ispod interlobarne fisure. Nakon ulaska u alveole mikobakterije se najprije nesmetano umnožavaju, dok ne nastupi stanična reakcija u kojoj dominiraju CD4 limfociti i makrofagi. Makrofagi fagocitiraju bacile pokušavajući ih otkloniti stoga može se reći da imaju ključnu ulogu u reakciji na Mycobacterium tuberculosis. Aktivaciji makrofaga značajno pridonosi interferon γ. Nakon digestije fagocitiranih bacila makrofagi prezentiraju antigene CD4 limfocitima pri čemu nastaju karakteristični granulomi-tuberkuli koji su karakteristični za reakciju kasne preosjetljivosti. Aktivirani se makrofagi diferenciraju u epiteloidne stanice ili se udružuju u Langerhansove divovske stanice. U središtu tuberkula dolazi do odumiranja epiteloidnih stanica, dolazi do nastanka kazeozne nekroze.

4


MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE

Slijed događaja pri primarnoj pulmonalnoj tuberkulozi, što započinje inhalacijom virulenta M.tuberculosis i kulminira razvojem staničnog imunog odgovora na organizam. (A) označava događaje u prva 3 tjedna nakon izlaganja, a (B) događaje poslije. Razvoj otpornosti na organizam popraćen je pojavom pozitivnog tuberkulinskog testa. [iNOS - inducible nitric oxide synthase; MHC - major histocompatibility complex; MTB - M.tuberculosis; NRAMP1 - natura resistance-associated macrophage protein].

Makrofazi fagocitiranjem bacila uklanjaju velik broj uzročnika ali neke bakterije ipak prežive unutar makrofaga. S obzirom na to da je Mycobacterium tuberculosis fakultativni unutarstanični patogen u nekim slučajevima dolazi do razmnožavanja Mycobacterium tuberculosis unutar makrofaga. Mnogi makrofagi nakrcani bacilima budu uništeni, a mikobakterije se brzo šire kroz plućne limfne žile u regionalne limfne čvorove. U limfnim čvorovima razvije se tuberkulozna upala, a čvorovi se znatno povećaju. Primarna plućna promjena zajedno sa zahvaćenim regionalnim limfnim čvorovima naziva se Ghonov kompleks.Ishod primarne tuberkulozne infekcije ovisi o: virulenciji mikobakterija, broju mikobakterija koje su ušle u pluća, prirodnoj otpornosti organizma i sposobnosti organizma da mobilizira limfocite i počne stavarati granulome. Na latentno preboljelu upalu upućuje pozitivan tuberkulinski test. Aktivna plućna tuberkuloza najizraženija je u djece predškolskog uzrasta kod kojih dolazi do razvoja limfadenitisa hilusa i hematogene diseminacije. U starije dijece i adolescenata dominira limfadenopatija uz dugogodišnju regresiju i kalcifikaciju žarišta. U imunosuprimiranih ili kahektičnih bolesnika koji nemogu mobilizirati CD4 limfocite u obrani od infekcije, bacili tuberkuloze mogu ući u limfne ili krvne žile i bronhe i proširiti se po plućima u obliku milijarne tuberkuloze. U bolesnika koji su preboljeli primarnu tuberkulozu i razvili staničnu imunost protiv

5


MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE

bacila tuberkuloze razvija se sekundarna tuberkuloza, koja može biti posljedica reinfekcije ili reaktivacije bacila koji su ostali u latentnom stanju u ovapnjenim žarištima primarne tuberkuloze. Javlja se eksudativni tip pneumonije s kazeifikacijom i kavernama. Klinički znakovi bolesti su: umor, slabost, gubitak apetita i tjelesne težine, subfebrilna temperatura i noćno znojenje. Plućnu tuberkulozu prati dugotrajni kašalj. Meningitis se može razviti postepeno uz glavobolje i ispade funkcija moždanih živaca a milijarna tuberkuloza je akutni oblik diseminirane infekcije u više organa karakteriziran mnogobrojnim čvorićima – tuberkulima uz visoku temperaturu i tresavicu te visoku smrtnost. U odrasloj dobi primarni oblik bolesti ne razlikuje se od sekundarnog. LITERATURA: 

G.Mlinarić Galinović, M.Ramljak Šeko i suradnici, Specijalna medicinska mikrobiologija i parasitologija

www.perpetuum-lab.com.hr/wiki/mikrobiologija tuberkuloze

SANDRA PAVLETIĆ

1.2 MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS (taksonomija. morfologija, patogenost) Rodu Mycobacterium pripada više od 100 vrsta koje su široko rasprostranjene u prirodi osobito u vodenim sredinama. Razlikuju se s obzirom na brzinu rasta te ih dijelimo na brzo i sporo rastuće mikrobakterije. Za ljude su kao obligatni patogeni značajni pripadnici svrstani u Mycobacterium tuberculosis kompleks (M. tuberculosis. M. caprae, M. bovis M. africanum) uzročnici tuberkuloze i vrsta M. lepre koja u čovjeka uzrokuje lepru. Po užetu nazvanih corde serpentine fenomen. Za uzgoj mikro bakterija koriste se različita obogaćena umjetna hranilišta a najčešće Lӧwenstein – Jensen (LJ) podloga koja sadrži jaja, glicerol, krumpirovo brašno i malahitno zelenilo koje inhibira rast drugih bakterija. Na čvrstim hranilištima kolonije uzročnika tuberkuloze se uočavaju tek nakon 2 do 8 tjedana inkubacije u aerobnim uvjetima na 350 C do 370C. Kolonije su obično blijede do svijetložute boje, nepravilnih rubova, suhe, izdignute i neravne nalik cvjetači. Pripadnici M. tuberculosis kompleksa su nepokretni, nesporogeni štapići bez kapsule. U preparatima se uočavaju kao ravni ili lagano savijeni pojedinačni štapići u manjim nakupinama dok se u tekućim podlogama pojavljuju u vidu dugačkih, isprepletenih mikrokolonija. Uzročnici tuberkuloze preživljava u mlijeku, organskim materijalima i okolišu sve dok do njih ne dospiju UV zrake na koje su izuzetno osjetljivi. Osjetljivi su na temperature pasterizacije, alkohol, glutaraldehid, hipokloite i fenolne dezinficijese. U odnosu na druge bakterije rezistentnije su na djelovanje kiselina, baza i kvaternih amonijevih spojeva. Teško bojenje uzročnika tuberkuloze je razlog da je otkriven dugo iza upoznavanja njegove prenošljivosti. Kochu je pomogao slučaj. Zaboravio je na preparatima bojilo i da bi grešku

6


MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE

popravio odbrojavao ih je sodom. Urođena znatiželja ga je privukla mikroskopu da bi vidio i te „pokvarene“ preparate. Ta znatiželja bila je nagrađena otkrićem bacila. Što je zauvijek proslavilo njegovo ime. Mycobacterium tuberculosis Morfološka građa:    

Nepokretan štapić (bacil) Asporogen 2 – 4 µm duljine 0.2 – 0.5 µm širine

Obligatni aerob, fakultativni unutar stanični parazit, karakterističan po građi staničnog zida jedinstvenog među prokariotima i ključnog za virulenciju. Virulencija onemogućava učinak kationskih proteina, lizozima i radikala kisika u granulama fagocita. Štiti ekstra celularne bacile od deponiranja komplementa u serumu. Sadrži preko 60 % lipida, peptidoglikane, arabinomanane, 50 % mikolične kiseline. Mikroskopski preparati boje se po Ziehl – Neelsen. Bojenje koristi specifičnist staničnog zida da se odupre odbojavanju kiselim alkoholom. Generacijsko vrijeme 15 – 20 h, kolonije se uočavaju tek nakon 4 – 6 tjedana na čvrstom hranilištu. „Cord“čimbenik (lipoarabinomanan) nastaje iz trehalozadimikolata kod virulentnih sojeva M.tuberculosis. Površinski glikolipid koji blokira aktivaciju makrofaga pod utjecajem INF¥. Inducira sekreciju TNFα, Inhibira migraciju PMN, Toksičan za stanice sisavaca. Tuberkuloza se prenosi uglavnom tijekom prolongiranog kontakta s bolesnikom inhalacijom kontaminiranih kapljica nastalih prilikom govora i kašljanja, a primarna infekcija se obično razvija u plućima (Ghon-ovo žarište) i regionalnim (hilusnim) limfnim čvorovima (Ghonov kompleks), obično je asimptomatska. Inkubacija je 4 – 12 tjedana. Virulencija uzročnika tuberkuloze zavisi od njegove sposobnosti preživljavanja u makrofagu pod utjecajem interleukina koje izlučuju senzibilizirani limfociti T stvaraju se oko makrofaga karakteristični granulomi čije središte je ispunjeno kazeoznom nekrozom. Simptomi bolesti slabo su izraženi i podmukli. Obični su to subfebrilne temperature, noćno znojenje, umor, gubitak teka i tjelesne težine. Tkiva i organi koji se odlikuju visokim zasićenjem kisika osobito su pogodni za razmnožavanje uzročnika tuberkuloze. To su prije svega gornji djelovi pluća, mozak, kralješci, bubrezi i druge kosti. LITERATURA: Vježbenica iz kolegija „ Medicinska bakteriologija i virologija“

MAKSIMOVIĆ JASNA

7


MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE

1.3 NACIONALNI NAPUTAK ZA SUZBIJANJE TUBERKULOZE U RH

8


MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE

Klinička dijagnostika je skup dijagnostičkih pretraga prilikom utvrđivanja tuberkuloze, a sastoji se od različitih postupaka koji u konačnici potvrđuju ili odbacuju sumnje na tuberkulozu. Osnovne su propedeutičke vještine uzimanje kvalitetne anamneze i fizikalni pregled. Anamneza je značajna zbog dobivanja informacija o općim i specijalnim znakovima koji ukazuju na možebitni tuberkulozni proces. U anamnezi se navode i činjenice o zdravstvenom stanju ostalih ukućana ili bliskih osoba od kojih bi netko moga biti potencijalni izvor zaraze. Fizikalni pregled i nalazi oboljelog nisu specifični, premda bi trebali imati svrhu razaznavanja simptoma tuberkuloze. Kožni test tuberkulinom (PPD) i IGRA testiranje koristi se za dokazivanje imunološkog odgovora na infekciju bacilom tuberkuloze. Hematološke i biokemijske pretrage najčešće se koriste u ispitivanju funkcije jetre, bubrega i gušterače, odnosno u slučaju komplikacije tuberkuloze. Endoskopske pretrage (osobito bronhoskopske) indicirane su kad se sumnja na tuberkulozu bronha i laringsa. Bronhalnih komplikacija (fistule i stenoze) i u diferencijalnoj dijagnostici. Testovi respiratorne i plućne cirkulacije imaju poseban značaj nakon završenog liječenja bolesnika kako bi se procijenilo potencijalno oštećenje ili invaliditet.

6.1.1. Otkrivanje i dijagnostika tuberkuloze u bolesnika s HIV infekcijom HIV infekcija mijenja kliničku sliku tuberkuloze i komplicira njezinu dijagnozu. HIV infekcija povećava rizik od progresije nedavne infekcije bacilom tuberkuloze ili reaktivaciju latentne infekcije za 5 – 15% godišnje, ovisno o stupnju imunodeficijencije.

9


MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE

10


MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE

6.2.1. Metode u mikrobiološkoj dijagnostici tuberkuloze 6.2.1.1. Metode konvencionalne mikrobiološke dijagnostike tuberkuloze 6.2.1.2. Brza dijagnoza tuberkuloze 6.2.1.3. Testovi ispitivanj osjetljivosti na antituberkulotike 6.2.1.4. Genotipizacija sojeva M. tuberculosis

6.2.2. Standardi za broj i ritam bakteriološke pretrage na tuberkulozu (algoritam) Broj i ritam mikrobioloških pretraga 6.2.2.1. Prije početka terapije 6.2.2.2. Tijekom terapije 6.2.2.3. Nakon završetka terapije 6.2.2.4. Kod bolesnika s inaktivnom tuberkulozom 6.2.2.5. Recidivi tuberkuloze 6.2.2.6. Bolesnik s kroničnom tuberkulozom 6.2.2.7. Za ocjenu radne sposobnosti 6.2.2.8. Uzorci sputuma svih osoba koje su u kontaktu s aktivnom tuberkulozom 6.2.2.9. Uzorci sputuma osoba koje su ranije liječene od tuberkuloze

6.2.3. Uzimanje i slanje uzoraka za pretragu na tuberkulozu Opća načela uzimanja uzoraka 6.2.3.1. uzimanje uzoraka 6.2.3.2. slanje uzoraka

6.2.4. Laboratorijska prijava BK pozitivnih bolesnika 6.2.5. Organizacija laboratorijske službe za mikrobiološku dijagnostiku tuberkuloze 6.2.5.1. Prva i druga razina 6.2.5.3. treća razina

11


MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE

6.2.6. L12 Laboratorijska dokumentacija U laboratorij se šalje klinički uzorak popraćen čitko ispunjenom uputnicom gdje se vodi dvostruka evidencija.

6.3. Radiološka dijagnostika tuberkuloze 6.3.1. Algoritam pretraga 6.3.2. prva razina (primarna zdravstvena zaštita) 6.3.3.druga razina (specijalističko konzilijarna) 6.3.4. treća razina (klinička ustanova)

6.4. Histološka dijagnoza tuberkuloze Upalne promjene izazvane bacilom tuberkuloze imaju karakterističnu histološku sliku 6.5. Dijagnostika dječje tuberkuloze 6.5.1. posebne karakteristike tuberkuloze u djece 6.5.2. Dijagnoza tuberkuloze u djece Djeca su jako podložna tuberkulozi koja je otporna na lijekove kao i tuberkulozi koja je osjetljiva na lijekove. Na rezistentni oblik tuberkuloze treba posumnjati ako je prisutna bilo koja od sljedećih karakteristika: 1. 2.

Karakteristike kod izvornog pacijenta koje ukazuju rezistentnu tuberkulozu Karakteristike djeteta kod kojeg se sumnja na rezistentnu tuberkulozu MAKSIMOVIĆ JASNA

12


MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE

2. MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERKULOZE Mikrobiološka dijagnostika tuberkuloze temeljni je i obavezni dio svakog nacionalnog programa za suzbijanje tuberkuloze. Bitna je u postavljanju dijagnoze, otkrivanju novooboljelih, odabiru terapije i praćenju uspješnosti liječenja.

2.1. PRIKUPLJANJE,TRANSPORT I POHRANJIVANJE UZORKA Opća načela uzimanja uzoraka Količina i kvaliteta uzoraka, čuvanje i transport te metode koje se koriste u laboratoriju direktno utječu na konačni rezultat pretrage. Tuberkuloza može zahvatiti svaki organ te se različiti klinički uzorci, kao likvor, pleuralni, perikardijalni i peritonealni punktat, gnoj, bris fistule, bioptički materijal, menstrualni sekret, stolica i krv mogu poslati na bakteriološku pretragu na tuberkulozu.. Uzimanje uzoraka: 1. Iskašljaj (sputum) – za pretragu je najpogodniji prvi jutarnji iskašljaj, natašte u količini 3- 5 ml. Preporuča se poslati 3 različita uzorka (povećati do 6, ako su 1. i 2. uzorak mikroskopski negativni) uzeta pod istim uvjetima: ujutro, nakon propisane toalete usne šupljine, duboki iskašljaj (ne ispljuvak). Uzorak se spremi u sterilnu posudu s poklopcem na navoj i dostavlja u laboratorij u roku 2 sata. Pacijentu treba točno objasniti što se od njega očekuje prilikom uzimanja uzorka. Može mu se dati dodatno pismeno uputstvo. Prozirna pljuvačka ili nazofaringealni sekret nisu sputum i nemaju značaja u dijagnostici tuberkuloze. Zdravstveni radnici trebaju biti oprezni ako se uzorak sputuma uzima u samom laboratoriju jer prilikom kašljanja može nastati aerosol koji sadrži bacile tuberkuloze. Prilikom prijema uzorka treba provjeriti da li je posuda ispravno zatvorena da materijal ne bi iscurio van. Isto je tako važno provjeriti da li je uzeta dovoljna količina uzorka. 2. Inducirani iskašljaj – postoji nekoliko načina da se dobije inducirani iskašljaj. Najčešće se koristi postupak inhalacije hipertoničnom otopinom natrijeva klorida (3–5%). Nakon inhalacije bolesnik miruje oko 10 minuta i potom iskašljava. Inducirani iskašljaj je vodenast i podsjeća na slinu te ga je potrebno posebno označiti. 3. Aspirat bronha, bronhoalveolarni lavat – na pretragu se šalje cijeli uzorak, uz što manji sadržaj anestetika, koji može spriječiti rast bacila tuberkuloze. 4. Obrisak larinksa – uzima se ujutro, natašte, kod bolesnika koji ne može dati iskašljaj. Bris je prije uzimanja uzorka potrebno namočiti u sterilnu destiliranu vodu ili u fiziološku otopinu, metalni dio lagano savinuti da prati krivinu jezika. Neposredno prije uzimanja uzorka bolesnik se mora nakašljati.

13


MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE

5. Želučani lavat – često se uzima kod djece koja ne mogu dati iskašljaj ni nakon inhalacije aerosolom. Aspirira se 50 ml želučanog sadržaja rano ujutro dok je bolesnik još u krevetu, nakon što je mirovao najmanje 8–10 sati. Uzorak je potrebno neutralizirati s Na2HPO4 odmah po uzimanju (na 35–50 ml lavata dodati 1,5 ml 40% Na2HPO4). 6. Urin – preporučuje se sukcesivno uzimanje jutarnjeg urina (srednji mlaz) u tri do pet različitih dana (30–50 ml). Uzorke urina potrebno je što prije (najbolje isti dan) poslati u laboratorij, a ako to nije moguće, do dostave ih čuvati u hladnjaku. 7. Krv, koštana srž – dezinficirati mjesto uboda alkoholom. Uzeti 5–10 ml krvi u sterilnu posudicu s navojem i dodati heparin (0,2 mg/ml) ili 1,5 ml 0,35% otopine natrijevog polietanol sulfata (SPS) na 8,5 ml krvi da se uzorak ne bi zgrušao. Moguće je krv uzeti i direktno u komercijalno dostupne epruvete sa saponinom »Isolator tube« (Oxoid). 8. Punktati (pleuralni, perikardijalni, peritonealni i dr.) – uzeti što veću količinu, najmanje 10–15 ml. Preporučuje se uzeti u epruvetu s antikoagulantnim sredstvom (heparin, natrijev citrat), a nakon uzimanja epruveta se obavezno nekoliko puta okrene. 9. Likvor – uzeti što veću količinu u sterilnu epruvetu bez sredstva protiv zgrušavanja (5–10 ml, nikako ne manje od 2 ml). Prikupljanje uzoraka Uzorke u bolnicama prikuplja medicinsko osoblje po dogovoru. Npr. u OB Zabok šofer je zadužen da prikupi uzorke sa odjela i dostavi ih u najkraćem roku do druge zdravstvene ustanove koja obrađuje uzorke! Slanje uzoraka Uzorci se uzimaju u propisane plastične sterilne posudice sa zatvaranjem na navoj. Za transport uzoraka potrebno je dvostruko pakiranje. Svaki uzorak mora biti spakiran na način da se onemogući izlijevanja sadržaja i da se spriječe drugi nepovoljni utjecaji koji mogu nastati u toku transporta. Ne smije doći do kontaminacije materijala tijekom transporta. Tokom transporta uzorke treba držati na niskoj temperaturi i zaštiti od sunca. Na posudici mora biti velikim slovima napisano ime i prezime oboljelog. Svaki uzorak mora biti popraćen uputnicom. Uzorke je potrebno dostaviti u laboratorij u roku od 24 sata (ne dulje od 48 sati). Do slanja u laboratorij sve uzorke treba čuvati na hladnom mjestu, po mogućnosti u hladnjaku na +4 C. Po dospijeću u laboratorij uzorke bi trebalo preuzeti na posebno odvojenom mjestu. Pri tome treba koristiti zaštitne rukavice, pažljivo otvarati transportne kutije i pregledati da li ima oštećenih posuda, i da li su uzorci obilježeni. LITERATURA: Naputak za suzbijanje i sprečavanje tuberkuloze /NN 083/2012)

KOŠANSKI SNJEŽANA

14


MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE

2.2 MIKROBIOLOŠKA OBRADA UZORKA Klasična bakteriološka dijagnostika TBC-a se sastoji od četiriju pretraga: 1. 2. 3. 4.

Mikroskopije acidorezistentnih bacila Kultivacije na tekućim i čvrstim hranilištima Identifikacije poraslog soja Testa osjetljivosti na antituberkulotike

Tuberkuloza je bolest koja može zahvatiti bilo koji dio i organ ljudskog tijela. S obzirom na tu činjenicu na mikrobiološku obradu za TBC od materijala koji se najčešće šalje na obradu su uzorci iz respiratornog sustava (sputum, iskašljaj, bronhoskopski uzorci ispirak želuca kod djece i žena). Kod izvanplućnih oblika se pretražuje (likvor, urin, krv, tkivo dobiveno biopsijom, obrisci rana, genitalni obrisci, sadržaj prostate, stolica). Od uzimanja uzorka do dostave u laboratorij mora proći što manje vremena. Potrebno je dostaviti dovoljnu količinu materijala. Uzorci se eventualno mogu čuvati u frižideru na +40C kako bi se sačuvala vijabilnost. Uzorci moraju biti u odgovarajućim posudama sa navojem dobro zatvoreni, moraju biti pravilno obilježeni i označeni, uputnica mora biti pravilno ispisana, ime i prezime pacijenta, dijagnoza, i o kojoj se vrsti materijala radi, te spremljena u posebnu foliju kako ne bi došlo do kontaminacije sa uzorkom. Obzirom da se radi o vrlo infektivnom materijalu svaki laboratorijski tehničar je odgovoran za vlastitu kao i za sigurnost svojih suradnika. U laboratoriju infekcija turberkulozom najčešće nastaje udisanjem infektivnog aerosola koji nastaje za vrijeme procesa rada. Moramo izbjegavati, smanjiti i kontrolirati sve laboratorijske manipulacije, kod kojih se stvara aerosol kao što su: odčepljivane posuda sa uzorkom i prelijevanje, odčepljivanje epruveta tijekom obrade, nalijevanje sredstva za homogenizaciju, odlijevanja supernatanta nakon centrifugiranja, izrade mikroskopskih preparata, žarenja eze s uzorkom, nasađivanja uzoraka, puknuća epruvete za vrijeme centrifugiranja te pipetiranja osobito kod ispuhivanja zadnje kapljice. Za vrijeme rada moramo provoditi zaštitne mjere. Radna površina mora biti pokrivena staničevinom koja je natopljena dezificijensom. Radni stol se mora prebrisati dezificijensom nakon završenog posla. Sve operacije kod kojih postoji mogućnost nastanka zaraznog aerosola moramo pažljivo izvoditi. Za vrijeme rada prozori u prostoriji moraju biti zatvoreni, a provjetravanje prostorije se vrši nakon obavljenog rada. Da zaštitimo sebe moramo nositi zaštitne kute, pregače, maske, jednokratne rukavice, često prati ruke tijekom radnog procesa i obavezno pranje ruku prilikom napuštanja laboratorija. Svaki tehničar mora se strogo pridržavati procedure rada i ni jedan se

15


MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE

postupak ne smije odraditi mimo onoga što je propisano i bez konzultacije sa odgovornom osobom. LITERATURA: 

Upute za rad u TBC laboratoriju ZZJZ Primorske-goranske županije

Vježbenica iz kolegija Medicinska bakteriologija i virologija

VOLARIĆ STELA

2.2.1 PRIPREMA UZORKA Bolest koju izaziva Mycobacterium tuberculosis zove se tuberkuloza . Od nje može oboljeti svaki organ, a najčešće su to pluća. Kao najčešću vrstu uzorka dobivamo iskašljaj, a može se obrađivati i aspirati bronha, lavati bronha i želuca, urini, pleuralni punktati, brisevi, krv, ejakulati. Materijal pristigao u laboratorij mora se posebno obraditi radi uklanjanja popratnih bakterija i gljivica, u cilju dobivanja što kvalitetnije izolacije Mycobacterium tuberculosis. Cijeli postupak obrade uzorka mora se vršiti u bio-zaštitnom kabinetu zbog toga što se bolest prenosi udisajem zaraženog aerosola. OBRADA UZORKA 1. HOMOGENIZACIJA 2. NEUTRALIZACIJA 3. KONCENTRACIJA 1. HOMOGENIZACIJA Prebacujemo iskašljaj u 50 mililitarske konične epruvete. Dodajemo jednaki volumen NALC otopine ( N-ACETYL-L-CYSTEIN otopina NaOH i NaCitrata ). Ovim postupkom vršimo uklanjanje fiziološke flore. 2. NEUTRALIZACIJA U epruvetu zatim dodajemo do 40 ml fosfatnog pufera i sve zajedno dobro zatvorimo. Homogenizaciju tada radimo mućkanjem i vorteksiranjem epruvete. Tim se postupkom bacili oslobađaju iz stanica, sluzi i staničnog detritusa. Fosfatni pufer zaustavlja proces neutralizacije. 3.KONCENTRACIJA  Centrifugiramo uzorak 15 min na 3000 okretaja.  Odlijemo supernatant u posebnu posudu sa dezinficijensom.  Rub epruvete obrišemo sa staničevinom namočenom u dezinficijens koja se odbacuje u posebnu posudu s dezinficijensom.

16


MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE

Sediment suspendiramo s 1-2 ml fosfatnog pufera.

 

Inokuliramo na podlogu 0,5 ml. Preparat na predmetnici napravimo iz ostatka sedimenta.

LITERATURA: 

Vježbenica iz kolegija « Medicinska bakteriologija i virologija»,

radni materijali prof.dr.sc. Brigita Tićac

TANJA LOVRINOV

2.2.2 MIKROSKOPSKA PRETRAGA Mikrobiološka dijagnostika je temeljni i obavezni dio nacionalnog programa za suzbijanje tuberkuloze. Mikroskopija je prva od tri standardizirane pretrage i kao takva jedan od standarda javljanja rezultata unutar 24 sata od dostavljanja uzorka. U mikroskopskoj dijagnostici koristimo mikroskopske preparate obojene po Ziehl –Neelsenu ili bojanje fluorokromnim bojama. Princip: Bojanjem po Ziehl- Neelsenu, bacil Mycobacterium tuberculosisa pokazuje izrazitu acidoalkoholnu rezistenciju što znači sposobnost vezanja i zadržavanja bazične boje karbol fuksina i nakon što se ispere kiselim alkoholom.Peptidoglikolipidi koji se nalaze u staničnoj stjenci sprječavaju odbojavanje karbol fuksina koji se vezao za mikoličnu kiselinu. Prilikom bojanja se koriste boje u većoj koncentraciji i uz zagrijavanje kako bi lakše prodrle u bakterijsku stanicu. Potrebni materijal: • Predmentno stakalce, • Mikrobiološka eza, • Plamenik, • Boje karbol- fuksin, metilensko modrilo (za Ziehl- Neelsen), • Boja Auramin, kalij-permanganat (za fluorokromno bojanje), • Kiseli alkohol, voda. Postupak: Nakon što uzorak pristigne u laboratorij, potrebno ga je dekontaminirati, homogenizirati i neutralizirati kako je navedeno u poglavlju br.2.2.1. Nakon toga radimo mikroskopski preparat na predmetnom stakalcu koje smo prije samog izvođenja označili brojem protokola na suprotnoj strani stakalca. Zatim sterilnom mikrobiološkom ezom uzmemo uzorak i ravnomjerno

17


MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE

razvučemo po srednjoj trećini stakalca. Ostavimo da se osuši i zatim fiksiramo plamenom. Kad se stakalca sa uzorkom osuše i fiksiraju treba ih položiti na most za bojenje. Sve ove postupke treba odrađivati u bio-zaštitnom kabinetu i treba se zaštititi odgovarajućim odjelima. Postupak bojenja po Ziehl-Neelsonu: 1. Preparat se prekrije bojom karbol fuksin i pažljivo se zagrijava plamenikom dok se ne pojave pare ali ne smije doći do vrenja 2. Zatim treba ostaviti da se preparat ohladi pa nakon toga ponoviti isto još dva puta 3. Ohlađeni preparat isprati kiselim alkoholom, a nakon toga i vodom također još dva puta 4. Preliti metilenskim modrilom i držati boju 3-5 minuta 5. Ponovno sve isprati vodom i ostaviti preparat da se osuši na zraku i tek tada je spreman za mikroskopiju Postupak bojenja fluorokromnim bojama (fluorescentna boja) 1. Osušeni i fiksirani preparat prekriti bojom auramin i ostaviti 15 minuta (nije potrebno zagrijavati niti prekrivati filter papirom) 2. Isprati vodom i ocjediti 3. Preparat isprati kiselim alkoholom 4. Isprati vodom i prekriti kalij-permanganatom 2-4 minute. 5. Ponovno isprati vodom i ostaviti preparat da se osuši Literatura: 

Color atlas and textbook of Diagnostic mycrobiology, Third edition ,ElmerW. Koneman, Stephen D.Allen, VR.Dowel JR, i dr. , 1988. str.541,542.

Medicinska mikrobiologija, Smilja Kalenić i suradnici, Medicinska naklada , Zagreb 2013, str.163,1683.

Naputak za suzbijanje i sprečavanje tuberkuloze, II.dopunjeno izdanje,Ministarstvo zdravstva i socijalne skrbi, HZJZ, Zagreb , lipanj 2010 str.33,34

MARIJANA GRBAC

18


MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE

2.2.2.1. Dokazivanje prisutnosti bacila tuberkuloze u mikroskopskim preparatima obojenim po Ziehl-Neelsenu Mikroskopiranje preparata obojenih po Ziehl-Nellsenu danas je jedna od najpoznatijih i najraširenijh metoda za dokazivane prisutnosti bacila tuberkuloze u uzorcima respiratornog sustava. Nedostatak joj je nedovoljna osjetljivost i specifičnost. Za detekciju se koristi svjetlosni mikroskop koji se nalazi u svim mikrobiološkim laboratorijima. Sastoji se od dva osnovna sustava koji međusobnim djelovanjem dovode do uvećane slike: sustava leća i svjetlosnog sustava. Razlikujemo mehanički dio koji čine podloga, stalak tubus, stolić, makrovijak i mikrovijak i optički dio koji se sastoji od okulara, objektiva, izvora svjetla, kondenzora i zaslona. Sustav leća svjetlosnog mikroskopa sastoji se od objektiva i okulara. Različita povećanja mikroskopa postižu se mijenjanjem leća objektiva koji se rotacijom revolvera postavlja na odgovarajuće mjesto. Za analizu preparata obojenih po Ziehl-Neelsenu koristi se imerzijski objektiv, za koji nam je potrebno imerziono sredstvo. Najčešće je to cedrovo ulje. Uz povećanje okulara 10x uporabom imerzijskog objektiva 100x, ukupno povećanje slike uzorka iznosi 1000x.

POSTUPAK: 1. 2. 3. 4. 5.

Stakalce s obojenim uzorkom postaviti na stolić svjetlosnog mikroskopa s oznakom okrenutom prema dolje. Podesiti imerzioni objektiv rotacijom revolvera. Na stakalce kapnuti kap imerzionog sredstva. Pomoću makrovijka uroniti imerzioni objektiv u kapljicu imerzionog sredstva i pronaći sliku. Mikrovijkom izoštriti sliku i analizirati preparat.

Prema preporukama CDC-a mikroskopira se serija vidnih polja u 3 horizontalne paralele i 9 okomitih linija. Na taj način vidimo od 100 do 300 vidnih polja što iznosi samo 1-4 % površine cijelog preparata. Preporuka je da razmaz pokriva površinu 1 x 2 cm jer veća površina razmaza smanjuje efikasnost mikroskopiranja. INTERPRETACIJA NALAZA: Pronalazak crvenih štapićastih bakterija obojenih Carbol fuksinom na kontrastnoj plavoj podlozi (Methylene Blue) dokaz je postojanja mikobakterija. Ukoliko imamo dva uzorka iskašljaja, potrebna su jedan ili dva pozitivna nalaza da se nalaz interpretira kao BK pozitivan TBC. Većina mikobakterija su acidoalkoholno rezistentne pa njihova prisutnost u kliničkim uzorcima daje samo preliminarne dokaze tuberkuloze.

19


MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE

Prema novim dokumentima i definicijama SZO-a tuberkuloza je mikroskopski pozitivna kada ja otkriven najmanje jedan acidorezistentni bacil u najmanje jednom uzorku iskašljaja. Ova definicija eksplicitno isključuje samo mikroskopsko dokazivanje pogrešaka u liječenju. Primjenjuje se u zemljama s mrežom TBC laboratorija gdje se kontinuirano provodi vanjska kontrola kvalitete rada. •

Lažno pozitivni rezultati mikroskopije brisa sputuma:

Mogu se pojaviti zbog sljedećeg: crvena boja zadržava se zbog ogrebotina na stakalcu, slučajnog prijenosa acidoalkoholnorezistentnih bakterija sa pozitivnog na negativno stakalce, kontaminacije mikobakterijom iz okoline, prisustva različitih djelića koji zadržavaju kiselinu, npr. komadića hrane, taloga ili drugih mikroorganizama. •

Lažno negativni rezultati mikroskopije brisa sputuma:

Mogu se pojaviti zbog problema u prikupljanju, procesiranju, tumačenju brisa sputuma ili zbog administrativnih pogrešaka. Iako je svjetlosna mikroskopija najčešća metoda detekcije Mycobacterium tuberculosis sve se češće koristi i mikroskopija fluoroscentnim mikroskopom zbog svoje brzine i veće osjetljivosti. Preparati koji se mikroskopiraju na fluoroscentnom mikroskopu moraju biti obojani fluorokromima odnosno fluoroscentnim bojama. Najčešće su to auramin koji fluorescira žuto , te fluoroscein izocijanat koji daje žuto-zelenu fluorescenciju. Preparati se promatraju pod povećanjem od 250-630x, a samo povećanje daje prednost u brzini pregledavanja preparata i značajnu uštedu vremena za osobu koja mikroskopira. Prednost je i to što ljudsko oko lakše uočava žuti štapić koji fluorescira u tamnoj podlozi. Nalaz mora biti izdan u roku od 24 sata. LITERATURA: 

Vježbenica iz kolegija „Opća mikrobiologija“

Vježbenica iz kolegija“Medicinska bakteriologija i virologija“

Radna skripta prof.dr.sc. Brigita Tićac

Naputak za suzbijanje i sprečavanje tuberkuloze, II. Dopunjeno izdanje, Ministarstvo zdravstva i socijalne skrbi, HZJZ, Zagreb, lipanj 2010.,str.355.

TBC/HIV, Klinički priručnik,drugo izdanje, A.Harries, D.Maher, S.Graham, str. 29

BAŠIĆ DAJANA

20


MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE

2.2.3 KULTIVACIJA Nakon što je uzorak prikupljen i transportiran do laboratorija na standardiziran način slijedi homogenizacija, neutralizacija PBS-om i centrifugiranje uzorka na 3000 okretaja 20 min. supernatant se odlije i plamenikom prođe rub epruvete. Kultivacija uzročnika tuberkuloze vrši se, iz pripremljenog sedimenta, na tekućim i čvrstim hranjivim podlogama. To su postupci standardne izravne metode mikrobiološke dijagnostike. Kultivacija mikobakterije na čvrstim podlogama radi se najčešće na Lowenstein-Jensen (LJ) podlozi. Podloga sadrži jaja, glicerol, krumpirovo brašno i malahitno zelenilo koje inhibira rast drugih bakterija Radi se istovremeno i nasađivanje na tekuću podlogu, ostavlja se u kosom položaju 3 dana. Kultivacija na ovoj podlozi vrši se zbog brže izolacije bakterija, a korisiti se MGIT tekuća podloga (Mycobacteria Growth Indicator Tube) s indikatorom za dokaz mikobakterija. Proces nasađivanja se odvija u digestorima s naglaskom na veliku opreznost pri radu (obavezno korištenja rukavica i zaštitnih pregača), zbog vrlo lake zaraze. Slijedi inkubacija u termostatu na temperaturi 35-37° C u aerobnim uvjetima. Kolonije sporo rastu, te se uočavaju tek nakon 2-8 tjedana inkubacije, a pregledavanje se vrši svakih 2. tjedna. Očitavanje rezultata: Kolonije su bijele do svijetložute boje, nepravilnih rubova, suhe, izdignute i nepravilne površine nalik cvjetači. U slučaju negativnog rasta ostavljaju se u inkubaciji do 12. tjedna i ponovno očitavaju.

Uz uzorak je potrebna i pravovaljana uputnica na kojoj uz opće identifikacijske podatke bolesnika obavezno treba navesti vrstu uzorka, datum (a za neke uzorke i vrijeme uzorka), dijagnozu ili vodeće simptome, laboratorijske i epidemiološke podatke. Prilikom zaprimanja uzoraka u laboratorij provodi se upis u kompjuter i evidencijsku MGIT (mycobacteria growth indicator tube) knjigu u kojoj su navedeni : 

ime i prezime uzorka, vrsta uzorka, ime liječnika, datum kad je zaprimljen uzorak i datum obrade, koje ujedno služe i kao arhiva svih uzoraka.

21


MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE

Izdavanje nalaza:  iz materijala nije izoliran M. tuberculosis  iz materijala je izoliran M. tuberculosis ( brojivo do 50 kolonija )  1+ iz materijala je izoliran M. tuberculosis ( brojivi 50 do 100 kolonija)  2+ iz materijala je izoliran M. tuberculosis ( više od 100 kolonija )  3+ iz materijala je izoliran M. tuberculosis (nebrojivo – konfluentan rast) LITERATURA: 

Naputak za suzbijanje i sprječavanje tuberkuloze (NN 083/2012). Preuzeto sa:

http://cadial.hidra.hr/searchdoc.php?query=&lang=hr&bid=TNL55lsNFr1cWun3pquCv Q%3D%3D 

Vježbenica iz kolegija „Medicinska bakteriologija i virologija “ Sveučilište u Rijeci,Medicinski fakultet

GUSTIN KRISTINA

2.2.3.1. Čvrste podloge Za uzgoj Mycobacterium tuberculosis koriste se različita obgaćena umjetna hranilišta, a najčešće Löwenstein-Jensen podloga koja je najšire primjenjivana podloga za primoizolaciju bacila tuberkuloze. Preporučena je modifikacija od strane Međunarodnog udruženja za borbu protiv tuberkuloze i plućnih bolesti (IUATLD). IZGLED I POSTUPAK Podloga Löwenstein-Jensen sadrži jaja, glicerol, krumpirevo brašno i malahitno zelenilo koje inhibira rast drugih bakterija. Kompletna podloga se razlijeva u količini od 6-8 ml u sterilne ukošene epruvete sa zatvaračima na navoj. Tako pripremljene podloge treba inkubirati na 3537° C 24 sata radi provjere sterilnosti. Uzorke koje nacjepljujemo mogu biti iz respiratornog sustava iskašljaj (sputum), brohonskopski uzorci te ispirak želuca kod djece i žena, urin, likvor, bioptati, obrisci rana i genitalni obrisci, sadržaj prostate, krv... Na svaku kosinu podloge trebalo bi sa jednokratnom plastičnom ezom aplicirati od 0,2 do 0,4 ml (2 do 4 omče eze) sedimenta raspoređenoj po cijeloj površini podloge. Kolonije uzročnika tuberkuloze se uočavaju tek nakon 2-8 tjedana inkubacije u aerobnim uvjetima na 35°C do 37°C. Kolonije su obično bijele do svijetlo žute boje, nepravilnih rubova, suhe, izdignute, neravne površine nalik cvjetači.

22


MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE

REZULTAT Kod negativnog rezultata može biti gotov za 8 tjedana od dana uzorkovanja a kod pozitivnog rezultata može biti gotov za 12 tjedana od dana uzorkovanja jer se dodatno radi test osjetljivosti na antituberkulotike-ALT. LITERATURA: 

Vježbenica iz kolegija „Medicinska bakteriologija i virologija“; prof.dr.sc.Brigita Tićac

www.tbc.zdravlje.gov.rs./files/biblioteka/vodiczamikrobioloskudijagnostikutuberkoloze

AVDOVIĆ SABINA

23


MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE

2.2.3.2. Tekuće podloge Tekuće podloge omogućuju bržu i osjetljiviju kultivaciju, te ispitivanje osjetljivosti Mycobacterium tuberculosis. Tekuća podloga (engl. Mycobacterium Growth Indicator Tube, MGIT) u dijagnostici M. Tuberculosis spada u standardizirane pretrage i suvremenu mikrobiološku dijagnostiku tuberkuloze. Standard su i indirektni fenotipski testovi na tekućim podlogama za ispitivanje osjetljivosti M. tuberculosis na antituberkulotike prvog i drugog reda.

Epruveta MGIT s indikatorom rasta mikobakterija sadrži 4 mL modificirane baze Middlebrook 7H9 bujona. Kompletan medij je obogaćen sa 0,5 mL OADC i 0,1 mL antibiotske mješavine PANTA, jedan je od najčešće korištenih tekućih medija za uzgoj mikobakterija. Svi tipovi kliničkih uzoraka, plućni kao i izvanplućni (osim krvi), mogu se obrađivati za primarnu izolaciju u epruveti MGIT pomoću standardnih metoda. Obrađeni se uzorak inokulira u epruvetu MGIT, inkubira i očitava pomoću dugovalnog UV svjetla. U vrijeme kada epruveta postane pozitivna prisutno je otprilike 104 – 107 CFU/mL mikobakterija. Princip Fluorescentni sastojak umetnut je u silikon na dnu epruvete s okruglim dnom. Fluorescentni sastojak osjetljiv je na prisutnost kisika rastopljenog u bujonu. Velika količina rastopljenog kisika na početku gasi emisije sastojka, pa se može otkriti malo fluorescencije. Kasnije, M.tuberculosis troši kisik i omogućuju otkrivanje fluorescencije pomoću UV uređaja za vizualizaciju gela valne duljine 365 nm ili dugovalnog UV svjetla (Woodova lampa). Rast se može otkriti i prisutnošću nehomogene zamućenosti, malih zrnaca ili pahuljica u mediju za kulturu.

24


MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE

Sastojci medija ključne su tvari za brzi rast mikobakterija. Bacili tuberkuloze koriste oleinsku kiselinu koja ima važnu ulogu u metabolizmu mikobakterija. Albumin djeluje kao zaštitni agens jer veže slobodne masne kiseline koje mogu biti otrovne za vrste Mycobacterium i na taj način povećava njihovu izolaciju. Dekstroza je izvor energije. Katalaza uništava otrovne perokside koji mogu biti prisutni u mediju. Kontaminacija se smanjuje kombiniranim dodavanjem baze MGIT i obogaćenja MGIT OADC s antibiotskom mješavinom MGIT PANTA prije inokulacije s kliničkim uzorkom. Materijal i pribor  Epruvete MGIT s indikatorom rasta mikobakterija,  MGIT PANTA,  OADC,  Epruvete za centrifugiranje marke Falcon od 50 Ml,  NALC (N-acetil-L-cistein prašak),  fosfatni pufer pH 6,8,  vorteks mikser,  inkubator na temperaturi od 37°C,  sterilne pipete od 1 mL,  sterilne prijenosne pipete,

      

UV uređaj za vizualizaciju gela (valna duljina 365 nm) ili Woodova lampa, MycoPrep, bujon , mikobakterijski agari ili mediji na bazi jaja, sterilni štapić, mikroskop i materijali za bojenje, pipete od 100 μL i 500 μL, odgovarajući nastavci pipeta, tuberkulocidno sredstvo za dezinfekciju.

Obrada uzorka LIKVOR – direktno se nasađuje u MGIT epruvetu URIN – treba ga centrifugirati, a sediment obraditi NALC-om, najviše do 5 ml BRIS RANE i ostali brisevi – otopiti u 3-5 ml NALC-a SPUTUM (iskašljaj) – direktno prebaciti u FALCON epruvetu STOLICA – rastopiti 1g uzorka u bujonu te potom 5 s promiješati na vorteksu Postupak Postupak se odvija u bio-zaštitnom kabinetu (digestoru). Najprije je potrebno pripremiti sterilan dio, staviti MGIT epruvete u stalak, te ih sve redom otvoriti, a čepove odložiti na staničevinu natopljenu s dezificijensom okrenute naopačke. Prvo se otpipetira PANTA (razrijedi se sa 3 ml sterilne fiziološke otopine - tako pripremljena PANTA može stajati u hladnjaku 3 dana, a može se i smrznuti) 0,1 ml, a potom 0,5 ml OADC. Tako pripremljene začepiti čepovima i odložiti sa strane do samog nasađivanja. Pripremiti FALCON epruvete u odgovarajući stalak i na njih napisati laboratorijske brojeve protokola. Uzorke prebaciti u epruvete, pazeći da se stvara što manje aerosola. Dodati istu količinu NALC-a kao i uzorka i epruvete dobro začepiti.

25


MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE

Svaki uzorak se dobro promiješa na vorteksu, te se potom stavljaju na treskalicu na 4000 okretaja kroz 20 minuta. Nakon toga epruvete staviti u stalak, sve ih redom otvoriti, čepove odložiti na staničevinu natopljenu dezinficijensom okrenute naopačke. Paziti da se čepovi ne zamijene jer su sada kontaminirani. U epruvete nadolijati fosfatni pufer (pH 6,8) do oznake 45. Kod nadolijevanja paziti da se ne dodiruje rub epruvete, te je zbog spriječavanja stvaranja aerosola potrebno nakositi epruvetu kod nadolijevanja. Epruvete se potom začepe, lagano promiješaju te centrifugiraju na 3000 okretaja kroz 15 minuta. Staničevinu sa dezinficijensom zamijeniti sa novom. Kad su uzorci centrifugirani složiti ih u stalak, sve ih redom otvoriti. Supernatant odlijati u posudu s dezinficijensom, a iz sedimenta napraviti mikroskopski preparat. Za izradu preparata koristiti automatsku pipetu sa dugačkim nastavcima ili plastične, jednokratne laboratorijske eze. Preostali dio sedimenta resuspendirati (neutralizirati) sa 0,5 ml fosfatnog pufera. Taj uzorak promiješati sa sterilnom psipetom i nasaditi 15 kapi u MGIT epruvetu i na krutu podlogu. MGIT epruvetu začepiti i lagano promiješati. MGIT epruvete stavljaju se u inkubator na 370C, te očitavaju pomoću UV uređaja za vizualizaciju gela (valna duljina 365 nm) ili Woodova lampa. Kod pozitivnog MGIT-a radi se mikroskopski preparat. Epruveta se otvori i sa sterilnom psipetom ili automatskom pipetom sa dugim nastavkom se cijela količina dobro promiješa i uzme se mala količina za mikroskopski preparat. Ako u preparatu ima acido alkoholo rezistentnih štapića uzorak se nasađuje (subkultivacija) na krute podloge, a MGIT epruveta se čuva do porasta subkulture na krutim podlogama. Ukoliko u preparatu ima i acido alkoholo rezistentnih bacila i kontaminacije (najčešće koki) taj se uzorak ponovno obrađue s NALCom. Cijela se količina prebaci u FALCON epruvetu i ponovno obrađuje. Ako se u preparatu vidi samo kontaminacija, taj se uzorak odbacuje kao kontaminirani. OGRANIČENJA POSTUPKA Izoliranje mikobakterija u epruveti MGIT ovisi o broju organizama prisutnih u uzorku, metodama prikupljanja uzoraka, faktorima pacijenta kao što su prisutnost simptoma, prethodno liječenje i metode obrade. Morfologija i pigmentacija kolonija mogu se utvrditi samo na čvrstom mediju. Otpornost mikobakterija na kiseline može varirati ovisno o soju, starosti kulture i drugim promjenjivim činjenicama Epruvete MGIT koje su pozitivne mogu sadržavati i druge vrste koje nisu mikobakterijske. Vrste koje nisu mikobakterijske mogu nadmašiti prisutne mikobakterije.

26


MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE

Takve epruvete MGIT treba ponovno dekontaminirati i ponovno tretirati kulturom. Upotreba antibiotske mješavine PANTA, iako neophodna za sve nesterilne uzorke, može imati inhibicijski učinak na neke mikobakterije. LITERATURA: 

Vježbenica iz kolegija « Medicinska bakteriologija i virologija», radni materijali prof.dr.sc. Brigita Tićac

Naputak za suzbijanje i sprečavanje tuberkuloze /NN 083/2012)

BBL MGIT Mycobacteria Growth Indicator Tube, OADC Enrichment, PANTA Antibiotic Mixture

Radna uputa MGIT – Mikrobiološki laboratorij Čakovec

Značenje laboratorijskih u nadzoru nad tuberkulozom u Međimurskoj županiji; Marina Payerl-Pal, Vera Katalinić-Janković, Mihaela Obrovac, Vesna Vršić Krištofić, Biserka Poje Jelenić, Marijana, Acta Med Croatica, 65 (2011) 11-17

Novi horizonti u molekularnoj dijagnostici TB: trebamo li još uvijek konvencionalnu mikrobiologiju ?, Vera Katalinić-Janković

DEBELEC DAMJAN

27


MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE

2.2.3.3.Testovi ispitivanja osjetljivosti na antituberkulotike Standard su indirektni fenotipski testovi na tekućim podlogama za ispitivanje osjetljivosti M. tuberculosis na antituberkulotike prvog i drugog reda. Nove tehnologije za brzo otkrivanje rezistencije na antituberkulotike prvog reda su prioritet. Prvi red antituberkulotika (ATL) čini šest lijekova: izoniazid (H), rifampicin (R), pirazinamid (Z), etambutol (E), streptomicin (S) i tioacetazon (T). SZO je 2008. godine u dijagnostički algoritam uveo hibridizacijske testove (line probe assays) za otkrivanje rezistencije na rifampicin i izoniazid. Kritične koncentracije antituberkulotika dobivene metodom proporcije u LöwensteinJensen podlozi: Antituberkulotik

Koncentracija u Löwenstein-Jensen podlozi 0,2-1,0 40,0 2,0 4,0

Izoniazid Rifampicin Etambutol Streptomicin Interpretacija nalaza:  S - soj je osjetljiv  R - soj je rezistentan

Kritična proporcija 1% 1% 1% 1%

LITERATURA: 

NAPUTAK ZA SUZBIJANJE I SPRJEČAVANJE TUBERKULOZE(„Narodne novine“, broj 83/12)

ODREĐIVANJE OTPORNOSTI VRSTE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS NA IZONIAZID MULTIPLEKS PCR METODOM Medicina 2007;43:47-54 UDK: 616.24-002.5:615.28.015.8

GUSTIN KRISTINA

28


MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE

2.2.4. DETEKCIJA ANTIGENA

Mycobacterium tuberculosis uzročnik je tuberkuloze, kronične zarazne bolesti čovjeka koja može zahvatiti sva tkiva i organe. Biokemijskim, imunološkim i molekularno biološkim ispitivanjima M. tuberculosis detektiralo se nekoliko antigena koji bi mogli biti korisni u razvoju poboljšanih dijagnostičkih metoda kako bi odredili razliku između Mycobacterium tuberculosis kompleksa i ostalih uvjetno patogenih i apatogenih mikobakterija. Poznato je da M.tuberculosis luči više od trideset i tri različita proteina. Jedan od glavnih proteina, MPT 64 pronađen je u tekućini samo kulture sojeva M. tuberculosis kompleksa. Zbog jednostavne i brze identifikacije M. tuberculosis kompleksa razvijena je metoda sa monoklonskim mišjim protutijelima antiMPT64 „ SD BIO LINE TB Ag MPT 64 Rapid“. To je brzi imunokromatografski test, koji je jednostavan za upotrebu, a test se izvodi iz sojeva uzgojenih na krutom ili tekućem hranilištu. Princip testa: Kazeta testa sadrži jastučić za uzorak, jastučić za zlatni konjugat, nitroceluloznu membranu i upijajući jastučić. Mišja monoklonska protutijela anti- MPT 64 su imobilizirana na nitroceluloznoj membrani. Još jedna protutijela koja prepoznaju epitop MPT 64 konjugirana su koloidnim zlatnim česticama korištena su za vezanje i detekciju u tipu „sandwich“ testa. SD – bioline TB Ag MPT 64 brzi test obilježen je slovima T (testna linija) i C (kontrolna linija). Niti jedna linija se ne vidi prije dodavanja bilo kojeg uzorka. C linija služi za kontrolu procedure i pojavljuje se svaki put, ako je procedura odrađena pravilno i ako reagensi rade. Kako se uzorak doda u jažicu za uzorak, on putuje membranom, protutijela zlatnog konjugata vežu se za MPT 64 iz uzorka. Takav kompleks tada putuje dalje i veže se za mišja monoklonalna anti- MPT 64 na solidnoj fazi testne linije, producirajući crvenu do ljubičastu liniju. U odsutnosti MPT 64 nema linije u testnoj regiji. Materijal i pribor: SD BIOLINE TB MPT 64 Rapid test sadrži: 1. Testne kazete pojedinačno pakirane u vrećici za prevenciju isušivanja 2. Ekstraktni pufer (za pripremu uzorka iz čvrstih kultura) 3. Upute za korištenje 4. Epruveta 5. Automatska pipeta od 200 µl i pripadajući nastavci s aerosolnom barijerom Postupak: Priprema i izvođenje testa u bio-zaštitnom kabinetu! 1. Otvoriti imunokromatografski test i na pločici naznačiti broj protokola. 2. Priprema i izvođenje testa Tekući medij:  Homogenizirati tekuću kulturu (eventualno centrifugirati na 3000 okretaja kroz 15 minuta)  100 µl tekuće kulture staviti u jažicu za uzorak na pločici

29


MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE

Kolonije (kultura na čvrstoj podlozi):  200 µl pufera za ekstrakciju staviti u ependorf epruvetu  3-4 kolonije rigorozno homogenizirati u puferu za ekstrakciju  100 µl pripremljene suspenzije staviti u jažicu za uzorak na pločici Kondenzna voda:  100 µl kondenzne vode staviti u jažicu na pločici  Ili kolonije mogu biti resuspendirane u kondenznoj vodi, umjesto u puferu za ekstrakciju (homogenizirati)  100 µl pripremljene suspenzije staviti u jažicu za uzorak na pločici 3.

Očitavanje testa:

Test se očitava nakon 15 minuta! POZITIVAN NALAZ  Prisutna linija (eng. band) u području C (kontrolna linija)  Prisutna linija u području T (testna linija) NEGATIVAN NALAZ  Prisutna linija u području C (kontrolna linija)  Nedostatak linije u području T (testna linija) Ukoliko se ne pojavi bend u području kontrolne linije test se obavezno mora ponoviti. LITERATURA: 

TB Ag MPT64 Rapid, STANDARD DIAGNOSTIC, INC. 08FK50Germany, 2013

BABIĆ MIRJANA

30


MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE

2.2.5. MOLEKULARNA DIJAGNOSTIKA TUBERKULOZE Konvencionalne metode za identifikaciju Mycobacterium tuberculosis kompleksa mogu potrajati i do 12 tjedana. Zbog velikog kliničkog i epidemiološkog značaja, stalna je tendencija razvoja molekularnih tehnika za identifikaciju uzročnika tuberkuloze. Jedna od takvih metoda je metoda amplifikacije nukleinskih kiselina lančanom reakcijom polimeraze (eng. PCR-Polimerase Chain Reaction). U mikrobiološkom laboratoriju molekularne se metode primjenjuju za direktni dokaz mikobakterija iz uzorka bolesnika i iz bakterijskih kultura kultiviranih na krutim ili u tekućim hranilištima. Princip Molekularna dijagnostika tuberkuloze temelji se na tri glavna procesa: izolacija bakterijske DNK, umnožavanje specifične genomske regije lančanom reakcijom polimeraze (PCR) i detekcija odnosno vizualizacija dobivenog produkta. Potrebni materijal i pribor 1. Uzorak dobiven od pacijenta ili bakterijska kultura 2. Jednokratne zaštitne rukavice bez pudera 3. Automatske pipete i pripadajući nastavci s aerosolnom barijerom 4. Stalak za mikroepruvete 5. Mikroepruvete od 1,5 ml i 2,0 ml 6. Komercijalni set za izolaciju DNK 7. Temperaturni blok (termomikser) 8. Centrifuga 9. Uređaj za amplifikaciju (eng. thermalcycler) 10. Hladni stalci za mikroepruvete

11. 12. 13. 14. 15. 16. 17.

Komercijalni set za PCR Reagensi i kalup za izradu agaroznog gela Uređaj za elektroforezu (kadica i izvor struje) UV transluminator Oprema za snimanje agaroznog gela Posude za odbacivanje Računalo i računalni program za obradu slike dobivene elektroforezom

Opis postupka Izolacija se odvija pomoću komercijalnih setova za izolaciju DNK prema protokolu navedenom od strane proizvođača, a započinje liziranjem bakterijskih stanica iz uzorka (poželjno nakon obrade) ili iz bakterijske kulture. Pri izolaciji DNK mikobakterija uputno je stanice izložiti duljem djelovanju lizozima zbog specifične građe bakterijske ovojnice. Raspadom stanica oslobađa se DNK koju je potrebno pročistiti, isprati i konačno izdvojiti. PCR se temelji na umnožavanju specifične genomske regije. Specifična genomska regija Mycobacterium tuberculosis kompleksa je IS6110. Umnožavanje se izvodi pomoću enzima polimeraze i specifičnih početnica (eng. primera). Uz uzorke se obavezno rade pozitivna i negativna kontrola kojima se kontrolira amplifikacija. Reakcija se odvija u automatiziranom uređaju (thermlacycler) koji precizno diže i spušta temperaturu u točno određenim vremenskim

31


MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE

intervalima koji se ponavljaju u 30 do 40 ciklusa. U svakom ciklusu događa se denaturacija, hibridizacija i produljivanje DNK. Po završetku zadnjeg ciklusa slijedi detekcija, odnosno vizualizacija dobivenog PCR produkta. U tu svrhu najčešće se koristi gel elektroforeza, nakon koje se agarozni gel prenese na UV transluminator, a rezultat elektroforeze zabilježi na disketu. Dobivena slika se obrađuje pomoću računalnog programa. Interpretacija nalaza Prisutnost linije (eng. band) na agaroznom gelu u području pozitivne kontrole dokaz je pozitiviteta uzorka na Mycobacterium tuberculosis compleks. Zaključak Danas se koriste metode „end point“ PCR-a, Real-time PCR-a, hibridizacije i masene spektometrije (MALDI TOF). Metode molekularne dijagnostike su visoko specifične, osjetljive i ubrzavaju dijagnostički postupak. Ovo je izuzetno važno zbog ranog i brzog otkrivanja uzročnika tuberkuloze i praćenja rezistencije, no nedostatak ovih metoda je u tome što ne možemo biti sigurni da li je detektirana genomska regija iz živog ili mrtvog uzročnika i da uzorak nije kontaminiran. Prema tome postupak kultivacije je još uvijek „zlatni standard“ u dijagnostici tuberkuloze i kao takav ima najvažniju ulogu u njenom dokazivanju. LITERATURA 

Kalenić, Smilja i suradnici. Medicinska mikrobiologija. Zagreb : Medicinska naklada, 2013. p. 169

Sacace Biotechnologies. MTB complex 390/750IC (Cat.No. B-15-50R). Italija : Sacace Biotechnologies, 2010.

Rapid detection of Smear-Negative Micobacterium tuberculosis by PCR and Sequencing for Rifampin Resistance with DNA Exstracted Directly from Slides. Patnaik, M., Liegmann, K. and Peter, J.B. 2001, Jurnal of Clinical Microbiology.

KLAUSBERGER LIDIJA

32


MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE

2.3. PPD-TEST Robert Koch je prvi otkrio da filtrat tekuće kulture Mycobacterium tuberculosis ubrizgan životinji već zaraženoj sa Mycobacterium tuberculosis izaziva u njoj specifičnu reakciju. Ta reakcija, nazvana tuberkulinska reakcija, je posebna vrsta kasne alergijske reakcije. Koch je pomoću toga napravio svoj alt-tuberkulin. To je gusta tekućina tamno sive boje koja se sastoji od autoliziranih, toplinom ubijenih tekućih kultura Mycobacterium tuberculosis koje su profiltrirane a zatim isprane. Aktivni dio te tuberkulinske supstance nalazi se u proteinima. Izdvajanjem proteina iz tuberkulina, Seibertova i njeni suradnici su dobili aktivan protein u čistom stanju. Taj protein nazvan je PPD-pročišćeni proteinski derivat. PPD kao pročišćeni specifični alergen danas se koristi umjesto ranije korišenog alttuberkulina za otkrivanje osoba zaraženih sa tuberkulozom, tj kao tuberkulinski test. Postoji više raznih tuberkulinskih reakcija, a najčešće se koristi Mantouxova kožna reakcija. Da bi se utvrdilo treba li izvršiti BCG cijepljenje izvodi se tuberkulinski test. Samo osobe koje ne reagiraju na tuberkulin (''nereaktori“) treba cijepiti. Taj test se izvodi intrakutano (tzv. metoda Mantoux) na volarnoj strani lijeve podlaktice. Tuberkulin u količini od 0,1 ml se uštrcava strogo intrakutano. Igle za to moraju biti tanke i kratke, a štrcaljke uske (tzv. PPD šprice). Poslije ispravno izvedene intrakutane injekcije stvori se na koži bjelkasti mjehurić koji je na površini hrapav kao narančina kora. Za testiranje se upotrebljava tuberkulin koji u 0,1 ml sadrži 2 jedinice PPD tuberkulina. Reakcija se čita nakon 72 sata. Pritom se vodi računa samo o promjeru infiltrata odnosno induracije, a ne o promjeru crvenila (eritema). Granice induracije mogu se odrediti prevlačenjem jagodice prstiju preko infiltrata kože. Veličina infiltrata mjeri se ravnalom od prozirne plastične mase koje je podijeljeno na mm. Korisno je osim promjera induracije zabilježiti i eventualnu prisutnost eritema (E), ili vezikule (V), ili bule (B), ili nekroze (N). Rezultati testa se moraju pažljivo protumačiti. Medicinski rizični faktori jedne osobe određuju na kojoj inkrementaciji (5mm, 10mm, 15mm) induracije se rezultat smatra pozitivnim: 

5mm ili više je pozitivno kod:  HIV pozitivne osobe  osobe sa nedavnim kontaktom sa TB pacijentom  pacijentima koji su imali transplantaciju organa ili kod osoba sa oslabljenim imunološkim sustavom

33


MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE

10mm ili više je pozitivno kod :  osoba koje su nedavno stigle iz zemalja sa visokom razinom frekvencije tuberkuloze  radnika TBC laboratorija  osoba sa kliničkim kondicijama koje povećavaju rizik (diabetes, leukemija itd.)  djece mlađe od 4 godine 15mm ili više je pozitivno kod:  osoba koje nemaju druge rizične faktore tuberkuloze

Može se desiti da test bude lažno pozitivan. To može biti uzrokovano sa strane od netuberkuloznog micobacteriuma. U nekim slučajevima je test lažno pozitivan radi alergijske reakcije ili hipersenzitivnosti. Rezultat testa može biti potisnut od slijedećih faktora:     

mononukleoze sarkoidoza Hodgkinova bolest upotreba steroida pothranjenost

Literatura: 

Mikrobiologija i parazitologija, urednik Bogdana Karakašević, Medicinska knjiga 1987., str.873., paragraf 5-7

Provedbeni program obveznog cijepljenja u Hrvatskoj u 2013. godini, str. 5, '' Upute za izvođenje BCG cijepljenja''

http://en.wikipedia.org/wiki/Mantoux_test

ŠIMAC INES

34


MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE

2.4 IGRA ( interferon-gamma release assay ) QuantiFERON – TB Gold In – Tube QFT (QuantiFERON test) je in vitro dijagnostički test koji služi za dokazivanje latentne tuberkulozne infekcije ( LTBI, engl. Latent TB Infection). LTBI je nezarazno asimptomatsko stanje, imuni odgovor na prije unesene antigene M.tuberculosis. Nužno ne znači da će nazočnost uzročnika biti prisutna za vrijeme testiranja. Ključni čimbenik kontrole tuberkuloze jest ciljano traženje i liječenje osoba sa LTBI koje imaju povišen rizik od progresije infekcije u aktivnu bolest. QFT-GIT je ELISA-test (enzyme-linked immunosorbent assay) koji nakon inkubacije s mješavinom sintetskih peptida koji simuliraju mikobakterijske proteine: ESAT-6, CFP-10 i TB7.7(p4) detektira otpuštanje interferona-gama (IFN-γ) iz T-limfocita u svježoj hepariniziranoj punoj krvi senzibiliziranih osoba. Svi BCG- cijepni sojevi, kao i većina netuberkuloznih mikobakterija, s izuzećem M. kansasii, M. szulgai i M. marinum, ne sadrže ove proteine. Osobe zaražene mikobakterijama iz M. tuberculosis kompleksa u krvi imaju limfocite koji prepoznaju mikobakterijske antigena. Detekcija, a zatim i kvantifikacija interferona-gama (IFN-γ) čine temelj ovog testa. Načela QFT-GIT testa Sustav QFT-GIT sadržava posebne epruvete (Nil kontrola-nulta kontrola, TB antigen i Mitogen kontrola-pozitivna kontrola odnosno kontrola pravilnog postupanja sa krvi i pravilne inkubacije) u koje se uzimaju uzorci pune krvi koji se najkasnije u roku od 16 sati nakon uzorkovanja trebaju inkubirati pri temperaturi od 370C u razdoblju od 16 – 24 sata. Uzorci se nakon inkubacije centrifugiraju, a nakon oduzimanja plazme slijedi utvrđivanje IFN-γ (uIJ/ml) metodom ELISA. Postupak rada: 2.4.1 Uzorkovanje QFT- GIT epruvete: Nil kontrola (sivi čep), TB antigen (crveni čep), Mitogen kontrola (ljubičasti čep). Antigeni se nalaze u suhom obliku na unutarnjoj stjenci epruvete. Svakom pacijentu potrebno je uzeti po 1ml krvi postupkom venepunkcije direktno u QFT-GIT epruvetu (Nil, TB, Mitogen). Poredak epruveta mora biti kako je navedeno: Nil, zatim TB Antigen i potom Mitogen. S obzirom da 1ml teče sporo (zbog slabijeg vakuuma) potrebno je pričekati 2-3 sekunde dulje kako bi smo bili sigurni da je epruveta napunjena. Na svakoj epruveti je nacrtana crta koja označava volumen krvi (0.8-1.2ml) koji treba biti u epruveti. Nakon vađenja epruvete se trebaju obavezno okrenuti nekoliko puta,a zatim intenzivno promiješati (okretati 8-10 puta). Miješanje je bitno kako bi se krv promiješala sa sadržajem

35


MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE

epruvete. Potrebno je pravilno označiti epruvete i transportirati u uspravnom položaju unutar 16 sati od uzorkovanja. Tijekom transporta uzorci se ne smiju držati u hladnjaku ili zamrzivaču. INKUBACIJA I ODVAJANJE PLAZME Ako krv nije inkubirana odmah nakon vađenja, miješanje mora biti ponovljeno neposredno prije inkubacije. Epruvete moraju biti u uspravnom položaju tijekom inkubacije,na temperaturi od 37 C tijekom 16-24 sata. Nakon inkubacije epruvete se centrifugiraju 5-15 minuta na 1500 do 2200 RCF (g). Želatinozni čep će odvojiti stanice od plazme. Potrebno je odvojiti plazmu pipetom i prebaciti u mikroepruvete. Uzorci plazme koja se odvoji može se direktno stavljati na QFT- GIT ELISA pločice. ELISA metodom se utvrđuje količina IFN – γ citokina. IFN-γELISA Potreban pribor i materijal: • • • • • • •

plazma Standard kit Konjugat 100x Enzyme substrate Enzyme Stopping Wash Buffer Green Diluent

• • • • •

Sterilna destilirana voda Mikropipete i nastavci Mikroepruvete za S1,S2,S3,S4 Stalak Radni papir sa tablicom ELISA pločice

2.4.2 Opis postupka QFT–GIT ELISA je komercijalizirani test, te ima svoj postupak izvođenja i korištenja reagensa, tj. cijelog ELISA kita. i po tim postupcima se se izvodi.

36


MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE

Interpretacija nalaza Dijagnoza LTBI iziskuje zajedničku ocjenu epidemioloških, anamnestičkih, medicinskih i dijagnostičkih rezultata; svi ovi rezultati se moraju uzeti u obzir pri interpretaciji rezultata testa QuantiFERON-Tb Gold In Tube. Tb antigen – Mitogen- Nula Nula <0,35 >0,5 >0,35 i <25% >0,5 Nula >0,35 i >25% <8,0 svejedno Nula <0,35 <0,5 >0,35 i <25% <0,5 Nula >8,0 svejedno koliko svejedno *Rezultati TB Antigen reakcije nejasni Nula (IJ/ml)

QT

Interpretacija

negat.

Nije vjer.LTBI

negat.

Nije vjer.LTBI

pozitiv.

LTBI vjerojatna

nejasan

*

nejasan

*

nejasan

*

Iz izmjerene visine IFN-γ koncentracije ne može se izvesti zaključak o stadiju ili stupnju infekcije, mjeri imunološke aktivnosti ili i vjerojatnosti aktivnog oboljenja. Sva mjerenja izražena su u IJ/ml. QT je pozitivan ako je vrijednost nulte epruvete ispod 8,o IJ/ML, a vrijednost TB antigen epruvete minus vrijednost nulte epruvete iznosi jednako ili više od 0,35 IJ/ml vrijednost i to je istovremeno više od 25% vrijednosti nulte epruvete; svejedno koliko je tada mitogen epruveta.

POZITIVAN NEGATIVAN NEJASAN

Tb odgovor – Nula > 0,35 IJ/ml i > 25% od Nule < 0,35 IJ/ml ili 25% od Nule < 0,35 IJ/ml ili < 25% od Nule Bilo koliko

Nula

Mitogen-Nula

< 8,0

Bilo koliko

< 8,0

> 0,5

< 8,0

0,5

> 8,0

Bilo koliko

U osoba s pozitivnim testom treba isključiti aktivnu tuberkulozu. Kada se dokaže da se radi o LTBI, treba procijeniti da li je potrebna kemoprofilaksa.

37


MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE

Negativan nalaz Rezultat se interpretira ovisno o tome radi li se o imunokompetentnoj ili imunokompromitiranoj osobi. Ako se radi o imunokompetentnoj osobi sa negativnim QFT, bez simptoma, daljnja dijagnostika nije potrebna jer se smatra da osoba nema infekciju M.tuberculosis. Ako osoba ima simptome (kašalj, mršavljenje, povišena temperatura), potrebno je učiniti dodatnu obradu (minimum radiološka snimka prsišta i mikrobiološka obrada sputuma). Ako se radi o imunokompromitiranoj osobi s negativnim QFT – TB GIT testom, bez simptoma, daljnja je dijagnostika ipak potrebna da bi se isključila aktivna TBC (minimum radiološka snimka prsišta i mikrobiološka pretraga sputuma). Negativna prediktivna vrijednost QFT – a u imunokompromitiranih osoba nije poznata, stoga je u osobe sa simptomima (kašalj, mršavljenje, povišena temperatura, znojenje) potrebno učiniti proširenu obradu na ekstrapulmonalnu TBC (radiološka snimka prsišta, mikrobiološka obrada sputuma, urina, stolice). Kod neodredivog nalaza nema svjetskih smjernica što dalje učiniti. Tada treba postupiti u skladu s odgovorom na pitanje kolika je vjerojatnost da je osoba inficirana s M. tuberculosis; U nalazu je važno navesti zbog čega je nalaz neodrediv, jer npr. Neadekvatan odgovor na mitogen može biti povezan s imunosupresivnim stanjima.

Literatura: • Liječnički vjesnik 133:361-432, br.11-12, Zagreb, studeni – prosinac 2011 •

The Whole Blood IFN-gamma Test, Mesauring Responses To ESAT-6, CFP-10, TB7.7 (p4) Peptide Antigens- package insert

http://www.bolnica-klenovnik.hr/index.php?task=group&gid=9&aid=666

MAJSTOROVIĆ SUZANA

38


MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE

Literatura  Naputak za suzbijanje i sprečavanje tuberkuloze /NN 083/2012) 

G.Mlinarić Galinović, M.Ramljak Šeko i suradnici, Specijalna medicinska mikrobiologija i parasitologija

www.perpetuum-lab.com.hr/wiki/mikrobiologija tuberkuloze

hr.wikipedia.org/wiki/sušica,

Vježbenica iz kolegija « Medicinska bakteriologija i virologija», radni materijali prof.dr.sc. Brigita Tićac

Mikrobiologija i parazitologija, urednik Bogdana Karakašević, Medicinska knjiga 1987., str.873., paragraf 5-7

Prvedbeni program obveznog cijepljenja u Hrvatskoj u 2013. godini, str. 5, '' Upute za izvođenje BCG cijepljenja''

Color atlas and textbook of Diagnostic mycrobiology, Third edition ,Elmer W. Koneman, Stephen D.Allen, VR.Dowel JR, i dr. , 1988 str.541,542

http://en.wikipedia.org/wiki/Mantoux_test

Naputak za suzbijanje i sprečavanje tuberkuloze, II. Dopunjeno izdanje, Ministarstvo zdravstva i socijalne skrbi, HZJZ, Zagreb, lipanj 2010,str.35

TBC/HIV,Klinički priručnik,drugo izdanje,A.Harries,D.Maher,S. Graham,str. 29

ODREĐIVANJE OTPORNOSTI VRSTE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS NA IZONIAZID MULTIPLEKS PCR METODOM Medicina 2007;43:47-54 UDK: 616.24-002.5:615.28.015.8

www.tbc.zdravlje.gov.rs./files/biblioteka/vodiczamikrobioloskudijagnostikutuberkoloze

Upute za rad u TBC laboratoriju ZZJZ Primorsko –goranske županije

Kalenić, Smilja i suradnici. Medicinska mikrobiologija. Zagreb : Medicinska naklada, 2013. p. 169.

Sacace Biotechnologies. MTB complex 390/750IC (Cat.No. B-15-50R). Italija : Sacace Biotechnologies, 2010.

Rapid detection of Smear-Negative Micobacterium tuberculosis by PCR and Sequencing for Rifampin Resistance with DNA Exstracted Directly from Slides. Patnaik, M., Liegmann, K. and Peter, J.B. 2001, Jurnal of Clinical Microbiology.

39


MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE

TB Ag MPT64 Rapid, STANDARD DIAGNOSTIC, INC. 08FK50Germany, 2013

Liječnički vjesnik 133:361-432, br.11-12, Zagreb, studeni – prosinac 2011

The Whole Blood IFN-gamma Test, Mesauring Responses To ESAT-6, CFP-10, TB7.7 (p4) Peptide Antigens- package insert

http://www.bolnica-klenovnik.hr/index.php?task=group&gid=9&aid=666

BBL MGIT Mycobacteria Growth Indicator Tube, OADC Enrichment, PANTA Antibiotic Mixture

Radna uputa MGIT – Mikrobiološki laboratorij Čakovec

Značenje laboratorijskih u nadzoru nad tuberkulozom u Međimurskoj županiji; Marina Payerl-Pal, Vera Katalinić-Janković, Mihaela Obrovac, Vesna Vršić Krištofić, Biserka Poje Jelenić, Marijana, Acta Med Croatica, 65 (2011) 11-17

Novi horizonti u molekularnoj dijagnostici TB: trebamo li još uvijek konvencionalnu mikrobiologiju ?, Vera Katalinić-Janković

40

Mikrobiološka dijagnostika tuberkuloza  

Seminar, MLD izvanredni II.godina

Read more
Read more
Similar to
Popular now
Just for you