Page 1

1-3세부과제

1/91

In vivo 미생물 대사체 독성 평가기술 개발 및 표준화

2009~2011. / 1중단위 3세부과제

약물대사기반연구사업단

약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

2/91

1. 최종 연구개발 목표 1) 세부과제의 목표 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·5 2) 세부과제의 목표달성 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·6 (1) 2차년도(2010) · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·6 (2) 3차년도(2011) · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·6 3) 국내·외 기술개발 현황 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·7

2. 연구개발 내용 및 방법 1) 무균동물 및 장내미생물 정착균동물 확보, 유지 및 공급 시스템 확립 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·11 (1) Germ-free mouse 도입 및 증식 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·13 (2) Germ-free mouse 확인을 위한 검사 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·13 (3) Gnotobiote 제작 및 증식 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·15 (4) Gnotobiote 확인을 위한 검사 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·15

2) 무균동물 및 장내미생물 정착균동물을 활용한 동태 연구 · · · · ·16 (1) Germ-free 및 SPF 마우스를 활용한 ginsenoside Re의 약물동태 연구 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·16 (2) Germ-free, gnotobiote 및 SPF 마우스를 활용한 acetaminophen 대사 연구 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·19 (3) In vivo acetaminophen 독물동태 연구 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·22 (4) In vivo geniposide 약물동태 연구 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·23 (5) In vivo baicalin 약물동태 연구 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·24

약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

3/91

3) 항생제 처치동물을 활용한 대사 연구 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·24 (1) Antibiotic-treated rat의 제작 및 검사 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·25 (2) Antibiotic-treated mouse의 제작 및 검사 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·26 (3) Rat의 생체내 baicalin 및 대사체의 분석법 확립 · · · · · · · · · · · · · · · · · ·29 (4) Mouse의 생체내 baicalin 및 대사체의 분석법 확립 · · · · · · · · · · · ·30 (5) 정상동물과 항생제 처치동물에서 baicalin 대사 특성 변화 연구 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·31

4. 연구개발 결과 1) 2차년도 연구결과 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·34 (1) 무균동물 및 장내미생물 정착균동물 확보, 유지 및 공급 시스템 확립 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·34 (2) 무균동물 및 장내미생물 정착균동물을 활용한 약물동태 연구 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·37 (3) 항생체 처치동물을 이용한 대사 및 약물동태 연구 · · · · · · · · · · · · · · · ·42

2) 3차년도 연구결과 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·66 (1) 무균동물 및 장내미생물 정착균동물 확보, 유지 및 공급 시스템 확립 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·63 (2) 무균동물 및 장내미생물 정착균동물을 활용한 약물동태 연구 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·67 (3) 항생제 처치동물을 이용한 대사 및 약물동태 연구 · · · · · · · · · · · · · · · ·77

5. 연구결과 고찰 및 결론 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·87

6. 참고문헌 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·90

약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

4/91

약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

5/91

1. 최종 연구개발 목표 1) 세부과제의 목표 장내미생물을 이용한 in vivo 대사독성 평가법을 개발하고자 2개년의 연구 기간을 통하여 무균 동물의 확보, 유지 및 공급 시스템을 구축하는 한편, 구 축된 무균동물에 장내미생물을 정착시킨 gnotobiote를 구축하여 독성평가에 활용하고자 하였다. 또한 무균동물 대조군과 특정 장내미생물을 정착시킨 동물에서 독성물질의 동태변화를 비교평가하여 장내미생물에 의한 대사가 미치는 영향을 판단하 고자 하였다. 아울러 무균동물과 gnotobiote, 항생제 처치에 의하여 장내미생물총의 변화 를 유발시킨 동물에서 시험물질의 약물동태 및 대사체 생성정도를 평가하여 장내미생물총을 정상적으로 보유하고 있는 대조동물과 비교하여 장내미생물 이 실제 어떤 영향을 미치는지를 시험하고자 하였다. 그리하여 장내미생물이 체내 대사에 미치는 영향을 과학적으로 입증하는 한 편, 최종적으로 장내미생물을 이용한 in vivo 대사 독성 평가 기반을 구축하 고 확립된 시험법은 표준작업수순서를 작성하여 표준화시킴으로써 국내에 전혀 기반구축이 이루어져 있지 않은 in vivo 장내미생물 활용 독성평가 기 반을 조성하고자 하였다.

약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

6/91

2) 세부과제의 목표달성도

(1) 2차년도 (2010) 목표

연구개발 수행내용

목표 달성도(%)

무균동물의 확보, 유지 및 공급시스템의 확립

무균동물 사육조건 확립 미생물 검사법 확립 무균동물 유지 및 공급을 위한 시스템 정립

100%

장내미생물 정착동물의 개발 및 확립

적용 장내미생물총의 선정 및 정착연구 수행 무균동물과 미생물 정착동물에 대한 비교독성 평가

100%

무균동물 및 장내미생 물 정착동물을 활용한 동태연구

독성물질 및 대사체 분석법 확립 (ginsenoside Re, acetaminophen) 독성동태 평가

110%

항생제 처치동물에서의 식품 또는 의약품의 동 태변화에 대한 연구

항생제 투여시 랫트의 장내세균총 변화 평가 랫트 혈액내 시험물질 분석법 확립 (baicalin 및 대사체) 랫트 정상동물과 항생제 투여동물의 동태 비교 (baicalin 및 대사체)

110%

(2) 3차년도 (2011) 목표

무균동물의 유지 및 공급 을 위한 시스템의 확립

장내미생물 정착동물의 개발 및 확립

무균동물 및 장내미생물 정착동물을 활용한 동태연구

항생제 처치동물에서의 식품 또는 의약품의 동태 변화에 대한 연구

목표 달성도(%)

연구개발 수행내용 Germ-free mouse 도입하여 hard isolator에 유 지하면서 증식하여 공급시스템 마련 지속적인 무균동물 유지 및 공급을 위한 시스템 가동 (수컷 기준 연 300마리) 3차년도 시험물질 분석을 위한 무균동물 생산 적용 장내미생물총의 선정 및 정착연구 수행 Gnotobiote 제작을 위한 무균동물의 대량 생산 및 유지 Gnotobiote mouse 검증 체제 가동 무균동물과 미생물 정착동물에 대한 비교독성 평 가 수행(acetaminophen, geniposide, baicalin) - 혈액생화학 및 병리조직검사 시험물질 및 대사체 혈중 분석법 확립 (acetaminophen, geniposide, baicalin) In vivo acetaminophen 독성동태 분석 수행 In vivo geniposide 약물동태 분석 수행 In vivo baicalin 약물동태 분석 수행 항생제 투여시 마우스의 장내세균총 변화 평가 마우스 혈액내 시험물질 분석법 확립 (baicalin 및 주요 대사체) In vivo baicalin 약물동태 분석

140%

100%

100%

100%

약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

7/91

3) 국내 외 기술개발 현황 사람 분변의 주요 미생물은 Bacteroides, Bifidobacterium, Eubacterium,

Clostridium, Peptostreptococcus, Ruminococcus 등 매우 다양하며, 일반 적으로 식이성분의 발효, 메탄 및 H2S와 같은 가스 생성대사를 비롯하여 담 즙산 대사 등의 대사과정이 알려져 있다 (McGarr 등, 2005). 특히, 대장암과 관련되어 담즙산의 아미노산 conjugate가 co-carcinogen 으로 알려진 lithocholic acid로 대사되는 과정과 역시 발암과정을 촉진하는 것으로 알려진 deoxycholic acid로의 대사 및 이들 대사체들의 발암과정에 서의 장내 미생물의 역할 등이 연구된 바 있다 (McGarr 등, 2005). 뿐만 아니라 장내미생물은 체외 미생물과 마찬가지로 증식과 분열을 위하여 에너지 대사를 할 뿐 아니라 장내의 특수한 환경에서 서식하기 위하여 특수 한 생체이물 대사계를 가지고 있어 식이 등을 통하여 장내에 들어온 수 많 은 화학물질의 대사에 관여하고 있음은 의심할 여지가 없다. 실제 장내 미생물의 생체이물 대사에 관한 많은 문헌에서 다양한 대사계가 가동되고 있음이 보고되었으며, 그 중 특히 이물질 대사에 있어서 숙주의 대 사계와 차별이 될 수 있는 대사계로는 β-glucuronidase, β-glycosidase, sulfatase, cysteine conjugate β-lyase, azoreductase, nitroreductase 등의 효소가 해당되며, 이러한 효소활성을 장내미생물들이 보유하고 있음이 널리 알려져 있다. 여러 연구보고를 요약하면, 장내미생물이 화학물질의 약물대사에 관여함으 로써 유발되어 나타날 수 있는 결과는 다음과 같다. - 첫째, 식이 등을 통하여 위장관으로 유입된 화학물질 또는 체내에 흡수되어 대사과정을 거쳐 생성된 대사체가 담즙을 통해 장내로 배설되었을 때 장내 미생물에 의한 추가적인 대사를 통하여 다시 장관에서 재흡수되는 장간재순 환이 일어날 수 있으며, 그 결과 화학물질의 체외로의 배설이 늦어질 수 있 다. - 둘째, 장내미생물이 생산하는 대사효소에 의하여 원래 독성이 없던 화학물 질이 독성을 발휘하는 대사체로 전환될 수 있다. - 셋째, 발암물질의 경우도 대사과정이 요구되는 2차발암물질의 경우 장내미 약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

8/91

생물에 의한 대사를 거쳐 자체는 발암성이 없다가 발암성을 띠게 되는 경우 가 있다. - 넷째, 원래 독성을 띠는 화학물질이 장내미생물에 의한 대사과정을 거치거 나 또는 대사과정 없이 장내미생물의 특성에 의해 독성이 없어질 수 있다. - 다섯째, 약물 중 약물학적 효과를 나타내기 위해 대사과정이 요구되는 전구 약물(pro-drug)의 경우 장내미생물에 의한 대사과정을 통하여 약효가 없다 가 약효를 띠게 되는 경우가 있다. 여기에는 전구약물 중 azo group을 함유 하는 prontosil을 예로 들 수 있다. - 여섯째, 사람을 비롯하여 각종 실험동물의 장내미생물총은 개체차도 심하고 종차도 심한 것으로 알려져 있어, 화학물질의 대사나 독성에 있어 종차를 나 타내는 중요 요인이 될 수 있다. - 일곱째, 체내 조직에서 발현되지 않는 특이 대사효소가 장내미생물에 의해 생산되는 예가 있기 때문에 결국 체내 조직에서는 생성될 수 없는 종류의 대 사체가 생기게 되는 요인으로 작용할 수 있다. - 여덟째, 화학물질의 약효나 독성이 투여경로에 따라 많은 차이를 보일 수 있는데 장내미생물에 의한 대사과정도 이러한 투여경로에 따른 작용의 차이 를 나타내는 한 요인이 될 수 있다. 그러나 이렇게 장내미생물이 화학물질의 대사를 담당하고 독성발현에 중요 한 영향을 줄 수 있음에도 불구하고 현재까지 장내미생물의 역할에 대한 연 구는 국내에서 거의 전무하다시피 한 것이 현실이며, 장내미생물 대사에 의 한 소수의 연구도 대부분 in vitro 연구에 국한되어 진행되고 있어 in vivo 시험에 관한 인프라 구축 뿐만 아니라 연구저변의 확대가 매우 절실히 필요 한 상황이다. 화학물질의 약물대사나 독성 발현에 미치는 장내미생물의 역할을 제대로 규 명하기 위해서 절대적으로 필요한 in vivo 연구에는 무균동물을 활용하거나 무균동물에 특정 장내미생물을 서식하도록 만든 실험동물(gnotobiote)을 활 용하는 기술 또는 두 동물을 동시에 이용하는 경우가 대부분이다. 이 때 정착시키는 장내미생물은 사람 또는 실험동물에서 분리한 분변시료 등을 활용할 수 있는데, 실험동물과 사람의 장내미생물총이 서로 다르므로 각각의 결과가 독성학적 의의가 있다고 판단된다. 약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

9/91

국외 연구현황 중 사람의 장내미생물을 접종시킨 예를 살펴보면 다음과 같 다. 고단백 식이를 가열할 때 생성되는 다환 방향족 아민류(heterocyclic aromatic amine)는 체내 대사 후 발암성이 생기는 것으로 식이를 통하여 쉽게 노출될 수 있는 물질로 다양한 quinoline계 화학물이 포함된다. - 다환 방향족 아민류에 대한 발암성에 있어서 장내미생물의 역할에 대한 연 구는

이런

이유로

여러

연구가

진행되어

왔다.

특히

2-amino-3-methylimidazo[4,5-f]quinoline(IQ)는 모델물질로 많이 사용 되어 왔는데, Ames test에서는 S-9 fraction 존재 하에서 양성을 보이는 2차 발암물질이다. - IQ를 conventional animal과 무균동물에 투여한 다음 대장세포와 간세포 에서의 DNA damage를 측정하면 무균동물에서는 DNA 손상이 거의 일어나 지 않으며(Kassie 등, 2001), 사람 장내미생물을 접종시킨 동물에서 얻은 분변과 IQ를 incubation 할 때 복귀돌연변이원성이 증가되는 결과로부터 (Hirayama 등, 2000), 장내미생물이 IQ의 대사활성화에 일정한 역할을 할 수 있음을 판단할 수 있다. - 이러한 결과는 F344 랫드에서 무균동물, 무균동물에 사람 장내미생물을 서식시킨 동물모델, 그리고 conventional animal에서 IQ에 의한 DNA damage를

연구한

보고에서도

동일한

결과를

보였다(Knasmuller

등,

2001). - 즉, IQ에 의한 DNA damage는 무균동물에서는 거의 나타나지 않은 반면, 사람 장내미생물을 서식시킨 모델동물과 conventional animal에서는 DNA damage가 뚜렷하게 나타난 것이다. - 또한, IQ로부터 직접적으로 frameshift 형태의 돌연변이를 유발하는 대사 체인 7-hydroxy-IQ가 생성되는 반응이 장내미생물인 Eubacterium과

Clostridium 등에 존재하는 사실도 밝혀져 있으며, 무균동물과, 사람 장내미 생물을 서식시킨 동물 및 conventional animal을 비교하여 7-hydroxy-IQ 의 생성량을 비교하면 무균동물에서 가장 적게 생성되는 사실이 보고된 바 있다(Knasmuller 등, 2001). - 뿐만 아니라 튀긴 육류의 extract를 Ames test 전에 대표적인 장내미생물 인 Bacteroides fragilis와 pre-incubation하면, 돌연변이원성이 약 2배 정 약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

10/ 10/91

도 증가하여 장내미생물이 다환 방향족 아민류의 발암성에 기여함이 재차 확인되었다. -

Schneider

Enterococcus

등(2000)도

사람

casseliflavus

장내미생물인

등을

서식시킨

Eubacterium

ramulus,

gnotobiotic

랫드에서

quercetin-3-glucoside의 대사능을 시험하여 장내미생물이 생산하는 배당 체 가수분해효소가 이 물질의 대사에 중요함을 밝힌 바 있다. - Aiub 등(2006)은 diethylnitrosamine과 같은 nitro 화학물의 대사에 있어 nitroreductase

N-

acetyltransferase의

역할을

살펴보기

위하여

Ames test 균주에 이들 효소가 발현되도록 유전자 조작을 하여 실험에 사 용하여 nitroreductase 발현시 diethylnitrosamine의 독성이 증가된다는 사 실을 보고한 바 있다. 이렇게 국외에서는 사람 장내미생물을 실험동물에 접종하여 서식시킨 모델 동물을 활용하여 다양한 화학물질에 대한 연구를 수행하고 있다. 이런 연구배경을 바탕으로 미국 NIH에서도 장내미생물에 의한 대사의 중요 성을 인식하고 2007년부터 ‘Human microbiome project'에 착수하여 식 품 및 의약품 중에 장내미생물 대사에 의해 독성을 나타내는 물질을 규명하 는 연구를 진행 중에 있다. 그러나 국내에서는 장내미생물을 이용한 모델동물을 활용할 수 있는 연구시 설이 제한적이고 독성학자들이 장내미생물에 의한 대사 중요성을 그동안 간 과하다보니 in vivo 장내미생물 독성 평가기술이 많이 뒤쳐져 있다. 더욱이 장내미생물에 의한 독성평가를 위해서 필수적인 무균동물이나 장내미생물 정착균동물 등을 생산할 수 있는 기반시설이 전무한 것이 국내 현실이었다. 이에 본 세부과제 수행을 통하여 무균동물 뿐만 아니라 사람의 장내미생물 총을 도입한 gnotobiote를 생산할 수 있는 국내 유일한 생산체제를 갖출 수 있게 되었고, 장내미생물에 의한 in vivo 평가연구를 지속성 있는 기반시설 및 인력을 확충할 수 있게 되었다. 또한 2개년에 걸쳐 몇몇 시험물질을 대상으로 장내미생물에 의한 약물동태 및 독성평가를 수행함으로써 in vivo 장내미생물 독성 평가기술에서 독보적 인 위치를 자리매김할 수 있게 되었고, 이번 사업을 통해 형성된 연구체계를 통하여 보다 지속적인 연구가 가능하게 되었다. 약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

11/ 11/91

2. 연구개발 내용 및 방법 1) 무균동물 및 장내미생물 정착균동물 확보, 유지 및 공급 시스템 확립 본 3세부과제에서는 ‘무균동물 (germ-free animal)’을 이용한 독성평가 기법의 개발을 위하여 무균동물을 확보하고, 교배를 통하여 실험에 사용할 동물을 생산 및 유지하고자 연구를 수행하였다. 또한, 사람의 분변 현탁액을 무균동물에 접종하여 사람의 장내미생물을 정 착시킨 ‘장내미생물 정착균동물 (gnotobiote)’를 제작하고, 이를 교배를 통하여 독성평가에 사용할 충분한 수의 gnotobiote를 확보하고자 하였다. 정착대상 미생물은 사업단의 수차례 회의를 통하여 사람의 장내미생물상을 대표할 수 있도록 사람 분변시료의 현탁액을 이용하는 방법으로 실시하였고, 경희대학교 배진우 교수 연구팀의 협조 하에 정착이 제대로 진행되었는지를 검사하였다. 2차년도 연구를 위해 미국에서 입수한 무균동물에서 1종의 미생물이 오염 되어 있었고, 3차년도에도 3회에 걸쳐 미국에서 입수한 동물에서 미생물의 오염이 검출되어 완전한 무균동물의 유지에 어려움을 겪었다. 이는 항공편으 로 동물이 수입되면서 기내의 압력 때문에 대기압에서 압력조절로 무균상태 를 유지하고 있는 동물용 운반용기가 오염되어 나타나는 것으로 판단되었으 며, 무균동물의 수입선을 지리적으로 가까운 일본으로 변경할 필요가 있었 다. 이러한 일련의 과정을 통하여 미생물 오염에 대한 평가과정, 무균동물의 입 수, 유지, 교배 및 실험에 관련된 각종 사항 등에 대한 많은 know-how를 축적할 수 있었다. 이후, 무균동물의 교배에 상당한 시일이 소요되기는 했지 만 일본에서 입수한 무균동물은 무균상태를 잘 유지할 수 있었고, 이 동물을 교배하여 3차년도 연구를 진행할 수 있었다.

(1) Germ-free mouse 도입 및 증식 무균동물의 대량 생산과 이를 이용한 독성평가는 국내에서 제대로 한번도 시행된 적이 없었기에 본 세부과제에서 가장 역점을 두어 진행한 부분이었 다. 국내에 대량의 무균동물을 생산할 수 있는 시설은 한국생명공학연구원의 약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

12/ 12/91

의 생명 마우스 연구센터에서 갖추고 있었다. 2차년도

무균동물은

미국

Taconic사에서

판매되는

Swiss

Webster

germ-free mouse (Closed colony)를 암컷 10마리, 수컷 5마리를 구입 (2010년 3월 5일)하여 아크릴 소재로 만들어진 hard isolator에서 유지하 면서 증식에 사용하였다 (Figure 1). 이후 무균동물의 수입선을 다양화하여 실험동물에 대한 이동 시의 스트레스를 줄이고자 일본에서 무균동물을 입수하 여 3차년도의 연구에 활용하였다. 즉,

3차년도

무균동물은

일본

실험동물중앙연구소에서

제공받은

IQI

germ-free mouse를 암컷 8마리 수컷 4마리를 입수(2011년 4월 14일)하 여 hard isolator에 유지하면서 증식에 사용하였다. 교배를 통하여 생산된 germ-free mouse는 기본적인 혈액생화학 및 조직 학적 검사 및 정기적인 미생물 검사를 실시하였고, 충분한 수의 동물이 생산 된 이 후, 사업단에서 지정한 시험물질의 약물동태 연구에 사용되었다. 3차년도 현재, 생명공학연구원 의생명 마우스 센터에서는 약 90여개의 무 균동물 유지용 isolator를 보유하고 있으며 당초 계획보다 많은 약 300여 마리의 무균동물(수컷 기준)을 생산하였다. 일반적으로 동물의 출산 시 암수 비율이 반반 정도로 나타나므로 실제 생산한 무균동물의 수는 약 600마리 정도였다.

또한

증식시기에

맞추어

2차년도에는

ginsenoside

Re

acetaminophen을 대상으로 실험을 진행하였다. 3차년도에는 짧은 연구기간 과 제한된 연구비 범위에서도 무균동물의 활용성 제고를 위하여 3종의 시료 즉, 독성용량의 acetaminophen을 비롯하여 geniposide 및 baicalin을 대상 으로 실험을 진행하였다.

약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

13/ 13/91

(2) Germ-free mouse 확인을 위한 검사 ① 2차년도 무균동물의 미생물 검사 무균동물은 바이러스 및 세균으로부터 무균상태 유지하여야 한다. 이를 위 하여 2차년도에는 액상 티오글리콜산 배지 및 액상 뉴트리언트 배지에 germ-free mouse의 분변을 직접 접종하여 각각의 온도에서 배양하였을 때 증식되는 미생물 (세균 및 진균)의 유무를 평가하였다. 검사 재료 및 방법 ① 검사용 배지 및 양성 대조균주 검사용 배지

양성 대조균주 <호기 배양>

액상 티오글리콜산 배지 액상 뉴트리언트 배지

Staphylococcus aureus P s e u d o m o n a s aeruginosa

② 배지의 적합성(무균성) 시험 제조된 배지 중 일부를 37℃에서 14일간 배양해 미생물의 증식 유무를 확 인하는 시험으로 미생물 증식이 발생되면 안 된다. ③ 배지의 성능시험 배지에 양성대조균을 접종하고 3일 이내에 각 균이 발육함을 확인하였다. ④ Germ-free mouse의 검사방법 및 판정 각 isolator에서 무균적으로 채취된 마우스의 분변을 액상 티오글리콜산 배 지 및 액상 뉴트리언트 배지에 각각 접종하였다. 이들 배지를 37℃에서 14 일간 배양하고 배양 후 7일 및 14일째 균의 발육 유무를 관찰하였다. 검체 에 따라 배지가 혼탁하고 판정이 곤란한 경우에는 14일째에 새로운 배지에 적당량 이식하고, 같은 온도에서 본래의 배지와 함께 4일간 배양하여 검사하였 다. Germ-free mouse 검사 결과, 균의 발육이 확인될 경우 오염되었다고 판 정하였고, 무균성 시험 및 성능시험에서 이상이 있다고 판단될 경우에는 재 시험을 실시하였다. 재 시험결과 이상이 없으면 음성으로 최종 판단하였다.

약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

14/ 14/91

나. 2차년도 무균동물의 항생제 감수성 시험 및 항생제 처치 2차년도 연구에서는 미생물 검사에서 발견된 세균의 사멸을 위한 항생제 처 치를 위하여 항생제 내성 및 감수성 시험을 실시하였다. 항생제 감수성 검사 결과, 발견된 세균을 사멸하기 위한 적절한 항생제를 선택하고 증식된 germ-free mouse에 항생제 처치를 실시하여 세균 검사를 실시하였다. 이 러한 일련의 과정을 통하여 germ-free mouse 모체에 대한 정기적이고 지 속적인 항생제 투여가 가능하도록 처치하였다. mouse의 병원체 검사항목은 다음과 같았다. SPF 마우스 검사항목 (Virus 12, Bacteria 11, Fungus 1, Parasite 3 ) Virus Ectromelia, Lymphocytic choriomeningitis virus(LCMV), Mouse hepatitis virus(MHV), Sendai virus, Hantavirus, Minute virus of mise(MVM), Mouse adenovirus(MAV), Mouse cytomegalovirus(MCMV), Mouse encephalomyelitis virus(GDVII), Pneumonia virus of mice(PVM), Reo3, Rotavirus(Epizootic diarrhea of infant mice) Bacteria

Citrobacter rodentium, Tyzzer,s disease, Corynebacterium kutscheri, Mycoplasma pulmonis, Pasteurella pneumotropica,Salmonella sp., Cilia associated respiratory(CAR) bacillus, Helicobacter hepaticus, Helicobacter bilis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus Fungus Dermatophytes Parasite Pinworm, Intestinal protozoa, Ectoparasites

다. 3차년도 무균동물의 미생물 검사 3차년도에는 운송시간에 따른 오염 가능성과 실험동물에 대한 스트레스 발 생을 상대적으로 줄이기 위하여 한국과 거리가 가까운 일본에서 무균동물을 수입하였고, 도입된 무균동물은 교배를 통한 생산과 증식에 활용하면서 미생 물 검사를 실시하였다. 무균동물의 미생물 검사항목은 2차년도와 같이 virus 12종, bacteria 11종, fungus 1종, parasite 3종에 대하여 실시하였으며, 미생물의 오염이 없어 추가적인 항생제 처치는 실시하지 않았다.

약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

15/ 15/91

(3) Gnotobiote 제작 및 증식

2차년도에는 정착균동물은 무균동물을 도입하여 증식시킨 4주령의 mouse 10쌍을 이용하여 human feces 희석액을 마리당 0.2 ㎖씩 3일간 연속적으 로 경구투여하여 제작하였다. 경구투여 후 1일째부터는 매일 분변을 수집하 여 균의 정착유무를 확인하였다. Mouse 10쌍에 대한 분변 검사결과, human feces에 포함된 미생물총이 germ-free mouse의 장내에 정착된 것이 확인되면 이들 동물을 교배하여 gnotobiote을 증식시켜 독성평가와 약물동태시험에 활용하였다. 2차년도의 연구결과 정착 1세대에서는 사람 분변의 장내미생물총이 유지되는 결과를 보였지만 이들의 교배로 생산된 F1에서는 상당히 다른 정착균 양상을 보임을 알 수 있었다. 이를 극복할 수 있는 방법을 사업단 운영위원회의를 통 하여 협의하여 3차년도에는 본시험 1주일 전에 3일간 사람 분변 현탁액을 경 구로 접종하여 일시적으로 정착을 유도한 다음 사용하기로 결정하였다. 한편, 정착미생물의 종류에 대해서는 당초 한두가지의 미생물을 정착시킬 예 정이었으나, 본 과제의 목표가 장내미생물에 의한 화학물질 대사의 중요성을 평가하는 in vivo 동물모델을 개발하고 평가하는 것인 만큼 사람의 장내미생 물 전체를 정착시켜 시험하는 것이 적절하다고 판단되어 사업단 운영위원회의 를 통하여 제1중과제의 제2세부과제 연구팀에서 제조한 사람 분변 현탁액을 제공받아 시험에 사용하였다.

(4) Gnotobiote 확인을 위한 검사

2, 3차년도에 각각 제조된 gnotobiote는 분변을 수거하여 미생물 군집 분 석을 실시하였다. 미생물 군집 분석결과, 사람의 feces 군집과 mouse의 장 내미생물 군집을 비교 분석하여 gnotobiote 유무를 확인하였다.

약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

16/ 16/91

2) 무균동물 및 장내미생물 정착균동물을 활용한 동태 연구

(1) Germ-free 및 SPF 마우스를 활용한 ginsenoside Re의 약물동태 연구

2차년도에는 장내미생물이 약물의 대사에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위 하여 germ-free mouse와 SPF mouse 수컷에 ginsenoside Re 현탁액 (50 mg/kg/10 ml, 1% methyl cellulose, 0.5% Tween 80)을 경구투여한 후 혈액 생화화 및 조직병리 검사와 투여시간에 따른 약물동태를 분석하였다. Germ-free mouse는 Taconic사에서 도입한 동물을 증식하여 사용하였으며, 대조군으로 사용한 SPF Swiss Webster mouse는 germ-free mouse와 동 일한 주령의 mouse를 Taconic사에서 구입하여 사용하였다. Ginsenoside Re는 경구투여하기 전에 3시간 동안 절식을 실시하였으며, 투 여 후 2시간 경과 후에 사료를 급여하였다. Germ-free 및 SPF mouse를 활용한 ginsenoside Re의 대사연구를 위한 시험군 구분 및 채혈 일정은 아래의 표와 같이 진행되었다. 대상동물이 마우 스인 점을 고려하여 채혈일정을 1마리 당 2-3회 씩으로 제한하고자 하였 고, 채혈시간에 따라 구분된 각 군(n=4)은 처음 2번의 채혈을 안와정맥에 서 실시하였고, 마지막 채혈은 개복하여 복대정맥에서 실시하였다. 채혈된 혈액은 3,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 혈장을 분리하여 deep freezer에 보관하여 이용하였다.

약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

17/ 17/91

동물번호 (대조/GF)

투여전

1

2

3

4

30분

1시간

2시간

4시간

6시간

8시간

10시간

12시간

24시간

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

*대조군은 SPF mouse, GF는 germ-free mouse

가. Ginsenoside Re 경구투여에 따른 혈액생화학적 검사

Germ-free 및 SPF mouse에 ginsenoside Re를 경구투여 후 8, 10, 12 시간 및 24시간 채혈군에서 채혈된 혈장은 Hitach사의 automatic analyzer 7020을 이용하여 AST, ALT, BUN 및 CRE에 대한 혈액화학분석을 실시 하였다.

나. Ginsenoside Re 경구투여에 따른 조직병리학적 검사 Germ-free 및 SPF mouse에서 ginsenoside Re 투여 후 24시간째에 간, 신장 및 폐 조직을 적출된 장기는 10% 중성포르말린 용액에 고정한 다음 수세, 탈수, 투명화 및 파라핀 침투과정을 거쳐 파라핀 블록을 제작한 다음 마이크로톰으로 절 편을 만들어 탈파라핀, 함수, Hematoxyin & Eosin (H&E) 염색을 실시한 후 탈수, 투명화 및 봉입과정을 거쳐 현미경으로 병리조직학적 분석을 수행 하였다.

약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

18/ 18/91

다. Ginsenoside Re 경구투여에 따른 약물동태 분석

혈액내 ginsenoside Re의 분석법 확립

① HPLC 및 mass spectrometry 분석조건 - HPLC는 Shiseido SI-2 system (Kyoto Japan)을 사용하였고 MS는 triple-quadrupole mass spectormetry (API4000, Applied Biosystems MDS SCIEX, Concord, Canada)을 사용하였다. -

Ginsenoside

Re와

관련

대사체들은

negative

ion

mode에서

ESI

(electrospray ionization) source를 이용하여 MRM (multiple reaction monitoring) 분석 조건을 확립하였다. Ginsenoside Re는 945 → 475, ginsenoside Rg1은 799 → 637, ginsenoside Rg2는 783 → 475, ginsenoside Rh1과 F1은 637 → 475, protopanaxatriol은 475 → 391, 그리고 internal standard(IS)인 digoxin은 779 → 649의 ion transition을 갖 는 MRM mode에서 분석을 진행하였다. - 분석용 컬럼으로는 Capcell pak C8DD column (5 μm, 250x2.1mm i.d, Shiseido,

Tokyo,

Japan)의

컬럼을

사용하고,

이동상으로는

2 mM

ammonium acetate (solvent A)와 2 mM ammonium acetate를 10% 혼 합한 methanol (solvent B)를 사용하였고 유속을 0.2 ml/min로 하여서 gradient system에서 분석하였다 (Table 1).

Table 1. HPLC gradient program Time

Solvent A

Solvent B

Flow rate (ml/min)

0

40

60

0.2

0.1

20

80

0.2

5.5

15

85

0.2

5.6

0

100

0.2

10

0

100

0.2

10.1

40

60

0.2

15

40

60

0.2

약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

19/ 19/91

② Sample 전처리 조건 - 혈장의 전처리는 SPE방법을 사용하였으며, SPE cartridge는 OASIS®HLB (30 μm, 30 mg, Waters, Milford, MA, USA)를 사용하였다. - SPE를 이용한 전처리는 혈장 50 μl에 10 μl의 IS 용액(digoxin, 200 ng/mL)을 spiking하고, 여기에 800 μl의 10% MeOH을 가하였다. 위 용 액을

MeOH로

cartridge에

activation하고고,

로딩하였다.

후,

10%

MeOH로

equilibration된

SPE

10%

MeOH로

2회

하고,

washing

isopropyl alcohol로 elution하였다. Elution된 용액은 질소 가스 하에서 40°C로

evpaporation시켰다.

이를

70%

MeOH

50 μL를

사용해

reconstitution하였고, 이중 10 μl를 LC-MS/MS system에 injection하였 다. Germ-free 및 SPF mouse에서 ginsenoside Re의 동태 특성 변화 연구 Germ free mouse와 SPF mouse에 ginsenoside Re를 50 mg/kg/10 ml 경구투여한 후 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12 및 24시간에 혈액을 채취하여 ginsenoside Re를 정량하여 시간에 따른 농도 profile로 나타내었고 약물동 태를 비교 분석하였다. 분석은 한국과학기술연구원 도핑컨트롤센터에서 수행 하였으며, 결과는 제2중단위과제 제1세부과제의 결과부분에서 제시하였다. (2) Germ-free, gnotobiote 및 SPF 마우스를 활용한 acetaminophen 대사 연구 2차년도에는 장내 미생물이 약물의 대사에 어떠한 영향을 미치는지 알아보 기

위하여

germ-free

mouse,

acetaminophen (Sigma Cat

gnotobiote

#A7085)

SPF

mouse

수컷에

현탁액(200 mg/kg/10 ml, 0.5%

methyl cellulose)을 경구투여한 후 혈액생화학, 조직병리 검사를 실시하였다. 2차년도와

3차년도의

연구의

차이점은

2차년도는

full

scale의

PK

parameter를 구할 목적으로 서로 다른 동물개체를 각 채혈일정에 맞게 구분 하여 40마리씩 동물을 사용하였는데, 이는 PK 지표 산출에 오히려 문제점으 로 작용하는 것으로 판단되어 3차년도에는 채혈시간을 한 동물당 4-5 point 로 국한하여 동일 동물에서 채혈을 실시한 점이다. 비록 PK parameter를 구 할 수는 없어도 장내미생물의 중요성을 판단하는데에는 더 적당할 것으로 판 약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

20/ 20/91

단했기 때문이었다. Germ-free mouse는 2차년도에는 Taconic사에서 도입한 동물을 증식하여 사용하였으며, 3차년도에는 일본의 실험동물중앙연구소에서 입수한 무균동 물을 교배하여 실험에 사용하였다. Gnotobiote는 human feces를 투여하여 만들어진 동물을 번식시켜 그의 산자들을 이용하였고, 대조군으로는 SPF Swiss Webster mouse를 사용하였다. 대조군으로 사용된 SPF mouse는 germ-free

mouse

구입한

Taconic사에서

구입하였으며,

germ

free

mouse와 동일한 주령을 이용하였다. Acetaminophen을 경구투여하기 전에 3시간 동안 mouse를 절식시켰으며, 투여 후 2시간 경과 후에 사료를 급여하였다. 실험군은 다음 장의 표와 같 이 채혈시간에 따른 군(n=4)으로 구분하여 정해진 시간에 채혈을 실시하였 다. 채혈은 개복하여 복대정맥에서 실시하였으며, 채혈된 혈액은 3,000 rpm 에서 10분간 원심분리를 실시한 후 혈장을 분리하여 deep freezer에 보관하 여 사용하였다.

가. Acetaminophen 경구투여에 따른 혈액생화학적 검사 2차년도에는

시험군에서

채혈된

혈장은

Hitachi사의

automatic

analyzer 7020을 이용하여 AST, ALT, BUN 및 CRE에 대한 혈액생화학 분석을 실시하였다.

나. Acetaminophen 경구투여에 따른 조직병리학적 검사

2차년도에는 각 시험군에서 적출된 간과 신장은 10% 중성포르말린 용액에 고정한 후 일반적인 방법에 따라 파라핀절편을 제작한 후 H&E 염색을 실시 하여 병리조직학적 분석을 실시하였다.

약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

21/ 21/91

동물번호 (대조, 정착, 무균) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

투여 전

30분

1시 간

2시 간

4시 간

6시 간

8시 간

10시 간

12시 간

24시 간

○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○

* 대조군은 SPF mouse, 정착균은 Gnotobiotic mouse, 무균동물은 Germ-free mouse

약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

22/ 22/91

(3) In vivo acetaminophen 독물동태 연구

3차년도에는 간독성 유발용량으로 acetaminophen을 투여했을 때 장내미생 물에 의한 영향을 평가하고자 하였다. 마우스에

대한

간독성

유발용량

실험을

거쳐

독물동태를

위한

acetaminophen 투여량을 200 mg/kg 및 300 mg/kg으로 설정하였고, 한국 생명공학연구원 의생명마우스센터에서 생산하는 germ-free 및 gnotobiote 모델동물에 acetaminophen을 경구투여한 후 혈액생화학 분석, 조직 검경 및 독물동태를 분석하였다. 혈액생화학 분석 및 조직병리학적 검사는 한국생 명공학연구원에서 수행하였고, acetaminophen의 독물동태 분석은 한국과학 기술연구원에서 수행하였다. SPF, 무균동물, 정착균동물에 대한 acetaminophen 투여는 50% PEG 400 (in

DW)을

이용하여

acetaminophen을

200 mg/kg/10

ml

300

mg/kg/10 ml로 각각 제조하여 단회 경구투여하였으며, 각각의 대조군은 50% PEG 400을 동량 투여하여 사용하였다. Acetaminophen 경구투여에 따른 혈액생화학적 검사는 경구투여 후 24시 간째 채혈하여 Hitach사의 automatic anaylzer 7020을 이용하여 AST, ALT, BUN 및 CRE에 대한 분석을 실시하였다. 조직병리학적 검사는 경구투여 후 24시간째에 간, 신장 및 폐을 적출하여 10% 중성포르말린 용액에 고정한 다음 수세, 탈수, 투명화 및 파라핀 침투 과정을 거쳐 파라핀 블록을 제작한 다음 마이크로톰으로 절편을 만들어 탈 파라핀, 함수, H&E 염색을 실시한 후 탈수, 투명화 및 봉입과정을 거쳐 현 미경으로 병리조직학적 분석을 실시하였다. 독물동태 분석은 acetaminophen 투여전, 투여 후 1시간, 2시간, 6시간 및 24시간에 혈액을 채혈하여 plasma 상태로 한국과학기술연구원에 전달하여 시간에 따른 혈중 농도 변화를 LC-ESI-MS로 측정하였다. 3차년도의 연구에서는 앞서 언급한대로 동일한 동물에서 채혈을 실시하였기 때문에 동태학적 지표의 산출은 어려웠지만 장내미생물이 acetaminophen의 혈중농도에 미치는 영향을 비교할 수 있었다. 장내미생물의 중요성을 나타낼 수 있는 최종 용량 설정을 위하여 수차례 예비실험을 수행하였다. 약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

23/ 23/91

(4) In vivo geniposide 약물동태 연구

3차년도에는 in vivo 장내미생물 대사 시험의 폭을 더욱 확대할 목적으로, 한국을 비롯한 동아시아에서 많이 이용되고 있는 치자의 유효 지표성분인 geniposide를 시험물질로 하여 in vivo 약물동태 연구를 수행하였다. 무균동물 및 gnotobiote 동물모델을 활용한 연구를 위하여 geniposide 경 구투여에 따른 혈액생화학적 검사, 조직병리학적 검사 및 약물동태 분석을 실시하였다. 이때, 혈액생화학 및 조직병리학적 검사는 한국생명공학연구원 에서 수행하였고, geniposide의 약물동태 분석은 한양대학교 유혜현 교수팀 에서 수행하였다. SPF, 무균동물, 정착균동물에 대한 geniposide 투여를 위하여 (주)MSC (MSC. Co. Ltd., Korea)의 식품기술연구소로부터 제공받은 액상 치자 색소 시료를 사용하였다. 원래는 Wako 등에서 지표물질로 판매되는 geniposide 를 사용할 예정이었으나 시판 단위가 20 mg으로 소량만 판매되고 있어 in vivo 실험을 위한 많은 용량을 수급할 수 없어 다른 공급처를 이용하게 되 었다. 본 실험에 사용한 액상 시료는, 국내 천연색소 생산업체인 (주)MSC에서 치 자청색소나 치자적색소를 생산하는 원료로 사용하는 것이다. 즉, 치자로부터 추출한 치자 황색소가 geniposide에 의해 녹변(청변)현상이 일어나는 것을 막기 위해 geniposide를 제거하는 과정에서 얻어지는 부산물로 이것을 이용 하여 치자청색소나 치자적색소를 생산하게 된다. (주) MSC에서 제공받은 액상 시료내 geniposide 순도는 한양대학교 유혜 현 교수팀에서 확립한 geniposide 분석법을 통하여 구하였으며, 액상 색소 원료 중 geniposide 햠량은 최종 47%로 확인되었다. 이에, geniposide 투 여 시료는 geniposide 함량 47%를 환산하여 실험에 사용하였다. Geniposide 투여량은 예비실험을 거쳐 최종 200 mg/kg/10ml (in saline, geniposide 47% 환산)으로 설정하였고, 단회 경구투여 후 12시간째에 채 혈하여 AST, ALT, BUN 및 CRE에 대한 혈액생화학적 분석을 실시하였다. 또한 경구투여 후 12시간째에 간과 신장을 적출하여 조직병리학적 검사를 실시하였다. 약물동태 분석을 위하여 경구투여 전, 경구투여 후 30분, 1시 약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

24/ 24/91

간, 4시간 및 12시간째에 채혈하여 혈장 상태로 한양대학교 유혜현 교수팀 에 전달하여 genipin의 혈중 농도를 분석하였다.

(5) In vivo baicalin 약물동태 연구

3차년도에는 2차년도에서 확립된 baicalin 분석법을 활용하여 germ-free, gnotobiote 및 SPF 마우스에 대한 약물동태를 평가함으로써 장내미생물에 의한 시험물질의 동태변화를 규명하고자 하였다. 이를 위해 2차년도와 동일하게 baicalin 100 mg/kg/10 ml (in 0.5% CMC-Na)을 투여량으로 설정하였고, SPF, 무균동물, 정착균동물의 각 대조 군은 투여용매인 0.5% CMC-Na을 동량 처리하여 혈액생화학 및 조직병리 검사, 약물동태 분석을 실시하였다. Baicalin 경구투여에 따른 혈액생화학적 검사는 경구투여 후 12시간째에 채 혈한 혈액에 대하여 AST, ALT, BUN, CRE을 분석하였고, 조직병리학적 검사는 경구투여 후 12시간째에 간을 적출하여 10% 중성포르말린 용액으 로 고정한 뒤 H&E 염색을 하여 현미경으로 관찰하였다. SPF, 정착균동물 및 무균 마우스를 활용한 baicalin의 약물동태 분석은 랫 트의 결과와 수차례 예비실험을 통하여 경구투여 전, 투여 후 2시간, 4시간, 8시간 및 12시간째에 하기로 결정하였고, 안와정맥을 통해 채혈한 후 혈청 상태로 제공받아 LC-ESI-MS로 분석하였다. Baicalin 분석은 3차년도에 영남대 연구팀이 확립한 마우스 생체 내 baicalin 및 대사체 분석법을 이용 하였다.

3) 항생제 처치동물을 활용한 대사 연구

항생제의 무분별한 처치는 결국 장내미생물총의 변화를 야기하게 되고 이로 인해 식품이나 의약품의 대사 양식에 변화를 초래할 수도 있다. 이에 본 연구에서는 정상동물에 항생제를 처치함으로써 장내미생물상의 변 화를 야기하였을 때 약물의 대사 특성에 어떤 영향을 미치는지 살펴보고 이 약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

25/ 25/91

를 통해 화학물질 대사에 있어 장내미생물의 중요성과 역할에 대한 평가를 수행하고자 하였다. 또한 2차년도에 항생제 처치유무에 따라 baicalin의 대사특성 차이를 랫드에 서 확인함으로써, gnotobiote를 활용한 3차년도의 연구와 병행하여 마우스에 서도 항생제 처치 모델을 도입함으로써 시험물질의 대사 및 독성평가 시험 을 수행할 수 있는 기반적 연구토대를 마련하고자 하였다. Baicalin은 황금의 주요 성분으로 장내미생물에 의한 대사 가능성이 보고되 어 있어 모델 시험물질로 적절하였기에 선정하였고, 2차년도에는 항생제 처 치

랫트에서,

3차년도에는

항생제

처치

마우스에서

장내미생물에

의한

baicalin의 혈중 동태 및 대사 특성변화를 비교 분석하였다. 즉,

2차년도에는

정상

랫트 (normal

rat)와

항생제를

투여한

랫트

(antibiotic-treated rat)으로 시험군을 구분하여 baicalin의 경구투여 시 약 물동태학적 지표에 미치는 장내미생물의 영향을 분석하였고, 3차년도에는 정상

마우스(normal

mouse)와

항생제를

투여한

마우스

(antibiotic-treated mouse)로 시험군을 구분하여 장내미생물이 미치는 영 향을 조사하였다.

(1) Antibiotic-treated rat의 제작 및 검사

실험동물은 6주령에 입수한 수컷 Sprague-Dawley (SD) rat을 1주일 정 도 안정화 시킨 뒤 7주령에 시험에 사용하였다. 항생제 처치군 제조를 위해 cefadroxil 100 mg/kg, oxytetracyclin 300 mg/kg, erythromycin 300 mg/kg을 10 ml 생리식염수에 잘 현탁한 후 1일 1회씩, 3일간 정해진 시간에 7주령 rat에 경구투여 하였고, 2일간 휴약한 후 8주령이 되는 3일째에 baicalin 100 mg/kg/5 ml (in 0.5% CMC-Na)을 단회 경구투여 하였다. 대조군은 정상동물에 항생제 대신 생리식염수를 1일 1회씩, 3일간 정해진 시간에 경구투여하였고, 그 외 모든 과정은 항생제 처치군과 동일하게 처리 하여 baicalin 및 대사체의 동태 변화를 항생제 처치군과 비교 분석하였다. 항생제 처치로 인하여 정상동물과의 병리학적 차이가 발생하는지 살펴보기 약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

26/ 26/91

위하여 baicalin 투여 후 24시간째 위장관, 간, 신장을 적출하여 조직병리 검사를 실시하였고, 장내용물을 혐기배양하여 총균수를 측정함으로써 정상군 과 항생제 처치군 간의 장내미생물 존재 정도를 확인하고자 하였다. 조직병리

검사는

군당

5마리

대조군인

normal

rat은

1

개체,

antibiotic-treated rat은 3개체를 선별하여 시행하였으며, 위장관은 위, 십 이지장, 공장, 회장, 맹장, 결장, 직장으로 구분하고 그 외 간과 신장을 아래 의 방법으로 슬라이드 및 블록을 제작하였다. 검체 제작은 각 조직에 대하여 일정한 두께로 삭정한 다음, 일반적인 조직처리과정을 거쳐 파라핀 포매하고 2~3 μm 두께로 박절하여 조직절편을 제작한 후 H&E 염색을 실시하였다. 완성된 검체는 광학현미경 (Olympus BX50, Olympus Optical Co., Japan) 으로 관찰하였으며, 관찰한 조직에 대해서는 광학현미경에 부착된 디지털 카 메라 (Olympus DP70, Olympus Optical Co., Japan)를 이용해 사진 촬영 하였다.

약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

27/ 27/91

장내용물의 미생물수 검사는 소장, 맹장, 대장 부분에서 장내용물을 각각 추 출하고, 장내용물 0.1 g/1 ml가 되도록 KPi buffer에 현탁시켰다. 이때 소장 내용물은 pH 8의 KPi buffer에, 맹장과 대장은 pH 7의 KPi buffer을 사용 하였고, 질소가스를 이용하여 혐기희석액 상태로 제조하여 108 배까지 단계 6

7

적으로 희석하였다. 각각의 농도별 혐기희석액은 BL 배지에 10 배, 10 배, 8

10 배로 도말하여 gas generating pouch system (BD Biosciences, CA., USA)을 이용하여 혐기적 조건에서 24시간 배양한 후 미생물수를 계수하였 다. (2) Antibiotic-treated mouse의 제작 및 검사

실험동물은 6주령에 입수한 수컷 ICR mouse를 1주일 정도 안정화 시킨 뒤 7 주령에 실험에 사용하였다. 항생제 처치군 제조를 위한 절차는 2차년도 절차에 준하여 시행하였고, 대 조군은 정상동물에 항생제 대신 생리식염수를 정해진 시간에 경구투여 하였 다. 다만, 여러 차례의 예비실험을 통해 랫트와 같이 3일간 항생제 투여한 후 2 일간 휴약하게 되면, 휴약기간 동안 항생제 처치군에서 장내미생물이 다시 재성장하여 미생물 배양에 검출되는 것을 확인하였다. 이에 휴약시간과 미생 물 배양실험, baicalin의 대사체 생성능 등을 통하여 최종적으로 항생제 처 치 마우스의 휴약시간은 6시간으로 설정할 수 있었다. 즉, antibiotic-treated mouse 제조를 위해서는 cefadroxil 100 mg/kg, oxytetracyclin 300 mg/kg, erythromycin 300 mg/kg을 10 ml 생리식염수 에 잘 현탁한 후 1일 1회씩, 3일간 정해진 시간에 7주령 mouse에 경구투 여 하고, 6시간 휴약한 후 baicalin 100 mg/kg/10 ml (in 0.5% CMC-Na) 을 단회 경구투여 하였다. 대조군은 항생제 대신 생리식염수를 1일 1회씩, 3일간 정해진 시간에 경구투여하였고 그 외 모든 과정은 마우스 항생제 처 치군과 동일하게 진행하였다. 항생제 처치로 인하여 정상 마우스와의 병리학적 차이가 발생하는지 살펴보 기 위하여 baicalin 투여 후 16시간째에 위장관, 간, 신장을 적출하여 조직

약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

28/ 28/91

병리 검사를 실시하였고, 장내용물을 혐기배양하여 총균수를 측정함으로써 정상군과 항생제 처치군 간의 장내미생물 존재 정도를 확인하고자 하였다. 조직병리 검사는 군당 5마리 중 대조군인 normal 마우스는 1 개체, antibiotic-treated mouse는 3개체를 선별하여 시행하였으며, 위장관은 위, 소장, 대장으로 구분하고 그 외 간과 우측 신장을 아래의 방법으로 슬라이드 및 블록을 제작하였다. 검체 제작은 고정된 각 조직에 대하여 일반적인 조직 처리과정을 거쳐 조직절편을 제작한 후 H&E 염색을 실시하여 광학현미경으 로 관찰하였다.

장내용물의 미생물수 검사를 위해 십이지장부터 직장까지의 장내용물을 통 째로 추출하였고, 장내용물 0.2 g당 1ml이 되도록 혐기성 배양액에 현탁시 켰다. 이 현탁액은 다시 혐기성 배양액으로 106배까지 단계적으로 희석시킨 뒤 BL agar 배지에 104배, 105배, 106배를 도말하여 Gaspak-anaerobe gas generating pouch system (BD biosciences, CA., USA)을 이용하여 혐기적 조건에서 24시간 배양한 후 미생물 수를 계수하였다. 이때 희석액 사용된

혐기성

배양액의

조성은

KH2PO

44.5 g,

Na2HPO

46.0 g,

L-cystein 0.5 g, tween 80 0.5 g을 물 1L에 용해시킨 것이다.

약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

29/ 29/91

(3) Rat의 생체내 baicalin 및 대사체의 분석법 확립

생체시료 중에 극미량 존재하는 baicalin 및 대사체를 정량하기 위하여 mass spectrometry를 이용하였다. 본 연구에 사용된 LC-MS/MS system 은 ESI source가 장착된 LCQ advantage trap mass spectrometer (Thermo Finnigan, San Jose, CA., USA)와 surveyor system (Thermo Finnigan, San Jose, CA., USA)으로 구성된 HPLC를 사용하였다. 분석용 칼럼은 reversed phase C18 칼럼으로 Atlantis T3 2.1×150 mm (3μm, Waters)를 사용하였고, guard cartridge(Security guard C18, 4×3 mm, Phenomenex)를 이용하였다. 이동상은 Table 2와 같이 ACN과 0.1% aqueous formic acid를 이용하여 gradient 조건에서 28분간 분석하 였다. 칼럼 오븐 온도는 40℃, 샘플 tray 온도는 10℃로 사용하였으며 샘플 injetion 양은 20 μl이었다.

Table 2. Mobile phase gradient for analysis of baicalin and its metabolite in biological samples

Time

ACN (%)

0.1% aqueous formic acid (%)

Flow rate (μl/min)

0

25

75

200

14

58

42

200

18

90

10

200

20

90

10

200

21

25

75

200

28

25

75

200

Baicalin 및 관련 대사체들은 negative ion mode에서 SRM (selected reaction monitoring)으로 분석조건을 확립하였다. SRM 조건은 총 분석시 간에 대하여 0~6.2분, 6.2~11.5분, 11.5~18분, 18~28분을 기준으로 4 개의

segment로

분할하여

IS (tetrabromobisphenol

A,

TBBPA)와

baicalin 대사체들을 동시 분석하였다. 약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

30/ 30/91

Baicalin 및 대사체 M2는 m/z 445.00 → 269.20, 174.90, 대사체 M1은 m/z 269.20 → 251.10, 대사체 M3은 m/z 621.00 → 445.00, IS인 TBBPA는 m/z 642.91 → 447.80, 527.66의 mass transition을 갖는 SRM mode에서 혈액 및 장내용물에 대한 분석을 진행하였다. 이때, MS 분석조건은 Table 3과 같이 segment에 따라 MS 조건을 달리하 였고, segment 1과 2는 baicalin 및 대사체 M2, M3를 분석하기 위하여 같 은 MS 조건을 사용하였다. Segment 3은 대사체 M1인 baicalein을 분석하 기 위한 조건이며, segment 4는 IS를 분석하기 위한 조건으로 사용하였다.

Table 3. Condition of LC/ESI-MS for analysis of baicalin and its metabolite in biological samples ESI source

Segment 1~2

Segment 3

Segment 4

40

40

20

0

0

0

4.50

4.50

5.00

Capillary temperature (℃)

275.0

275.0

275.0

Capillary voltage (V)

-35.0

-11.0

-33.0

Tube lens offset (V)

-20.0

-20.0

-30.0

Segment 1~2

Segment 3

Segment 4

Multipole 1 offset (V)

5.75

6.50

3.25

Lens voltage (V)

36.0

90.0

24.0

Multipole 2 offse (V)

9.50

10.5

5.50

400.0

400

400

Sheath gas flow rate (arb) Aux/Sweep

gas

flow

rate

(arb) I Spray voltage (kV)

Ion optics

Multipole RF amplitude (V)

(4) Mouse의 생체내 baicalin 및 대사체의 분석법 확립

마우스 혈액 내에 극미량 존재하는 baicalin 및 대사체를 정량하기 위하여 MS는 ESI source가 장착된 triple-quardupole mass spectrometry (API4000, SCIEX Division of MDS)와 HPLC는 Agilent 1100 system (Agilent Technologies)을 사용하였다.

약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

31/ 31/91

분석용 칼럼은 Atlantis T3 2.1×150 mm (reversed phase C18, 3 μm, Waters)를 사용하였고, 이동상은 Table 4와 같이 gradient 조건에서 18분 간 분석하였다. 칼럼 온도는 40℃, 샘플 주입량은 5 μl 이었다.

Table 4. Mobile phase gradient for analysis of baicalin and its metabolite in biological samples

μ

Baicalin 및 대사체는 positive ion mode에서 MRM으로 분석하였고, IS는 methaqualone을 사용하여 positive ion mode에서 분석하였다. 이때 MS는 DP 71 V, EP 10 V, CE 29 V, CXP 6 V 조건에서 baicalin (m/z 447.1 → 271.1)을 분석하였고, DP 91 V, EP 10 V, CE 39 V, CXP 8 V 조건에서 IS (m/z 251.1 → 132.1)를 분석하였다.

(5) 정상동물과 항생제 처치동물에서 baicalin 대사 특성 변화 연구 가. 혈액내 baicalin 및 대사체의 약물동태 비교 ① 정상 랫트와 항생제 처치 랫트를 이용한 연구 2차년도에는 정상 랫트 및 항생제 처치 랫트에 baicalin을 100 mg/kg/5 ml 로 단회 경구투여한 후 1, 2, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 16, 20, 24시간째에 0.15 ml씩의 혈액을 채취하였다. 채혈된 혈액은 실온에서 20분간 방치한 뒤 4000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상층액을 얻고, 이를 다시 원심분리하 여 serum 50 μl를 취하여 샘플 전처리 과정을 거쳤다. Serum 전처리는 MeOH 용액를 이용하여 제단백 과정을 거쳤다. 즉, 약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

32/ 32/91

serum 50 μl당 10 μg/ml 농도의 IS 50 μl를 가하여 혼합한 뒤 MeOH 100 μl를 첨가하여 일정시간 혼합하고 4℃, 15,000 rpm에서 20분간 원심 분리한 후 상층액 120 μl를 취하여 LC-MS/MS 분석에 이용하였다. 혈액

샘플의

결과는

시간에

따른

혈중

농도

profile로

나타내었고,

WinNonlin (version 2.1) program을 이용하여 비모델적 해석을 통한 약물 동태 파라미터(pharmacokinetic parameter, PK parameter)를 계산하였으 며, AUC (area under the plasma concentration versus time curve), Tmax (time

to

reach

maximum

plasma

concentration),

Cmax

(maximum plasma concentration), t1/2 (half-life) 등의 PK parameter 를 산출하였다.

② 정상 마우스와 항생제 처치 마우스를 이용한 연구 3차년도에는 마우스를 이용한 약물동태 시험의 한계점(각 동물에서 채혈할 수 있는 혈액의 양과 채혈 횟수)를 고려하여 장내미생물에 의한 대사가 약 물동태에 가장 중요하게 작용할 것으로 예측되는 4-5 point에 국한하여 혈 중 약물 농도의 변화를 평가하고자 하였다. 이는 2차년도의 연구에서 여러 동물로부터 채혈 시간을 달리하여 동태시험 을 수행한 결과, 시험결과의 편차의 처리 등 해석 상에 어려움이 따르는 문 제점이 발생하여 장내미생물에 의한 대사의 중요성만을 강조하기 위한 대책 으로 결정한 것이다. 이를 위해 여러 차례의 예비실험을 통하여 baicalin의 약물동태에서 중요한 시간을 결정하여 진행하였다. 최종적으로, 정상 마우스 및 항생제 처치 마우스에 baicalin을 100 mg/kg/10 ml로 단회 경구투여한 후

2, 4, 8, 16시간째에 안와 채혈로 혈

액을 채취하였다. 채혈된 혈액은 실온에서 20분간 방치한 뒤 4000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상층액을 얻고, 이를 다시 원심분리하여 serum 40 μl 를 취하여 샘플 전처리 과정을 거쳤다. Serum 전처리는 IS가 함유된 MeOH 용액을 이용하여 제단백 과정을 거쳤 다. 즉, serum 10 μl당 100 μl MeOH (1ng/ml methaqualone 함유, IS) 을 가하여 30초간 혼합한 뒤 13,200 rpm에서 10분간 원심분리한 후 상층 약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

33/ 33/91

액 80 μl를 취하여 LC-MS/MS 분석에 이용하였다.

나. 장내용물에서의 baicalin 및 대사체의 대사 특성 ① 정상 랫트와 항생제 처치 랫트를 이용한 연구 항생제 처치군과 정상군의 장내용물을 각각 추출하고 장내용물 1 g당 5 ml 가 되도록 KPi buffer을 첨가하였다. 이때 소장 내용물은 pH 8의 KPi buffer에, 맹장과 대장은 pH 7의 KPi buffer에 현탁하여 사용하였다. 장내 용물 현탁액 1 ml와 KPi buffer 2.6 ml, 500 μM 농도의 baicalin 400 μl 를 혼합하여 최종 농도가 장내용물 0.2 g, baicalin 50 μM가 되도록 제조한 후 가스팩을 이용한 gas generating system 조건에서 1시간 혐기배양 하 였다. 각 배양물은 용매 제단백과정을 거쳐 전처리한 후 baicalin 및 관련 대사체 분석을 실시하였다. 전처리는 배양물 50 μl에 IS 50 μl를 혼합한 후 MeOH 100 μl를 첨가하여 일정시간 혼합한 후 4℃, 15,000 rpm에서 20분 간 원심분리하여 상층액 120 μl를 취하고 LC-MS 분석에 이용하였다. ② 정상 마우스와 항생제 처치 마우스를 이용한 연구 항생제 처치군은 매일 1회씩, 3일간 항생제 투여한 후 6시간 휴약하여 사 용하였고, 정상군은 생리식염수를 항생체 처치군과 동일하게 경구투여한 다 음 6시간 휴약하여 장내용물을 동일하게 추출하였다. 추출된 장내용물은 1 g 당 혐기 배양액 5 ml를 넣어 현탁시킨 후 1 ml를 취하여 혐기 배양액 2.6 ml를 넣어 희석시킨다. 여기에 0.5% CMC-Na에 녹인 500 μM의 baicalin 0.4 ml을 넣어서 총 baicalin이 50 μM이 되도록 제조한 후 가스팩을 이용 한 gas generationg system 조건에서 1시간 혐기배양하였다. 최종 배양물은 시료 10 μl에 IS가 함유된 MeOH 100 μl를 가하여 제단백 처리한 뒤 원심분리하여 상층액 80 μl를 LC-MS로 분석하였다.

약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

34/ 34/91

3. 연구개발 결과 1) 2차년도 연구결과 (1) 무균동물 및 장내미생물 정착균동물 확보, 유지 및 공급 시스템 확립 가. Germ-free mouse 도입 및 증식에 따른 미생물 검사 결과 ① 배지의 적합성(무균성) 시험 - 본 시험에서 사용된 모든 배지를 각각 14일간 배양했을 때, 전혀 미생물의 증 식이 관찰되지 않아 배지의 무균성이 확인되었다. ② 배지의 성능시험 - 본 시험에 사용된 배지는 양성 대조군이 각각 3일 이내에 증식하여 성능에 이상이 전혀 없었다.

③ Germ-free mouse의 검사 및 판정 - 2010년 4월 19일 최초로 실시된 무균 시험결과, 모든 시험 개체에서 7일과 14일 배양 검체로부터 세균이 관찰되었다. -

이에 좀더 정확한 검사를 위하여 2010년 5월 4일 검사를 재실시하였다. 재검사에서 7일 배양 후 샘플에서 역시 동일한 세균 오염을 확인할 수 있었 고 순수 배양 후 동정을 실시하였다.

- 세균의 분리 동정 결과, 오염세균은 Aeromonas hydrophila로 동정되었다. 이 세균은 그람 음성 세균으로써 사람과 동물에서 잘 알려진 Aeromonas속 의 세균 종으로써 여러 가지 항생제 및 염소 그리고 낮은 온도에 저항성을 가진다. 또한 endospore를 생성하지 않으며, 면역 결핍 숙주 및 어린 숙주에 기회감염을 일으키는 것으로 알려져 있다. - 그 밖에 다른 세균의 감염은 발견되지 않았다. - 2010년 6월 16일, germ-free mouse 6마리에 대한 바이러스 및 세균 기생 충 검사를 실시하였다.

그 결과, 모든 mouse 병원체에 대하여 음성을 나타

내었다. - 2010년 7월 15일, 항생제 처치에 따른 세균오염 정도를 파악하기 위하여 세 약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

35/ 35/91

균검사를 실시하였다. -

항생제

처치

후에도

많은

isolator에서

세균

오염이

확인되었으나,

Aeromonas hydrophila 외에 다른 세균의 오염은 발견할 수 없었다. 일부 isolator의 경우에는 세균 오염이 발견되지 않아 항생제 처치에 의한 세균 억 제 및 사멸이 이루지고 있다고 판단되었다. ④ 항생제 감수성 시험 결과 및 항생제 처치 -

미생물 검사에서 발견된 세균에 대한 항생제 처치를 위하여 광범위 항생제 인 nalidixic acid, gentamycin, tetracyclin, chloramphenicol, kanamycin, streptomycin을 이용한 항생제 내성 및 감수성 시험을 실시하였다.

- 그 결과, 본 과제에서 분리 동정된 Aeromonas hydrophila는 gentamycin, tetracyclin, chloramphenicol, kanamycin에 감수성을 아래의 그림과 같이 나타내었다.

- 이들 세균을 사멸하기 위해 이중 kanamycin과 tetracyclin을 선택하여 음수에 1 mg/l씩 5일간 투여한 후 세균 검사를 실시하였다. - 그 결과, 계속적인 세균오염이 확인되어 지속적인 항생제 처치가 필요하다 고 판단되었다. 따라서 germ-free mouse 모체에 대한 항생제 투여를 지속적으로 실시하 였고 이와 관련된 세균 오염을 4주에 1회씩 실시하면서 germ-free mouse 의 공급시스템을 마련하였다.

약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

36/ 36/91

나. Gnotobiote 제작 및 증식에 따른 검사 결과 Gnotobiote 제작은 무균동물을 도입하여 증식시킨 4주령의 mouse 10쌍에 human feces 희석액을 마리당 0.2 ml씩 3일간 연속적으로 경구투여 (2010 년 5월 18일 투여시작) 하였다. 경구투여 후 1일째부터는 매일 분변을 수집하여 균의 정착유무를 확인하였 다 (2010년 6월 4일). 미생물 군집 분석 결과, human feces 투여 초기에는 모두 정착되지 않았으나 시간이 경과함에 따라 모든 마우스에서 사람의 feces 군집과 거의 동일한 장내미생물 군집이 나타났다. 최종적으로, 10쌍 모두 human feces에 포함되어 있던 미생물총이 germ free mouse의 장내 에 정착된 것으로 확인되었다 (Figure 2). Gnotobiote 증식을 위해 균의 정착이 확인된 이들 동물을 교배 (2010년 6 월 30일)하여 새끼를 분만 (2010년 7월21일)시켜 3주간의 포유기를 거친 후 분리하여 동태 실험에 사용하였다. 또한 이들 동물로부터 분변을 수집하 여 균의 정착 유무도 확인하였다. 그 결과, 미생물을 접종한 해당 세대에는 사람의 분변 현탁액과 유사한 미 생물총을 보여주었으나, 이들을 교배한 F1 세대에는 미생물총의 변화가 일 어나 사람의 장내 미생물총과는 다른 양상을 보여주었다. 즉, 정상 사람 장 내미생물총의 정착을 위해서는 다양한 시도가 필요함을 알 수 있었다.

Figure. 2. Gnotobiote production by oral feeding of human fecal suspension. 약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

37/ 37/91

(2) 무균동물 및 장내미생물 정착균동물을 활용한 약물동태 연구 가. Germ-free 및 SPF 마우스를 활용한 ginsenoside Re의 동태시험 ① Ginsenoside Re 경구투여에 따른 혈액생화학적 검사 - 혈액생화학적 검사 결과, AST 항목에서 ginsenoside Re 투여 후 8시간째 혈장에서 SPF mouse 보다 germ-free mouse에서 유의성 있는 증가 (p<0.05)를 나타내었으나, 시험물질의 영향인지는 판단하기 어려웠고, 기타 다른 항목은 채혈시간에 따른 유의적인 차이가 나타나지 않았다 (Table 5).

Table 5. Blood biochemistry results after oral administration of ginsenoside Re in germ-free and SPF mice Item hour

AST (IU/L) SPF

SPF

GF

19.3±1.3

19.7±2.2

0.3±0.0

0.3±0.0

48.8±12.6

21.2±1.1

20.3±2.3

0.3±0.0

0.3±0.0

47.3±34.8

20.3±2.5

17.8±2.5

0.2±0.2

0.2±0.2

86.4±73.2 78.9±38.3 66.9±77.8 71.4±102.7 19.6±2.5

19.9±4.7

0.3±0.0

0.2±0.1

10

123.8±50.8

12 24

200.3±32.2 *

66.8±39.7 69.8±12.6

178.5±115. 120.0±144.

8 6 174.8±138. 149.3±107. 135.8±171. 2

8

GF

CRE (mg/dl)

GF

107.3±62.6

SPF

BUN (mg/dl) SPF

8

GF

ALT (IU/L)

9

* p<0.05, GF; Germ free mouse.

② Ginsenoside Re 경구투여에 따른 조직병리학적 검사 - 대조군인 SPF mouse 및 germ-free mouse에 ginsenoside Re를 단회 경구투여한 후 간장, 신장 및 폐조직의 조직검경을 실시하였다. - 간장, 신장 및 폐조직의 조직학적 소견을 관찰한 결과, germ-free mouse 와 SPF mouse 조직간에 ginsenoside Re 투여에 의한 이상 소견은 관찰되지 않았다 (Figure 3).

약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

38/ 38/91

Figure 3. Histologic diagnosis after oral administration of ginsenoside Re in germ-free and SPF mice. A~C: liver, kidney, lung of SPF mice. D~F: liver, kidney, lung of germ-free mice.

③ Ginsenoside Re 경구투여에 따른 약물동태 변화 - Germ-free 및 SPF mouse에 ginsenoside Re를 단회 경구투여한 후 혈 중 농도변화를 분석하기 위하여 Figure 4와 같이 분석법을 마련하고 ginsenoside Re를 정량하였다. Ginsenoside Re 및 대사체 분석은 2중단위 과제의 제1세부과제기관인 한국과학기술연구원(KIST)에서 수행하였다. 그 결과, ginsenoside Re 경구투여에 따른 혈중 농도 profile은 Table 6 및 Figure 5와 같았고,

germ-free 및 SPF mouse간의 PK parameter는

Table 7과 같았다. - 시험결과, 각 ginsenoside의 분석조건은 결정할 수 있었지만 다른 대사체 들이 보이지 않았으며, ginsenoside Re의 혈중 농도에 있어서도 각 동물의 차이점을 찾을 수 없었다. 투여 1 시간째에는 outlier의 존재로 영향이 있어 보이나 통계적 유의성이 없는 것으로 판단되었다. 아마도 시험물질의 용해도 로 인하여 매우 낮은 흡수율을 보이는 점이 영향이 없었던 주요 원인이었던 것으로 판단되었다.

약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

39/ 39/91

Intensity, cps

XIC of -MRM (7 pairs): 945.6/475.4 amu from Sample 16 (200) of 0716_cal.wiff (Turbo Spray) 7960

945 → 475

Max. 7960.0 cps.

Ginsenoside Re

4.5

5000 0

Intensity, cps

7 8 9 10 Time, min XIC of -MRM (7 pairs): 799.5/637.5 amu from Sample 16 (200) of 0716_cal.wiff (Turbo Spray)

2.6e4 2.0e4

0.0

1

2

3

4

799 → 637

Intensity, cps

0.0

3

4

5

6

783 → 475

6.4

Intensity, cps

2

3

4

5

6

Ginsenoside Rh1

637 → 475

7.0

Intensity, cps

14

Max. 2.6e4 cps.

11

12

13

14 Max. 3.9e4 cps.

11

12

13

14 Max. 2.8e4 cps.

Ginsenoside F1

4.6 0.0

2.6e4 2.0e4

1

2

3

4

Ginsenoside Rh1 6.5

637 → 475

7.0

11

12

13

14 Max. 2.6e4 cps.

Ginsenoside F1

4.6 0.0

5 6 7 8 9 10 Time, min XIC of -MRM (7 pairs): 475.4/391.1 amu from Sample 16 (200) of 0716_cal.wiff (Turbo Spray) Intensity, cps

13

6.6

5 6 7 8 9 10 Time, min XIC of -MRM (7 pairs): 637.5/475.4 amu from Sample 16 (200) of 0716_cal.wiff (Turbo Spray)

4.0e4

1

2

3

4

475 → 391

9.9

0.0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Time, min XIC of -MRM (7 pairs): 779.5/649.5 amu from Sample 16 (200) of 0716_cal.wiff (Turbo Spray) Intensity, cps

12

Ginsenoside Rg2

7 8 9 10 Time, min XIC of -MRM (7 pairs): 637.5/475.4 amu from Sample 16 (200) of 0716_cal.wiff (Turbo Spray) 2.8e4 2.0e4

1

11

Ginsenoside Rg1

4.6

2

6

7 8 9 10 Time, min XIC of -MRM (7 pairs): 783.5/475.4 amu from Sample 16 (200) of 0716_cal.wiff (Turbo Spray) 3.9e4

1

5

5.0

779 → 649

11

12

13

14 Max. 4.0e4 cps.

Protopanaxatridol

11

12

13

14 Max. 1.3e4 cps.

I.S. (Digoxin)

1.00e4 5000.00 0.00

1

2

3

4

5

6

7 8 Time, min

9

10

11

12

13

14

Collected by: API4000\Administrator Electronic Signature: no

Figure 4. Chromatgrams of ginsenoside Re and its relevant metabolites (200 ng/ml).

약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

40/ 40/91

Table 6. Plasma concentration (ng/ml) after oral adminstration of ginsenoside Re to germ-free and SPF mice SPF mice Time (hr)

1

2

3

4

average

±

s.d.

0.5

12.3

56.6

9.94

9

22.0

±

20.0

1

17

-

10.6

24

17.2

±

5.47

2

8.64

10.4

15.9

11.3

11.6

±

2.68

4

8.15

4.43

6.09

4.04

5.68

±

1.62

6

13.4

5.66

4.19

3.89

6.79

±

3.88

8

4.16

3.41

-

-

3.79

±

0.375

10

-

-

-

-

-

-

12

-

-

-

-

-

-

24

-

-

-

-

-

-

Germ-free mice Time (hr)

1

2

3

4

average

±

s.d.

0.5

21.6

-

6.01

4.61

10.7

±

9.43

1

243

13.5

265

34.1

139

±

133

2

20.3

5.08

6.66

6.14

9.55

±

7.20

4

48.9

12.5

14.9

2.42

19.7

±

20.2

6

-

-

6.39

3.75

5.07

±

1.87

8

11.7

-

9.45

-

10.6

±

1.59

±

0.523

10

-

-

-

2.75

2.75

12

1.85

2.59

-

-

2.22

24

-

-

-

-

-

-

300

Concentration (ng/mL)

250

Germ Free Mice SPF mice

200

150

100

50

0 0

2

4

6

8

10

12

Time (hr)

Figure 5. Plasam concentration of ginsenoside Re after oral administration to germ-free and SPF mice.

약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

41/ 41/91

Table

7.

Pharmacokientic

germ-free

paramters

for

ginsenoside

and

Re

in

SPF

the mice

 PK parameters

SPF mice

Germ-free mice

AUC (ng·hr/mL)

69.9

202

MRT (hr)

4.94

3.31

Tmax (hr)

0.5

1.00

Cmax (ng/mL)

22.0

139

t1/2 (hr)

3.22

1.78

나. Germ-free, gnotobiote 및 SPF 마우스를 활용한 acetaminophen 대사 연구 ① Acetaminophen 경구투여에 따른 혈액생화학적 검사 - 혈액생화학적 검사결과, AST의 경우 투여 1시간째에 무균동물이 정착균동 물에 비해 유의적인 증가(P< 0.05)를 나타낸 것 이외에는 각각의 투여군에 따른 차이를 나타내지 않았다 (Table 7). ALT의 경우 투여 1시간째에 무균 동물이 정착균동물에 비해 유의적인 증가(P<0.05)를 나타내었으며, 투여 후 2시간째의 경우에는 SPF동물 투여군에 비하여 정착균동물에서 유의적인 증 가(P<0.05)를

나타내었다 (Table

8).

하지만

실험에

사용한

acetaminophen의 용량은 간독성을 충분히 나타내는 용량이 아닌 관계로 독 성 면에서 두 시험군의 차이를 그대로 해석하기에는 충분하지 않은 것으로 판단되었으며, 채혈한 혈액 시료에 대한 acetaminophen 및 그 대사체들에 대한 동태 분석은 제2중단위 12세부과제의 결과에서 설명하였다. 그리고 BUN 및 CRE의 경우에는 투여군별에 따른 유의적인 차이는 관찰되지 않았 다(Table 8). ② Acetaminophen 경구투여에 따른 조직병리학적 검사 -

간장 및 신장 조직에 대한 조직병리학적 검사를 실시한 결과, 모든 시험군 에서 이상 소견이 관찰 되지 않았고 투여시간에 따른 차이도 나타나지 않았 다 (Figure 6).

약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

42/ 42/91

Table 8. Blood biochemistry results after oral administration of acetaminophen in germ-free, gnotobiote and SPF mice. AST (IU/L)

Item Time

ALT (IU/L)

SPF

Germ-Free

Gnotobiote

SPF

Germ-Free

Gnotobiote

Normal

88.9±32.8

72.0±38.3

73.5±16.1

44.0±16.6

39.0±22.6

53.1±17.6

30min

91.0±13.2

127.0±41.4

86.8±21.2

51.8±20.1

63.5±17.5

55.5±16.9

1 hr

105.0±34.0

153.0±32.6

76.7±11.7

59.0±15.2

67.5±15.6

43.3±2.5

2 hr

94.0±40.8

142.5±55.6

94.3±3.6

40.0±6.9

83.5±33.0

68.3±6.7

4 hr

95.0±13.1

90.5±17.1

107.0±22.9

48.5±5.3

63.0±20.2

60.0±9.8

6 hr

70.0±9.4

64.0±10.4

77.5±2.6

36.5±5.7

31.3±3.1

50.5±11.2

8 hr

83.3±8.1

64.7±13.3

75.3±12.0

42.0±2.0

33.3±9.5

46.0±6.5

10 hr

98.7±39.7

64.0±5.3

64.8±14.2

52.7±9.5

35.3±10.1

49.5±16.1

12 hr

71.0±7.0

66.5±16.1

66.8±13.1

34.5±10.1

43.5±14.0

40.3±7.6

24 hr

85.3±24.2

76.0±30.8

70.8±6.1

50.0±11.3

46.7±9.5

54.5±16.9

BUN (mg/dl)

Item Time

CRE (mg/dl)

SPF

Germ-Free

Gnotobiote

SPF

Germ-Free

Gnotobiote

Normal

18.2±4.2

20.4±4.6

21.6±5.5

0.3±0.1

0.3±0.1

0.3±0.1

30min

18.2±6.5

22.9±2.8

20.2±3.2

0.4±0.1

0.3±0.1

0.4±0.1

1 hr

17.4±0.8

23.2±4.3

23.0±4.8

0.4±0.1

0.3±0.1

0.3±0.1

2 hr

20.7±2.5

21.2±2.9

23.0±4.9

0.3±0.1

0.4±0.1

0.4±0.1

4 hr

17.5±2.7

18.0±1.0

15.9±4.4

0.4±0.1

0.4±0.2

0.3±0.1

6 hr

17.0±2.9

18.5±1.5

16.6±2.8

0.3±0.1

0.4±0.1

0.3±0.1

8 hr

18.8±2.2

15.7±2.0

14.8±1.8

0.3±0.1

0.3±0.1

0.4±0.1

10 hr

24.5±3.1

17.0±2.8

16.8±1.0

0.3±0.1

0.3±0.1

0.3±0.1

12 hr

22.3±2.4

17.2±1.8

19.0±2.7

0.3±0.1

0.3±0.1

0.3±0.1

24 hr

19.4±2.2

23.4±6.3

20.8±1.7

0.4±0.1

0.2±0.1

0.3±0.1

약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

43/ 43/91

Figure 6. Histologic diagnosis after oral administration of acetaminophen in germ-free, gnotobiote and SPF mice. A,

tissues

of

normal

mouse;

B,

tissues

24 hr

after

oral

administration of acetaminophen. a, d: liver and kidney of germ-free mice; b, e: liver and kidney of gnotobiote; c, f: liver

and kidney of SPF mice.

(3) 항생체 처치동물을 이용한 대사 및 약물동태 연구 가. Antibiotic-treated rat의 제작에 따른 검사 결과 ① 조직병리학적 검사 - 항생제 처치로 인하여 정상동물과의 위장관 조직의 병리학적 소견이 생기 는 경우 약물의 흡수에 영향을 미칠 수 있기 때문에 이를 검토하기 위하여

약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

44/ 44/91

항생제 처치군과 정상군에서 위, 십이지장, 공장, 회장, 맹장, 결장, 직장 및 간과 신장을 적출하여 조직병리학적 검사를 실시하였다. - 조직병리학적 결과, Figure 7와 Table 9에 나타낸 것과 같이 간, 신장, 위, 십이지장, 공장, 회장, 맹장, 결장, 직장에 대하여 대조군인 normal rat 과 비교하였을 때 antibiotic-treated rat에서는 어떠한 형태학적인 변화도 관찰되지 않았다. 따라서, 두 종류의 동물군에서 화학물질의 동태변화를 시 험하기 적절한 항생제 처치 스케줄임을 확인할 수 있었다.

② 장내용물의 미생물수 검사 - 항생제 처치군과 정상군의 장내용물을 혐기적 조건에서 배양하여 미생물수 를 측정하였다. 그 결과, 소장, 맹장, 대장내 미생물수에 있어서 정상군과 항 생제 처치군 간에 유의적인 차이를 보였다 (Figure 8). 항생제 처치군에서 미생물이 어느 정도 검출된 것은 3일간의 항생제 투여 후 2일간 휴약처리 했기 때문인 것으로 판단되었다. - 따라서 항생제 처치군과 정상군간에 장내 미생물수가 현저히 다르기 때문 에 antibiotic-treated rat이 정상적으로 제작되었으며, 항생제 처치군과 정 상군 간의 약물 대사양식 연구에 활용가능하다고 판단되었다.

약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

45/ 45/91

Table 9. Histopathological findings in SD rats (Group summary)

Sex Organ/Findings

Male

Group

Normal rat

Antibiotic-treated rat

Number of animals

1

3

Cecum

Unremarkable findings

1

3

Colon

Unremarkable findings

1

3

Duodenum

Unremarkable findings

1

3

Ileum

Unremarkable findings

1

3

Jejunum

Unremarkable findings

1

3

Kidney

Unremarkable findings

1

3

Liver

Unremarkable findings

1

3

Rectum

Unremarkable findings

1

3

Stomach

Unremarkable findings

1

3

약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

46/ 46/91

Figure 7. Histologic diagnosis after oral administration of baicalin in normal and

antibiotic-treated

rats.

×100,

H&E

stain.

There

was

no

remarkable change. 약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

47/ 47/91

Figure 8. Microbial enumeration using anaerobic culture of intestinal contents after oral administration of antibiotics for 3 days.

나. Rat의 생체내 baicalin 및 대사체의 분석법 ① Baicalin 및 대사체의 LC-MS/MS 분석조건 - 장내미생물이 baicalin 및 이들 대사체에 미치는 영향을 살펴보기 위하여 항생제 처치군과 정상군의 생체시료로부터 baicalin 및 대사체의 분석법을 확립하고자 하였다. - 먼저, baicalin (baicalein 7-glucuronide)의 주요 대사체로 알려져 있는 baicalein (5,6,7-trihydroxyflavone)과

baicalin

표준품을

구입하여

ESI-MS에서 direct infusion을 실시하였다. 그 결과, positive 및 negative ion mode에서 모두 검출되었으나, negative mode에서 검출 감도가 높고 안정적이었다. 즉, baicalin 및 baicalein은 수소 이온이 하나 떨어져 나간 [M-H]- 상태인 m/z 445.0와 m/z 269.2가 검출되었으며, baicalin의 MS/MS pattern은 glucuronic acid moiety가 떨어져 나간 baicalein 형태 인 m/z 269.2가 검출되었다. -

정량을 위한 IS는 blank serum의 간섭효과나 negative ion mode에서의 intensity, 대사체와의 retention time (RT)이나 분리능 등을 고려하여 tolbutamide를 사용하려 했으나 일부 대사체와 mass 값 (m/z 269.2) 및 RT가 일치하여 negative mode에서 안정적으로 검출되는 TBBPA를 IS로 사용하였다. 약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

48/ 48/91

- Blank serum으로 baicalin, baicalein 및 IS의 stock을 제조하여 LC-MS 검출조건을 확립한 후, baicalin을 100 mg/kg/5 ml 경구투여한 rat serum 을 이용하여 혈액 샘플 내 baicalin 및 관련 대사체의 분석조건을 확립하였 다. - 그 결과, 경구투여 후 serum sample에서 대사체 M1를 검출할 수 있었다. 대사체 M1은 baicalein으로 확인되었으나, 몇몇 개체에서만 아주 약하게 검 출되며 대다수의 혈액 샘플에서는 검출되지 않았다. - 경구투여 후 serum sample에서는 baicalein 외에 또 다른 대사체인 m/z 621과 m/z 445의 product ion이 검출되었다. Solvent standard stock이 나 blank serum에서는 발견되지 않던 m/z 621과, baicalin과 다른 RT에서 검출되는 m/z 445 피크를 확인하기 위하여 Figure 9와 10에서와 같이 full mass 및 MS/MS를 실시하여 피크 특성을 비교 분석하였다. - 이상의 결과를 기존에 보고된 연구논문을 토대로 종합적으로 평가해 보면 (Figure 11), baicalin을 경구투여한 후 혈액 샘플에서 검출되는 RT 5.2분 의 대사체 M3는 m/z 621.00 → 445.00의 mass transition을 갖는 baicalein-6,7-diglucuronide로 추정되었다. 즉, baicalein-7-glucuronide 의 구조를 띠고 있는 baicalin에 glucuronic acid가 6번 위치에 하나 더 붙 어서 형성된 것이다. RT 7.6분의 m/z 445 → 269.20, 174.90의 mass transition을 갖는 피크 는 baicalin으로 확인되었다. 그러나 baicalin은 장간순환을 통해 baicalin → baicalein → baicalin으로 합성된다고 알려져 있기 때문에, 경구투여 후 혈 액에서 검출된 baicalin이 원래 투여된 물질이 혈중에 잔존한 것인지, 간에 서 새롭게 만들어진 것인지, 아니면 장내미생물에 의해 새롭게 대사된 것인 지는 확인할 수 없었다. Baicalin과 같은 m/z 445 → 269.20, 174.90의 MS/MS pattern을 갖던 RT 9.7분의 피크는 baicalin의 당이 7번이 아닌 다른 위치로 전이된 것으로 확인되었다. 즉, baicalin의 7번 위치에 존재하던 당이 5번이나 6번 위치에 붙은 baicalein-6-glucuronide나 baicalein-5-glucuronide로 추정되었다. 다만 기존 연구에서 baicalein-6-glucuronide에 대한 보고가 많아 RT 9.7 분의 대사체 M2는 baicalein-6-glucuronide일 것으로 예상되었다.

약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

49/ 49/91

RT 12.9분의 대사체 M1은 m/z 269.20 → 251.10의 baicalein으로 확인 되었다. -

이러한 결과를 토대로 생체내 존재하는 baicalin 및 주요 대사체의 정량법 을 결정하였다. 즉, LC-ESI-MS를 이용하여 negative mode에서 SRM으 로 분석하며, SRM 조건은

총 분석시간에 대해 4개의 segment로 분할하여

각각의 MS 조건을 사용하여 baicalin 및 대사체, IS를 동시에 정량하였다. - 본 과제에서 확립된 분석법을 통하여 baicalin 경구투여에 따른 혈중 주요 대사체를 검출해 보면, Figure 12와 같이 제안될 수 있었다.

Figure 9. Representative full mass chromatograms and MS spectra of baicalin and its metabolites in rat serum after oral administration with 100 mg/kg baicalin.

약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

50/ 50/91

Figure 10. MS/MS chromatograms and MS/MS spectra of baicalin and its metabolites in rat serum after oral administration with 100 mg/kg baicalin.

Figure 11. SRM chromatograms obtained with serum sample after oral administration of baicalin at 100 mg/kg. 약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

51/ 51/91

mw 622

mw 446

신속하게 대사

mw 270

glucuronyltransferase (liver/intestine) mw 446

mw 446

Figure 12. The proposed metabolic pathway of baicalin in rat serum after oral administration of baicalin.

② Calibration 및 validation - 상기에서 언급한 정량방법은 baicalin, baicalein 및 IS stock solution을 blank serum에 spike하여 농도별 표준희석용액을 제조한 뒤 생체 샘플과 동일한 전처리 과정을 거쳐 calibration 및 validation을 실시함으로써 분석 방법을 검증하였다. - Baicalin의 calibration을 위해 50~5000 ng/ml 농도 범위에서 7 농도를 측정 하였고, calibration curve는 y = 0.0002x - 0.0073 (r2 = 0.9993)으로 직 선성을

확인하였고,

LOD는

5 ng/ml

이었다.

Validation은

accuracy와

precision으로 표시하였으며 Table 10와 같았다.

약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

52/ 52/91

Table 10. Accuracy and precision of determination for baicalin in rat serum

Spiked concentrations (ng/ml)

Intra-day precision (n=5) Accuracy (%)*

RSD (%)

Inter-day precision (n=5) Accuracy (%)*

RSD (%)

4.64

100.80 ± 11.26 92.96 ± 2.54

1.2

99.00 ± 12.52

12.65

96.28 ± 7.07

2.6

100.18 ± 6.61

6.60

106.80 ± 5.98

6.7

50

118.91 ± 6.26

5.27

250

97.99 ± 4.55

800 2000

3.7

* mean±S.D.

다. 정상동물과 항생제 처치동물에서 baicalin 대사 특성 변화 ① 혈액내 baicalin 및 대사체의 약물동태 비교 - Baicalin 경구투여에 따른 항생제 처치군과 정상군 간의 baicalin 약물동태 및 PK parameter를 비교 분석한 결과, Figure 13과 Table 11에 나타낸 바와 같았다. - Antibiotic-treated rat은 normal rat에 비해 baicalin의 혈중 농도가 현저 히 낮았고, Cmax, AUC0→∞도 감소되었으며 반감기는 오히려 길어지는 양상 을 나타내었다. 이는 항생제 투여로 인한 장내 미생물 감소가 baicalin → baicalein → baicalin으로의 대사에 영향을 미치기에 때문에 항생제 처치군의 baicalin 혈 중 농도가 매우 낮게 나타난 것으로 판단되었다. 또한 장내 미생물의 감소가 혈중에 잔존하는 baicalin과 대사되어 생성된 baicalin이 다음 대사과정으로 전환되는 것을 지연시키기 때문에 baicalin의 혈중 농도가 빠르게 감소되지 못하고 반감기가 길어지는 것으로 추정된다.

약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

53/ 53/91

Figure 13. Mean serum concentration-time curves after oral administration of baicalin (100mg/kg) in normal and antibiotic-treated rats.

- 시간에 따른 baicalin 및 주요 대사체의 혈중 농도 변화를 peak ratio로 비 교해 보면, Figure 14과 같았다. Antibiotic-treated rat에서 baicalin 뿐 아니라 주요 대사체의 모든 혈중 농도가 전체적으로 현저히 감소됨으로써 장내 미생물이 baicalin 대사에 직접적인 영향을 끼치는 것을 확인할 수 있 었다.

Table 11. Pharmacokinetic parameters of baicalin after oral administration of baicalin (100 mg/kg) in normal and antibiotic-treated rats.

약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

54/ 54/91

Figure 14. Mean serum concentration-time curves of baicalin and its major metabolites after oral administration of baicalin (100 mg/kg) in normal and antibiotic-treated rats.

② 장내용물에서의 baicalin 및 대사체의 대사 특성 -

경구투여된 baicalin은 당이 떨어지고 비당체가 되어 흡수된 뒤 장간순환을 통해 간에서 새롭게 배당체인 baicalin을 형성하게 된다. 또한 소장관내의 장내미생물에 의해서도 대사되어 baicalin이 생성되게 된다. 따라서 경구투 여 후 baicalin의 혈중 농도나 대사 양식을 분석하였을 때 이것이 간대사의 영향인지 장내미생물의 영향인지가 명확하지 않았다.

- 이에 항생제 처치군과 정상군의 장내용물을 추출하여 장내용물 0.2 g당 baicalin을 50 μM이 되도록 한 조건에서 혐기배양한 후 baicalin의 대사 양 식을 분석하였다. - 분석 초기에는 소장관을 구분하지 않고 장내용물을 추출하여 baicalin과 in vitro 배양했을 때, 아래의 그림처럼 baicalin, M1, M2가 검출되었고 M3는 매우 적은 농도로 존재하였다. 특히 Figure 11에서 살펴본 것과 같이 혈중 에서는 거의 검출되지 않았던 대사체 M1 (baicalein)이 모든 샘플에서 검출 되었다.

약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

55/ 55/91

- 이는 혈중에서는 [baicalin → baicalein → 다른 대사체]로 빠르고 신속하 게 대사되기 때문에 중간단계의 baicalein은 검출되지 않았던 것에 반해, 장 내용물을 in vitro 배양했을 때는 간대사 영향이 배제되고 장내미생물에 의해 서서히 대사되기 때문으로 추측된다. - 이후 소장관의 부위별로 존재하는 장내미생물총의 종류나 미생물의 수가 다르기 때문에 baicalin의 대사 양식에도 차이가 있을 것으로 판단되어, 장 내용물을 소장, 맹장, 대장으로 구분하여 추출한 뒤 baicalin을 혐기적 조건 에서 in vitro 배양하였다. 장내용물의 부위별 배양액은 10, 30, 60 및 240 분 반응시간에 따라 baicalin 및 대사체 M1, M2, M3를 정량하였으며, 정량 법은 혈액 분석법을 이용하였다. - 그 결과 (Figure 15), 부위별 장내용물 배양액에 존재하는 baicalin의 농도 는 항생제 처치에 따라 큰 차이를 나타내었다. 특히 항생제 처치 유무가 baicalin 및 대사체의 대사양식에 영향을 미쳐 부위별 장내용물 및 배양시간 에 따라 대사체의 대사특성이나 검출 양에 있어 많은 차이를 보였다. 이는 항생제 남용 등으로 인하여 장내미생물총의 변화가 약물의 대사방식에 영향 을 주는 인자로 작용할 수 있다는 증거라 하겠다. - 먼저, baicalin의 농도는 소장, 맹장, 대장의 모든 배양액에서 항생제 처치 약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

56/ 56/91

군이 정상군 보다 높게 검출되었다. 소장 배양액에서는 항생제 처치군이 정 상군 보다 2배 이상 높았으며, 맹장과 대장 배양액에서는 항생제 처치군이 20배 이상 baicalin이 높게 검출되었다. 또한 정상군은 baicalin이 소장 배양 액에 월등히 많이 존재하였으나 항생제 처치군은 소장 보다 맹장이나 대장 배양액에 매우 높게 존재하였다 (Figure 15). Baicalin의 농도가 항생제 처치군에서 높았던 이유는, 정상군이 장내미생물 에 의해 baicalin이 다른 대사체로 신속하고 빠르게 대사되는 반면, 항생제 처치군은 장내미생물의 감소로 활발한 대사과정이 일어나지 못했기 때문으 로 판단된다. 또한 항생제 처치유무에 따라 baicalin의 최고 농도 부위가 각 각 소장과 맹장으로 달랐던 이유는 소장관 부위에 따라 서식하는 장내미생 물이 다르고 그로 인해 생성되는 대사체의 종류나 양도 차이가 있기 때문으 로 추정되었다.

Figure 15. Mean concentration of baicalin and its major metabolites obtained with in vitro metabolism of baicalin (50 μM) by intestinal content microflora. 약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

57/ 57/91

- Baicalin의 주요 대사체 농도는 Figure 16과 같이 항생제 처치군과 정상군 간에 차이를 보였다. 대사체 M1 (m/z 269)인 baicalein은 항생제 처치군과 맹장 배양액을 제외한 모든 정상군에서 배양시간 10분 < 30분 < 60분으로 갈수록 M1의 농도가 증가하다가 배양시간 240분이되면 감소하였다. 다만, 이러한 M1의 검출 감도가 항생제 처치군 보다 정상군에서 빠르게 감소하는 것으로 나타났다.

Figure

16.

Mean

concentration

of

metabolites

obtained

with

in

vitro

metabolism of baicalin (50 μM) by intestinal content microflora.

약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

58/ 58/91

- 대사체 M2 (m/z 445)인 baicalein-6-glucuronide도 배양시간 10분 < 30 분 < 60분으로 갈수록 M2 농도가 증가하다가 배양시간 240분째에 급속히 감소함을 보였으나 항생제 처치군에서는 이러한 경향이 매우 완만하게 일어 났다. 정상군의 경우 소장 배양액에서 M2의 생성이 크게 변화는 것으로 나 타났다. - 대사체 M3 (m/z 621)인 baicalein-6,7-diglucuronide는 항생제 처치군 에서 거의 검출되지 않거나 검출 양이 미미하였다. 반면 정상군의 경우 항생 제 처치군 보다 높은 농도로 검출되었으며, 소장 < 맹장 < 대장 배양액에 많 이 존재하고 있었다. 정상군의 맹장 및 대장 배양액에 존재하는 M3는 배양 시간이 길어질수록 빠르게 소실되는 것으로 나타났다. - 또한 1중단위 2세부과제팀에서 한국인 분변 fecalase를 이용한 baicalin 대사

활성

실험에서

baicalin → baicalein → oroxylin

A

(5,7-dihydroxy-6-methoxy-2-phenylchromen- 4-one)으로 대사된 다고 보고하여 혈중에서 검출된 주요 대사체 외에 다른 대사체가 존재하는 지는 확인하였다. 이를 위해 부위별 장내용물을 baicalin과 혐기적으로 in vitro 배양한 후 부위별 및 배양시간별로 대사체를 분석하였다. - 그 결과, 장내용물 배양액에서는 혈중에서 보이지 않던 대사체 M4, M5, M6, M7의 존재를 추가로 확인할 수 있었다. 물론 이러한 대사체의 대사 경 로는 좀더 명확하게 파악하게 위한 면밀한 추가 실험이 필요하겠으나, in vitro 결과가 in vivo와 다르기 때문에 장내미생물의 독성평가에서 in vivo 실험에 의한 검증이 더욱더 중요하다고 하겠다. 특히 장내미생물의 독성평가 기법에서 in vivo 모델의 정립이 더욱 필요한 이유라 하겠다. - 장내용물 배양액에서 검출된 대사체 M4와 M5는 baicalin -→ baicalein으 로 대사된 후

baicalein이 장내미생물의 sulfotransferase의 작용을 받아

sulfation된 후 다시 glucuronic acid가 결합된 경우이었다. 즉, baicalein의 6번이나 7번 위치의 OH기가 sulfation (-SO3H)된 M4 (m/z 349)를 거친 후 남은 6번이나 7번의 OH기에 glucuronide된 M5 (m/z 525)가 생성된 것 으로 추정된다(Figure 17~19).

약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

59/ 59/91

Figure 17. MS/MS chromatograms and spectra of metabolite M4 and M5 obtained with in vitro metabolism of baicalin (50 μM) by intestinal content microflora.

- 이들 대사체는 항생제 처치유무에 따라 대사체의 생성 양과 검출 부위가 다른 것으로 나타났다. 정상군의 경우 대사체 M4가 맹장이나 대장 배양액에 서는 거의 검출되지 않았거나 낮은 농도로 존재하였고, 소장 배양액에서 높 은 농도로 검출되었다. 반면 항생제 처치군에서는 대사체 M4가 소장 보다는 맹장이나 대장 배양액에 훨씬 많은 양이 존재하고 있었다. 항생제 처치군에 서는 9.9-10분대에서 M4의 frageent인 m/z 269가 나타났지만, 정상군에 서는 6.17-6.21분대에 또다른 m/z 269도 검출되었다. - 대사체 M5는 항생제 처치군에서 소장, 맹장, 대장 배양액에서 모두 불검출 되었고, 정상군에서는 소장에 가장 많이 존재하였고 그 외 맹장과 대장 배양 액에서도 모두 M5가 상당량 존재하였다.

약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

60/ 60/91

Figure 18. MS/MS chromatograms of metabolite M4 obtained with in vitro metabolism of baicalin (50 μM) by intestinal content microflora.

- 이상의 결과로 볼 때, Figure 18에서 검출된 6.17-6.21분대의 피크는 대 사체 M5가 검출되는 시간대로 M5의 fragment인 m/z 269가 동시에 검출 된 것이며, 항생제 처치군은 M4

M5가 되기 때문에 M4의 농도가 정상군

보다 항생제 처치군에서 계속 높았던 것이다. 또한 항생제 처치군은 소장 뿐 아니라 맹장, 대장 배양액에서도 M4 → M5로 대사되지 않았지만, 정상군은 맹장 및 대장 배양액에서도 M4 → M5로 진행되었기에 맹장이나 대장에서의 M4 검출 양이 낮은 반면, M5의 검출 양은 상대적으로 높았던 것이다. - 장내용물 배양액에서 검출된 대사체 M6과 M7은 baicalin -→ baicalein으 로

대사된

baicalein이

장내미생물의

methyltransferase에

의해

methylation된 후 다시 glucuronidation 된 경우이었다. 즉, baicalein의 6 번 위치의 OH기가 methylation된 대사체 M6 (m/z 284)을 거쳐 남은 7번 위치의 OH기가 glucuronidation된 M7 (m/z 460)이 생성된 것으로 판단되 었다 (Figure 20~22).

약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

61/ 61/91

Figure 19. MS/MS chromatograms of metabolite M5 obtained with in vitro metabolism of baicalin (50 μM) by intestinal content microflora.

Figure 20. MS/MS chromatograms and spectra of metabolite M6 and M7 obtained with in vitro metabolism of baicalin (50 μM) by intestinal content microflora.

약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

62/ 62/91

Figure 21. MS/MS chromatograms of metabolite M6 obtained with in vitro metabolism of baicalin (50 μM) by intestinal content microflora.

Figure 22. MS/MS chromatograms of metabolite M7 obtained with in vitro metabolism of baicalin (50 μM) by intestinal content microflora.

- 대사체 M6인 oroxylin A는 m/z 283 → 268의 ion transition을 가지며, 반응시간 전체에서 소장 보다 대장에서 높게 검출되었다. 특히 반응초기 10 분에는 대장 배양액에서 현저하게 높게 검출되는 경향을 보였다. 반응시간이 경과함에 따라 정상군의 M6은 빠르게 감소하면서 동시에 9.1-9.2분대의 새로운 피크 농도가 증가되지만 항생제 처치군의 M6은 점진적으로 완만하 게 감소되었고 M7로 추정되는 9.13-9.2분대의 피크가 형성되지 않았다. - 대사체 M7은 m/z 459 → 283의 ion transition을 가지며 9.1-9.2분대에 검출되었으며, 항생제 처치군 보다 정상군에서 높게 검출되었다. 대사체 M7 약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

63/ 63/91

은 정상군의 경우 소장 배양액에서만 검출되고 맹장과 대장 배양액에서는 전혀 검출되지 않았다. 또한 배양시간이 10분 < 30분 < 60분으로 검출감도가 높았다. 항생제 처치군의 경우 소장 외에도 맹장과 대장 배양액에서 반응초 기에 M7이 소량 검출되었으나 배양시간 60분째부터는 어느 부위에서도 M7 이 검출되지 않았다. - 이상과 같이 장내용물 배양액에서 검출된 대사체들을 이용하여 rat내 baicalin의 대사경로를 추정해 보면, Figure 23과 같이 제안될 수 있었다. 이러한 장내미생물을 이용한 in vitro 대사에서 항생제 처치군과 정상군 간 에 baicalin의 대사 양식에 차이가 있음을 알 수 있었고 혈중의 in vivo 대 사와도 차이가 있음을 확인할 수 있었다. - 따라서 장내미생물에 대사체 평가기술을 개발하는데 있어서는 in vitro 연 구 뿐 아니라 in vivo 연구가 반드시 필요함을 다시 한번 확인할 수 있었다.

Figure 23. The proposed metabolic pathway of baicalin obtained with in vitro metabolism of baicalin (50 μM) by intestinal content microflora. 약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

64/ 64/91

- 뿐만 아니라 기존의 in vitro 연구에서, 장내미생물이 ginsenoside Re 및 baicalin 대사에 영향을 미친다고 보고되었으나 실제로 germ-free mouse 를 활용한 in vivo 실험에서 ginsenoside Re의 체내 동태에 장내미생물이 미치는 영향은 미미하였다. 반면, 본 연구에서 antibiotic-treated rat을 활 용한 baicalin의 in vivo 및 in vitro 연구를 통해 장내미생물에 의한 baicalin의 대사양식 및 체내 동태에 큰 차이가 있음을 입증하였다. 따라서 장내미생물 정착균동물을 이용한 대사체 평가기술의 개발을 위해서 는 시험약물의 선택도 중요하다고 판단되었다. - 이에 3차년도에는 in vitro 및 in vivo 연구를 통해 장내미생물의 대사 영향 이 검증된 baicalin에 대하여 무균동물/gnotobiote 모델을 활용한 in vivo 대사체 평가기술의 다양화를 기하고자 하였다. 동시에 사업단 회의를 통해 정해진 시험약물인 acetaminophen과 geniposide에 대해서도 gnotobiote와 germ-free 동물을 활용하여 in vivo 약물동태 평가기술을 확립하고 이를 표준화함으로써 장내미생물에 의한 in vivo 대사평가 기술의 활용성이 증대 될 수 있도록 하고자 하였다. 2차년도 수행결과를 종합해 보면, 무균동물 및 장내미생물 정착균 동물의 생산 및 확보를 위하여 유지 공 급 기반을 마련하였고, 이를 통해 사람 장내미생물이 정착된 gnotobiote 생산 시스템을 확보하였다. 무균동물 및 장내미생물 정착균 동물의 확보 및 유지공급 시스템이 가능 하도록 ginenoside Re 및 acetaminophen에 대한 시스템 평가를 실시 함으로써 gnotobiote를 활용한 대사평가 연구가 가능토록 하였다. Gnotobiote를 활용한 약물대사를 평가하기 위한 전단계 연구로, 항생제 처치군을 이용하여 baicalin의 대사특성을 분석하고 장내미생물의 대사 영향을 평가하였다. 또한 정상 랫트와 항생제 처치 랫트로부터 장의 부위별 내용물을 분리하 여 in vitro에서 baicalin의 대사시험을 수행한 결과 baicalein을 비롯한 상당수의 대사체를 검출할 수 있었으며, 적절한 대사경로를 유추할 수 있었다. 이상의 연구를 바탕으로 차기년도의 연구를 성공적으로 수행하여 in vivo 장내미생물 대사체 독성평가 기술에 관한 연구기반을 조성할 수 있 을 것으로 판단되었다. 약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

65/ 65/91

2) 3차년도 연구결과 (1) 무균동물 및 장내미생물 정착균동물 확보, 유지 및 공급 시스템 확립 가. Germ-free mouse 및 gnotobiote mouse 유지 및 공급 국내 기반기술이 전혀 정립되어 있지 않은 in vivo 모델을 이용한 장내미생 물 대사체 독성평가기술을 개발하기 위하여 3세부과제에서는 무균동물 및 정착균동물의 생산시스템 확립이 필요하였다. 특히 무균동물이나 정착균동물 의 안정적 공급을 위해서는 일반 실험동물 사육과는 차원이 다른 별도의 유 지 공급 기술이 확립되어야만 하였기에 가장 중요한 부분으로 여기고 역점을 두었다. 이를 위해 한국생명공학연구원 의생명 마우스센터에서는 2차년도에 미국 Taconic 사의 무균마우스의 도입을 시도한 데에 이어 3차년도에는 일본의 실험동물 중앙연구소로부터 무균동물을 입수하였다. 미국으로부터의 수입은 미생물 오염의 문제를 지속적으로 일으켜 최종적으로는 일본을 수입선으로 변경한 것이며, 일본에서 도입된 무균동물은 무균상태를 잘 유지하고 있었 고, 성공적으로 교배를 통해 생산을 계속하고 있다. 무균동물 및 정착균동물 의 생산, 유지 및 공급시스템을 보완 확립하였고, 현재 약 90여개의 무균동 물 유지용 isolator를 보유 가동할 수 있게 되었다. 그 결과, 수컷 기준으로 당초 계획보다 많은 약 300여 마리의 무균동물을 생산하였으며, 주령수를 맞춰 3가지 시험물질(acetaminophen, geniposide 및 baicalin)에 대한 동태연구를 수행할 수 있었으며, acetaminophen과 geniposide의 경우 2중단위의 제1세부과제 연구팀에서 핼액시료의 분석을 맡아 주었고, baicalin은 본 세부과제에서 분석을 실시하였다. 뿐만 아니라 무균동물이 필요한 연구팀에 동물을 제공할 수 있었다.

① Acetaminophen 독물동태 연구 - 제2중단위의 1세부연구팀에서 acetaminophen 분석을 실시하였다. 이를 위 하여 SPF 및 무균동물, 정착균동물을 45마리씩 2차에 걸쳐 총 90마리를 사용 하였다. 약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

66/ 66/91

- 즉, 1차 연구에서 대조동물인 SPF 15마리 중 SPF 대조군 5마리, acetaminophen 투여군(200 및 300 mg/kg) 10마리를 사용하였고, 무균동물 15마리

정착균동물

15마리도

SPF와

동일하게

대조군

5마리,

acetaminophen 투여군(200 및 300 mg/kg) 10마리로 처치하여 사용하였다. - 시험의 재현성을 확보하고 부족할 수 있는 혈액 시료의 보충을 위해 동일한 시험을 1회 더 반복하여 실시하였다. 1차 시험과 동일한 처치방법으로 대조 군, acetaminophen 처치군을 SPF, 무균동물, 정착균동물을 대상으로 제작하 여 각각 15마리씩 총 45마리를 사용하였고 분석은 역시 한국과학기술연구원 에서 실시하였다. - 정착용 사람 분변 시료는 경희대 김동현교수 연구실에서 제공받았으며, 정착 의 확인을 위한 미생물 검사는 경희대 배진우교수 연구실에서 실시하였다. ② Geniposide 약물동태 연구 - 제2중단위의 1세부연구팀에서 분석을 실시하였다. Geniposide는 200 mg/kg 의 용량으로 단회 경구투여한 SPF 및 무균동물, 정착균동물을 각각 30마리 씩 2차에 걸쳐 총 60마리를 사용하였다. - 1차 연구에서 SPF 동물로 대조군 5마리, geniposide 투여군 5마리 등 총 10마리를 사용하였고, 무균동물도 대조군 5마리, geniposide 투여군 5마리 등 총 10마리를 사용하였다. 정착균 동물도 총 10마리를 사용하였으며, 대조 군 5마리, geniposide 5마리를 각각 사용하였다. - 시험의 재현성을 확보하고 부족할 수 있는 혈액 시료의 보충을 위해 동일한 시험을 1회 더 반복하여 실시하였다. 1차 시험과 동일한 처치방법으로 대조 군, geniposide 처치군을 SPF, 무균동물, 정착균동물을 대상으로 제작하여 각각 10마리씩 총 30마리를 사용하였고 분석은 한양대학교 약학대학의 유혜 현교수 연구실에서 실시하였다. - 정착용 사람 분변 시료는 경희대 김동현교수 연구실에서 제공받았으며, 정착 의 확인을 위한 미생물 검사는 경희대 배진우교수 연구실에서 실시하였다. ③ Baicalin 약물동태 연구 - 본 연구팀에서 2차년도에 확립한 baicalin 분석법 및 항생제 처치 랫드에서의 baicalin 동태연구결과를 활용하여 무균 마우스 및 정착균 마우스에서의 약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

67/ 67/91

baicalin에 대한 약물동태를 평가하고자 하였다. 이를 위해 대조동물로 활용할 SPF 마우스와 무균 마우스, 장내미생물을 장착시킨 정착균 마우스를 각각 30 마리씩 2차에 걸쳐 총 60마리를 생산하여 실험에 사용하였다. - 1차 동물 생산은 SPF 동물로 대조군 5마리, baicalin 100 mg/kg 투여군 5마 리를, 무균동물로 대조군 5마리, baicalin 투여군 5마리를, 정착균동물로 대조 군 5마리, baicalin 투여군 5마리를 생산하여 총 30마리 약물동태 분석에 활용 하였다. - 2차 동물 생산도 1차 동물 생산과 동일하게 진행하여 SPF, 무균동물, 정착균 동물을 각각 10마리씩 총 30마리 생산하여 약물동태 분석에 활용하였다. - 정착용 사람 분변 시료는 경희대 김동현교수 연구실에서 제공받았으며, 정착 의 확인을 위한 미생물 검사는 경희대 배진우교수 연구실에서 실시하였다.

나. Germ-free 및 gnotobiote mouse 제작과 장내미생물 모니터링 2차년도 연구에서 사용한 무균동물은 미국에서 수입해 오는 운송과정에 장 시간의 시간이 소요되고 이런 과정에서 오염문제가 발생되어 미생물 검사에 서 세균이 발견되었고, 이를 해결하기 위해 모체에 대한 지속적인 항생제 처 치와 항생제 감수성 시험을 실시해야만 했었다. 이에 3차년도에는 운송시간에 따른 오염 가능성과 실험동물에 대한 스트레 스 발생을 상대적으로 줄이기 위하여 한국과 거리가 가까운 일본에서 무균 동물을 입수하였고, 도입된 무균동물은 교배를 통한 생산과 증식에 활용하면 서 미생물 검사를 실시하였으며, 2차년도와 같은 미생물 검사항목에서 미생 물의 증식이 전혀 관찰되지 않았다. 즉, 무균동물 제작 및 증식을 위하여 일본 실험동물 중앙연구소에서 분양한 IQI germ-free mouse를 암컷 8마리, 수컷 4마리를 입수(2011년 4월 14 일)하여 암컷 2마리와 수컷 1마리씩 동거시켜 1차적으로 74마리를 증식시 켰다. 이후 순차적으로 교배, 증식시켜 8월 1일~5일생 수컷 78마리(암컷은 도 태), 8월 8일~13일생 수컷 78마리(암컷은 도태), 8월 21일~25일생 수컷

약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

68/ 68/91

80마리(암컷은 도태), 8월 28일~9월 3일생 수컷 50마리(암컷은 도태), 9 월 19일~9월 23일생 수컷 79마리(암컷은 도태)의 germ-free mouse를 대량 증식하여 연구에 사용하였다. 이러한 무균동물 교배에 따른 증식과정 마다 virus 12종, bacteria 11종, fungus 1종, parasite 3종에 대한 미생물 검사를 실시하였고, 모든 검사항 목에서 미생물의 증식은 없어서 2차년도와 같은 항생제 처치에 따른 항생제 감수성 시험 등은 시행하지 않았다. 한편, 정착균동물의 경우 2차년도의 결과를 보면, 장내미생물을 정착시킨 1 대에서는 사람의 장내미생물총과 유사한 미생물이 정착되었지만 2세대로 가 면서 장내미생물총의 양상이 달라지는 현상이 나타난 점을 감안하여 3차년 도 연구에서는 시험물질을 투여하기 1주 전에 일시적으로 사람 장내미생물 을 정착시킨 후 시험에 사용하는 방법을 채택하였다. 즉, 무균동물을 도입하여 증식시킨 후 해당 주령에 도달하면 human feces 희석액을 마리당 0.2 ml씩 3일간 경구투여하여 정착균동물을 제작하였고 해 당 마우스의 분변을 수집하여 균의 정착유무를 확인하였다. 그 결과, Figure 1과 같이 장내미생물을 정착시키는데 필요한 시간이 다소 부족하여 미생물 정착이 완벽하게 일어나지는 못하였다. 2차년도에는 1세대 정착균동물의 경우 정착을 확인할 수 있었으나 이번 3차년도의 방법으로는 다소간 미생물 정착에 문제가 있는 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 무균동물을 증식시키고 사람 장내미생물을 정착시키는 일련 의 정착 연구를 위해 보다 많은 연구수행이 이루어져야 하지만, 10개월이란 짧은 연구기간동안 무균동물을 생산, 증식시키고 이를 연구에 활용하기 위해 대량 생산 시키면서 동시에 정착균동물을 대량 생산하는데 현실적인 어려움 이 있었다고 판단된다. 따라서 장내미생물 대사 연구를 위하여 정착균 동물모델을 활용하려면 반드 시 추가적이고 심도깊은 정착 연구가 수행되어야 할 것이다.

약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

69/ 69/91

Figure 1. Gnotobiote production by oral feeding of human fecal suspension.

(2) 무균동물 및 장내미생물 정착균동물을 활용한 약물동태 연구 가. In vivo acetaminophen 독물동태 연구 ① Acetaminophen 경구투여에 따른 혈액생화학적 검사 - 1, 2차에 걸친 acetaminophen 대상의 혈액생화학적 검사 결과 (Table 1과 2), SPF, germ-free mouse 및 gnotobiote mouse의 모든 개체에서 대조군 보다 acetaminophen 투여군에서 AST 및 AST가 증가하였다. - 특히 추가적인 연구가 필요한 것으로 보이긴 하나 acetaminophen 300 mg/kg 투여군에서 대조동물인 SPF 마우스 보다 무균동물에서 AST 및 ALT 활성이 모두 현저히 증가하는 것으로 나타났다. - 즉, acetaminophen을 일정량 이상 고용량 투여하면, 정상동물에 비해 무균 상태일 때 시험물질의 영향을 받아 간독성 유발이 될 가능성이 높은 것으로 추 정된다. 그러나 무균동물에 장내미생물을 정착시킨 개체의 경우 정착균의 수나 종류가 부족하고 완전한 정착이 이루지지 않은 점을 감안할 때 시험물질의 영 향인지를 판단하기는 어려웠다. 다만, 1차 공급 동물보다

2차 공급 동물에서

시험물질에 대한 장내미생물의 영향을 보다 명확하게 볼 수 있었다. 즉, 장내 약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

70/ 70/91

미생물의 정착에 의해 무균동물에서의 acetaminophen에 의한 독성이 다시 SPF 대조동물과 유사한 정도로 경감되었다. 추후 acetaminophen 대사에 미치 는 장내미생물의 영향을 좀더 심도있게 연구할 필요성이 크다는 사실을 확인한 연구로 평가되었다. Table 1. Blood biochemistry results after oral administration of acetaminophen in germ-free, gnotobiote and SPF mice (1차 동물공급 실험 결과) Item

ALT (IU/L)

39.6±2.5

31.2±2.7

16.6±2.6

0.3±0.0

200 mg/kg

99.6±95.6

315.6±525.5

14.2±0.5

0.2±0.2

300 mg/kg

70.2±40.8

151.8±188.9

15.2±1.6

0.3±0.0

Control

52.8±14.3

36.6±5.8

11.9±1.2

0.2±0.2

200 mg/kg

139.2±50.8

117.6±94.7

15.8±2.2

0.2±0.1

300 mg/kg

1837.2±208 9.9

1827±1202. 6

12.7±1.7

0.2±0.2

39±3.7

28.2±2.7

11.5±1.6

0.3±0.0

200 mg/kg

57±17.4

71.4±60.6

13.4±0.9

0.3±0.0

300 mg/kg

4999.2±644 3.6

6194.4±820 6.9

32.0±47. 0

0.4±0.5

Control SPF mouse

Germ-fre e mouse

Gnotobiot e mouse

BUN (mg/dl)

AST (IU/L)

Group

Control

CRE (mg/dl)

Table 2. Blood biochemistry results after oral administration of acetaminophen in germ-free, gnotobiote and SPF mice (2차 동물공급 실험 결과) Item

SPF mouse

Germ-fre e mouse

Gnotobiot e mouse

BUN (mg/dl)

AST (IU/L)

ALT (IU/L)

Control

33.6±2.5

27±2.1

16.1±1.3

0.3±0.0

200 mg/kg

48.6±9.3

36.6±11.1

15.6±1.9

0.3±0.0

300 mg/kg

202.8±199.7

861±1062.7

15.0±1.7

0.3±0.0

38.4±7.2

26.4±4.4

14.0±1.3

0.2±0.1

200 mg/kg

104.4±22.5

140.4±67.4

14.9±2.3

0.3±0.0

300 mg/kg

5539.5±447 9.3

7737±7427. 0

45.1±64. 4

0.7±0.8

Control

33±3.0

27.6±22.9

14.0±1.3

0.3±0.0

200 mg/kg

57±5.6

94.8±39.7

16.3±0.6

0.3±0.0

300 mg/kg

2025±2852. 6

2183.25±23 96.5

14.6±0.9

0.3±0.0

Group

Control

CRE (mg/dl)

약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

71/ 71/91

② Acetaminophen 경구투여에 따른 조직병리학적 검사 - 조직병리학적 검사결과는 11월초 삽입 예정 (Figure 2) (11월 초 삽입 예정) Figure 2. Histologic diagnosis after oral administration of acetaminophen in germ-free, gnotobiote and SPF mice. A~C: liver, kidney, lung of SPF mice. D~F: liver, kidney, lung of germ-free mice.

③ Acetaminophen 경구투여에 따른 독물동태 변화 - SPF, 무균동물, 정착균동물에 acetaminophen을 경구 투여한 뒤

채혈한 시

료를 대상으로 독물동태의 변화를 살펴본 결과는 제2중단위의 제1세부과제의 결과보고서에 제시하였기에 여기에서는 생략하였다.

나. In vivo geniposide 약물동태 연구 ① Geniposide 경구투여에 따른 혈액생화학적 검사 - 1, 2차에 걸친 geniposide의 약물동태 평가에서 얻은 시료를 대상으로 혈액 생화학적 검사를 실시하였고 그 결과를 Table 3과 4에 나타내었다. 대조군에 비해 geniposide 투여군에서 AST 및 ALT가 유의적인 차이를 보였다. 즉, 대 조군과 달리 geniposide를 투여하면 간독성 지표인 AST 및 ALT를 증가시켰 는데, 이는 geniposide가 genipin으로 대사되면 세포독성 및 유전독성 등이 증 가한다는 1-1세부과제의 결과와는 상치되는 것으로 어떤 결론에 도달하기는 어려웠다. 당초 예비실험에서 geniposide는 간독성을 유발하지 않는 용량으로 파악되었으나, 본시험에서는 간독성이 유발되었고, 무균동물에서의 결과와는 차이를 보이는 것도 인정되었다. 이는 최종 채혈시간이 투여 후 12시간째로 일반적인 24시간째 실험에서 관찰할 수 없었던 독성이 일시적으로 나타난 것 으로 판단되었다. - 특히 2차 동물실험 결과에서 보듯이, 정상동물인 SPF 마우스 보다 장내미생 물이 없는 무균 마우스에서 geniposide의 독성이 극명하게 증가되었다. 반면 약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

72/ 72/91

정착이 완전하게 이루어지지는 않았지만 정착균동물은 SPF와 유사한 값을 나 타내었다. 물론 개체 간의 차이가 매우 커서 현 상태에서 결론을 도출하기는 어려웠지만 이는 geniposide → genipin 대사에 관여하는 장내미생물의 영향 을 in vivo에서 자세히 연구할 필요가 있음을 뒷받침해 주는 결과인 점은 분명 해 보였다. Table 3. Blood biochemistry results after oral administration of geniposide in germ-free, gnotobiote and SPF mice (1차 동물공급 실험 결과) Item Group Control

SPF mouse

100 mg/kg

Germ-fre e mouse Gnotobiot e mouse

Control 100 mg/kg Control 100 mg/kg

BUN (mg/dl)

AST (IU/L)

ALT (IU/L)

CRE (mg/dl)

41.4±12.2

27±3.9

21.1±3.9

0.3±0.0

106.2±42.5*

59.6±28.2*

18.8±1.2

0.3±0.1

46.2±5.1

26.6±0.9

21.7±1.9

0.2±0.1

132±57.3*

146±218.1

16.0±2.5

0.3±0.1

38.4±1.5

23±2.1

20.9±2.0

0.2±0.1

173.6±138.9

167.4±111.2 *

20.2±2.8

0.3±0.0

Table 4. Blood biochemistry results after oral administration of geniposide in germ-free, gnotobiote and SPF mice (2차 동물공급 실험 결과) Item Group SPF mouse Germ-fre e mouse Gnotobiot e mouse

Control 100 mg/kg Control 100 mg/kg Control 100 mg/kg

BUN (mg/dl)

AST (IU/L)

ALT (IU/L)

CRE (mg/dl)

55.6±12.5

44.8±11.2

21.4±2.5

0.3±0.0

103.6±34.2*

67.8±18.3*

18.7±3.7

0.3±0.0

47.2±4.0

27.4±5.3

19.2±1.5

0.3±0.0

391.8±608.6

505.6±948.6

16.9±2.7

0.3±0.0

41.8±3.6

26±2.5

21.0±2.1

0.2±0.0

114±26.8**

206.6±147.6 *

18.2±4.2

0.2±0.1

② Geniposide 경구투여에 따른 조직병리학적 검사 - 조직병리학적 검사결과는 11월초 삽입 예정 (Figure 3)

약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

73/ 73/91

(11월 초 삽입 예정) Figure 3. Histologic diagnosis after oral administration of geniposide in germ-free, gnotobiote and SPF mice.

③ Geniposide 경구투여에 따른 독물동태 변화 - SPF, 무균동물, 정착균동물에 acetaminophen을 경구 투여한 뒤

채혈한 시

료를 대상으로 독물동태의 변화를 살펴본 결과는 제2중단위의 제1세부과제의 결과보고서에 제시하였기에 여기에서는 생략하였다.

다. In vivo baicalin 약물동태 연구 ① Baicalin 경구투여에 따른 혈액생화학적 검사 - Baicalin 100 mg/kg을 경구투여하였을 때 SPF, 무균동물 및 정착균동물의 모든 군에서 대조군 보다 AST 및 ALT가 현저히 증가하였다 (Table 5와 6). 특히 1차 동물공급 실험에서는 군별로 baicalin 투여에 따른 유의적인 차 이를 나타내었고, SPF < 정착균동물 < 무균동물 순으로 AST

및 ALT가 증

가하는 경향이었다. 당초 24시간 투여 일정의 예비실험에서는 독성을 유발하 지 않는 것으로 나타났기에 매우 의외의 결과이었다. 이는 최종 채혈시간이 투여 후 12시간째로 일반적인 24시간째 실험에서 관찰할 수 없었던 독성이 일 시적으로 나타난 것으로 판단되었다. - 이러한 결과는 baicalin이 baicalein으로 대사되면 독성이 감소된다는 1-1 세부과제 결과와 연관지어 볼 때, SPF나 정착균동물은 장내미생물에 의해 baicalin이 대사되어 대사체로 전환되는 반면, 무균동물은 baicalin의 대사가 일어나지 않기 때문에 무균동물의 간독성이 더 크게 나타났던 것으로 추측할 수 있다. 그러나 1, 2차 동물공급 실험 모두에서 유의적인 결과가 도출된 것 이 아니라 시험군간의 차이를 그대로 해석하기에는 충분하지 않은 것으로 판 단되며, 추후 baicalin의 독성작용에 대하여 추가적인 연구가 필요한 것으로 보인다. 특히 장내미생물에 의한 대사와 관련지어 연구를 계속 수행할 필요가 있다고 판단된다. 약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

74/ 74/91

Table 5. Blood biochemistry results after oral administration of baicalin in germ-free, gnotobiote and SPF mice (1차 동물공급 실험 결과) Item Group Control

SPF mouse

100 mg/kg

Germ-fre e mouse Gnotobiot e mouse

Control 100 mg/kg Control 100 mg/kg

BUN (mg/dl)

AST (IU/L)

ALT (IU/L)

CRE (mg/dl)

43.6±3.9

35.4±2.4

24.3±2.0

0.3±0.0

132.6±31.0* *

62.4±13.3**

21.4±4.7

0.3±0.1

47.2±5.0

31±4.1

22.3±3.6

0.3±0.1

268.2±120.3 **

208.8±111.5 *

18.0±2.3

0.3±0.1

45.4±12.3

24±4.4

26.7±1.5

0.3±0.1

140.6±41.8* *

116.6±63.3*

19.9±1.7

0.3±0.0

Table 6. Blood biochemistry results after oral administration of baicalin in germ-free, gnotobiote and SPF mice (2차 동물공급 실험 결과) Item Group Control

SPF mouse

100 mg/kg

Germ-fre e mouse Gnotobiot e mouse

Control 100 mg/kg Control 100 mg/kg

BUN (mg/dl)

AST (IU/L)

ALT (IU/L)

CRE (mg/dl)

67±28.7

46.8±8.3

29.3±11. 4

0.3±0.1

364.8±513.3

152.2±170.1

23.3±5.7

0.3±0.0

60±16.9

30.6±3.0

24.5±2.5

0.3±0.0

225±112.9*

190.6±153.8 *

20.0±3.0

0.3±0.0

74.6±74.0

77.4±123.3

24.0±0.9

0.3±0.0

124.2±26.1

149.8±106.9

21.5±2.2

0.3±0.1

② Baicalin 경구투여에 따른 조직병리학적 검사 - 조직병리학적 검사결과는 11월초 삽입 예정 (11월 초 삽입 예정) Figure 4. Histologic diagnosis after oral administration of baicalin in germ-free, gnotobiote and SPF mice.

약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

75/ 75/91

③ Baicalin 경구투여에 따른 약물동태 변화 - 무균동물, 정착균동물 및 SPF 마우스에 baicalin 100 mg/kg을 단회 경구 투여한 후 혈중 농도 변화를 분석한 결과는 Figure 5와 6에 도시한 바와 같 았다. - Baicalin은 SPF 대조동물, 무균동물 및 gnotobiote 모두에서 경구투여 후 4 시간째에 최고 혈중농도를 나타내었고, 정상동물인 SPF 마우스에서 baicalin 농도가 전시간에 걸쳐 가장 높았다. 또한 SPF 마우스의 경우에는 최고 혈중 농도인 4시간째 이후에는 빠르게 혈중에서 소실되는 것으로 나타났다. 반면 에 무균동물과 정착균동물의 경우 SPF 동물에 비해 혈중 농도가 전체적으로 매우 낮게 검출되었고 최고 혈중농도인 4시간 이후에도 완만하게 감소하는 경향을 보였다. - Baicalin 대사체로는 baicalein이 일부 개체에서 미량 검출되었으나 정량한 계 부근이었고, 2차년도에 실시한 항생제 처치 랫트를 이용한 대사 연구에서 발견되었던 baicalein-6,7-diglucuronide는 검출한계 이하이어서 정량할 수 없었다. 그러나 baicalin 투여 후 랫트 혈중에서 주요 대사체로 검출되던 baicalein-6-glucuronide는 모든 개체에서 다량 검출되었다. - 즉, 정상동물인 SPF 마우스에서는 장내미생물에 의해 baicalin이 원활한 대 사과정을

거쳐

baicalein-6-glucuronide을

생성하거나

baicalin →

baicalein → baicalin으로 대사되어 혈중에서 다량의 baicalin이 잔존하게 된 것으로 보인다. 그러나 무균 마우스의 경우에는 장내미생물에 의한 baicalin 의 대사가 차단되고 간에서의 대사만 이루어지기 때문에 baicalin 및 대사체 의 농도가 매우 낮게 검출된 것으로 판단할 수 있다. - 또한, 정착이 완전하게 이루지지 않아 확연한 차이는 볼 수 없었지만 정착균 동물의 경우에도 무균동물 보다는 대사가 좀더 원활하게 진행되어 baicalin 및 대사체 baicalein-6-glucuronide의 혈중 농도가 다소 높은 것을 확인할 수 있었다. - 따라서 germ-free, gnotobiote, SPF mouse를 이용하여 장내미생물이 baicalin 대사에 직접적인 영향을 끼친다는 것을 확인할 수 있는 결과를 얻었 다.

약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

76/ 76/91

Figure 5. Mean serum concentration-time curves after oral administration of baicalin (100 mg/kg) in germ-free, gnotobiote and SPF mice.

Metabolite (Baicalein-6-glucuronide)

Baicalin (Baicalein-7-glucuronide)

Figure 6. Mean serum concentration-time curves of baicalin and its major metabolites

after

oral

administration

of

baicalin (100

mg/kg)

in

germ-free, gnotobiote and SPF mice.

약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

77/ 77/91

(3) 항생제 처치동물을 이용한 대사 및 약물동태 연구 가. Antibiotic-treated mouse의 제작에 따른 검사 결과 ① 조직병리학적 검사 - 항생제 처치 모델은 무균동물을 대용할 수 in vivo 모델이다. 하지만 무균동 물과는 달리 장내미생물의 수를 감소시키기 위하여 인위적으로 항생제를 처 치하게 되는 관계로 처치된 항생제가 동물의 상태에 영향을 줄 수 있으며, 약 물동태 평가를 하는 경우에는 항생제와의 상호작용의 가능성이 있을 수 있다. - 따라서 in vivo 모델로서 항생제 처치모델의 유용성을 제고하기 위해서는 항생제 처치가 위장관계에 여양을 주지 않으며, 약물동태에 영향을 줄 수 있 는 요인이 배제되었는지를 평가해야만 한다. - 이러한 이유로 항생제 처치로 인하여 위장관 조직에 병리학적 소견이 유발 되는지 확인하기 위하여 항생제 처치군과 정상군에서 간, 신장 및 위장관을 적출하여 조직병리학적 검사를 실시하였다. - 그 결과, (Figure 7와 Table 7은 11월 5일 데이터 삽입예정)

약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

78/ 78/91

Table 7. Histopathological findings in male ICR mice (Group summary) (11월 5일 삽입 예정)

약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

79/ 79/91

(11월 5일 삽입 예정) Figure 7. Histologic diagnosis after oral administration of baicalin in normal and antibiotic-treated mice.

×100, H&E stain. There

was no remarkable change.

② 장내용물의 미생물 수 검사 - 항생제 처치군과 정상군의 장내용물을 혐기배양하여 미생물 수를 측정하여 Figure

8에

나타내었다.

결과,

대조군인

normal

mouse와

antibiotic-treated mouse의 장내용물을 혐기배양 했을 때 두 군간에는 유 의적인 차이가 있었다. - 즉, 항생제 처치군과 정상군 간에 장내미생물 수가 현저히 다르기 때문에 antibiotic-treaed mouse는 정상적으로 제작되었으며, 항생제 처치군과 정 상군 간의 약물 대사양식 연구에 활용가능하다고 판단되었다. - 한편, 항생제 처치군에서도 미생물이 어느 정도 검출되는 양상을 보였는데 이는 항생제 투여 후 휴약시간 때문인 것으로 판단된다. 특히 여러 차례의 예 비실험을 통해 2차년도의 랫트 실험에서와 같이 48시간 휴약했을 때에는 항 생제 종류나 투여량, 증식배지의 종류에 상관없이 정상군 정도로 미생물이 빠 르게 재증식하였다. 특히 랫트와 다르게 마우스의 경우에는 휴약 시간을 12, 24시간으로 했을 때에도 장내미생물의 재증식이 급격히 이루어지는 것을 알 수 있었다(결과는 보이지 않았음). 이에 휴약시간과 미생물 수 검사를 반복적으로 실시하여 항 생제 처치 마우스를 활용한 대사 연구에는 3일간 항생제 처치 후 6시간 휴약 하는 것으로 확정하였다.

약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

80/ 80/91

Figure 8. Effects of antibiotic treatment on the number of intestinal bacteria in male ICR mice. Microbial enumeration using anaerobic culture of intestinal contents were performed after oral administration of antibiotics for 3 days.

나. Mouse의 생체내 baicalin 및 대사체의 분석법의 확립 ① Baicalin 및 대사체의 LC-MS/MS 분석조건 - 장내미생물이 baicalin의 대사에 미치는 영향을 측정하기 위하여 항생제 처 치군과 정상군의 생체시료로부터 baicalin 및 대사체 분석법을 확립하고자 triple-quadrupole mass spectrometry을 사용하였다. - Baicalin 및 baicalein 표준품을 구입하여 direct infusion을 실시한 결과, API 4000에서는 positive mode에서 안정적으로 검출되었고, baicalin 및 baicalein 모두 수소 이온이 하나 붙은 [M+H]+ 상태인 m/z 447.1과 m/z 271.1이 검출되었다. 정량을 위해 사용된 IS인 methaqualone도 positive mode에서 m/z 251.1로 안정적으로 검출되었다. - Baicalin 및 대사체 분석을 위하여 baiclain은 m/z 447.1 → 271.1, IS는 251.1→132.1으로

MRM

조건으로

분석하였으며,

Blank

serum으로

baicalin, baicalein, IS의 stock을 제조하여 LC-MS 검출조건을 확립한 후 baicalin 100 mg/kg을 경구투여한 마우스로부터 분리한 serum을 이용하여 혈액 샘플내 baicalin 및 관련 대사체의 분석조건을 확립할 수 있었다 (Figure 9). 약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

81/ 81/91

-

결과,

경구투여

baicalein-6-glucuronide만

후 다량

serum

sample에서는

검출되었으며,

대사체 baicalein,

baicalein-6,7-diglucuronide 등은 검출한계 이하였다. 이를 2차년도에 랫트에서 실험한 결과와 비교해 보면, 검출되는 대사체의 종 류나 양이 매우 낮았다. 이는 랫트와 마우스라는 종의 차이나 분석기기의 차 이도 있겠지만 마우스의 특성상 1개체에서 채혈할 수 있는 혈액 양이 적은 것도 한 원인으로 판단되었다. ② Calibration - 정량을 위하여 baicalin을 blank serum에 spike하여 농도별 표준희석용액 을 제조한 뒤 생체 샘플과 동일한 전처리 과정을 거쳐 calibration을 실시하 였다. - Baicalin의 calibration을 위하여 5, 10, 50, 100, 500, 100, 5000 ng/ml 의 7 농도 범위에서 측정하였고, 이때 calibration curve는 y = 0.00354x 0.00064 (r2=0.9992)으로 직선성을 확인하였으며, LOQ는 5 ng/ml 이었다.

약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

82/ 82/91

Figure 9. MRM chromatograms obtained with serum sample after administration of baicalin at 100 mg/kg.

약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

83/ 83/91

다. 정상동물과 항생제 처치동물에서 baicalin 대사 특성 변화 ① 혈액내 baicalin 및 대사체의 약물동태 비교 - 항생제 처치 마우스와 정상 마우스 간의 baicalin 약물동태를 분석한 결과, Figure 10 및 11과 같았다. Antibiotic-treated mouse는 normal mouse에 비해 baicalin의 혈중 농도가 현저히 낮았다. 대사체 역시 정상군에 비해 항 생제 처치군에서 매우 낮은 혈중 농도를 보였다.

Figure 10. Mean serum concentration-time curves after oral administration of baicalin (100 mg/kg) in normal and antibiotic-treated mice.

약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

84/ 84/91

Metabolite (Baicalein-6-glucuronide)

Baicalin (Baicalein-7-glucuronide)

Figure 11. Mean serum concentration-time curves of baicalin and its major metabolites after oral administration of baicalin (100 mg/kg) in normal and antibiotic-treated mice.

- 시간에 따른 baicalin 및 대사체의 혈중 농도곡선이 항생제 처치에 따라 확 연한 차이를 보인 것으로부터 mouse의 장내미생물도 baicalin의 대사에 직접 적인

영향을

끼친다는

것을

확인할

있었다.

다만,

앞서

보고한

germ-free, gnotobiote 및 SPF mouse와 비교했을 때 혈중 최고농도가 2 시간과 4시간으로 다소 차이가 있었으나 이는 같은 mouse라도 계통이 다르 기 때문으로 추정된다. - 특히 2차년도에는 랫트를 이용한 항생제 처치동물 모델에서 baicalin 대사에 장내미생물이 관여하는 것을 입증할 수 있었고, 3차년도에는 마우스를 이용 한 항생제 처치동물 모델을 성공적으로 개발하여 장내미생물의 대사 영향을 입증할 수 있었기에 향후 무균동물을 대체 또는 보완할 수 있는 in vivo 모 델로 활용할 수 있을 것으로 판단되며, 본 연구진의 기술이 일정 수준에 이른 것으로 자체 판단된다. - 따라서 본 연구진의 항생제 처치동물 모델 기술을 이용하여 식품이나 한약 재 성분 등의 체내 동태에 미치는 장내미생물의 영향을 파악하고, 장내미생물 에 의한 화학물질의 대사 특성 및 종간 차이나 체내 거동학적 영향 등을 규 약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

85/ 85/91

명하는데도 활용할 수 있을 것으로 생각된다. 뿐만 아니라 항생제 처치모델을 이용하여 다양한 약물 등에 대한 in vivo 독성 및 약효평가에도 충분히 활용 할 수 있을 것으로 사료된다.

② 장내용물에서의 baicalin 및 대사체의 대사 특성 (데이터 11월 9일경 삽입)

(데이터 11월 9일경 삽입) Figure

12.

Mean

concentration

of

metabolites

obtained

with

in

vitro

metabolism of baicalin by intestinal content microflora.

약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

86/ 86/91

3차년도에 수행한 연구의 결과를 종합해 보면, 3세부과제는 국내 기반기술이 전혀 정립되어 있지 못한 in vivo 장내미 생물 이용 독성평가 기술을 개발하는 것이 최종 목표로 무균동물, 정착균 동물 및 항생제 처치 동물 등 다양한 in vivo 평가모델을 확립하고자 하 였다. 랫트 및 마우스에 대한 항생제 처치동물 모델을 이용하여 baicalin에 대 한 장내미생물의 대사 영향을 명확하게 밝힐 수 있었다. 또한 항생제 처치 동물 모델을 통한 대사특성 연구의 기술력을 확보하여 표준화 할 수 있게 되었다. 무균동물은 특히 일반 실험동물 사육과는 차원이 달라 그 동안 무균동물 유지기술의 상용화에 상당 시일이 소요되었으나, 다양한 시행착오 자체가 기반 구축에 많은 도움이 된 것으로 판단된다. 특히 정착균동물의 생산과 증식에는 오랜 기술적 노하우가 필요함으로 보다 다양하고 심도 깊은 정 착연구가 좀 더 필요하다고 판단된다. 또한 당초 계획인 1개의 시험물질 보다 많은 3종의 시험물질을 대상으로 연구 수행을 하였고, 모델동물에 대한 acetaminophen, geniposide, baicalin 시험물질의 동태분석도 한국과학기술연구원, 한양대학교 및 영남 대학교 약학대학 연구진이 협동체제로 연구수행함으로써 학연간 협력연구 도 원활하게 이룰 수 있었다. 뿐만 아니라 국내 유일한 무균동물 생산시설을 확보하고 있는 한국생명 공학연구원에서는 당초 계획보다 많은 무균동물과 사람 장내미생물총이 도입된 gnotobiote 모델동물을 생산 및 유지하게 되었고, 동시에 이들 모 델동물의 공급을 통하여 시험물질의 약물동태 분석연구가 지속적으로 가 능하도록 뒷받침 할 수 있었다.

약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

87/ 87/91

5. 연구결과 고찰 및 결론

무균동물의 확보와 각종 시험에 활용이 가능할 정도로 안정적인 유지 및 공 급시스템을 갖추는 것이 본 세부과제에서 가장 역점을 두고 수행한 연구임. 지난 2년간의 연구를 통하여 무균동물의 유지 및 관리 기법은 어느 정도 확 립된 것으로 판단되었다. 즉, 무균상태의 유지를 평가하기 위한 각종 장내미 생물 배양 및 미생물 검출기법을 확립하였으며, 약물투여 기술 및 약물동태 평가 기술도 확립되었다. 3차년도에 암수 총 600여마리의 무균동물을 생산 할 수 있었고, 보통 동물실험에 수컷동물을 활용하기 때문에 수컷 기준으로 약 300마리의 동물을 생산하였고, 대부분은 독성평가 및 약물동태 시험에 활용할 수 있었다. 앞으로도 무균동물을 필요로 하는 연구에 안정적으로 공 급할 수 있을 것으로 판단되었다. 확립된 무균동물 유지 및 생산시설 그리고 관련 기술을 국가 R&D 연구 및 안전성 평가에 적극 활용하기 위해서는 본 사업의 결과로 도출한 각종 관련 기술을 안전성 평가 시험에 적용하여야 할 것으로 판단되며 1회성으로 연구 가 종료되지 않도록 지속적인 시설유지 및 연구수행을 위한 연구가 필요하 다. 막 갖추어진 know-how를 유지 발전시키기 위해서는 다양한 목적의 응 용연구가 뒤따라야할 것으로 보이며, 후속 연구가 진행되지 못한다면 애써 다진 기반을 잃게 되는 결과를 초래하여 그 동안의 노력이 무산될 것으로 판단된다. 무균동물 시험을 맡은 생명공학연구원 의생명 마우스 센터에는 약 90여개의 무균동물 유지용 isolator를 보유하고 있으며, 본 사업을 위하여 무균동물을 당초 계획보다 많은 약 300여마리를 생산하였다. 현재의 시설상황으로 볼 때, 4-5배 정도 규모로 생산을 늘릴 수도 있다고 판단된다. 뿐만 아니라 무균동물, 정착균동물, 항생제 처치동물에 대한 독성동태 평가와 더불어 혈액생화학 지표 및 조직병리 검사 기술도 이미 보유하고 있어 장내 미생물에 의한 대사 특성 연구에 다방면으로 활용가능성이 높다. 다만, 정착균동물의 안정적 공급을 위해서는 반드시 추가적인 정착 연구가 수행되어야 본 연구결과가 1회성으로 그치지 않고 다양한 국가 연구에 활용 될 수 있을 것으로 생각된다. 정착조건에 따른 미생물총의 변화 뿐만 아니라 약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

88/ 88/91

특정 장내세균 특히 대사능이 왕성한 장내세균을 접종하여 정착균동물을 다 양하게 확보하는 작업도 필요한 것으로 판단되며, 정착동물 및 무균동물의 직접

제작을

정상동물

국내외에서

개발하고

있는

transgenic

knock-out 동물에서 시도하는 연구도 필요할 것으로 판단된다. 2차년도의 연구는 무균동물의 유지에 어려움을 겪어 3차년도 연구에는 다소 무리가 있었지만 acetaminophen, geniposide 및 baicalin과 같이 3종의 시 료에 대하여 무균동물에서의 동태시험을 수행하여 무균동물 활용도를 제고 하고자 하였다. 이 연구가 가능했던 것은 본 사업단을 구성하고 있는 각 세 부과제 참여 연구진들 간의 유기적인 협동연구가 무엇보다도 중요했다고 판 단되었다. 즉, 각종 시험물질과 사람 분변 현탁액을 제공받고, 정착균의 미생 물총 정착상태의 파악을 위한 지원을 비롯하여 각 시험물질의 분석을 개별 적으로 확립하여 분석 부분이 원활하게 가동된 점 등이 그 것이다. 사업단 연구를 구성할 때의 장점을 극대화한 결과로 판단되었다. 본 세부과제 연구를 통하여 장내미생물에 의한 화학물질의 대사가 화학물질 의 체내 동태를 결정하는 매우 중요한 요인임을 밝힐 수 있었다는 것이 본 연구의 가장 핵심이 되는 연구성과로 볼 수 있다. 특히 무균동물과 항생제 처치 동물 등 다양한 in vivo 장내미생물 대사 평가 시험계를 개발하여 적 용함으로써 장내미생물 대사의 중요성을 입증할 수 있었던 것이다. 특히, baicalin의 경우 본 연구진에서 무균동물, 정착동물, 항생제 처치 마우스 및 랫드 등 다방면으로 동태학적 영향을 살펴보았으며, 장내미생물에 의한 대사 과정이 체내 동태에 필수적임을 밝힐 수 있었다. 향후 동태학적 변화 뿐만 아니라 본 연구를 통해 개발된 in vivo 동물시험계를 활용하여 특정 약리활 성에 미치는 영향 및 분자 수준에서의 접근 등 다양한 활용성 극대화 연구 가 필요한 것으로 판단된다. In vivo 독성평가 모델을 2년 간에 걸쳐 연구를 수행하여 장내미생물이 화하 물질 대사에 중요하다는 사실은 어느 정도 입증할 수 있었지만, 사실은 앞으 로 해결해야할 문제가 산적해 있다고 보인다. 즉, 장내미생물에 의한 대사는 실제 host 조직에서의 대사와 비교하여 어느 정도로 중요한 의미를 갖는지 그리고 하나하나의 약물 또는 독성물질이 체내에서 영향을 미칠 때 과연 조 직의 대사계와 장내미생물 대사가 어느 정도의 중요성을 가지고 대사반응에 관여하는지에 대한 연구가 너무나 부족한 현실이기 때문이다. 약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

89/ 89/91

따라서 향후 in vivo 시험계를 이용하여 다양한 화학물질에 대하여 기존의 독성평가계에 접목한 end-point 중심의 독성 평가도 매우 중요한 이슈가 될 것으로 보이며, 한편으로는 다양한 물질에 대하여 세포 및 분자수준의 작 용기작을 판단할 수 있는 다양한 평가기술의 개발도 지속적으로 수행되어야 할 것으로 판단된다.

약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

90/ 90/91

6. 참고문헌 Aiub CAF, Mazzei JL, Pinto LFR, Felzenszwalb I (2006) Evaluation of nitroreductase

and

acetyltransferase

N-nitrosodiethylamine

participation

in

Chemico-Biological

genotoxicity.

Interactions, 161: 161 146-154. Hirayama K, Baranczewski P, Åkerlund JE, Midtvedt T, M ller L, Rafter J (2000) Effects of human intestinal flora on mutagenicity of

and

DNA

adduct

formation

from

food

and

environmental

mutagens. Carcinogenesis, 21(11): 21(11) 2105-2111. Kassie F, Rabot S, Kundi M, Chabicovsky M, Qin HM, Knasmuller S (2001)

Intestinal

genotoxicity

microflora

of

the

plays

a

crucial

cooked

2-amino-3-methylimidazo[4,5-f]quinoline

role

food (IQ).

in

the

mutagen

Carcinogenesis,

22(10): 22(10) 1721-1725. Knasmuller S, Steinkellner H, Hirschl AM, Rabot S, Nobis EC, Kassie F (2001) Impact of bacteria in dairy products and of the intestinal microflora heterocyclic

on

the

aromatic

genotoxic amines.

and

carcinogenic

Mutation

Research,

effects

of

480-481: 480-481

129-138. McGarr SE, Ridlon JM, Hylemon PB (2005) Diet, anaerobic bacterial metabolism, and colon cancer. Journal of Clinical Gastroenterology, 39(2): 39(2) 98-109. Schneider H, Simmering R, Hartmann L, Pforte H, Blaut M (2000) Degradation

of

quercetin-3-glucoside

in

gnotobiotic

rats

associated with human intestinal bacteria. Journal of Applied

Microbiology, 89: 1027-1037.

약물대사기반연구사업단


1-3세부과제

91/ 91/91

약물대사기반연구사업단

1-3세부과제  

약물대사기반사업단