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Guía Practica 2

[SOLUCIONES Y ESPECTROFOTOMETRIA]

UNIVERSIDAD NACIONAL DE CHIMBORAZO FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD BIOQUÍMICA CLINICA I GUÍA PARA PRÁCTICA DE LABORATORIO No2 1. 2. -

TEMA: PREPARACIÓN DE SOLUCIONES Y LECTURA ESPECTROFOTOMÉTRICA OBJETIVOS: 2.1. OBJETIVOS GENERALES Preparar correctamente soluciones para la ejecución de prácticas de laboratorio.

-

Aplicar la Espectrofotometría como una técnica cualitativa y cuantitativa de análisis. 2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

-

Realizar los cálculos teóricos mediante la aplicación de fórmulas y/ó factores de conversión, para en la práctica preparar soluciones a partir de solutos sólidos o líquidos aplicando normas de bioseguridad, utilizando correctamente materiales y equipos en el laboratorio.

-

Analizar conceptos relacionados con la espectrofotometría, para entender su importancia como técnica de análisis bioquímico.

-

Realizar la lectura de la Absorbancia de una banco de diluciones de orina en el espectrofotómetro y correlacionar los resultados con la concentración expresada en porcentaje y la transmitancia de cada muestra analizada.

3. -

MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS 1 gradilla 6 tubos de ensayo pequeños limpios y secos. 1 pipetas graduadas de 5 y 10 mL 1 pera de succión 2 vasos de precipitación de 50 y 100 mL 1 balón aforado de 250 ml 1 varilla de agitación 1 probeta de 100 ml 1 espátula Parafilm Temporizador Espectrofotómetro, Balanza analítica.

Acido Acético 100%, Cloruro de sodio, Amoniaco 25%(d=0,91g/dL) TRAER CADA GRUPO: -

Orina (una muestra recogida en un recipiente estéril, las ¾ partes del chorro medio de la micción). Etiqueta (adhesivo multipek) (para etiquetar la solución preprada) 1 Envase de plástico limpio y seco 250mL (para envasar correctamente la solución preparada)

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4.

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FUNDAMENTO TEÓRICO

ANÁLISIS BIOQUÍMICO A) INTRODUCCIÓN Un análisis bioquímico o clínico es la exploración complementaria de líquidos y/ó especímenes biológicos que permiten: interpretación de resultados, diagnóstico médico, valoración del pronóstico, valoración del tratamiento, investigación, ensayos clínicos, conocimiento de patologías, análisis del metabolismo. El resultado de un análisis se interpreta frente a valores de referencia establecidos para cada población y requiere de una interpretación médica. Por un lado está la prueba diagnóstica realizada y su resultado, y por el otro, la interpretación que el médico, respetando cada campo profesional. Lo más importante es que al realizar un análisis, siempre se deben tener en cuenta ciertas características propias de una prueba diagnóstica. Algunos de estos aspectos clave son: 1. Exactitud: Grado de concordancia entre el resultado y un valor de referencia certificado. En ausencia de exactitud se tiene error sistemático. 2. Precisión: Grado de concordancia entre los datos obtenidos de una serie. Refleja el efecto de los errores aleatorios producidos durante el proceso analítico. 3. Sensibilidad: Capacidad para discriminar entre pequeñas diferencias de concentración del analito. Se evalúa mediante la sensibilidad de calibración, que es la pendiente de la curva de calibración a la concentración de interés. 4. Límite de detección: Concentración correspondiente a una señal de magnitud igual al blanco más tres veces la desviación estándar del blanco. 5. Selectividad: Cuantifica el grado de ausencia de interferencias debidas a otras especies contenidas en la matriz. 6. Seguridad: Amplitud de condiciones experimentales en las que puede realizarse un análisis. Las pruebas de laboratorio constituyen un factor fundamental en el diagnóstico, evaluación, tratamiento y pronóstico de la mayoría de las afecciones humanas. Durante todo el procesamiento de la muestra, pueden ocurrir situaciones que se escapan al control, muchas veces por factores externos y otras por circunstancias propias del procedimiento, las cuales deben ser detectadas, registradas y resueltas: este es el caso de las no conformidades del sistema. En otras ocasiones los profesionales del laboratorio clínico y las instituciones en las que trabajan, se ven inmersos en incidentes de trabajo que no tienen que ver con situaciones internas del laboratorio, sino por condiciones legales, éticas, morales o de comunicación con agentes externos, los cuales deben ser correctamente solucionados en procura de preservar la imagen del laboratorio o de la Institución.

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PROGRAMACIÓN DEL TRABAJO EN EL LABORATORIO CLÍNICO Los análisis clínicos comprenden tres fases perfectamente diferenciadas: 1. FASE PRE ANALÍTICA: Conjunto de actividades realizadas desde el momento en que se recibe la petición analítica hasta que se inicia la fase analítica, sus etapas son: 

Formulación Pedido o Solicitud de Examen.

Recepción del Pedido de Examen

Preparación del paciente

Obtención del espécimen

Identificación y trazabilidad de la muestra

Manipulación, conservación y envío de muestra

Aceptación o rechazo de la muestra.

Revisión del Método (Fundamento, Composición, Técnica, Valoración)

Preparación de materiales, reactivos y equipos.

La calidad, la estabilidad, la cadena de frío y la caducidad de los reactivos son aspectos claves por donde se empieza a garantizar un buen resultado en la etapa analítica.

Equipos: la calibración, verificación y mantenimiento de los equipos son fundamentales, y son fuente de no conformidades, especialmente porque se manejan con un erróneo criterio de contención de costos.

2. FASE ANALÍTICA: Conjunto de actividades directamente relacionadas con la ejecución analítica, sus etapas son: 

Recurso humano: La primera y por lo tanto la más importante es la competencia del personal con base en su educación formación, habilidades y experiencia.

El control de calidad interno: en algunos casos no realizado, en otros realizado a intervalos no definidos y en otros aunque realizados no registrados o analizados. Los costos de los controles no son negociables.

Aplicación del Método y Obtención de datos de la Prueba

3. FASE POSTANALÍTICA: Conjunto de actividades realizadas con posterioridad a la ejecución analítica, sus etapas son: 

Esta es la etapa definitiva, en la cual el profesional del laboratorio se compromete con un resultado que va a tener importantes implicaciones en el paciente, bien sea positiva o negativa, mediante la aplicación de fórmulas, factores etc.

Verificación de los resultados e Interpretación: cada resultado está reflejando la situación de un paciente, y en ese sentido su análisis es individual. La calidad del resultado la garantiza el tecnólogo

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médico y no la máquina. En ocasiones la no conformidad se presenta por confiar ciegamente en la máquina. 

Elaboración Informe de Resultados o Exámenes realizados

Diagnóstico final (Personal responsable, únicamente el o la médico).

B) TÉRMINOS RELACIONADO CON EL ANÁLISIS: Espécimen: Material biológico para el análisis sangre, orina, heces, saliva, esputo, liquido cefalorraquídeo, líquido pleural, líquido amniótico, líquido ascítico, etc. Muestra: Parte representativa de la materia o espécimen objeto del análisis. Analíto: Especie química o sustancia que se analiza. Solución estándar o disolución estándar: Disolución que contiene una concentración conocida de un analíto o sustancia específica, llamada patrón primario, empleado para valorar las concentraciones de otras soluciones. Blanco de reactivo: Es la solución en la cual están todos los componentes menos el que desencadena la reacción coloreada o analito generalmente se utiliza agua destilada o el reactivo de trabajo. Método: Conjunto de operaciones y técnicas aplicadas al análisis de una muestra. Técnica: Medio de obtener información sobre el analito. Análisis: Estudio de una muestra para determinar sus composición o naturaleza química. C)

MÉTODOS DE ANÁLISIS 1. MÉTODOS CLÁSICOS: 1.1

MÉTODOS CUALITATIVOS: Métodos que permiten valorar calidad, considerada una

propiedad existente que pueda ser analizada como tal, comparada con otra similar, afín o de la misma especie, así se tiene las características organolépticas como textura, olor, color, aspecto. En el análisis de muestras y/ó líquidos biológicos no se aplica el sabor.

El

reporte

puede

ser:

positivo,

negativo, reactivo, no reactivo, presente, ausente…..etc. 1.2

MÉTODOS CUANTITATIVOS: Métodos que permiten valorar cantidad, examinar los

datos de manera científica, específicamente en forma numérica, determinar la concentración de analítos de interés diagnóstico. El reporte es en concentraciones (densidades). 2. MÉTODOS QUÍMICOS 2.1

MÉTODOS GRAVIMÉTRICOS: Determinan la cantidad de una sustancia por el peso.

2.2

MÉTODOS VOLUMÉTRICOS: Sinónimo de valoración o titulación son: 2.2.1 

POR LAS REACCIONES:

Método Volumétrico de Neutralización (Acido – Base): Se utilizan reactivos valorantes para determinar la concentración de un analito o sustancia en la muestra, mediante reacciones acido–base.

Método Volumétrico de Precipitación: Determinación de iones o sustancias en la muestra con reactivos valorantes que sean capaces de formar precipitados.

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Guía Practica 2 

Método Volumétrico de Oxido-reducción: Mediantes reactivos valorantes de oxidación se determina la concentración de un analito o sustancia reductoras por pérdida y ganancia de electrones y viceversa.

Método Volumétrico de Formación de complejos: Mediantes reactivos valorantes de se determina la concentración de un analito o sustancia por formación de complejo.

2.2.2

2.3

POR EL VOLUMEN TOTAL EMPLEADO

Macrométodo: más de 2 ml de volumen total en el análisis.

Semimicrométodo: de 1 a 2 ml de volumen total en el análisis.

Micrométodo: de 0.1 a 1 ml de volumen total en el análisis.

Ultramicrométodo: menos de 0.1 ml de volumen total en el análisis MÉTODO COLORIMÉTRICO: Miden la concentración de un compuesto, a partir de la

diferencia de la intensidad de color desarrollada en el análisis.

2.4

MÉTODO ENZIMÁTICO: Miden la concentración de un compuesto, a partir de la

utilización de enzimas y coenzimas que catalizan las reacciones químicas.

3. MÉTODOS FÍSICOQUÍMICOS O MÉTODOS INSTRUMENTALES 3.1

MÉTODOS ESPECTROMÉTRICOS: Basados en la interacción de la radiación

electromagnética u otras partículas con un analito o sustancia para identificarlo o determinar su concentración. Emplean técnicas que se dividen en técnicas espectroscópicas y en técnicas no espectroscópicas 3.2

MÉTODOS ELECTROANALÍTICOS: Estudian un analito mediante la medida del

potencial (voltios) y/o la corriente eléctrica (Amperios) en una celda electroquímica, que contiene el analito.

Estos métodos se pueden dividir en varias categorías dependiendo de qué

aspectos de la célula son controlados y cuales se miden: 3.2.1

Potenciometría: Miden la diferencia de potenciales en el electrodo.

3.2.2

Coulombimetría: Mide la corriente de las celdas con el tiempo

3.2.3

Voltamperometría: Mide la corriente de las celdas mientras se altera activamente el potencial.

3.3

MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS: Métodos de separación para la caracterización de

mezclas complejas, utilizan técnicas basadas en el principio de retención selectiva, para separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos componentes.

3.3.1

Cromatografía plana. La fase estacionaria se sitúa sobre una placa plana o sobre

un papel. Las principales técnicas son: Cromatografía en papel, Cromatografía en capa fina

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3.3.2

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Cromatografía en columna. La fase estacionaria se sitúa dentro de una columna. Según el fluido empleado como fase móvil se distinguen: Cromatografía de líquidos, Cromatografía de gases, Cromatografía de fluidos supercríticos.

ESPECTROFOTOMETRIA A) INTRODUCCIÓN A LA ESPECTROFOTOMETRÍA Espectrofotometría es una técnica de análisis óptico usada en las investigaciones químicas y biológicas para: -

Determinar la cantidad de concentración en una solución de algún compuesto utilizando las fórmulas ya mencionadas.

-

Determinar estructuras moleculares.

-

Identificar unidades estructurales específicas ya que estas tienen distintos tipos de absorbancia (grupos funcionales o isomerías).

Todas las sustancias pueden absorber energía radiante, aun el vidrio que parece ser completamente transparente absorbe radiación de longitudes de ondas que no pertenecen al espectro visible; el agua absorbe fuertemente en la región del infrarrojo. La absorción de las radiaciones depende de la estructura de las moléculas (grupos funcionales) o grupos químicos llamados CROMÓGENOS que tienen la capacidad de absorber radiación UV – VISIBLE así: dobles enlaces, triples enlaces, anillos aromáticos y otros. Cuando la luz atraviesa una sustancia, parte de la energía es absorbida; la energía radiante no puede producir ningún efecto sin ser absorbida. El color de las sustancias se debe a que éstas absorben ciertas longitudes de onda de la luz blanca que incide sobre ellas y solo dejan pasar a nuestros ojos aquellas longitudes de onda no absorbidas. La absorción y trasmitancia de luz depende tanto de la cantidad de la concentración y de la distancia recorrida.

ESPECTRO ELECTROMAGNÉTICO Es el conjunto de las ondas electromagnéticas, que emite (espectro de emisión) o absorbe (espectro de absorción) una sustancia. Dicha radiación sirve para identificar la sustancia de manera análoga a una huella dactilar. Los espectros se pueden observar mediante espectroscopios que, además de permitir observar el espectro, permiten realizar medidas sobre éste, como la longitud de onda, la frecuencia y la intensidad de la radiación. El espectro electromagnético se extiende desde la radiación de menor longitud de onda, como los rayos gamma y los rayos X, pasando por la luz ultravioleta, la luz visible y los rayos infrarrojos, hasta las ondas electromagnéticas de mayor longitud de onda, como son las ondas de radio. Se cree que el límite para la longitud de onda más pequeña posible es la longitud de Planck mientras que el límite máximo sería el tamaño del Universo. Dependiendo del fenómeno estudiado, la radiación electromagnética se puede considerar no como una serie de ondas sino como un chorro o flujo de partículas, llamadas fotones. Esta dualidad onda-corpúsculo

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hace que cada fotón tenga una energía directamente proporcional a la frecuencia de la onda asociada, dada por la relación de Planck: Donde E es la energía del fotón, h es la constante de Planck y ν es la frecuencia de la onda. Valor de la constante de Planck:

Así mismo, considerando la radiación electromagnética como onda, la longitud de onda λ y la frecuencia de oscilación ν están relacionadas por una constante, la velocidad de la luz en el medio (c en el vacío):

c = λ.v RADIACIONES ELECTROMAGNÉTICAS Banda

Longitud de onda Frecuencia Energía

Rayos gamma

< 10 pm

> 30,0 EHz > 20·10−15 J

Rayos X

< 10 nm

> 30,0 PHz > 20·10−18 J

Ultravioleta extremo

< 200 nm

> 1,5 PHz

> 993·10−21 J

Ultravioleta cercano

< 380 nm

> 789 THz

> 523·10−21 J

Luz Visible

< 780 nm

> 384 THz

> 255·10−21 J

Infrarrojo cercano

< 2,5 µm

> 120 THz

> 79·10−21 J

Infrarrojo medio

< 50 µm

> 6,00 THz > 4·10−21 J

Infrarrojo lejano/submilimétrico

< 1 mm

> 300 GHz > 200·10−24 J

Microondas

< 30 cm

> 1 GHz

Ultra Alta Frecuencia - Radio

<1m

> 300 MHz > 19.8·10−26 J

Muy Alta Frecuencia - Radio

< 10 m

> 30 MHz

> 19.8·10−28 J

Onda Corta - Radio

< 180 m

> 1,7 MHz

> 11.22·10−28 J

Onda media - Radio

< 650 m

> 650 kHz

> 42.9·10−29 J

Onda Larga - Radio Onda Media - Radio Muy Baja Frecuencia - Radio

< 10 km

> 30 kHz

> 19.8·10−30 J

> 10 km

< 30 kHz

< 19.8·10−30 J

> 2·10−24 J

A MENOR LONGITUD DE ONDA, MAYOR FRECUENCIA, MÁS ENERGÉTICA SERÁ LA RADIACIÓN Y POR LO TANTO MÁS PELIGROSA. A MAYOR LONGITUD DE ONDA, MENOR FRECUENCIA, MENOS ENERGÉTICA SERÁ LA RADIACIÓN Y POR LO TANTO MENOS PELIGROSA.

ESPECTRO VISIBLE

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Por encima de la frecuencia de las radiaciones infrarrojas se encuentra lo que comúnmente es llamado luz, un tipo especial de radiación electromagnética que tiene una longitud de onda en el intervalo de 0,4 a 0,8 micrómetros. La unidad usual para expresar las longitudes de onda es el Angstrom o los nm. Los intervalos van desde los 8.000 Å (rojo) hasta los 4.000 Å (violeta), donde la onda más corta es la del color violeta.

Color

Longitud de onda

violeta

380–450 nm

azul

450–495 nm

verde

495–570 nm

amarillo

570–590 nm

naranja

590–620 nm

rojo

620–750 nm

B) LEY DE LAMBERT - BEER La transmitancia o transmitencia es una magnitud que expresa la cantidad de energía que atraviesa un cuerpo en la unidad de tiempo (potencia). La transmitancia óptica que se define como la fracción de luz incidente, a una longitud de onda especificada, que pasa a través de una muestra. Su expresión matemática es:

Donde Io es la intensidad del rayo incidente e I es la intensidad de la luz que viene de la muestra. La transmitancia de una muestra está normalmente dada porcentualmente, definida como:

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La transmitancia se relaciona con la absorbancia (o absorbencia) A como

A=2-log10T% Donde T% es el porcentaje de transmitancia y T es transmitancia en "tanto por uno". Entonces:

A= log 1/T

Lo que es igual a:

A= -log T

ó: T= antilog (- A) La cantidad de luz absorbida por un cuerpo depende de la concentración en la solución y de la distancia recorrida por la luz. La ecuación simplificada de la Ley de Beer – Lambert.

A= a.b.C A= Absorbancia a= Factor de calibración, relaciona la concentración y la absorbancia de los estándares. b= Espesor recorrido por la radiación. C= Concentración.

C Concentración en: g/l mol/l g/100 ml

a Absorbilidad como: absorbilidad absorbilidad molar a 1 por ciento 1 cm

Símbolo a am A 1 cm 1%

La aplicación práctica de la Ley de Beer es, que conociendo la a bsorbancia de una sustancia se puede averiguar su concentración así:

1. Por comparación con una solución conocida: Dos soluciones, una problema (P) y una estándar (S), establecer la siguiente relación matemática entre ellas. Para el estándar

As = a.b.Cs

Para el problema

Ap = a.b.Cp

Dividiendo las ecuaciones:

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Como se trata de la misma sustancia a y b son los mismos:

As =

Absorbancia del estándar

Ap =

Absorbancia problema o muestra

Cs =

Concentración estándar

Cp =

Concentración problema o muestra

2. A través de una curva de calibración: La curva de calibración es la representación gráfica en un eje de coordenadas de la Absorbancia (eje de ordenadas) frente a la Concentración (eje de abcisas). Se ensayan varias soluciones de concentración conocida y se determinan sus A, construyéndose la curva de calibrado, que es una recta. Una vez ensayadas las soluciones problemas, su concentración se averigua por interpolación de las A de las soluciones problema en la curva de calibración. Ejemplo:

Absorbancia de la muestra: Absorbancia de reactivos: Absorbancia del de lablanco muestra: Absorbancia del blanco de muestra: Absorbancia corregida de la muestra:

0,333 0,011 0,24 0,082

CON LA ECUACIÓN DE LA RECTA SE DETERMINA LA CONCENTRACIÓN: C=0.076x0.082+0.1693 C=11,023µg/mL Ó por Interpolación de la recta. De la misma manera que se obtiene la gráfica de A vs. T, se pueden interpretar los resultados de T vs. C y A vs. T. 

A MAYOR ABSORBANCIA TRASMITANCIA. A MENOR ABSORBANCIA TRASMITANCIA.

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MAYOR CONCENTRACIÓN Y MENOR MENOR CONCENTRACIÓN Y MAYOR

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Hay que tener en cuenta la LINEALIDAD, que es el intervalo de concentraciones del cromógeno entre las cuales existe una relación lineal entre Absorbancia y Concentración. Cuando la concentración del cromógeno sobrepasa los límites de linealidad se deja de cumplir la Ley de Beer, convirtiéndose la recta en una curva. La lectura de la Absorbancia fuera de los límites de linealidad se traduce en una concentración falsamente baja de cromógeno. En esta situación, hay que diluir la muestra para que su concentración entre en los límites de la linealidad.

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C) ESPECTROFOTOMETRO Y SUS COMPONENTES Es un instrumento que permite comparar la radiación absorbida o transmitida por una solución que contiene una cantidad desconocida de soluto o analito, y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia o analito que consta de:

1. Fuente de luz o energía radiante. 2. Selector de longitud de onda (rendija, lente, prisma). 3. Cubeta o Célula de flujo para la muestra. 4. Detector de energía radiante. 5. Registro o Dispositivo de lectura de la señal generada por el detector. Fuente de luz: Es la fuente de energía radiante, consta de una lámpara de tungsteno, halógeno, molibdeno, hidrógeno para emitir luz poli cromática (formada por varias radiaciones de diferentes longitudes de onda). Selector: Permite seleccionar la longitud de onda (λ ) requerida para analizar una determinada sustancia en la muestra. Está formado por un sistema monocromador que obtiene luz monocromática (de una sola longitud de onda ( λ )) a partir de la policromática emitida por la fuente de luz. Cubeta o Célula de Flujo: Es el recipiente donde se coloca la muestra a analizar. Normalmente tienen un grosor estandarizado de 1 cm, a simple vista parecen un tubo de ensayo, presentan diversas formas redondas, cuadradas y rectangulares. Pueden ser de plástico, vidrio y cuando se trabaja a inferiores a los 300 nm son de cuarzo. Antes de cada lectura deben limpiarse y el volumen de muestra debe ser exactamente de 5 ml o hasta la marca que viene señalada en la cubeta. Detector: Está formado por células fotovoltaicas o foto tubos, que recogen la luz resultante de atravesar la cubeta y la transforman en energía eléctrica. Registro: Suele ser un galvanómetro que registra la señal eléctrica generada por el detector y la indica en forma de lectura como Absorbancia o D.O. (densidad óptica), % de transmitancia o incluso directamente en concentración.

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5. DISEÑO EXPERINMENTAL A) PREPARACIÓN DE SOLUCIONES 1. Realice los cálculos y prepare las siguientes soluciones: 2. Solución de ácido acético al 5%, 250 mL, utilice agua destilada. Preparada la solución transfiera a un recipiente de plástico limpio y estéril debidamente etiquetado. 3. Solución de cloruro de sodio 0,15 M, 250 mL, utilice agua destilada. Preparada la solución transfiera a un recipiente de plástico limpio y estéril debidamente etiquetado. 4. Solución de Amoniaco 0.21 M, 250 mL, utilice agua destilada. Preparada la solución transfiera a un recipiente de plástico limpio y estéril debidamente etiquetado. Datos: Densidad del amoniaco al 25% es 0.91 g/mL 5. Banco de Diluciones de Orina. 

Recoger una muestra de orina ¾ partes del chorro medio de la micción en un recipiente limpio y estéril.

En tubos debidamente rotulados, utilizando la orina y agua destilada prepare un banco de 4 diluciones de orina a razón geométrica de ½. Volumen total de cada dilución 2mL.

TUBOS Blanco A B C D 

DILUCION Agua destilada ORINA SIN DILUIR (ESTÁNDAR) 1/2 1/4 1/8

Registre el color de cada tubo con su tonalidad.

B) REVISIÓN DEL EPECTROFOTOMÉTRO 1. Identifique las funciones que realiza el espectrofotómetro a través del panel principal. 2. Verifique las diferentes partes que constituyen el equipo. 3. Compruebe como se realiza el manejo del equipo, cuidado y mantenimiento. C) MEDICIÓN DE LA ABSORBANCIA DEL BANCO DE DILUCIONES DE ORINA Con el Banco de Diluciones de la Orina preparado en el apartado anterior proceda a realizar la lectura de la Absorbancia (A) en el espectrofotómetro a 505 nm de longitud de onda, con sistema monocromático. 1. Lavado del sistema de flujo o succión del equipo con agua destilada. 2. Lectura de Absorbancia del BLANCO DEL REACTIVO 3. Lectura de Absorbancia del ESTANDAR 4. Lectura de Absorbancia de LAS MUESTRAS DE CONCENTRACIÓN CONOCIDA

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5. La docente entregará un tubo de dilución de orina como muestra desconocida, para que también se realice la lectura de absorbancia de la MUESTRA DE CONCENTRACIÓN DESCONOCIDA. 6.

CÁLCULOS Exprese los cálculos realizados.  Solución de ácido acético al 5%, 250 mL.  Solución de cloruro de sodio 0,15 M, 250 mL  Solución de Amoniaco 0,21 M, 250 mL. Densidad del amoniaco 0.91 g/mL Banco de Diluciones de Orina  Con los valores de las diluciones de la orina calcule la concentración en porcentaje de volumen (%V/V) de cada tubo.  Calcule

la

concentración

en

porcentaje

de

volumen

(%V/V)

de

la

muestra

desconocida o problema, con los valores de la Absorbancia calcule la Transmitancia. 7.

RESULTADOS En la siguiente tabla registre resultados a partir de los cálculos anteriores. TUBOS

DILUCION

A

Orina Estándar

B C D X

1/2 1/4 1/8

CONCENTRACIÓN % ABSORBANCIA

TRANSMITANCIA

sin diluir

Muestra Problema

Grafique en papel milimetrado la variación de la Lectura de A Vs. C. Una los puntos de la curva, obtenga la ecuación de la recta, determine la concentración de la muestra problema a través de la ecuación. Establezca conclusiones.

Grafique en papel milimetrado la variación de la Lectura de T Vs. C. Una los puntos de la curva. Establezca conclusiones.

Grafique en papel milimetrado la variación de la Lectura de A Vs. T. Una los puntos de la curva. Establezca conclusiones.

NOTA:

8.

Cada gráfica debe tener el título, nombres de los ejes, escala adecuada, interpretación

CUESTIONARIO 1. ¿Qué tipos de vinagre existen y cuáles son sus usos en medicina? 2. ¿De qué manera se prepara el suero fisiológico usado en el laboratorio clínico? 3. ¿Qué es el amoniaco, cuáles son los efectos nocivos y benéficos para la salud? 4. ¿Qué son soluciones proponga 5 ejemplos de soluciones del organismo humano?

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5. ¿Qué es la espectrofotometría y qué importancia tiene en Bioquímica? 6. ¿Cuál es la relación entre Absorbancia, Transmitancia y Concentración? 7. ¿Qué es longitud de onda, frecuencia, energía? 8. ¿Cuál es el cuidado y mantenimiento que se debe dar al espectrofotómetro? 9. ¿Qué diferencias hay entre solución estándar o patrón, muestra, y blanco de reactivo? 10. Coteje la columna de la izquierda con la respuesta correcta de la columna de la derecha (a) Transmitancia

(

)

Relación entre la Intensidad final de la radiación y la Intensidad inicial

(b) Absorbancia

(

)

Grupos funcionales químicos que tienen la capacidad de absorber la radiación UV- Visible del espectro ejemplo: dobles, triples enlaces, anillos aromáticos y otros.

(c) Cromógeno

(

)

Ciencia que estudia los fenómenos de absorción y de dispersión de la luz.

(d) Espectrofotometría

(

)

Técnica de laboratorio cualitativa que permite identificar la sustancia de una muestra y cuantitativa porque permite conocer la concentración exacta de la muestra utilización radiaciones electromagnéticas.

(e) Espectro electromagnetico

(

)

Cuando los átomos pierden energía radiante y emiten una radiación electromagnética

(f) Espectro de emisión

(

)

Conjunto de radiaciones espectro electromagnéticas, caracterizadas por su energía, longitud de onda y frecuencia

(g) Espectroscopia

(

)

Cantidad de la Intensidad de la radiación que es captada por los átomos que constituyen una muestra

11. Visite Hospitales, Centros de Salud, Consultorios Médicos y/ o Laboratorios Clínicos: anexar al presente informe una Solicitud de Examen e Informe de laboratorio Clínico (Buscar referencias en formatos estándares del Ministerio de Salud). RESUELVA LOS SIGUIENTES EJERCICIOS DE ESPECTROFOTOMETRÍA (realice los cálculos necesarios). 12. En la determinación del colesterol total en el suero del paciente se obtiene una absorbancia de 0,840. Un patrón de colesterol total de 200 mg/dl leído en el espectrofotómetro da una absorbancia de 0,435. ¿Cuál es la concentración de colesterol total en la muestra? 13. Cuando una muestra presenta un valor de Absorbancia X. ¿Cuál es la transmitancia y el porcentaje de Transmitancia? Absorbancia Transmitancia % Transmitancia 0,445 0,555 0,632 14. ¿Cuál es la concentración de hemoglobina total de una muestra de suero de una paciente mujer que leída en el espectrofotómetro obtuvo una Absorbancia de 0.248? Por otra parte un estándar de BIOQUÍMICA CLÍNICA I

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hemoglobina total tiene una concentración de 12g/dL en el mismo instrumento dio una Absorbancia de 0.321.

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2 soluciones espectrofotometria