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Guía Practica 1

[Actividad enzimática de (GOT/AST y GPT/ALT)]

UNIVERSIDAD NACIONAL DE CHIMBORAZO FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD BIOQUÍMICA PRÁCTICA GUÍA PARA PRÁCTICA DE LABORATORIO N°1 1. TEMA: Medición de la actividad enzimática de (GOT/AST y GPT/ALT) enzimas de importancia Biomédica en suero Humano. 2. OBJETIVOS: 2.1.

OBJETIVO GENERAL: -

2.2.

Determinar la actividad enzimática de las Enzimas GOT/AST (transaminasa glutamicooxalacetico) y GPT/ALT (transaminasa glutamico-piruvico en suero sanguíneo). OBJETIVO ESPECÍFICO:

-

Identificar el método de análisis utilizado en esta determinación. Calcular la actividad enzimática de GOT/AST y GPT/ALT en una muestra de suero humano y compararlo con los valores normales. Correlacionar los resultados obtenidos con la importancia biomédica. Expresar los resultados obtenidos en unidades SI (μkat/L).

MATERIALES EQUIPOS Y REACTIVOS: -

Espectrofotómetro con compartimiento de medición termostatado a 30/37°C para leer a 340nm. Temporizador 5 Tubos de ensayo pequeños, perfectamente limpios y secos (lavar días antes) Pipeta automática de 10-100 µL, 100-1000 y puntas descartables Parafilm 1 Gradilla Suero, plasma heparinizado u obtenido con EDTA, libre de hemólisis.

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Agua destilada Solución salina

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Calculadora (individual) Envase ámbar 20mL perfectamente limpios y secos (uno por grupo)

REACTIVOS: DETERMINACIÓN ALT/TGP -

R1 tampón/Sustrato ALT. Tampón TRIS 150 mmol/L pH 7,3, L-alanina 750 mmol/L, lactato deshidrogenasa > 1350 U/L. R2 enzima/Coenzima ALT. NADH 1,3 mmol/L, 2-cetoglutarato 75 mmol/L. Biocidas Tris es el nombre abreviado del compuesto orgánico conocido como tris (hidroximetil)aminometano, de fórmula (HOCH2)3CNH2. Se utiliza ampliamente en bioquímica y biología molecular, en particular para preparar disoluciones tampón

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DETERMINACIÓN AST/GOT

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[Actividad enzimática de (GOT/AST y GPT/ALT)]

R1 Sustrato AST. Tampón TRIS 121 mmol/L pH 7,8, L-aspartato 362 mmol/L, malato deshidrogenasa >460 U/L, R2 Coenzima AST. NADH 1,3 mmol/L, 2-cetoglutarato 75 mmol/L. Biocidas

3. FUNDAMENTO TEORICO Las enzimas son moléculas de naturaleza proteica que catalizan reacciones bioquímicas. En estas reacciones, las enzimas actúan sobre unas moléculas denominadas sustratos, las cuales se convierten en moléculas diferentes denominadas productos. Las transaminasas (o aminotransferasas) son enzimas transferasas que catalizan la reacción de transferencia del grupo amino (-NH2) de un aminoácido a un α-cetoglutarato (un α-cetoácido). Las transaminasas más conocidas son:  Glutamato-oxalacetato transaminasa aminotransferasa (AST).

(GOT),

llamada

también

aspartato

 Glutamato-piruvato transaminasa (GPT), o bien alanina aminotransferasa (ALT).

Las transaminasas están por todo el organismo. La GOT o AST está en el hígado, miocardio, riñón, encéfalo y musculatura esquelética. La GPT o ALT está presente en concentraciones mucho más elevadas en el hígado que en los demás tejidos. La GOT cataliza la siguiente reacción: Aspartato + α-Cetoglutarato ⇔ Oxalacetato + Glutamato La GPT cataliza esta otra reacción: Alanina + α-Cetoglutarato ⇔ Piruvato + Glutamato UNIDADES ENZIMÁTICAS Las cantidades de enzima pueden ser expresadas en moles, como las de cualquier otro compuesto químico, o pueden ser cuantificadas en términos de actividad enzimática. La actividad enzimática es una medida de la cantidad de enzima activa presente y del nivel de actividad de la misma, por lo que la medida de la actividad es dependiente de las condiciones, que deben ser especificadas cuando se dan valores de actividad. La actividad expresa la cantidad de sustrato convertido por unidad de tiempo, teniendo en cuenta el volumen de reacción. En el Sistema Internacional de Unidades la unidad para la actividad catalítica es el katal (kat), pero es una unidad demasiado grande y suele usarse la unidad de actividad enzimática (UI).  

1 kat = 1 mol sustrato convertido x s-1 = 6 x 107 UI 1 UI = 1 μmol sustrato convertido x min-1 = 16,67 nkat MÉTODO ANALISIS: ENZIMÁTICO UV, CINETICO CONDICIONES DE REACCION: DISMINUCIÓN DE ABSORBANCIA

AST/GOT (EC 2.6.1.1) La aspartato aminotransferasa o ASAT, antes conocida como transaminasa glutámicooxalacética (GOT), también llamada aspartato transaminasa (AST)

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La aspartato aminotransferasa (AST/GOT) cataliza la transferencia del grupo amino del aspartato al cetoglutarato con la formación de glutamato y oxalacetato. Este último es reducido a malato por la malato deshidrogenasa (MDH) en presencia de nicotinamido adenin dinucleótido reducido (NADH). La reacción se controla cinéticamente a 340 nm a través de la disminución de la absorbancia resultante de la oxidación del NADH a NAD+, proporcional a la actividad AST en la muestra

ALT/GPT EC 2.6.1.2 La Alanina aminotransferasa (ALAT), anteriormente conocida como Transaminasa glutámicopirúvica (TGP), también llamada alanina transaminasa (ALT), La alanina aminotransferasa (ALT/TGP) cataliza la transferencia del grupo amino de la alanina al cetoglutarato con la formación de glutamato y piruvato. Este último es reducido a lactato por la lactato deshidrogenasa (LDH) en presencia de nicotinamido adenin dinucleótido reducido (NADH). La reacción se controla cinéticamente a 340 nm a través de la disminución de la absorbancia resultante de la oxidación del NADH a NAD+, proporcional a la actividad ALT en la muestra.

FACTORES QUE AFECTAN AL ENSAYO - Fuerza osmótica. La mayoría de las enzimas no pueden tolerar concentraciones de sal extremadamente altas. Los iones interfieren con los débiles enlaces iónicos de las proteínas. - Temperatura. Todas las enzimas trabajan en un rango de temperaturas específicas del organismo al que pertenecen. Los aumentos de temperatura generalmente provocan un incremento de la velocidad de reacción. Esto se debe a alteraciones de la estructura de la proteína debidas a la interrupción de uniones iónicas que resultan en la estabilización de la estructura tridimensional de la enzima. La temperatura óptima de las enzimas humanas se encuentra generalmente entre los 35 y los 40 °C; la temperatura media del organismo del ser humano es 37 °C. Así, las enzimas humanas comienzan a desnaturalizarse rápidamente a partir de los 40 °C - pH. La mayoría de las enzimas son sensibles al pH y tiene un rango específico en el que se detecta actividad; todas tienen un pH óptimo. El pH puede detener la actividad enzimática al provocar la desnaturalización de la estructura proteica rompiendo enlaces iónicos y puentes de hidrógeno. La mayoría de las enzimas funcionan entre un pH 6 y 8; sin embargo, la pepsina estomacal tiene un pH óptimo de 2 y la tripsina de 8. - Saturación del sustrato. Aumentando la concentración de sustrato aumenta la velocidad de la reacción o actividad enzimática. Sin embargo, el límite de saturación limita la velocidad. Una enzima está saturada cuando los sitios activos de todas las moléculas están ocupados la mayoría del tiempo. BIOQUÍMICA PRÁCTICA II

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VALORES DE REFERENCIA (TGO/AST y TGP/ALT) En suero o plasma: Adultos

37°C 30°C

Hasta 40U/L (0,67 µKat/L) Hasta 25U/L (0,42 µkat/L)

Neonatos y niños doblan los valores observados en adultos acercándose a éstos aproximadamente a los seis meses de edad. El diagnóstico clínico no debe realizarse únicamente con los resultados de un único ensayo, sino que debe considerarse al mismo tiempo los datos clínicos del paciente. SIGNIFICADO CLINICO El grupo de enzimas denominados transaminasas se hallan presentes en tejidos de muchos órganos. La actividad necrótica en estos órganos es la causante de la liberación de cantidades anormales de enzimas en la sangre donde son medidas. Al ser el tejido cardíaco rico en AST se presentan niveles séricos aumentados en pacientes tras un infarto de miocardio, así como en pacientes con enfermedades musculares, distrofia muscular y dermatomiositis. El hígado es especialmente rico en ALT, siendo la determinación de este enzima empleado principalmente como prueba analítica en la hepatitis infecciosa y tóxica, aunque pueden hallarse niveles elevados de ambas enzimas, AST y ALT, en casos de daño celular hepático y pancreatitis aguda, situación que parece indicar que la obstrucción del árbol biliar por un páncreas edematoso y la presencia de una enfermedad hepática asociada pueden contribuir a los elevados aumentos de AST en estos pacientes. Aumentos entre ligeros y moderados de AST y ALT pueden observarse tras la ingesta de alcohol y tras la administración de ciertos fármacos, tales como salicilatos, opiáceos y ampicilina. DISEÑO EXPERIMENTAL - Preparar el reactivo de trabajo: Mezclar 4 mL de R1 + 1 mL de R2. Estable durante 4 semanas a 2-8°C. Resguardar de la luz. - Tomar en cuenta los siguientes parámetros: PARÁMETRO

ALT

LIMITE DE DETECCIÓN

7,95 U/L 500 U/L

4,69 U/L 500U/L Pre incubar el reactivo de trabajo, muestras y controles a la temperatura de reacción. Ajustar a 0 el espectrofotómetro con agua destilada. Pipetear en un tubo de ensayo: Temperatura de Reacción 37°C 30°C Reactivo de trabajo 1000µL 1000µL Muestra o Control 50µL 100µL Mezclar suavemente por inversión, Insertar el tubo de ensayo en el compartimiento termostatado del instrumento y poner el cronómetro en marcha. Incubar durante 1 minuto, y anotar la absorbancia inicial. Repetir las lecturas exactamente a los 1,2 y 3 minutos. Calcular la diferencia entre absorbancias. Muestras con ΔA/min superiores a 0,160 a 340 nm deben diluirse 1:10 con solución salina y repetir el ensayo. Multiplicar los resultados por 10. Calcular el promedio de los resultados para obtener el cambio promedio en absorbancia por minuto (ΔA/min). Para expresar los resultados en unidades SI: U/L x 0,01667 = μkat/L LINEALIDAD

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AST

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4. CALCULOS U/L = ΔA/min x 3333 (37ºC) U/L = ΔA/min x 1746 (30ºC) Para expresar los resultados en unidades SI aplicar: U/L x 0,01667 = μkat/L 5.

RESULTADOS Y DISCUSIONES

6.

OBSERVACIONES

7.

CONCLUSIONES

8.

RECOMENDACIONES

9.

CUESTIONARIO

9.1. 9.2.

¿Describa otros métodos de análisis para cuantificar actividad enzimática en general? ¿Qué enfermedades se relacionan con resultados anormales de ALT y AST, desarrolle pequeños conceptos que describan las mismas? Cree organizadores gráficos e identifique los signos y síntomas más relevantes de las enfermedades antes mencionadas. ¿Qué es un perfil hepático y que pruebas de laboratorio se solicitan dentro de este perfil? Escriba las 10 enzimas que frecuentemente se dosifican en los análisis bioquímicos y cuáles son los beneficios e una cuantificación oportuna.

9.3. 9.4. 9.5.

10. BIBLIOGRAFÍA 11. ANEXOS

Referencia: 

Técnicas para determinación de AST/GOT Y ALT/GPT del Laboratorio Linear Chemicals. Barcelona España.

MURRAY,Robert. Bioquímica de Harper. 16ªedición, Manual Moderno. México. 2004. Dra. Rosa Elisa Cruz DOCENTE BIOQUÍMICA PRÁCTICA

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ALT Y AST

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