Issuu on Google+

芽孢杆菌定量测定方法的比较研究 芽孢杆菌是单细胞微生物,个体小,给生物定量带来一定难度。对一般单细胞微生物来说,培养时的对数生长期,细胞的数量与 细胞的生物量之间呈现明显的量比关系,因此细胞个体数量在一定程度上反映生物量的大小。细胞的数量可分为总菌数和活菌数两大 类。总菌数包括活菌和死菌,反映生物量的大小,并可核定活菌数的测定结果的正确性。活菌数测定结果,一方面反映生物量的大小, 另一方面反映微生物的内部结构,所以活菌数的测定常作为微生物定量的重要指标。本研究比较了芽孢杆菌的几种定量测定方法,以 便选择一种适合于不同芽孢杆菌活菌数的准确定量方法。

1. 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌种:四株芽孢杆菌,菌号分别为 O1、T2、T8、E8,由本中心微生态研究室提供。平皿直径 9 或 12 ㎝,L 棒自制。 1.1.2 营养肉汤:蛋白胨 10g,牛肉膏 5 g,蒸馏水 1000ml,pH7.2-7.4。 1.1.3 营养琼脂:营养肉汤加 1.8%琼脂粉。 1.1.4 稀释液:0.85%生理盐水。 1.2 方法 1.2.1 涂片染色法:首先将待测菌液作 10 倍递进稀释,用铂金圈取不同稀释度的稀释液接种环均匀涂在直径为 1.0 ㎝的载玻片上圆 圈内,尔后固定革兰氏染色,在显微镜下计数每个视野的菌数。一般取 10 个以上视野计数,求出平均值。按以下公式计算细菌总数。 每毫升原菌液含菌数=每视野已知细菌平均数×稀释倍数×A×B A:重量系数,即每毫升菌液所含的接种环数。 B:面积系数,即直径为 1 厘米的圆圈内所含的视野数。


1.2.2 倾注平皿法:将待测菌液作 10 倍递进稀释,取三个稀释度的稀释液各 1 ml 与融化并冷至 45℃左右的营养琼脂一起倾入无菌 平皿中摇匀,静置,待凝固后 37℃培养 24-48 小时,每个稀释度作三个重复。通过平皿上长出的菌落数,计算原菌液含菌数,以每平 皿上长出的菌落数在 30-300 之间合格。 每毫升原菌液含活菌数=同一稀释度的菌落平均数×稀释倍数 1.2.3 涂布平皿法:将待测菌液作 10 倍递进稀释,取三个稀释度的稀释液各 0.1 ml 和 0.5 ml 至营养琼脂平皿表面上,用灼烧过的 L 形棒或三角形玻璃推子推匀。每个稀释度作三个重复。37℃培养 18-24 小时,计数平皿面上的菌落数,按以下公式计算原菌液含活菌 数。以每个平皿上生长的菌落数在 30-300 间为合格。 每毫升原菌液含活菌数=同一稀释度的菌落平均数×稀释倍数×10

2. 结果 2.1 涂片染色法、倾注平皿法和涂布平皿法三种方法对四株芽孢杆菌的测定结果,涂片染色法为 10.5×108/ml,偏高;涂布平皿法 为 9×108/ml,倾注平皿法为 7×108/ml,偏低(见表 1)。


表1

三种不同培养方法测定结果

2.2 0.1 ml 涂布在直径为 9 厘米平皿和取 0.5 ml 涂布在直径为 12 ㎝平皿,两种不同取量胳测定结果,取 0.1 ml 稀释后所含活菌 数 18.3×108,取 0.5 ml 为 17.6×108(见表 2)。


表2

涂布平皿法测定不同取量结果

3. 讨论 3.1 细菌计数的方法较多,每种方法都各有优点和局限性,只有在综合考虑各影响因素同需要解决的问题之间的关系之后,才能对 具体的方法进行评价、选择。本次试验的目的是要寻找一种简便、快速、准确的测定芽孢杆菌活菌数的方法。 3.2 涂片染色法,是用显微镜直接计数,该法在研究工作中很重要,不需要培养,可以快速测定细菌总菌数,在一定程度上反映了 活菌数,可节省大量的人力、物力和时间。因此这种方法可用于快速检测细菌数量。但该法不能区分死细胞和活细胞,测得的结果是 死细胞和活细胞的总数,不能客观反映样品中活菌的数量,从本次三种方法检测结果,亦知菌数含量偏高,因此不宜作为测定芽孢杆 菌活菌数的方法。


3.3 倾注平皿法,是教学、科研和生产中最常用的一种活菌计数方法。但是操作过程中意外的损伤可能导致菌数的减少,如在稀释 倾注平皿过程中细菌受到损伤,引起人为的误差;处于融化状态的营养琼脂温度太高时,易受势力影响的繁殖体往往不能存活,造成 操作误差;相反,培养基温度偏低,倾注到平皿后不能与菌液充分混匀,使多个细胞堆积在一起,共同形成一个菌落,以致造成实验 误差。有的菌株在这种厌氧培养条件下不能生长,如本次试验 E8 是严格好氧菌,在深层培养基中不能生长。另外,倾注平皿法的操作 比较复杂,每次测定均要准备融化的营养培养基,对操作人员的熟练程度要求较高,故在专性需氧芽孢杆菌活菌数测定中受到极大的 限制。因此该法也不能作为专性需氧芽孢杆菌活菌数的测定方法。 3.4 涂布平皿法是一中简便快速的测定方法,影响因素较少能准确测定芽孢杆菌活菌数,只要选择稀释度恰当,便可避免多个细胞 堆积在一起共同形成一个菌落。另外,操作比较简单,重复性好,可预先备好经无菌检验过的营养平皿待用。需氧菌、兼性厌氧菌均 能生长良好。该法既能保持以上两种方法的优点,又克服了两种方法的弱点。因此,选用涂布平皿法测定专性需氧、兼性厌氧芽孢杆 菌的活菌数为宜。 3.5 不同样品量的选择,本次试验为取 0.1ml 与 0.5ml 分别用涂布平皿法测定结果,取 0.1ml 菌数含量偏高,可能因为 0.1ml 样品太 少,容易产生误差,而 0.5ml 样品涂布在直径为 12 ㎝的平皿,以测定芽孢杆菌活菌数为宜。


芽孢杆菌定量测定方法的比较研究