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PROTOCOLLO HISTOSONDA RICOSTITUIRE LA SONDA 1. Aggiungere 65 ul di Acqua distillata alla vial di Histosonda, vortexare brevemente, centrifugare se necessario. SPARAFFINARE 1. Riscaldare i vetrini a 62° per 10 minuti 2. Immergere i vetrini in: Xilene: 10 min Xilene: 10 min Alcool assoluto (etanolo o isopropanolo): 5 min X 2 Alcool 96%: 5 min X2 Metanolo contenente 0.3% H2O2: 5min (in alternativa 3% H2O2 ) 3. Lavare bene con acqua e lasciare in immersione per 1 min

INIBIZIONE DEL LEGAME ASPECIFICO CON IL DNA (OPZIONALE) Generalmente questo passaggio non è necessario a meno che il tessuto da ibridizzare contenga un’elevata quantità di eosinofili es.midollo osseo e tessuto gastrico) 1. Porre i vetrini in un contenitore con Acqua distillata. Inserire nel microonde alla massima potenza finché non si raggiunge una bollitura uniforme Alternativamente, porre i vetrini in acqua portata ad ebollizione per 30 secondi 2. Trasferire immediatamente i vetrini in Acqua distillata a temperatura ambiente Importante! Un eccesso di trattamento può generare background:rimuovere immediatamente i vetrini

Solo per BOM e campioni ricchi di eosinofili

PROTEOLISI 1. Rimuovere i vetrini dall’acqua e lasciarli asciugare bene (circa 10-15 min) 2. Ricostituire la Proteinase K (CEM-E-PK-G- versione 2) con 200 ul di PBS e coprire i vetrini per esattamente 10 min a T° amb in camera umida. (Importante: se i vetrini sono stati precedentemente trattati al microonde, il tempo di proteolisi deve essere ridotto a 5 minuti. Tessuti decalcificati possono tuttavia richiedere un tempo di proteolisi variabile dai 5 ai 20 minuti o temperature di incubazione superiori es. 55°C) BOM fissate con acido formico o EDTA possono richiedere una digestione di 20 minuti a 55°C. Per alcuni tessuti,il trattamento ottimale è di 10 minuti a 37°C Una volta ricostituita, la Proteinase K è poco stabile, non conservarla

3. Risciacquare accuratamente con dH2O 4. Trasferire i vetrini in PBS per 2 minuti

Histo-Line Laboratories Srl Via Brembo, 27 Milano. Tel. 0255230061 Fax 0255213764 www.histoline.com info@histoline.com

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INCUBAZIONE CON LA SONDA Rimuovere l’eccesso di tampone dai vetrini Aggiungere i 65 ul di sonda sulla sezione in modo uniforme e senza lasciare bolle Porre i vetrini nell’incubatore a 62°C all’interno di una camera umida preriscaldata e chiudere bene il coperchio Incubare a 62°C per 60min Importante : i vetrini devono essere posizionati orizzontalmente e non devono assolutamente andare a secco (Se non si dispone di un’adeguata camera umida, aggiungere i 65 ul di sonda su un coprioggetto 24x50 e posizionarlo sulla sezione. Sigillare i margini con mastice. Dopo l’incubazione rimuovere delicatamente mastice e coprioggetto.)

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LAVAGGIO POST-IBRIDAZIONE Lavare la sezione con PBS in modo energico per rimuovere la sonda

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Agitare in PBS per 5min. RIVELAZIONE Protocollo per la rivelazione manuale. Alternativamente, si può utilizzare un immunocoloratore

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Ricostituire l’ anticorpo anti-digossigenina con 1 ml di Acqua distillata. Ogni flacone è sufficiente per 10 vetrini. Rimuovere l’eccesso di tampone dalla sezione

Coprire la sezione con 100 ul di anticorpo anti-digossigenina e incubare per 30 minuti a T° ambiente in camera umida

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Lavare con PBS, agitare in PBS per 1 min. Rimuovere l’eccesso di tampone dalla sezione Incubare con un polimero anti-mouse marcato con perossidasi per 20-30 minuti a T° ambiente in camera umida, seguendo le istruzioni del produttore 7. Lavare con PBS, agitare in PBS per 1 min. 8. Rimuovere l’eccesso di tampone dalla sezione e incubare con Diaminobenzidine (DAB) seguendo le istruzioni del produttore 9. Lavare con Acqua 10. Controcolorare brevemente (2-3secs) con ematossilina di Harris diluita al 50% in acqua 11. Lavare con Acqua, disidratare e montare i vetrini.

Utilizzare un sistema di rivelazione validato per Immunoistochimica

Versione 10/10 Histo-Line Laboratories Srl Via Brembo, 27 Milano. Tel. 0255230061 Fax 0255213764 www.histoline.com info@histoline.com

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Protocollo Histosonda