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Investigación y diagnóstico de la patología de los peces de acuicultura; una perspectiva proteómica
El uso de la proteómica en la acuicultura de peces puede resultar una herramienta muy prometedora para la investigación y el diagnóstico de la patología de estos animales. A pesar de que apenas se encuentra en sus inicios, permite un enfoque más holístico de los procesos de patogénesis, proporcionando información importante sobre la identificación de patógenos y la caracterización de los mecanismos de virulencia y las interacciones entre el huésped y el patógeno, iluminando nuevas rutas de respuesta al estrés y respuestas fisiológicas del huésped previamente desconocidas. En este artículo desarrollado por investigadores del Centro de Ciencias Marinas de la Universidad de Algarve, Portugal y el Instituto Portugués por los Mares y la Atmósfera (IPMA) se ofrece a los lectores una revisión del estado del arte de las tecnológicas proteómicas y su uso en la producción acuícola.
Por: Márcio Moreira, Denise Schrama, Ana Paula Farinha, Marco Cerqueira, Cláudia Raposo de Magalhães, Raquel Carrilho y Pedro Rodrigues *
La producción de animales vivos siempre conlleva un riesgo de pérdidas por enfermedades infecciosas, y los peces de acuicultura, debido a las prácticas de cría utilizadas en su producción, son más vulnerables a las enfermedades derivadas de una amplia gama de infecciones bacterianas, víricas, parasitarias y fúngicas que los peces salvajes.
Asimismo, la tendencia a sistemas de producción de mayor densidad, las perturbaciones en el equilibrio de los sistemas ecológicos relacionadas con la contaminación y los cambios climáticos, y el previsible aumento de las transacciones internacionales de productos de la acuicultura y sus derivados, contribuyen a alterar la dinámica de interacción entre los organismos, los agentes infecciosos y las personas.
Esto influye en las tasas de replicación y proliferación de los patógenos, lo que lleva a una distribución geográfica más amplia de los agentes patógenos y a un aumento de las especies afectadas por brotes de enfermedades.
Para obtener modelos epidemiológicos adecuados, los programas de vigilancia de la sanidad animal y la bioseguridad, deben integrar la información ambiental y la procedente de diferentes ámbitos como la patogénesis, el diagnóstico de la enfermedad, la resistencia a la misma, la respuesta fisiológica a los patógenos, la caracterización del patógeno, la caracterización de las respuestas del sistema inmunitario del huésped, los biomarcadores de la enfermedad y la respuesta del organismo a los productos de tratamiento de la enfermedad.
Figura 1. Diagrama de enfermedades de la acuicultura, que indica los principales factores para la evaluación del patógeno y las interacciones huésped-patógeno que intervienen en los brotes de enfermedades de los peces. Adaptado de: (Sitjà-Bobadilla; Oidtmann, 2017 y Freitas; Vaz-Pires; Câmara, 2020.
La cantidad de datos de diferentes orígenes y el aumento de la frecuencia y la gravedad de las enfermedades marinas exige que se implementen nuevas herramientas de diagnóstico para que éste sea más rápido y eficaz.
Las técnicas ómicas se están convirtiendo en una realidad que ofrece una amplia gama de beneficios a la industria acuícola.
Las técnicas proteómicas son una de esas nuevas herramientas y uno de los enfoques más interesantes para la gestión sanitaria, la epidemiología y la investigación de las enfermedades de los peces.
Los métodos proteómicos de alto rendimiento basados en la espectrometría de masas (EM) permiten medir múltiples propiedades de miles de proteínas, como su abundancia, distribución en los tejidos, localización subcelular, modificaciones postraduccionales e interacciones proteína-proteína.
Por lo tanto, los enfoques basados en la proteómica pueden ofrecer una visión única de la regulación celular de los peces en respuesta a los patógenos y durante la progresión de la enfermedad, además de permitir la detección e identificación rápida y sensible de los patógenos.
Figura 2. Interacción entre el bienestar, la carga alostática, la susceptibilidad a enfermedades y las experiencias estresantes repetitivas / crónicas en los peces.
Salud, estrés y bienestar de los peces
Aunque el estado de salud de los peces ofrece criterios objetivos como parte de la evaluación del bienestar, éste no proporciona una imagen completa.
Un buen estado de salud es esencial para garantizar bienestar, pero no indica necesariamente que el pez se encuentre en un buen estado. Por otra parte, una salud deficiente, es decir, la capacidad reducida del animal para funcionar normalmente, para hacer frente a las condiciones de estrés y para prevenir las enfermedades, generalmente implica/conduce a falta de bienestar en una variedad de contextos.
En el caso de los peces producidos en estanques, los patógenos están naturalmente presentes en el entorno. En la mayoría de los casos, es la ausencia de bienestar, debido a las malas condiciones de cría, lo que se traduce en un deterioro de la salud.
En la acuicultura, las condiciones de cría inadecuadas, o incluso las prácticas de cultivo estándar, son factores de estrés cotidianos en los sistemas de cultivo.
La carga alostática impuesta a los animales, puede reducir el funcionamiento de sus mecanismos inmunitarios, favoreciendo así la presencia de enfermedades y amenazando al bienestar de los peces.
Sin embargo, la relación entre el estrés inducido por la cría y las enfermedades no es tan sencilla de analizar.
Desde el punto de vista de la productividad, la salud de los peces se interpreta a menudo como “ausencia de enfermedad”, ya que, desde un punto de vista ético o económico, cualquier estado de enfermedad es inaceptable para la industria.
Como en todos los demás vertebrados, ante un factor de estrés, los peces ponen en marcha una reacción generalizada; la llamada respuesta fisiológica al estrés, que permite al individuo ajustarse y hacer frente a los cambios predecibles e impredecibles de su entorno.
Como respuesta primaria, liberan cortisol y catecolaminas en el torrente sanguíneo, que inducirán una serie de reacciones posteriores.
En términos de costos energéticos, la respuesta fisiológica adaptativa necesaria para contrarrestar la alteración de la homeostasis requiere una cantidad significativa de energía.
En cuanto a las respuestas inmunitarias, se activan inmediatamente varios mecanismos para responder directamente al desafío.
El consumo total de las reservas energéticas da lugar a la sobrecarga alostática y el pez puede perder su capacidad de adaptación, lo que puede conducir a la inmunosupresión, la enfermedad y, en el caso de las alteraciones más graves, incluso la muerte.
Además, varios estudios han demostrado el impacto de las condiciones de cría estresantes en el funcionamiento de las barreras epiteliales.
Se sabe que el cortisol desempeña un papel inmunomodulador, inhibiendo componentes específicos del sistema inmunitario y potenciando otros, como la inducción de la apoptosis, el cambio de los patrones de diferenciación, la inhibición de la liberación de citoquinas y la inhibición de la migración de inmunocitos.
No obstante, la respuesta del cortisol puede variar entre diferentes especies e incluso entre individuos y verse afectada por varios otros parámetros, lo que puede dificultar establecer la relación entre el estrés y el estado inmunitario.
Figura 3. Anillo concéntrico de diagnóstico de enfermedades, que representa capas de diagnósticos de enfermedades como entorno, comunidad, organismo, tejido y ómicas como herramienta para interpretar las respuestas de células / tejidos (adaptado de Complementary approaches to diagnosing marine diseases, 2016).
Los estudios proteómicos en peces se centran, principalmente, en el hígado; sin embargo, el plasma sanguíneo y las mucosas están adquiriendo una importancia creciente desde el punto de vista inmunológico, ya que las mucosas de la piel son una de las barreras de defensa en los peces y el plasma actúa como espejo/reporte de las condiciones fisiológicas o patológicas.
Las aplicaciones importantes de la proteómica en este campo se refieren al estudio de los efectos de ciertas enfermedades y parásitos sobre la abundancia y las modificaciones de las proteínas y a la investigación de las interacciones huésped-patógeno.
Diagnóstico de enfermedades
En la proteómica, independientemente de la complejidad de las mezclas de proteínas analizadas, que pueden ir de cientos a varios miles de proteínas, el objetivo principal es la identificación precisa del mayor número posible de proteínas en esas mezclas.
En los enfoques basados en el gel, las proteínas se separan primero por electroforesis en gel de una (1-DE) o dos dimensiones (2-DE) y luego, se identifican por espectrometría de masas.
Mientras que, en los enfoques sin gel (o basados en la EM), las mezclas de proteínas permanecen en solución antes de la identificación de proteínas.
En cada caso, las muestras de proteínas pueden ser digeridas en péptidos por una enzima específica de la secuencia, típicamente tripsina, en un enfoque llamado proteómica “ascendente” basada en péptidos, para distinguirlo del análisis de proteínas enteras en la proteómica “descendente”.
A continuación, las muestras de péptidos pueden separarse y analizarse mediante cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS), empleando normalmente la ionización por electrospray (ESI) como método para convertir los péptidos en iones en fase gaseosa para el análisis por EM.
Alternativamente, las muestras de péptidos pueden analizarse mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo (TOF) por desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI).
Por otro lado, la LC-MS/MS es la más adecuada para la caracterización sistemática y a gran escala de los estudios promeóticos.
Identificación de patógenos
En los últimos diez años la proteómica ha surgido como una opción poderosa.
Esta herramienta puede utilizarse para la identificación de patógenos como complemento de otras técnicas de genética molecular, siendo la espectrometría de masas de desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI- TOF-MS) la principal técnica utilizada para este fin.
También es muy útil para la caracterización de los factores de virulencia y del ciclo de vida de los patógenos.
Sintomatología
Las enfermedades pueden expresarse en diferentes etapas y pueden evolucionar de una enfermedad aguda a una crónica o a la inversa.
Esta etapa crónica puede pasar desapercibida si no se realizan medidas de diagnóstico.
Los estadios agudos de la enfermedad con una alta mortalidad pueden aparecer de forma esporádica, lo que aumenta la gravedad de la enfermedad.
La observación de los signos clínicos (externos o internos) y las alteraciones del comportamiento, pueden ayudar a detectar la presencia de un patógeno en los peces.
Sin embargo, los signos exhibidos en respuesta a una enfermedad pueden ser inespecíficos de la misma y muy similares entre diferentes infecciones por patógenos.
Además, los peces pueden mostrar pocos o ninguno de estos signos.
Tras estas observaciones, la patología macroscópica y microscópica puede utilizarse para confirmar algunos patógenos, aunque a menudo es necesario el uso de tipos de diagnóstico más específicos para la identificación.
Herramientas para el estudio de las interacciones huésped-patógeno. El enfoque “holobioma”: metagenómica y metaproteómica
Las interacciones huésped-patógeno son extremadamente complejas y pueden establecerse a múltiples niveles, desde el molecular, el celular y el fisiológico, hasta el de las poblaciones y los ecosistemas.
La interacción huésped-patógeno comienza cuando el organismo huésped es desafiado por un agente patógeno, desencadenando así una respuesta biológica; donde el patógeno, a su vez, desarrolla una respuesta de contra ataque.
Esta interacción implica la inducción de la expresión de genes y la síntesis de proteínas en ambas partes, y puede desarrollarse un proceso infeccioso en el huésped, que en última instancia conduce a la muerte, si la respuesta del huésped o el sistema de defensa no logran combatir el desafío patógeno.
Por otro lado, los enfoques metagenómicos y metaproteómicos permiten caracterizar la microbiota asociada a la mucosa de la piel o al intestino de los peces, desentrañando así genes o proteínas clave en la función inmunitaria, que pueden actuar como todo el biosistema a través de redes complejas durante las interacciones huésped-patógeno de los peces.
Una ventaja adicional e importante de estas herramientas es la posibilidad de acceder a especies no cultivables cuya identidad y función permanecerían de otro modo desconocidas.
Estrategias basadas en la ómica y redes de interacción proteínaproteína (PPI)
La integración de la proteómica con otros enfoques basados en la ómica, puede utilizarse para modelar redes capaces de predecir la dinámica de las interacciones entre los biocomponentes celulares implicados en las respuestas inmunitarias de los peces, para fomentar nuevas estrategias terapéuticas en la acuicultura.
Las redes de PPI pueden ofrecer una visión única de las interacciones huésped-patógeno y coinfección de patógenos, identificando biomarcadores eficaces de salud/ enfermedad, acelerando así la aplicación de medidas de prevención, el tratamiento de las enfermedades de los peces y el desarrollo de vacunas.
La proteómica también se utiliza mucho para comprender la respuesta inmunitaria de los peces, las estrategias de supervivencia del patógeno y las interacciones entre los peces y el patógeno.
Como esta técnica puede mostrar la expresión diferencial de las proteínas identificadas en varias etapas del desarrollo de los peces y en diferentes condiciones de alimentación, estrés y enfermedad, proporciona una visión global de varias funciones del metabolismo de los peces.
Como ya se ha mencionado, las proteínas de la membrana externa son importantes para la patogenicidad. La inmunidad de los peces podría verse reducida ya que las proteínas de las bacterias son capaces de interactuar con las proteínas extracelulares.
Conclusiones
En general, podemos considerar a la proteómica como una herramienta muy prometedora para la investigación y el diagnóstico de la patología de los peces, ya que permite un enfoque más holístico de los procesos de patogénesis, proporcionando información importante sobre la identificación de patógenos y la caracterización de los mecanismos de virulencia y en las interacciones entre el huésped y el patógeno, iluminando nuevas rutas de respuesta al estrés y respuestas fisiológicas del huésped previamente desconocidas.
Sin embargo, el uso de la proteómica en la acuicultura de peces está todavía en sus inicios y se limita a algunos organismos secuenciados.
Esta es una traducción y versión divulgativa desarrollada por el equipo editorial de Panorama Acuícola Magazine del artículo original titulado “Fish Pathology Research and Diagnosis in Aquaculture of Farmed Fish; a Proteomics Perspective” autoría de Márcio Moreira, Denise Schrama, Ana Paula Farinha, Marco Cerqueira, Cláudia Raposo de Magalhães, Raquel Carrilho y Pedro Rodrigues que fue publicado a través de del journal Animals de MDPI durante enero de 2021 bajo una licencia de uso abierto Creative Commons 4.0. La versión original en inglés se encuentra disponible a través del link: https://doi. org/10.3390/ani11010125 Email de correspondencia con los autores: pmrodrig@ualg.pt
