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PROTOCOLO DE INVESTIGACIÓN

“DETERMINACIÓN DEL CRECIMIENTO BACTERIANO EN MODELOS DE CÁLCULO RENAL.”

INVESTIGADORES: FRANCO AVECILLA DENNYS ANDREA ESPINOSA PADRÓN LEILANI PAMELA RUIZ ARRIAGA MÓNICA

TUTOR: Dra. ADRIANA JHENY RODRÍGUEZ MENDEZ

AGOSTO 2011


ÍNDICE

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CAPÍTULO I: TÍTULO “DETERMINACIÓN DEL CRECIMIENTO BACTERIANO EN MODELOS DE CÁLCULOS RENALES”

CAPÍTULO II: MARCO TEÓRICO DEFINICIÓN DEL PROBLEMA ¿Cuál es el crecimiento bacteriano en modelos de cálculos renales?

ANTECEDENTES

Urolitiasis (Concepto) La urolitiasis o litiasis urinaria se define como la presencia de cálculos (piedras, arenillas) o conglomerados cristalinos en el interior de las vías urinarias, desde el cáliz renal, hasta la uretra1. Esta patología es frecuente a nivel mundial y año con año presenta molestias tanto en hombres como en mujeres, adultos y niños.

Epidemiología De acuerdo a la literatura universal, la presencia de urolitiasis en la población está involucrada en aspectos bilógicos como la edad, sexo, ubicación geográfica, y etnicidad, así como estilos de vida. Los hombres son más susceptibles a formar cálculos renales que las mujeres en una proporción de 1.3:1, en donde el riesgo de enfermedad, por lo general, parece aumentar hacia la cuarta o quinta década de vida; la mayor prevalencia de litiasis en los hombres entre los 70 a 74 años de edad ocurre en un 13.3%. Las mujeres experimentaron un pico de prevalencia en la sexta década del 7.0% 2, 3. En cuanto al factor étnico, la mayor prevalencia de cálculos renales fue encontrada entre la población blanca, con una prevalencia del 5.9%. Los pacientes hispanos y

3


afroamericanos poseen un menor riesgo de enfermedad con prevalencias de 2.6% y 1.7% 1, 2. En México la frecuencia de la litiasis renal es mayor a lo señalado en la literatura internacional. Esto se debe a la dureza del agua para consumo humano en algunas regiones de regiones de México y por los antecedentes heredofamiliares de litiasis renal 4. A pesar de que se han efectuado pocos estudios epidemiológicos de la urolitiasis. Otero y colaboradores reportaron que este padecimiento comprende 13% de todas las hospitalizaciones por enfermedad renal en el ámbito nacional en el Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS). Otra encuesta nacional efectuada en este mismo Instituto reportó una prevalencia de 2.4 casos de urolitiasis/10 000 habitantes derechohabientes, y menciona a los estados de Yucatán, Puebla y Quintana Roo como áreas endémicas, de las cuales Yucatán tuvo la prevalencia más elevada con 5.8 casos/10 000 derechohabientes 5.

Fisiopatología Un requisito previo para la formación de cálculos renales

es la agregación de

cristales; la interacción de factores químicos y físicos así como la sobresaturación en la orina o la presencia o ausencia de inhibidores de piedras juegan un papel importante en la litiasis. La sobresaturación (sobreabundancia de un soluto en una solución) de la orina urinaria es necesaria para la formación de cálculos clínicos. La orina es una solución mucho más compleja; cuando se alcanza un nivel de sobresaturación crítico se pueden formar núcleos de

cristal en las superficies existentes, tales como

membranas de células, restos celulares, cristales de otros cálculos , eritrocitos, y cilindros urinarios, a través de un proceso conocido como nucleación heterogénea 6. La aglomeración de los cristales es un mecanismo importante en la formación de cálculos. Cuando algunos núcleos cristalinos están presentes en una solución acuosa, las colisiones entre los cristales causados por agentes químicos o las fuerzas eléctricas pueden conducir a su agregación. 4


El proceso combinado de crecimiento de cristales y su agregación se ha establecido como una hipótesis en la patogénesis de la urolitiasis al formar cristales lo suficientemente grande como para ocluir la luz de los túbulos colectores 6. Los suplementos alimenticios de vitamina D son un factor de riesgo para la nefrolitiasis y la hipercaluria. No hay datos que sugieran que la corrección en la deficiencia de vitamina D en pacientes que sufren de cálculos renales de forma frecuente esté asociada con un incremento en la aparición de estos

7

.

Experimentalmente se han demostrado varios indicadores tempranos de la formación de cálculos renales, por ejemplo la baja excreción de oxalato en la orina. Esto se debe a que las bacterias que colonizan consumen oxalato en el colon, disminuyendo la cantidad de oxalato para reabsorción y en consecuencia disminuyendo la cantidad de lo que se secreta de éste en la orina 8 . Para evitar este proceso es importante mencionar algunos hábitos alimenticios para el decremento de frecuencia de litiasis son los siguientes: tomar la suficiente agua para obtener un volumen de orina de aproximadamente 2 L/d; Disminuir y de ser posible evitar las proteínas de origen animal, ya que causan litiasis a diferencia de las de origen vegetal; comer frutas y verduras a lo largo del día y evitar aquellas que posean oxalato; el consumo de productos lácteos aumenta la concentración de calcio, lo cual está relacionado con el aumento de sal en orina; la sal ingerida por persona es difícil de contabilizar en un experimento, sin embargo se sabe que ésta incrementa la calciuria y la sodiuria, los cuales se han relacionado con el acumulo de proteínas así como el incremento de cálculos renales. Otros factores igual de importantes relacionados con litiasis son el ejercicio primeramente, no se ha probado en tantos artículos esta teoría, sin embargo es evidente que el riesgo de cálculos es mayor en la inmovilidad y que el ejercicio tiene beneficios en la salud, por lo tanto los tendrá en esta patología. El segundo factor es la obesidad, debido a su alta concentración en grasas, las cuales estimulan la litiasis renal 9.

5


Cálculos renales: composición La gran mayoría de los pacientes con litiasis tiene cálculos compuestos de oxalato de calcio (65% -70%) o fosfato de calcio (16% -20%). Aproximadamente el 8% de los pacientes con cálculos compuestos de ácido úrico. Un 2% adicional de los pacientes presentan cálculos de cisteína 2. Frecuencia de los diversos tipos de cálculos renales Oxalato de calcio puro

36%-70%

Fosfato de calcio puro

6%-20%

Mixtos

Tabla .

11%-31%

Estruvita

6%-20%

Ácido úrico

6%-17%

Cisteína

0.5%-3%

García-Alvarado R, Mundo-Alegría AX. Litotripsia extracorpórea por ondas de choque en niños. A propósito de

un caso complicado. Acta Pediatr Mex. 2010; 31 (3): 95-101

La etiología de cada tipo de cálculo está muy bien descrita, sin embargo dentro de la presente investigación los más relevantes son los cálculos de estruvita.

Cálculos de estruvita Los cálculos de estruvita, también llamados cálculos de infección o infecciosos, están compuestos de fosfato de magnesio amónico, y son causados por bacterias que catabolizan la urea, produciendo dióxido de carbono y tornando

la orina

alcalina. Este estado alcalino deriva en la precipitación de apatita e hidroxiapatita y por lo tanto, la formación de un urolito. Los microorganismos más comunes son: Proteus, Klebsiella, Pseudomonas y Staphylococcus 3. Los cálculos de estruvita a menudo son bastante grandes en el momento del diagnóstico y pueden formar una gran masa sistema de recolección de una forma similar a los cuernos de un ciervo, de ahí el nombre común ''staghorn calculi'”. Los cálculos de estruvita, también denominados coraliformes, pueden desencadenar una infección del tracto urinario (UTI, por sus siglas en inglés). 6


7


Infección del tracto urinario (UTI) y su relación con el cálculo renal La UTI es una respuesta inflamatoria del urotelio a la invasión bacteriana que generalmente está asociada con bacteriuria (presencia de bacterias en la orina) y piuria (presencia de glóbulos blancos) 10. Una de las complicaciones de un cálculo renal es la obstrucción de la vía urinaria. La asociación de una obstrucción por cálculo, junto con una UTI es generalmente considerada una emergencia debido al riesgo de sepsis. Las bacterias se instalan en los intersticios de la piedra y, por lo general, mediante el establecimiento de un microambiente propio, se hacen difíciles o incluso imposibles de erradicar sin retirar del cálculo. Es difícil eliminar la infección ya que los organismos son inaccesibles en los intersticios del cálculo

2,11,12

.

Ciertas piedras son el resultado directo de las infecciones, específicamente piedras de carbonato de calcio. Algunos microorganismos mediante la alteración de su microambiente, facilitan la precipitación de sales, la promoción de la formación de cálculos de novo y por lo tanto la persistencia de la infección. Si las bacterias entran en contacto con otros tipos de piedras, establecen un nuevo nido de infección

10

.

Las bacterias colonizadas en los intersticios de los cálculos urinarios puede liberar endotoxinas (componente lipopolisacárido de la membrana de una bacteria Gramnegativa)

13

causando

durante e inmediatamente después de la manipulación de la piedra, el

síndrome

de

bacteriemia,

respuesta

inflamatoria

sistémica,

endotexemia, urosepsis, shock séptico, y eventualmente la muerte 12.

Bacterias Entre los antecedentes encontrados sobre este tema, se plantean en diversas ocasiones la existencia de casos clínicos que respaldan la preocupación de la comunidad médica sobre los efectos de la SWL en las bacterias de los cálculos renales. Las bacterias de las cuales se ha documentado su existencia en los cálculos es variada, la lista abarca: Candida albicans

14

(la cual le provocó endoftalmitis al

paciente), Salmonella entérica, 15 Stafilococo aureus, 15 E.coli 16. 8


Se cree que la razón por la que existen bacterias habitando el interior de los cálculos es el origen de estos (infección bacteriana del tracto urinario) lo cual explicaría

8

el por qué la mayoría de estas bacterias son Gram negativas. Su

subsecuente liberación es lo que conduce a una bacteriemia o septicemia.

Infecciones crónicas del tracto urinario por bacterias que catabolizan la urea, como Proteus, Pseudomonas, Providencia, Klebsiella, y Ureaplasma, puede conducir a la alcalinización de la orina, por lo general generan un pH superior a 7,2, lo que potencialmente resulta en la formación de cálculos de estruvita compuesto de fosfato amónico magnésico 2. E. coli es el microorganismo más frecuente en el intestino, más que los anaerobios, y es lógico pensar que es el más común en todo tipo de Infecciones urinarias, especialmente teniendo en cuenta las ventajas de supervivencia. Otro grupo de agentes patógenos que se incluyen en el grupo complicado son los hongos. La mayoría de los comunes de este grupo, por lejos, es el género Candida, con los albicans, tropicalis, y kruzei predominantemente. Estas formas de la levadura se encuentran con frecuencia en el tracto urinario como la colonización agente, en lugar de un organismo de la infección 12.

Modelos de cálculos Para efectos experimentales se han realizado dos tipos de modelos de cálculos, estos son pueden ser clasificados de forma general en Suaves (S) y Duros (H). De los cuales se elaboraron utilizando una mezcla de Cemento Gypsum (Estados Unidos Corp Gypsum Chicago IL) y Velmix-stone con agua destilada y utilizando una batidora manual. (Velmix. Stone es un polvo rosado de sulfato de calcio con una solubilidad de 0.26% que es frecuentemente usado por dentistas) 15. La mezcla fue colocada en una serie de pequeños moldes cilíndricos estériles y se dejaron secar por 90 min a una temperatura de 36°C (±1 °C) El tiempo de mezclado y secado se mantuvo constante, La longitud y el diámetro de los modelos fue de 7.30 ±0.05 mm y 8.00 ±0.05 mm, respectivamente. Los cálculos fueron pesados en una báscula de precisión. El peso de los cálculos S y H “no infectados” fue de 0.64 9


gr ±0.001 gr y 0.76 gr ± 0.02 gr, respectivamente. Fueron seleccionadas dimensiones relativamente pequeñas para los modelos, porque el tamaño focal del litotríptico piezoeléctrico es pequeño. Esto asegura mejor reproductividad, porque un alto porcentaje de fragmentos de cálculo y bacterias se encontraban dentro del volumen focal durante el tratamiento.

Modelos de cálculos renales inoculados con bacterias Una cepa de Salmonella entérica serovar Typhimurium ATCC (Colecciones de Cultivo Tipo Americano) 14028 fue usada para inocular una serie de cálculos renales artificiales. Todos los modelos inoculados fueron manufacturados como se explica en la sección previa, aún así, en este caso se utilizó solución salina isotónica que contenía las bacterias en lugar de agua destilada. Todos los utensilios microbiológicos usados fueron adquiridos de Bixon (Becton Dikinson, Mexico). Los microorganismos fueron almacenados en un agar nutritivo (Merk GmbH, Darmstadt, Alemania). La cepa fue activada por incubación en brotes de soya suplementados con 0.6% de extracto de levaduras (TSBY) a 35°C por 24 horas. Las bacterias fueron inoculadas en el mismo medio y se mantuvieron en una fase

estacionaria

de

crecimiento.

Las

bacterias

fueron

recolectadas

por

centrifugación usando una centrifuga Van Guard V6000 (Hamilton Bell Co., Inc, Montvale, NJ) a 3400 revoluciones por minuto por diez minutos a temperatura ambiente y en una re-suspensión en 0.8% de solución salina isotónica 15.

Porcentaje de componentes usados en la elaboración de los dos tipos de cálculos renales artificiales Componente

Cálculos suaves

Cálculos duros

Vel –mix Stone

1%

20%

Cemento Gypsum

49%

30%

Agua destilada

50%

50%

Tabla Quintero M., Álvarez, M.S., Wacher C., Gutiérrez J., Castaño-Tostado E., Fernández F., Loske, A., Interaction of Shockwaves with Infected Kidney Stones:Is There a Bactericidal Effect?. JOURNAL OF ENDOUROLOGY. 2008 Ago; 22:08

10


Tratamiento: Litotricia El término litotricia se deriva de la palabra griega ''lith” piedra' y” tripsis'' que significa aplastar

17

. La litotricia es realizada por medio de un dispositivo denominado

litotriptor, el cual es utilizado para fragmentar y retirar urolitos en el tracto urinario superior, por medio de la técnica de litotricia por ondas de choque. La ESWL (Litotripsia Extracorpórea por ondas de choque, por sus siglas en inglés) se puede utilizar para fragmentar y retirar urolitos en el tracto urinario superior, mientras que litotricia intracorpórea con láser se puede utilizar para fragmentar urolitos en el tracto urinario inferior por uretrocistoscopía. Previo a su existencia, existían otras opciones, como la intervención quirúrgica, también conocida como litotripsia intracorpórea

El índice de infección urinaria

posterior al tratamiento de litotripsia intracorpórea está entre 1 y 2%

18

; entre las

ventajas que se pueden mencionar de la SWL frente a la litotripsia intracorpórea se encuentran: el poder prescindir de la anestesia general así como la disminución del daño al tejido; esto se debe a la naturaleza poco invasiva de la SWL

Litotricia extracorpórea por ondas de choque (ESWL) El tratamiento de litotricia extracorpórea con ondas de choque (ESWL) ha venido a revolucionar la forma en la que se trata a los pacientes que sufren de cálculos renales. La satisfacción de pacientes basada en dolor, síntomas de invalidez, costo y estado libre de piedras ha sido en todos los casos mayor en pacientes tratados mediante ESWL que en pacientes tratados mediante ureteroscopía y otros métodos de eliminación de cálculos 19. ESWL se refiere a la fragmentación de los cálculos renales con ondas de choque de alta energía generadas fuera del cuerpo. Los fragmentos resultantes -- urolitos pequeños-- pueden pasar de forma espontánea usando la orina como medio de transporte a través de la vía excretora 17.

11


Efectividad de ESWL en la clínica Los métodos de eliminación de cálculos renales conocidos son: litotricia extracorpórea mediante ondas de choque, ureteroscopía, nefrolitotomía percutánea, cirugía abierta. En las pasadas décadas ha habido un incremento de efectividad en el correcto tratamiento de la urolitiasis. Los más comunes han sido la uteroscopía, la nefrolitomía percutánea y la litotricia mediante ondas de choque, las cuales han venido a reemplazar la cirugía abierta. La litotricia extracorpórea in situ y la ureteroscopía (URS) son las dos opciones terapéuticas más utilizadas para el tratamiento de la litiasis ureteral. Dependiendo de la localización o el tamaño del cálculo, alcanzan una resolutividad entre el 6386%, en el caso de la litotricia, y entre el 57–92%, en el caso de la URS. Ninguna de las dos está exenta de complicaciones, situándose la frecuencia por debajo del 1% en ambos casos 20. La litotricia extracorpórea mediante choques de onda se ha reportado exitosa desde 1980 y gracias a esto han disminuido las cirugías invasivas para su estirpe, la cual tiene varios riesgos para el paciente

21

. En primer lugar, la tasa de eliminación de

piedras después de una ESWL ha sido en promedio un 71% a 90%, 73% a 91% y 25% a 85% en piedras localizadas en la parte superior, medio y bajo del cáliz, respectivamente 22. Un cálculo renal debe de tener ciertas características ideales para poder ser destruido correctamente mediante ESWL, tales como: densidad baja: (94% de los pacientes tratados) de cálculos con menos de 500 unidades de Hounsfield. Menor y mediano diámetro (92 y 74%) han sido correctamente tratados mediante ESWL. En cuanto a la localización ha sido demostrado que hay mayor en piedras distantes del cáliz renal 23. Numerosos estudios han descrito factores predictivos de éxito preoperatorio para ESWL, basados principalmente en los hallazgos de la TAC sin contraste. Se han descrito como factores de éxito la distancia piel-cálculo (DPC), la densidad del cálculo (determinados en la TAC sin contraste), así como el índice de masa corporal (IMC). Sin embargo, como consecuencia de una gran heterogeneidad en las definiciones de desenlace, se han publicado diferentes tasas de éxito (46-91%) 12


dependiendo del número de sesiones realizadas y del tiempo de seguimiento. Por otro lado, y probablemente más relevante, no existe consenso en la definición de éxito. Algunos autores han definido el éxito de una ESWL como la ausencia de cálculos o fragmentos residuales insignificantes en la radiografía simple a las 6 semanas después de una única sesión. Otros lo han definido como la ausencia de cálculos o fragmentos menores de 4 mm después del tercer mes posterior al último tratamiento, con un máximo de tres sesiones 24. Se considera indicada la técnica de ESWL como monoterapia para la resolución de las litiasis ureterales mayores de 10 mm, ya que se logró 96,6% de éxito, a un bajo número promedio de sesiones y sin complicaciones significativas 25. A pesar del éxito de estos nuevos tratamientos, aún hay retos que superar para perfeccionar estas técnicas ya que la eliminación de cálculos renales mediante ondas de choque o nefrolitomía percutánea no puede ser usado en pacientes diabéticos o personas embarazadas ya que es muy probable la presencia de una hemorragia 21. La ESWL no puede remover el cálculo de una vez, por lo tanto LP es un tratamiento ideal para pacientes que necesiten la desaparición del cálculo en una sesión. También es útil para pacientes con antecedentes de patologías pélvicas. Este procedimiento está asociado a un alto índice de éxito de un estado libre de cálculos (80%) 26.

Ciertas limitaciones de la ESWL como el índice de masa corporal del paciente o ciertas características del propio cálculo podrían limitar su efectividad, sin embargo la característica de ser mínimamente invasiva sigue dándole fama 27. El porcentaje de fragmentación de la piedra ha tendido a aumentar a medida que se disminuye la frecuencia de la onda; observaciones hechas tanto en estudios in vivo como in vitro. El enfoque contemporáneo sobre utilizar una frecuencia a menos de 120 ondas de choque por minuto durante la ESWL ha demostrado que la disminución de la tasa de la onda de choque puede mejorar la fragmentación de la

13


piedra. El reto ahora es encontrar una frecuencia de onda que permita inactivar las bacterias sin perder el efecto de la fragmentación óptima del cálculo 22.

Contraindicaciones Las contraindicaciones para ESWL incluyen el embarazo, la coagulopatía no corregida, obstrucción de uréter distal, y urinarias no tratadas Infección de las vías. La ESWL puede ser limitado en pacientes con obesidad, ya que su peso podrá exceder los límites de la mesa, su tamaño puede superar longitud focal del litotriptor, o impedir la visualización de piedra adecuada en el momento de ESWL 21,27

. Daño colateral en ESWL

Las ondas de choque tiene la capacidad de fragmentar cálculos renales con ciertas características, sin embrago observaciones importantes denotan que dichas ondas pueden provocar un daño a los tejidos cercanos. Las ondas de choque extracorpóreas son conocidas por inducir cambios agudos y estructurales en los riñones de los pacientes tratados. Los dos efectos secundarios renales más comunes después de SWL son hemorragia y edema, del o alrededor del riñón. Existen casos reportados aislados de hematoma hepático cuando ESWL es practicado en el riñón derecho. Factores de riesgo definidos para hematoma renal después de ESWL

son

hipertensión preexistente y el uso de compuestos que contengan ácido acetilsalicílico. No hay correlación entre el número de ondas de choque o la potencia de las mismas 28. El índice de bacteriuria después de ESWL es de 5%, mientras que el índice de urosepsis es menor al 1%. Endocarditis después de la litotripsia ha sido reportada previamente solo una vez 29. A principios de los setenta se estudió más a fondo el posible trauma a células y tejidos, encontrándose que después de la exposición de los eritrocitos a las ondas de choque se producía una hemolisis mínima; se realizaron incontables estudios para identificar cualquier daño microscópico sobre los riñones. Las investigaciones

14


con cultivos de células tumorales mostraron efectos de membrana y no hubo daño a los cultivos celulares 30. También se realizaron estudios con el fin de observar daño tisular en túbulos renales, usando marcadores a enzimas representativas de dicho daño en la orina como la fosfatasa alcalina, la cual está presente en la superficie de los túbulos proximales con borde de cepillo. Esta investigación efectivamente estuvo en la orina demostrando una lesión en los túbulos renales, que después se comprobó mediante pruebas histológicas 31. A pesar del daño reportado, que el tratamiento mediante ESWL es mínimo, ya que se probó la posibilidad de realizar otros métodos tales como la nefrolitotomía percutánea posterior a una ESWL fallida 32.

Ondas de choque Existe un principio físico que determina la aparición del conocimiento acerca de las ondas de choque. El proceso físico que aparece en un medio líquido tras la caída de una gota de agua produce una perturbación; la gota al golpear la superficie, pasa su energía a las moléculas del medio produciendo su aceleración. Si se produjera una perturbación por medio de un voltaje eléctrico en las moléculas de agua, el movimiento ondulatorio producido provocaría un cambio agudo en la presión, temperatura y densidad del medio acuoso. Una perturbación extremadamente delgada que viaja a velocidades supersónicas y presenta modificaciones en sus propiedades termodinámicas es llamada onda de choque

33

.

Las ondas de choque son impulsos mecánicos cortos, que se caracterizan por un incremento extremadamente rápido en la presión. Pueden ser generadas por una chispa bajo el agua, que a su vez es producida cuando existe un arco de alto voltaje entre dos electrodos. La posterior evaporización del agua que lo rodea por la “explosión” genera una onda de choque, que se disemina en todas direcciones 34.

15


Mecanismo de acción de la onda de choque Al llegar la onda de choque al cálculo renal se encuentra con una resistencia que provoca que una parte de la misma onda se refleje, otra sea absorbida y otra se transmita. El choque entre zonas de distinta impedancia acústica (resistencia que opone un medio a las ondas que se propagan sobre éste) produce en la zona anterior del cálculo una fuerza de compresión y en la zona posterior se produce una fuerza de tensión con un rebote parcial de la onda inicial; la onda reflejada se superpone a la siguiente sumando las presiones dentro del cálculo. Esta onda es llamada onda de tracción, ya que, al oponerse a la onda de presión provoca la fragmentación del cálculo. En la parte anterior del cálculo se produce erosión por cavitación: al originar distintos gradientes de presión, se forman burbujas de vapor de agua, que se expanden rápidamente y posteriormente se colapsan súbitamente y liberan ondas de choque de alta presión que explotan sobre la superficie

4, 22

.

Litotriptores Como se mencionó anteriormente, la litotricia es llevada a cabo por medio de un litotriptor y dentro de la técnica de las ondas de choque existen varios tipos de litotriptores capaces de generar ondas de choque, sin embargo difieren en su mecanismo de acción y por ello puede inferirse que algunos son más efectivos que otros, o bien, más apropiados para ciertas situaciones. Un litotriptor es un dispositivo de trituración o de desintegración de urolitos. Un litotriptor de onda de choque incluye una fuente de energía para la generación de las ondas de choque, un dispositivo de enfoque para concentrar la energía de ondas de choque a una zona central, un medio de acoplamiento para transmitir las ondas de choque desde el generador hasta el urolito en el cuerpo del paciente, y un sistema de imagen (fluoroscopía o ecografía) para situar la urolitos dentro de la zona focal 17. En la mayoría de los litotriptores las ondas de choque se generan en el agua, y son dirigidas paciente mediante una membrana flexible que se concentra en el punto en el que se encuentra el cálculo para fragmentarlo. Un litotriptor electrohidráulico genera la onda de choque por acción de un electrodo que produce una intensa descarga eléctrica en un medio líquido y crea ondas por la 16


vaporización que causa y que se reflejan de forma divergente en una semielipse metálica; esto permite reorientarlas a la zona del cálculo 4. El litotriptor piezoeléctrico: utiliza la energía piezoeléctrica y produce una onda de choque al pasar una corriente eléctrica por unas bandejas semiesféricas cubierta de cristales piezoeléctricos cerámicos alineados, que induce presión elevada en un pequeño punto focal. Su punto focal de impacto es de 1-2mm. Su desventaja es que la fuente de energía tiene gran diámetro y en ocasiones son necesarias varias sesiones para fragmentar el cálculo 4. La acción del litotriptor electromagnético se basa en el desplazamiento retrógrado de una membrana metálica colocada dentro de un tubo donde una bobina plana genera una corriente magnética al ser excitada por una descarga eléctrica. La membrana metálica está cargada eléctricamente del mismo signo que la bobina; al pasar la corriente magnética se desplaza con un movimiento brusco de repulsión, lo que genera presión suficiente para formar la onda de choque 4.

Litotricia extracorpórea por ondas de choque: posible manejo de cálculos renales e infecciones Entre las desventajas de la SWL se encuentran la producción de infecciones posteriores a su intervención; las cuales, aunque poco comunes (1% -2%)

18

representan un problema grave de salud para las personas que lo padecen ya que el índice de mortalidad puede alcanzar rangos tan altos que van desde el 66%- 80% 15, 35

.

A diferencia de los pacientes con pequeñas piedras de calcio, los cálculos infectados tienden a ser insidiosos y crónicos en su formación y por lo general no se presentan con el cólico renal agudo con frecuencia visto con una piedra de obstrucción ureteral. En su lugar, los cálculos coraliformes generalmente se desarrollan en el sistema colector renal y permanecen allí hasta el diagnóstico. Mientras que muchos pacientes son asintomáticos, otros pueden presentar infección del tracto urinario recurrente, hematuria, dolor abdominal vago, fiebre, y urosepsis.

17


La historia natural de la enfermedad de cálculo en asta de ciervo es uno de morbilidad y mortalidad progresiva. En 1976, y Blandy Singh reportaron un alarmante 10 años tasa de mortalidad de 28%

36

.

Existe controversia en cuanto a la incidencia de IU después de litotricia, Schaeffer & Schaeffer informan infecciones en un rango de 0% a 28% sin profilaxis antimicrobiana

10

. Paterson por su aparte declara que la infección previa a un SWL

puede ser difícil de erradicar, sin embargo se ha observado que en un SWL no hay presencia de complicaciones por sepsis, por lo tanto no es necesario dar antibióticos 37

.

Las complicaciones antes mencionadas de una infección urinaria, ponen en riesgo al paciente; por ello se ha comenzado a trabajar en la idea de utilizar la misma onda de

choque

tanto

para

la

fragmentación

de

cálculos

como

para

la

inactivación/destrucción de bacterias que inoculan dichos urolitos. Si bien, esta propiedad de las ondas de choque no ha sido probada con éxito, se tienen registros de algunos experimentos.

Efecto bactericida de litotripsia La eficacia del SWL frente a otro tipo de tratamiento no es lo que se pone en discusión en esta investigación; lo que se pretende es establecer el efecto de ésta y por lo tanto de su relación con las bacterias que habitan los cálculos renales. Ya que desafortunadamente es muy poco lo que se conoce en el efecto bactericida de las ondas de choque y los resultados son controversiales aun cuando se cree que aproximadamente el 15% de los cálculos renales son causados debido a una infección bacteriana de las vías urinarias 15. Con este antecedente se predice un probable efecto bactericida en la SWL debido a la ausencia de sepsis al aplicarla y a la escasa necesidad de una administración posterior de antibiótico. En investigaciones anteriores se observó este efecto en dos bacterias importantes: Staphyloccocus aureus y Escherichia coli.

18


Se usó un litotriptor modificado a pequeños especímenes, escogiendo a S. aureus por su gran resistencia. Se utilizaron tubos PVC para contener a las bacterias a analizar. Realizando 4 experimentos, los primeros 3 fueron diseñados para evaluar el efecto que tenía en las bacterias S. aureus las ondas de choque y el cuarto para probar el efecto de diferentes cantidades de ondas de choque en la supervivencia bacteriana. Se observó un decremento en la viabilidad bacteriana de S. aureus con el aumento de ondas de choque dadas. Se demostró que la aplicación de energía ultrasónica puede ser bien usada para la desintegración de bacterias Gram-negativas y mico bacterias particularmente 38. Lo que llevó a pensar que sería un buen uso en el ser humano, a causa de su utilización in-vitro con ayuda de tubos PVC. Este método garantiza el tratamiento de infecciones bacterianas crónicas resistentes a antibacteriales potentes. Posteriormente, la observada reducción en infecciones renales después de una litotricia extracorpórea mediante ondas de choque, lleva a realizar el experimento bajo el agua, ya que en ésta permite la expansión de ondas de choque en una mayor cantidad además de evitar que el calor se eleve en la muestra. Se observó que como efecto colateral, las ondas de choque producen un fenómeno llamado cavitación, el cual es bien conocido como un efecto bactericida, lo que va a depender de la presión del medio y de la aparición de microburbujas en el líquido 39. La cavitación se explica mencionando que en la orina que rodea a los cálculos se encuentran pequeñas burbujas (1mm de diámetro aprox.) y estas son comprimidas por la presión de la onda de choque, pero después de que esta cesa, las burbujas continúan creciendo, y agua y vapor pueden difundirse dentro de ellas hasta que colapsan por la extremadamente baja presión dentro de ellas y cuando esto sucede crean ondas de choque secundarias y microjets con velocidades superiores a los 400 m/s. La velocidad del microjet podría explicar el efecto bactericida de la SWL 15. Se han documentado que existen otros factores que influyen en el efecto de la cavitación

16

. La cavitación depende del contenido de gases disueltos, viscosidad,

superficie de tensión, temperatura del líquido y presión aplicada. Además de 19


depender de la concentración de microorganismos. Si la densidad de la bacteria dentro del organismo esta incrementada una sola burbuja colapsante afectaría más bacterias. Gracias a esto y a pesar de experimentos fallidos pasados, se observó una parcial inactivación en la bacteria E. coli. Contrario con anteriores investigaciones, se demostró que la amplitud en la presión de la onda de choque aplicada no es un factor significativo, por otro lado, la radiación contribuye en mayor medida. Y sobre todo, la cavitación es el fenómeno más importante, ésta es producida por un cambio súbito en la presión generada. La reducción de viabilidad en E. coli se debe a factores como la temperatura, el número de ondas de choque aplicadas, la cavitación inducida y la radiación 39. Uno de los factores controversiales en la teoría de la naturaleza bactericida del SWL es que en los estudios realizados se utilizan sistemas que producen ondas de choque por términos de descargas de alto voltaje en el agua. Las luces visibles y ultravioleta provenientes del aparato fueron identificadas como el mecanismo más potente en la inactivación bacteriana. Como este tipo de radiación no puede penetrar al cuerpo del paciente, no debe ser considerada como el efecto bactericida durante el SWL. En la aplicación clínica solo a la acción directa de las ondas de choque y la cavitación acústica se les puede atribuir el decremento bacterial 16. Sería de esperarse que E. coli, al ser una bacteria gramnegativa, fuera más susceptible a las ondas de choque, sin embargo se observó que una bacteria Gram positiva es más susceptible que una gramnegativa. Cuando se da la onda de choque, aparecen microburbujas que primero se hacen pequeñas, para después explotar violentamente con una energía extremadamente alta y produce microjets con una gran velocidad, lo que contribuye a la fragmentación de las piedras renales 40. Además existen diversos experimentos en los cuales se plantea la posibilidad de que al exponer al cálculo a ondas de choque de tipo tándem, el efecto bactericida aumente. 20


Esto se explica porque se ha reportado que el colapso de las burbujas puede ser incrementada si se manda una segunda onda de choque en el momento en el que las burbujas (producida por la onda de choque previa) empiezan a colapsar. Experimentos en vivo y en vitro indican que las ondas de choque llamadas tándem incrementan a calidad de la destrucción de los cálculos renales sin incrementar el daño del tejido. El espacio de tiempo más conveniente entre cada onda de choque depende del tipo de generador de onda, las características del cálculo y las propiedades del fluido que lo rodea. Dentro de los tejidos blandos, el crecimiento de las burbujas es uniforme y el colapso no es tan violento 16. Los mecanismos de inactivación de las bacterias son todavía desconocidos, pero es probable que la onda de choque generada por la cavitación y el estrés mecánico producido, produzcan agujeros en la membrana de las células, concluyéndose que la ESWL inactiva las bacterias por lisis 41. Además de los efectos bactericidas del SWL se ha hecho una amplia investigación en si éste es un efecto deseable o no. Ya que la destrucción de la pared celular de las bacterias podría provocar una liberación de sus endotoxinas, como se comentó anteriormente. La profilaxis para este efecto puede ser el uso de antibióticos previos al tratamiento con SWL 14. La reducción de la tasa de infecciones urinarias después de litotricia fue de un 5,7% al 2,1%. Antecedentes de una infección urinaria reciente o de enfermedades de cálculos infecciosos garantiza un tratamiento completo de antibióticos antes de litotricia 10.

JUSTIFICACIÓN La urolitiasis es una enfermedad con una prevalencia en nuestro de país de 13% de todas las hospitalizaciones por enfermedad renal en el ámbito nacional en el Instituto Mexicano del Seguro Social.

5

Algunos de los cálculos renales formados

son inoculados por bacterias y generan en el paciente una infección de vías urinarias si no son tratados, por ello, es preciso contar con un registro estricto de su crecimiento dentro del mismo cálculo, es decir, bajo qué condiciones es viable su existencia, así como los factores que pueden influir para su desarrollo e incluso reincidencia. Uno de los tratamientos más comunes utilizados en la clínica para el tratamiento de cálculos renales es la litotricia extracorpórea por ondas de choque. 21


Se ha observado que después de un tratamiento con litotricia, las bacterias que inoculan el cálculo quedan libres en el huésped teniendo la capacidad para generar una septicemia en un porcentaje de hasta 28% de los casos

10

; sin embargo, no se

sabe con certeza en qué cantidades son potencialmente peligrosas. Nuestra investigación podrá servir de pauta para determinar en un momento determinado si las ondas de choque tienen un efecto bactericida importante además del efecto en la fragmentación del cálculo 42. Tenemos la oportunidad de trabajar con investigadores expertos en la materia y con los recursos necesarios para llevar a cabo los diversos experimentos.

OBEJTIVO GENERAL Determinar el crecimiento bacteriano y curva de crecimiento en modelos de cálculos renales.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS Determinar la cantidad de bacterias inoculadas en el modelo de cálculo renal. Determinar la curva de crecimiento de E. coli en modelos de cálculos renales.

CAPÍTULO III: MATERIAL Y MÉTODOS DISEÑO El diseño de la investigación es experimental, trasversal, descriptivo y prospectivo.

DEFINICIÓN DEL UNIVERSO Cepa de E.coli ATC 25990 en modelos de cálculos renales.

CRITERIOS DE INCLUSIÓN Modelos de cálculos renales inoculados con cepas de E.coli ATC 25990.

CRITERIOS DE EXCLUSIÓN Modelos de cálculos renales contaminados con bacterias diferentes a E.coli ATC 25990 antes de su incubación.

CRITERIOS DE ELIMINACIÓN Modelos de cálculos renales contaminados con bacterias diferentes a E. coli ATC 25990.

22


DEFINICIÓN DE VARIABLES Y UNIDADES DE MEDIDA VARIABLE Colonia bacteriana de E.coli ATC 25990

DEFINICIÓN

DEFINICIÓN

TIPO DE

CONCEPTUAL

OPERACIONAL

VARIABLE

Conteo de colonias

Cuantitativa

ESCALA

UNIDAD DE MEDIDA

Formación macroscópicamente

Intervalo

UFC/ml

visible de bacterias

SELECCIÓN DE LAS FUENTES, MÉTODOS, TÉCNICAS Y PROCEDIMIENTOS DE RECOLECCIÓN DE LA INFORMACIÓN Se solicitará la autorización al laboratorio de la Facultad de Química para acudir a realizar los modelos de cálculos renales. Se contará con la cepa de E.coli ATC 25990 proporcionada por el instituto FATA . Se estandarizará la composición de los modelos de cálculos renales siguiendo las técnicas previamente diseñadas y posteriormente se fabricarán los mismos.

La

técnica de modelado requiere la mezcla de 45% de yeso de cemento y un 5% Velmix-piedra con un 50% agua destilada, usando una batidora de mano. La mezcla es colocada en moldes cilíndricos y se espera a que solidifiquen durante 4 horas a 30°C. La longitud y el diámetro de las piedras es 10 ± 0.2 mm, y 10 ± 0,1 mm, respectivamente. La media de peso de los modelos es 0,785 ± 0.012 g. Una vez estandarizada la fabricación de los modelos, éstos se inocularán con una cepa de E.coli ATC 25990 mediante la siguiente técnica: Todas las piedras infectadas se fabrican tal como se explica en la sección anterior, sin embargo, para lograr inocularlas se incluye en la fórmula una salina que contiene E. coli en lugar de agua destilada. El recuento inicial de viables se acerca a 2.34 x 10 7 unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC / ml) y se utiliza 0,01% de inóculo de la suspensión bacteriana para inocular los modelos, se dejan incubar secándose durante 4 horas cerca de dos quemadores a unos 30°C, y se utilizan de inmediato. Después de la incubación de los modelos, se procederá a contar las colonias de E.coli ATC 25990 presentes como sigue: un conjunto de modelos es aplastado con una prensa manual para determinar las variaciones en la cantidad de bacterias inoculadas dentro de los cálculos; finalmente se realizará la curva de crecimiento de la cepa 23


Es importante remarcar el uso de técnicas de higiene apropiadas para evitar la contaminación de los modelos utilizando guantes, cubre bocas y bata durante la fabricación, incubación y manejo de los cálculos.

PRUEBA PILOTO Se fabricará un modelo de cálculo renal mediante las técnicas antes descritas y con la adecuada capacitación para estandarizar la composición de los mismos, además de su posterior inoculación e incubación con el objeto de determinar un crecimiento de E.coli ATC 25990 óptimo.

DEFINICIÓN DE PLAN DE PROCESAMIENTO Y PRESENTACIÓN DE LA INFORMACIÓN Se resguardará la información en una bitácora a la que sólo tendremos acceso los participantes involucrados. A los resultados obtenidos se les realizará análisis para graficar la curva de crecimiento de E.coli ATC 25990. Los resultados se presentarán en gráficas y cuadros.

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shock

waves

on

bacteria.

Shock

Waves

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CAPÍTULO IV: ORGANIZACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN PROGRAMA DE TRABAJO ACTIVIDAD Desarrollo y revisión del tema de investigación. Revisión de la literatura y elaboración de fichas de resumen Elaboración del protocolo Revisión del protocolo. Acudir a laboratorio de FATA

Agosto 2011 Septiembre 2011 Septiembre 2011 Noviembre 2011 Noviembre 2011

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Concentración de la información en bitácoras Análisis de la información. Descripción de resultados. Revisión de informe técnico Presentación de informe técnico

Noviembre 2011- Enero 2012 Enero 2012 Febrero 2012 Marzo 2012 Marzo 2012

RECURSOS HUMANOS •

Franco Avecilla Dennys Andrea o Estudiante de la Facultad de Medicina de la Universidad Autónoma de Querétaro o Redacción o Registro en bitácora o Elaboración de modelos de cálculo renal

Espinoza Padrón Leilani Pamela o Estudiante de la Facultad de Medicina de la Universidad Autónoma de Querétaro o Redacción o Registro en bitácora o Elaboración de modelos de cálculo renal

Ruiz Arriaga Mónica o Estudiante de la Facultad de Medicina de la Universidad Autónoma de Querétaro o Redacción o Registro en bitácora o Elaboración de modelos de cálculo renal

Director de investigación: •

Dra. Adriana Jheny Rodríguez Méndez o Laboratorio de Inmunología Celular y Molecular o Departamento de Investigación Biomédica

RECURSOS MATERIALES Producto

Precio

Unidades

Subtotal

Matraz Erlen Meyer

$100

5

$500 28


Yeso Velmix

$300

6

$1800

Gradilla de acero inoxidable

$500

2

$1000

Cajas de Petri

$40

20

$800

Medio de cultivo

$120

15

$1800

Jeringa

$1.5

100

$150

Incubadora

$1800

2

$3600

Contador de colonias de bacterias

$1500

2

$3000

Agua destilada

$80

10

$800

Total

$13,450

PREUPUESTO

Aproximadamente $13,000 MXN para la elaboración de 100 modelos de cálculo renal

DIFUSIÓN Foro interno en la Facultad de Medicina de la Universidad Autónoma de Querétaro

CAPÍTULO V: DATOS DE IDENTIFICACIÓN a. DATOS DE LA INSTITUCIÓN Universidad Autónoma de Querétaro Facultad de Medicina Clavel N° 200 Col. Prados de la capilla CP. 76170 Tel. (442)1921200 ext. 6200, 6201 b. DATOS DE LOS INVESTIGADORES •

Dra. Adriana Jheny Rodríguez Méndez o Laboratorio de Inmunología Celular y Molecular o Departamento de Investigación Biomédica

29


Franco Avecilla Dennys Andrea. Estudiante de la licenciatura en medicina FMUAQ.

Espinosa Padrón Leilani Pamela. Estudiante de la licenciatura en medicina FMUAQ.

Ruiz Arriaga Mónica. Estudiante de la licenciatura en medicina FMUAQ.

c. DATOS DE LA INVESTIGACIÓN “Determinación de crecimiento bacteriano en modelos de cálculos renales.” Universidad Autónoma de Querétaro, Facultad de Medicina. México, 2011.

30


CAPÍTULO VI: FIRMA DEL INVESTIGADOR PRINCIPAL E INVESTIGADORES ASOCIADOS INVESTIGADORES

_____________________________ Franco Avecilla Dennys Andrea

_____________________________ Espinoza Padrón Leilani Pamela

_____________________________ Ruiz Arriaga Mónica

DIRECTOR DE INVESTIGACIÓN

______________________________ Dra. Adriana Jheny Rodríguez Méndez

31

Marco teórico corregidopablo