Issuu on Google+

B GIÁO D

O IH

B YT C HÀ N I

B GIÁO D

O IH

B YT C HÀ N I

NGUY N TH H NG

NGUY N TH H NG

XÂY D NG TH I VITAMIN A, D, E TRONG S A CÔNG TH C VÀ TH C PH M B SUNG NG B NG HPLC VI CH

LU

C

HÀ N I 2016

CH C

XÂY D NG TH I VITAMIN A, D, E TRONG S A CÔNG TH C VÀ TH C PH M B SUNG VI CH NG B NG HPLC

LU

CH C

CHUYÊN NGÀNH: KI M NGHI M THU C

C CH T

MÃ S : 60720410

ng d n khoa h c: PGS.TS. Lê Th H ng H o PGS.TS. Ph m Th Thanh Hà

HÀ N I 2016


L IC Trong su t th i gian nghiên c u và hoàn thành lu cs

n

t n tình c a các th y cô giáo, các chuyên gia trong nhi

v c, các anh ch k thu

ng nghi p, b

V i lòng kính tr ng và bi

c, tôi xin g i l

.................................................................................................................... 1

n: PGS. TS Lê Th H ng H o và PGS.TS Ph m Th Thanh Hà là nh ng i th

ng d n, ch b

................................................................................................... 3

tôi trong su t quá trình ............................................................................... 3

h c t p và nghiên c u. Tôi xin g i l i c

n

an toàn v sinh th c ph m qu c gia, các anh, ch , em ki m nghi m viên t i ng ph gia & Ch t h tr ch bi n th c ph m cùng các anh, ch

khoa Ch

cán b phòng K ho ch

H p tác qu c t

và t o m

u

ki n thu n l i cho tôi trong su t th i gian làm th c nghi m t i Vi n. il ic

Hà N

n tình d y d

quan tâm và t

u ki

ih

c

tôi trong su t th i gian h c t p t

Cu i cùng, tôi xin chân thành c

1.2.

A, D, E ......................................................................... 4 ............................................................................... 4 ............................................................................... 5 ................................................................................ 5

y cô trong Ban Giám hi u, phòng

i h c cùng toàn th các th y cô các b

....................................... 3

o Vi n Ki m nghi m

p nghiên c

......................................................................... 7 ............................... 7

ng. ng viên,

....................................................................................................... 7 ......................................................................... 7

hoàn thành lu

............................................................. 12

Hà N

-VIS) ................................................... 12

Nguy n Th H ng

.................................................................................................... 12 ...................................................................................................... 13 ...................................................................................... 13 ................................. 16

............................................................. 16 ................................................................................... 16 ............................................................................... 16


2.2.1.

2

.......................................................................................... 18

............................................................. 36

.............................................................................. 18

................................................................................................................ 37

........................................................................... 18

............................................................................................................... 38

.............................................................................. 18

....................................................................................... 40

......................................................................... 19

..................................................................................................... 41

. 21

.................................................................................................... 41

......................................................................................... 22

............................................................................................................. 41

............................................................................ 23

....................................................................... 42

........................................................................ 23

....................................................................................... 43

................................................................................ 23

........................................................................................ 45

................................................................................................ 23 .......................................... 23 ........................................................................................................... 25 ................................................................................................. 25 ...................................................................................... 26 ân tích ................................................................. 27 ..................................................... 27 ......................................................................... 28 ................................................................................... 29 .................................................................................. 30 ................................................... 31 ............................................................................ 33 ................................................................................... 33 ............................................................................................................. 34 .................................................................................................. 35


DANH M C CÁC KÍ HI U, CÁC CH

VI T T T

DANH M C CÁC B NG Trang

AOAC:

(Association of Official Analytical Chemists) - Hi p h i các nhà

B ng 1.1. Tóm t t m t s

hóa h c phân tích

trong th c ph m và thu c ................................................................................. 9

ACN:

Acetonitril

B ng 1.2. M t s

BHT:

Butylate hydroxytoluenen

và trên th gi i .................................................................................................13

EtOH:

Ethanol

B ng 3.3. K t qu

p c a h th ng ................................33

GC:

S c ký khí

B ng 3.4. K t qu

nh kho ng tuy n tính ...............................................36

HPLC:

S c ký l ng hi

B ng 3.5. K t qu

nh LOD, LOQ ..........................................................37

ISO:

(International Organization for Standardization): T ch c tiêu

B ng 3.6. K t qu

l p l i.................................. ..................................37

chu n hóa qu c t

B ng 3.7. K t qu

thu h i c a vitamin A ....................................38

B ng 3.8. K t qu

thu h i c a vitamin D ....................................39

B ng 3.9. K t qu

thu h i c a vitamin E ....................................39

LOD:

(Limit of detection) - Gi i h n phát hi n

LOQ:

(Limit of quantitation)

MeOH:

Methanol

PA:

(Pure analysis)

PDA:

(Photo diod array)

ppm:

(part per million) ph n tri u

RSD:

(Relative standard deviation)

SD:

(Standard deviation)

STT:

S th t

TCVN:

Tiêu chu n Vi t Nam

THF:

Tetrahydrofuran.

UV-VIS:

(Ultra Violet

Gi i h

ng

lý m u phân tích vitamin A, D3, E

u ki n s c ký l ng phân tích vitamin A, D3, E

B ng 3.10. K t qu phân tích m t s m u trên th tinh khi t phân tích m ng diod quang

Visible)

l ch chu

l ch chu n

t ngo i kh ki n

i

Vi t Nam

ng ..............................40


DANH M C CÁC HÌNH

TV Trang

Hình 1.1. Công th c c u t o c a vitamin A, D3, E .........................................6 Hình 3.2. K t qu kh o sát t l dung môi pha Hình 3.3. K t qu kh o sát Hình 3.4. K t qu kh o sát t

ng c a nhi

ng th p, không cung c p

ng ......................................24 c t .................................25

dòng ..........................................................26

Hình 3.5. K t qu kh o sát hi u qu c

Vitamin là nh ng ch t h

n k t qu

ng .......28

ng trong các quá trình chuy n hóa c th , có

n s c kh e và b nh t t.

Tuy m

ch c n m

ng r t nh tính b ng miligam,

th m chí microgam, tuy nhiên thi u ho c th a các vitamin trong kh u ph

Hình 3.6. K t qu kh o sát

ng c a th tích KOH 20%/EtOH ............29

gây ra nhi u xáo tr n cho ho

Hình 3.7. K t qu kh o sát

ng c a nhi

b nh. Do v y vitamin có vai trò quan tr ng góp ph n duy trì cu c s ng, giúp

Hình 3.8. K t qu kh o sát

ng c a th i gian th y phân .....................31

kh e m nh.

Hình 3.9. K t qu kh o sát

ng c a dung môi chi t ............................32

Trong công nghi p th c ph m, nghiên c u phát tri n các d ng th c

th y phân ......................30

Hình 3.10. Quy trình x lý m u phân tích vitamin A, D, E ............................33 Hình 3.11. K t qu Hình 3.12. K t qu

HPLC................................................................................. .............................35

th m chí có th gây

ph m b sung vitamin và các vi ch

c hi u ........................................................34 tinh khi t c a pic trên ph n m m thi t b

ng hàng ngày c

thành m

c

u b i nh ng giá tr thi t y u c a s n ph m góp ph n ng nhu c u c a th

ng và h a h n mang l i nhi u l i nhu n cho các

nhà kinh doanh th c ph

c ki m nghi m th c

ph m ngày càng ti p nh n ki m nghi m nhi u lo i th c ph m b

sung

vitamin nói chung, vitamin tan trong d u (vitamin A, vitamin D, vitamin E) ng s n ph m trên th

ng theo yêu c u c a

n lý.

ng cao trong

th c ph m b sung, nên hi n nay có m t s

nh

ng th i hai lo

ng

ng th i c 3 lo i vitamin A, D, E trong th c ph m vì vitamin D có ho t l c m nh nên ch

c b sung v

c u xây d D, E trong th c ph

ng nh . Nghiên ng th i các vitamin A,

c bi t là các th c ph m có n n m u ph c t

công th c và th c ph m b sung vi ch

ng giúp ti t ki m th i gian,

hóa ch ki n các phòng thí nghi

a

n, d áp d

u

c là m t nhu c u thi t th c. Vì v y,

1


chúng tôi t p trung nghiên c

tài

ng

PH N 1. T NG QUAN

ng th i vitamin A, D, E trong s a công th c và th c ph m b sung vi v i nh ng m c tiêu sau:

ch - Xây d

ng th i vitamin A, D, E

trong s a công th c và th c ph m b sung vi ch -

ng d

1. T ng quan v

Vi t Nam.

1.1. Vai trò c

ng.

ng trên th

iv

Vitamin A có vai trò t o s c t võng m

ng cho phân tích vitamin A, D, E trong m t

s m u s a công th c, th c ph m b sung vi ch

ng nghiên c u

ng

cho quá trình bi t hóa các t bào bi u mô s toàn v n c

u và ch c

u ti t m t, c n thi t

da và niêm m c, có vai trò b o v

a bi u mô kh

, nh t là bi u mô

tr c a nhu mô m t. Cùng v i vitamin D, vitamin A có vai trò giúp cho s phát tri

c bi t

N u thi u vitamin A tr em s

m l n. Trên h mi n d ch,

vitamin A giúp phát tri n lách và tuy n có vai trò mi n d ch c vitamin A hàng ngày

tr em.

o ra lympho bào

ng h p các protein mi n d ch. Nhu c u i l n kho ng 750 - 1000 µg,

th a vitamin A gây ra tình tr

tr em là 300 µg.

ng, bu

,

ch m ch p, phù gai th , thóp ph ng, vài ngày ti p theo da bong toàn thân r i h i ph c d

ng thu c. Ð i v i ph n

u, n u

vitamin A m i ngày kéo dài d b d d ng thai nhi. Vitamin D có vai trò r t quan tr ng trong quá trình t d ng trên chuy n hóa các ch

y u là calci và phosphat.

u hòa n ru t không h

calci trong máu. Khi thi u vitmin D,

calci và phospho làm calci máu gi

ng t l

tác

nh calci máu nên gây h u qu là tr em ch m ng, ch m bi

il ns b

gãy. Ph n mang thai thi u vitamin D có th sinh ra tr khuy t t t trình bi t hóa t bào bi u mô và g

u v tác d ng c ch n ti

2

3

8].


Nhu c u vitamin D hàng ngày

i l n kho ng 2,5 µg,

tr em kho ng 10

Vì retinol có ho t tính sinh h c quan tr ng nh t và d ng ch y u chi m nên trong ph m vi lu

µg. Vitamin E có tác d ng ch ph n thi t y u trong t

n oxy hóa các thành n t o thành các s n ph ov

c

Vitamin A là nh ng tinh th ho c b n m ng màu vàng nh t, nóng ch y 63

64ºC, không

c, tan trong methanol, ethanol và m t s

tính toàn v n c a màng t bào. Khi thi u vitamin E có th g p các tri u

dung môi h

ch ng: r i lo n th n kinh, y

không b n v ng trong không khí, ánh sáng, nhi

giác, d t

t nhãn c u, gi m nh y c m v xúc

v h ng c u, d t

c bi t trên

n khi thi u vitamin E th y t

c, gây

vô sinh [8].

i l n c n kho ng 15 mg,

mg vitamin E.

tr em c n kho ng 7

th a vitamin E có th g p các tác d ng ph do y các t n h i do quá trình ôxy hóa gây ra và kh ng ch các

i

t t là vitamin A).

c h i),

b o v màng t bào kh i s t n công c a các g c t do, nh

này ch nghiên c u v

n

các ch t béo d b ho nhi

p nên vitamin A d b oxy hóa, cao hay khi có m t c a

oxy hóa. Vì v y, ph i b o qu n vitamin A

ch

th p, tránh ánh sáng, trong chai l th y tinh màu vàng, bao bì kín,

thêm ch t ch ng oxy hóa [4]. 1.2.2.

m lý hóa c a vitamin D

Vitamin D là m t nhóm g m t D2

n D7

t có ho t tính

tác nhân ch ng lão hóa khác. Bi u hi n d nh n th y nh t khi dùng vitamin E

m nh nh t là D2 và D3. Nói chung, v ho t tính không có s khác nhau nhi u

quá li u là tiêu ch

gi a vitamin D2 và D3 [7].

ng, r i lo n tiêu hóa, m t m

Nh ng tri u ch ng này s nhanh chóng m i nhanh ra kh 1.2.

c...

ng ng thu c do

c a 0,025µg vitamin D3 b

.

xúc v i không khí, nhi t

m lý hóa c a vitamin A Vitamin A không ph i là m t ch

ho t tính sinh h

ch nhi u ch t có

nhau. T t c các d

u có vòng beta

ionon và g n vào nó là m t chu i isoprenoid. Trong th c ph m có ngu n g

ng v t, d ng chính c

t nt i

i d ng aldehyd là retinal hay d ng acid là acid retinoic. Ch

c

g i là vitamin A là retinol, có phân t gam là 286,45 [3]. Hi n nay, vitamin A c t o ra b ng t ng h p hóa h c. Ho t tính c nh b

qu c t ,

c xác

qu c t b ng 0,3 g vitamin A ho c 0,6 g

-caroten.

qu c t vitamin D3.

Vitamin D3 là nh ng tinh th tr ng ho c g

m lý hóa c a vitamin A, vitamin D, vitamin E

1.2.1.

tài này t p trung nghiên c u v vitamin D3 (cholecalciferol). Ho t tính ng, d bi

và ánh sáng. Trong dung d ch, tùy thu c vào nhi t

và th i gian mà có th x y ra hi n t

ng

ng phân hóa thu n ngh ch

thành pre-cholecalciferol. Vitamin D3 d tan trong chloroform, ethanol 96% và ether, tan trong d u béo; th c t không tan trong n

c. Dung d ch trong

các dung môi bay h i không v ng b n, nên dùng ngay. 1.2.3.

m lý hóa c a vitamin E

Vitamin E là thu t ng ch m t nhóm h p ch t có ho t tính sinh h t nhau là , , ,

-tocoferol có ho t tính m nh nh t.

Ho t tính c a 1 mg -tocoferol b

vitamin E.

Các vitamin E và ester c a chúng là ch t l sáng, h

4

i khi ti p

u, màu vàng c, tan trong ethanol,

5


các dung môi h

u béo (riêng d ng mu i succinat là b t màu

tr ng). Do trong phân t có các carbon b phân quang h

ng

ng phân h u truy n (d

m

ng có ho t tính

ng phân t truy n (d ng L). Các tocoferol trong t nhiên

c b sung v v im

t vitamin A, D, E ra kh i m u th c ph m

-M us ab

y, th y tinh màu

ch nhi

th p, tránh sánh sáng [3], [4].

Vitamin E t nhiên t n t

ng nh

ng nh t k

c khi cân, s a l

i8d

d ng

có ho t tính sinh h c khác nhau chút ít. D ng -tocoferol có công th c phân

c l y tên chung là

vitamin E. Ngày nay, vitamin E ch y

u ch b

t ng h p hóa h c [5], [6]. Trong ph m vi lu

này ch nghiên c u d ng

c ch n ng u nhiên; d ng siro, d ng l

g m các triglycerid, m

ng nh các thành ph n g n gi ng m . T t c các ch t này c ch kh a các lo i vitamin tan trong d u. M t ph n các vitamin này

h

n ph i phá v liên k

ph

c b sung v

ng t 4

ng

t tách phù c khi ti

ng [35].

xà phòng hóa, chi t b ng c n, s d ng enzym, chi t b ng dung t b ng dung môi siêu t i h n [28,41,45,38,57,].

* Xà phòng hóa Xà phòng hóa là cách truy n th n n m u ph c t

t l ng

gi i phóng các vitamin trong các

l ng b ng dung môi h

M t ph n các vitamin tan trong d u trong th c ph m t n t i

ng và s a công th c, vitamin 400 - 600µg/100g, vitamin D

gi i phóng

t vitamin tan trong d u ra kh i n n m u th c

môi h

ng t

yc

chi t các vitamin ra kh i n n m

Có m t s

c b sung v

c

ng r t ít các sterol, carotenoid, phospholipid và

vitamin ra kh i các ph c h

Trong th c ph m b sung vi ch

cl

T l ch t béo trong các th c ph m ch a vitamin tan trong d u ch y u

liên k t v i ph c h

Công th c c u t o Công th c c u t o c a Công th c c u t o c a vitamin A vitamin D3 c a vitamin E ( (retinol) (cholecalciferol) tocoferol) Hình 1.1. Công th c c u t o c a vitamin A, D3, E

c nghi n, tr n k ;

2.1.2. Tách chi t vitamin ra kh i n n m u

m

ng phân -tocoferol.

u cho

khi cân.

ng là 430,7 (g/mol) chi m ch y u trong t

nhiên và có ho t tính quan tr ng nh t, vì v

cl

c khi cân.

- M u th c ph m th c ph m b sung d

u có d ng , , , ; m i d ng

t là C29H50O2 và phân t

u

2.1.

nhân: tia t ngo i, ch

Vì v y, c n ph i b o qu n vitamin E trong chai l kín

ng, tình tr ng s c kh e khác nhau.

2. T ng quan v

2.1.1. X lý m

ng ki m.

8mg/100g tùy vào t ng lo i th c ph m

a tu

d ng D, lo i t ng h p d ng racemic. Các vitamin E d b oxy hóa v i các tác ôi, m t s kim lo i n

ng t 4,5

k t v i các ph c h ch

d ng liên

n phá v các liên k t protein -

gi

c s d ng

gi i phóng các liên k t ho c phá v d ng ester c a vitamin A, D, E [23].

6

7


c ti

ng ki m m

u

Chi t l ng siêu t i h n s d ng CO2 siêu t i h

này giúp gi m s có m t c a các ch t khác trong n n m u hòa tan vào dung

m ts

môi h

kh

t sau này. Quá trìn

hành b ng cách thêm dung d ch NaOH ho c KOH nhi

c ti n nhi

ng ho c

cao v i s có m t c a ch t ch

t s k t qu kh quan vì CO2 siêu t i h n có nh các ch t không phân c c. K thu t này giúp tách các

vitamin ra kh i n n m u th c ph m, huy t thanh, kem, s a công th c, thu c m [53, 47].

t l ng siêu t i h

Ngay sau quá trình xà phòng hóa luôn luôn là quá trình chi t b ng dung môi

công s c, t

h

nghi m th c ph m t i Vi

iethyl ether, diisopropyl ether, chloroform, n-hexan ho c các h n

h p c a chúng [2, 1, 36].

m nhanh, h n ch

phí trang b ng d

t, h u h t các phòng ki m c k thu t này.

* Chi t pha r n

* Th y phân b ng enzym

Chi t pha r n là

Nhi u lo th y phân nhi u liên k t hóa h

t d a vào s phân b c a ch t phân

c s d ng trong công ngh th c ph

tích gi a hai pha l ng và r n. Pha r

c hi

vào các ng nh . Pha l ng ch y qua ng, các ch

amylase xúc

tác th y phân tinh b t, lipase, protease xúc tác ph n ng th y phân triglycerid i v i phân tích vitamin trong th c ph m, các

r ns

ng ki m, s

ng là các h t nh , x p

c gi l i trên ng. Các ch

i pha

ng th tích dung môi r a gi i nh

u so v i th tích dung d ch m u. K thu t này ti n hành khá nhanh,

t tr c ti p b ng dung môi h

thu h i t t, t nghiên c

ng qui [14], ch ng t

i chi t l ng

c, các tác gi

ng d

l ng. Trong nhi u

c k thu t chi t pha r n trong

enzym có ho t l c th y phân th c ph m t t, giúp gi i phóng vitamin ra kh i

phân tích vitamin D và các d ng chuy n hóa c a nó trong máu, d

n n m u, giúp quá trình chi t di n ra thu n l i. Tác gi Xiuping và c ng s

th

có nghiên c u b

ng ki m (dung d ch

th y phân m u th

Chi t l ng

l ng là m t k thu t r t ph bi

ng các

vitamin. Sau quá trình xà phòng hóa, các vitamin tan trong d tách ra kh i n n m u b ng cách chi t l p l ng môi h

B ng 1.1. Tóm t t m t s

ng [23].

tiêu chu n/ bài báo khoa h c/ công trình nghiên c u

l ng nhi u l n b ng các dung

c (petroleum ether, n-hexan, n-heptan). Pha h

c cô l i b ng thi t b c t quay ho c th b

c

8

A

D

X n Vi t Nam IV [6]

t phân tích

X AOAC 992.06 [12]

* Chi t l ng siêu t i h n

,

].

t b ng ethanol [56].

* Chi t b ng dung môi h

c nh i

c r a gi i kh i pha r n b ng

m t dung môi khác phù h

c s d ng trong phân tích vitamin K vì vitamin này không b

c mô t trong

X

E

lý m u phân tích vitamin A, D3, E trong th c ph m và thu c

D ng bào ch / n n m u Ch ph m ph c t p ho c ch a vitamin ng th p viên nén/ thu c u ng d ng gi t/ dung d ch tiêm S a công th c cho tr

9

lý m u

Xà phòng hóa b ng KOH/ ethanol và chi t b ng dung môi ether. Hòa tan ch ph m b ng toluen và ng. pha loãng b Xà phòng hóa m u b ng dung d ch c. Chi t b ng dung môi nhexan + methylen chloride (3:1).


Qua tóm t t m t s tiêu chu n/ bài báo khoa h c/ công trình nghiên c u

A

D

lý m u

S n ph m công th c và h tr tiêu hóa cho tr nh

X

AOAC 992.03 [11]

X

S a công th c cho tr

X

TCVN 8973 : 2011 (EN 12821 : 2009) [3]

Th c ph m

X

TCVN 8276 : 2010 (EN 12822 : 2000) [1]

Th c ph m

X

Dionex (2009) [31]

X

X

Cao Công Khánh (2010) [8]

X

X

Nhi u lo i th c ph u, m , margarin, các lo i th c ph m khác) c u ng dinh ng S a (b t, l ng)

Xà phòng hóa m u, chi t b ng dung môi ndung môi, r i s d ng chi t pha r n, d ch chi ng. Xà phòng hóa b c, chi t b ng n-hexan : methylen chlorid (3:1) Xà phòng hóa b ng KOH/ ethanol + ch t ch ng oxy hóa acid ascorbic sau t b ng d u nh / n-hexan/ diethyl ether Xà phòng hóa b ng KOH/Ethanol + t ch t ch ng o b ng dung môi h ch b ng s c ký l u ch , s c ký b n m ng Xà phòng hóa b ng KOH/ethanol (ho c methanol) + ch t ch ng oxy t b ng n-hexan Hòa tan m ng A (dung d ch acid formic 0.015%) Xà phòng hóa b ng KOH/EtOH sau t b ng dung môi n-henxan. t tr c ti p b ng

nM 36 [55]

n và bài báo nghiên c u v

phân tích vitamin A, D, E trong thu c và th c ph m, chúng tôi có nh n xét sau:

AOAC 995.05 [13]

TCVN 89721:2011 (EN 12823-1 :2000) [2]

E

D ng bào ch / n n m u

dung môi n-hexan + dimethylsulfoxide X

Semahat K., Onur B., Huseyin K. [49]

X

Xiuping X., Jinming Y., Pingly H. [58]

X

X

X

X

X

X

X

Viên nang

Viên nén multivitamins

Th

ng KOH/ pyrogallol, chi t b ng dung môi n-hexan + methylene chloride (3:1) M u nghi n thành d ng b t m n và hòa tan b ng dung môi TFA:methanol (80:20), ly tâm thu d ch chi t. Xà phòng hóa b ng NH3/ethanol có b sung enzym savinase proteinase, t pha r n b ng cartridges Oasis HLB

-

m nghi ng d

ng qui (TCVN, AOAC, EN,

ng th i vitamin A, D, E trong th c ph m nói

chung và s a công th c, th c ph m b sung vi ch -

ng nói riêng.

i v i các ch ph m thu c, thành ph n ch ph m và d ng bào ch ng n ph m th c ph

m u không quá ph c t p: có th xà phòng hóa ho dung môi ít phân c c [6,18,51,55 ng, s a công th

t b ng c ph m b sung vi ch t

ng có thành ph n n n m u ph c t

có thêm nhi u thành ph

ng

c bi t là các lo i lipid, peptid,

ng t ng lo trình x lý m u ph c t n nm

c x lý tri

i quá

chi

ng. N u

s

ng nhi

c bi t v i nh ng ch t phân tích có m t v

n k t qu phân tích, ng nh trong m

vitamin D3. Trong nghiên c u này l a ch pháp này phù h p v i vi c chi t tách vitamin A, D, E, lo i tr ch t béo và lipid hi u qu , chi phí th

a, n

d ng t n t i c a các lo

ph m thu c, c thì trong s a công th c s d ng

nguyên li u t t nhiên nên các vitamin t n t i th c ph m b sung vi ch h n ch s oxy hóa.

nhi u d ng khác nhau; trong ng t n t i

khía c

d ng ng ch

n ho t l c t ng c a t ng lo phòng hóa không ch giúp gi i phóng các vitamin ra kh i liên k t v i các thành ph n khác trong th c ph m mà còn giúp chuy n vitamin t d ng ester

10

11


sang d ng ancol, giúp ti t ki m chi phí s d ng chu n làm vi c trong quá

phân gi i cao, chi phí th p, có th ti

trình phân tích, thu n ti n trong quá trình tính toán k t qu . Tuy nhiên, vi c

ng nhi u m u trong kho ng th i gian ng

b sung thêm enzym trong quá trình xà phòng hóa v a giúp phá v các liên

áp d

k t ester, v a phá v các liên k t peptid trong n n m

48

t

vitamin ti p theo b ng dung môi di n ra thu n l

1, 54].

Các sterol, carotenoid, vitamin tan trong d u không b xà phòng hóa c chi t ra kh i h n h p sau khi th y phân b ng dung môi h d ng k thu t chi t l ng

l ng, ti n hành chi t l p l i nhi u l

c

c và trong d u [30, 34,

mc

nh

n sai s l

ng m u

ng l n do h s pha

loãng cao. 2.2.3. S c ký khí (GC)

chuy n t i

ng vitamin có trong m u phân tích sang pha dung môi h

n di mao qu

ng các lo i vitamin tan t

s d ng nh d

nh

Quá

Trong nh

c khi HPLC phát tri

d ng r

c ng

nh các vitamin tan trong d u trong th c ph

trình chi t th c hi n trong các d ng c th y tinh t i màu, lo i khí oxy b ng

v i vi c chuy n t công ngh c t nh i sang c t mao qu n thì hi u qu

cách s

d ng c a k thu t GC phát tri n m nh m . K thu

t ch

hóa. D ch chi

h n ch t

oxy

c

chu n b m u ph c t

trình c t c n ti n hành trong bình c c t quay ho c s

y b i dung môi

h n ch t

tan b

oxy hóa [48]. C

ng v i th tích thích h

2.2. M t s k thu

c hòa

ti n hành ch y HPLC.

ng th i, ph i d n xu b n v ng c a chúng trong nhi

ng nhanh, thao tác ti

n, ng th i các

vitamin A, D, E trong m t s ch ph m thu c và th c ph m [23, 24]. -

khi c n d n xu t hóa. V

c hi u không

c bi t là các

vitamin A, D, E v n r t d b oxy hóa.

l p l i ch p nh

B ng 1.2. M t s

c s d ng r ng rãi trong th p k

nh nhi u ho t ch t sinh h c quan tr

12

m c a

c thì HPLC là m t

tiêu chu n/ bài báo khoa h c/ công trình nghiên c u

A

u ki n s c ký l ng phân tích vitamin A, D, E và trên th gi i D

n di mao qu n phân tá

nh các vitamin tan trong d u

c l a ch n hi n nay [1,2,10-18].

c a vitamin. Trong th c t , các m u th c ph ng không tránh kh i tình tr ng thoái hóa, bi n ch

i GC và các k thu t s c ký

hi n khá ch n l c các lo i vitamin, quá trình x lý m u không quá ph c t p, ít

nói chung v i m

cao, nh t là khi có m t c a các t p ch t khác, nh t là các s n ph m phân h y

n di mao qu n t

cao [7, 27, 51] .

khác khi phân tích vitamin trong th c ph m nói chung, vì HPLC có th phát

2.2.1. Quang ph h p th t ngo i kh ki n (UV-VIS)

th

lo i b lipid, sterol và m t s t p ch t khác ra kh i

HPLC có m t l i th quan tr

c l p ho

i quá trình

2.2.4. S c ký l ng hi

ng vitamin A, D, E

UV-

n nm

ng

n Vi t Nam IV [6]

X X

E

D ng bào ch / n nm u Ch ph m ph c t p ho c ch a vitamin A hàm ng th p viên nén/ thu c

13

Vi t Nam

u ki n s c ký

ng: Methanol - ethyl acetat c (90 : 7 : 3); t c dòng: 1,5 - 2,0 ml/phút; th tích tiêm: 20 l; C t C18 (25 cm 4 mm) h t 5-10µm Pha ng: Hexan-n-pentanol (997 : 3)


tiêu chu n/ bài báo khoa h c/ công trình nghiên c u

A

D

E

D ng bào ch / n nm u u ng d ng gi t/ dung d ch tiêm

AOAC 992.06 [12]

S a công th c cho tr

X

AOAC 995.05 [13]

X

AOAC 992.03 [11] TCVN 89721:2011 (EN 12823-1 :2000) [2]

X

X

TCVN 8973 : 2011 (EN 12821 : 2009) [3]

Th c ph m

X

TCVN 8276 : 2010 (EN 12822 : 2000) [1]

Dionex (2009) [31]

Cao Công Khánh (2010) [8]

n M 36 [55]

Th c ph m

X

X

X

X

X

S n ph m công th c và h tr tiêu hóa cho tr nh S a công th c cho tr

X

X

X

Nhi u lo i th c u, ph m , margarin, các lo i th c ph m khác)

c u ng dinh ng

S a (b t, l ng)

Viên nang

u ki n s c ký

T c dòng: 2 ml/phút C t thép không g (25 cm × 4,6 mm, c h t 5 µm) ng n-hexan + isoproyl ancol (100 + 0,25, th tích/th tích); C t 15cm * 4,6mm, c h t nh i 5µm; ng ACN + MeOH + ethyl acetat ch y gradient, t i t 0,7 n 2,5ml/ phút, th tích tiêm 250µm, c t C18 25cm * 4,6mm, c h t 5µm ng n-hexan + isopropyl alcohol (99,92 + 0,08%), c t 25cm *4.6mm c h t 5µm.

tiêu chu n/ bài báo khoa h c/ công trình nghiên c u

ng: n-hexan + di-isopropyl ete (80 + 20), t dòng 1,5ml/ phút. ng: kênh A (acid formic/ H2O 0,015%); kênh B (MeOH: ACN = 17:83) u, 0 45% kênh B trong 5 phút sau, 45 100% kênh B trong 0,1 phút, 100% kênh B trong 16,9 phút, t 0 100% kênh A trong 5 phút cu i cùng. P ng MeOH c theo gradient, c t s c ký o C18, t dòng 1ml/ phút, nhi c t 40ºC.

D

E

D ng bào ch / n nm u

Semahat K., Onur B., Huseyin K. [49]

X

X

X

Xiuping X., Jinming Y., Pingly H. [58]

X

X

X

T

c (46,5: 46,5: 7,0); c t 4,6mm*25mm, h t nh i L1; t dòng 3ml/ phút, detector UV 291nm, nhi c t 40ºC. ng TFA:MeOH (95:5), n 6 phút sau gi m d 20 phút t l TFA:MeOH (5:95), cu i cùng l i nt l TFA:MeOH (95:5). c (98:2), C t C18 15cm*4,6cm, c h t 5µm, t dòng 1ml/ phút, th tích tiêm 10µl, nhi c t 35ºC.

Viên nén multivitamins

Th nuôi

b ng tóm t t trên cho th y, s c ký l ng hi t ph bi

t

ng các vitamin tan trong d u, tuy nhiên

m t s

ng d

c l p

vitamin A, D, E thì l i s d ng c t s c ký pha thu các dung môi không phân c

butanol, diethylether [1, 2, 13, 15, 17].... ch

ng là

-hexan, isooctan, có th b sung thêm mc

l p l i c a h th ng khi s d ng c t pha thu

o, th

ng không nghiên c

ng

nh. lý m u b ng k thu t xà

phòng hóa có b sung enzym, chi t tách vitamin b ng dung môi h s

i

ng th i 3 lo i vitamin A, vitamin D,

vitamin E trong th c ph m b ng HPLC, s d ng c

ng: n-hexan; c t 4,6mm*15mm, h t nh i 3µm L8; t dòng 1ml/ phút, detector UV 325nm. ng: n-hexan + isopropyl alcohol (99+1); c t 4,6mm*15mm, h t nh i 3µm L8; t dòng 1ml/ phút, detector UV

14

u ki n s c ký

265nm.

ng n-hexan : n-butanol (98: 2), t c dòng 2ml/ phút, c t pha thu n, th tích P ng MeOH c = 95 :5 (ho c 93 :7), có s d ng n i chu n D2 ; c t pha ng kính 4-4,6mm,dài 2530cm, c h t 5µm.

A

15

o.


PH

U

c).

-

n nghiên c u

c).

- N-hexan (PA, Trung Qu c).

ng nghiên c u

- Petroleum ether 30:60 (PA, Trung Qu c).

M u ki

vitamin A, D, E bao g m :

- Ethanol (EtOH, PA, Trung Qu c).

- S a công th c có vitamin A, D, E.

- Butyl Hydroxy Toluen (BHT, PA, Trung Qu c).

- Th c ph m b sung vi ch

- Kali hydroxid (KOH), (PA, Trung Qu c).

ng.

- Enzym alkaline protease > 500 U/g (PA, Sigma, M ).

n nghiên c u 2.1.2.1. Trang thi t b , v

c).

* Pha các dung d ch chu n

nghiên c u

- H th ng s c ký l ng hi

i detector PDA (Shidmazu,

- Dung d ch chu n g c: cân chính xác 20 mg ch t chu n vitamin A, 25 mg

Nh t).

ch t chu n vitamin D, 500mg ch t chu n vitamin E b ng cân phân tích hoà

- Máy c t quay chân không Eyela (Tokyorikarika, Nh t).

tan và chuy

- Máy quang ph h p th UV-VIS UV1800 (Shidmazu, Nh t).

phòng, l c k

- B p cách th y (WNB22, Memmert). . chính xác 0,01g ML802 (Mettler Toledo, Th

- T s y Shellab (Sheldon, M ). - Pipet các lo

Các dung d ch chu n g c b o qu n

- Ph u chi

.

ml

này hàng ngày.

c).

- Bình c

c).

- Dung d ch chu n làm vi c: T các dung d ch chu n trung gian, ti n hành nh m

c).

2.1.2.2. Hóa ch t, thu c th

A, D, E có n

- Chu n Retinol 99,5% (Sigma, M ).

d ch chu n g c.

c dãy chu n dung d ch vitamin

loãng 20; 50; 100; 500; 1000, 4000 l n so v i các dung

- Chu n cholecalciferol 99,5% (Sigma, M ). - Chu n D,L- -tocoferol 99,5% (Sigma, M ). 16

c trong

methanol

c).

- ng nghi m th y tinh lo

4ºC, s d ng

khi c n thi t.

D, E

c).

nh m c các lo

nhi t

c các dung d ch chu n g c vitamin A 200 ppm, vitamin

6 tháng, ki m tra l i n

- Cân k thu

nh m c b ng methanol

D 250 ppm, vitamin E 5000ppm.

chính xác 0,1mg và 0,01mg AL204 (Mettler Toledo, Th y

-

nh m

17


2

u ki n [11-16] D a trên nh ng phân tích trong ph n T ng quan

ki n xây d

trên, chúng tôi d

- Kh o sát

ng c a th i gian th y phân

- Kh o sát

ng c a dung d ch KOH 20%

- Kh o sát

ng c a dung môi chi t

2.2.4. Th

ng th i vitamin A, vitamin D,

vitamin E trong th c ph m b

c ký l ng hi

HPLC v i detector PDA bao g

Tính ch n l c cho bi t s có m t c a ch t phân tích có th phân bi t

n sau:

c v i các ch t khác trong m

nh tính ch n l c b ng cách

- Th y phân các m u th c ph m b ng KOH 20% trong ethanol v i s có m t

phân tích các m u tr ng, m u tr ng có thêm ch t chu n, m u th thêm chu n.

c a enzym protease.

V i m u tr ng ph

- Chi t m u b ng dung môi h

thu d ch chi t ch a vitamin

các m

c n phân tích. -

a ch t phân tích gi a m u chu n và m u tr ng thêm chu n không có ý ng kê, so sánh ph t

u ki n ch y s c ký

Kh o sát các thông s s c ký l ng c 3 lo i vitamin A, D, E cho s

mt có th

ng th i

Xây d o Shodex C18M 4E (4,6mm * 250mm,

kích c h t 5µm); Column No: K1590663, hãng s n xu t: Snowa Denko. ng: Kh o sát thành ph n và t l dòng: Kh o sát t

u ki n nhi - Nhi

tinh khi t c

c t, th tích tiêm c

có n

ng chu n tuy n tính b ng cách ch y dãy dung d ch chu n

khác nhau pha t chu n g c và chu n trung gian cho phù h nh kho ng n

c a ch

i nhi

i quy tuy n tính y = ax + b

dòng phù h p. c t t 25ºC

l di n tích pic ch t phân tích/di n tích ch t chu n x là n

ch t kh o sát

ng chu n xây d u ki n tách chi t ng c a enzym

- Kh o sát

ng c a nhi

th y phân

c ph i có h s

ch ch th a mãn.

- Gi i h n phát hi n LOD (Limit of detection) là n phân tích có th phát hi n

18

ph thu c tuy n

c a ch n 2ml/ phút v i các

l a ch n t

c t: Kh o sát k t qu s c ký v i s

- Kh o sát

tinh khi t

tính gi a t l di n tích pic ch t phân tích/di n tích pic ch t chu n v i n ng

ng.

dòng t

n 40ºC. 2.2.3. T

r ng c

nh pic,

i, các pic tách nhau rõ ràng, th i

- C t s c ký: S d ng c t s c ký

-T

m khác nhau trên pic s

c tính toán b ng ph n m m tích h p s n v i thi t b HPLC.

gian phân tích phù h p.

-

c a

n l c d a theo các tiêu chí: s khác bi t th i gian

ng th i vitamin A, vitamin D, vitamin E b ng h th ng HPLC.

2.2.2. T

c cho tín hi u phân tích. So sánh s

c tr

th p nh t c a ch t

u ki n thí nghi m c th . Trong s c 19


ký LOD có th

nh b ng cách thêm chu n có n

n n m u tr

c pic có chi

trên nhi u n - Gi i h

cn

Th c hi n phân tích l p l i t i thi u 6 l n v i các n n m u khác nhau

ng t l tín hi u

a công th c, th c ph m b sung..., th i gian th c hi n thí nghi m phân tích ng n (v i cùng m

chu

ng LOQ (Limit of quantification) là n

ch t phân tích có trong m u th có th phát hi ch m nh n

th p d n vào

th p nh t c a

cv m

l pl ic

ng v i

c. Trong s c ký LOQ có th

c a ch t phân tích mà t i

i, trong cùng m t ngày, trên cùng m t thi t b ..)

nh là

l gi a tín hi u c a ch t phân tích và

phù h p c a k t qu th c nghi m so v i giá tr th c (true value) ho

c ch p nh n th

tín hi u n n b ng 10 (S/N =10). Có th tính LOQ theo LOD theo công th c:

thu h i.

LOQ = 10/3 * LOD.

thu h

nh d

chu n thêm vào m u th ph l p l i th hi n s g n nhau c a các k t qu

th ng

nh t c a các k t qu th riêng bi l i trên cùng m t m

l pl

t thêm chu n.

m b o sao cho n

c u sau khi thêm chu n n m trong kho

c th hi n b

l ch chu l ch chu

ng ch t phân tích. Các công th

i

R%

Cm

i RSD%

c

Cm

Cc

Cm+c : N

sau:

trong m u th thêm chu n trong m u th

+ Giá tr trung bình :

Cc: N

chu n thêm

n

Ti n hành phân tích th c nghi m 3 lô m u: m u th thêm chu n

xi

th p, m u th thêm chu n

i 1

x là giá tr trung bình s h c c a t p h p các giá tr xi còn xi là giá

n

cao (các m c n

kho ng n

tr k t qu c a m i l n thí nghi m.

trung bình, m u th thêm chu n

chu n th

u n m trong c). Ti n hành phân tích l p l i m i

thu h i chung là trung bình c

(x i x) 2

RSD

n ng

thu h i các l n làm

l p l i.

n

l ch chu

n

tuy

m u6l

l ch chu n :

SD

c

100

Cm: N

1 n

c a ch t c n nghiên thu h

Ti n hành thí nghi m n l n l p l i.

x

ng ch t

c áp d ng l p

RSD. Ti n hành thí nghi m l p l i 6 l c

g có th

ng vitamin A, D, E trong m t s

i 1

n 1

ph m trên th

i:

ng

S d ng k thu t x lý m

SD 100% x

ng và k thu t x lý m

a ch n và t

20

ng th c

t qu .

21


- Phân tích trên các m u th c ph m b sung vi ch

ng.

PH N 3. K T QU NGHIÊN C U

3.1.1. L a ch

2.3

lý s li u

- Các k t qu

c trong quá trình ti n hành nghiên c

ng d ng ph n m m tin h

Giá tr trình h i quy và h s

l ch chu

c sóng phân tích

Tham kh o m t s tài li c x lý

b ng các ph n m m có s n trong thi t b HPLC. -

u ki n ch y s c ký

3.1. T

- Phân tích trên các m u s a công th c.

i quy.

vitamin E trong th c ph m; TCVN 7081A trong s a b t g

tính toán các s li u: l ch chu

ng d

thu h

th c ph m và m t s sóng phân tích vitamin A

ng d

nh vitamin D trong

ng qui khác,

a ch

265nm, vitamin E

[1, 2, 3]. K t qu phân tích v i detector PDA

nhi

h p th c c

(Ph h p th UV c

nh vitamin

ng d

325nm, vitamin D

y vitamin

nh

c th hi n

c 292 nm

c sóng khác nhau i

n. Ph l c 1).

3.1.2. L a ch n c t s c ký u ki n phòng thí nghi m, chúng tôi ch n c t s

o

c c t 4,6mm* 250mm, c h cho tín hi u phân tích t t, k t qu

t

c gi a các l n tiêm l p l i có s sai

l ch v th 3.1.3. L a ch

ng và thành ph

ng

Trong nhi u tài li u nghiên c u, MeOH, acetonitril (ACN) c ch n là thành ph n chính c trong d u b ng s

ng

ng trong phân tích các vitamin tan

o. Tuy nhiên n u s d

ng là ACN s

hòa tan nhi u thành ph n khác có trong d ch chi t, khi phân tích s gây nhi u t

u này có th gây sai s l n trong phân tích vitamin A, D vì

c a vitamin D trong m u th p, pic c t p m u vì th

d

22

ng xu t hi n cùng v i

ng

thành ph n chính c c thành ph n và t l

ng

nh ch n MeOH là

ng, có kh o sát t l b sung H2O và THF ng thích h p.

23

xây


Kh o sát s

c am

t là 95: 5: 0; 94: 5: 1; 92: 5: 3; 90: 5: 5; 85: 5: 10. mAU 60 Ch1-265nm4nm (1.00) Ch2-292nm4nm (1.00) Ch3-325nm4nm (1.00) 55

A/5.512

mAU Ch1-265nm,4nm (1.00) Ch2-292nm,4nm (1.00) 50 Ch3-325nm,4nm (1.00)

s

A/5.056

MeOH : H2O : THF l

ng theo các t l

20

30 25 20 15

D/15.885

15

10

2.5

5.0

Vit E

tùy thu

5

10.0

12.5

15.0

17.5

20.0

22.5

25.0

27.5

min

0.0

55

n 50 l

ng ch t phân tích trong m u. Qua kh o sát,

2.5

5.0

mAU Ch1-265nm4nm (1.00) Ch2-292nm4nm (1.00) Ch3-325nm4nm (1.00)

7.5

10.0

12.5

15.0

17.5

20.0

22.5

25.0

min

ch n th tích tiêm m

mb

c tín hi u phân tích t t, pic

i, rõ nét, t p không quá l n.

50

Vit D

(c)

7 6 5

3 2

3.1.5. Nhi (d)

30 25 20 15

D/11.572

4

35

10

1

5

0

0

10.0

12.5

15.0

min

c t

u ki n nhi

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

17.5

A/3.092

phòng

40ºC.

c t 40ºC khi n các ch

c r a gi i s m c kho ng 2 phút, các

20.0 min

pic v n tách nhau rõ ràng, g mAU Ch1-265nm4nm (1.00) 50 Ch2-292nm4nm (1.00) Ch3-325nm4nm (1.00)

t

ng th i gian phân tích c 3 vitamin rút ng

-5

7.5

t nhi

K t qu cho th y, nhi

-2 5.0

c khi c

thí nghi m 25 -

-1

2.5

bu ng c t

Kh o sát tín hi u s c k

D/11.196

8

40

Vit E

Vit E

9

E/15.156

10

E/14.701

45

Vit A

11

Vit D

12

0.0

u trong kho n

0

A/4.035

mAU Ch1-265nm,4nm (1.00) 14 Ch2-292nm,4nm (1.00) Ch3-325nm,4nm (1.00) 13

7.5

ng cho phân tích là MeOH :

ng ch n th tích m

-5

Vit A

0.0

ki m dung môi phân tích, chúng tôi ch n t l

A/3.883

0

10

/8.064

/4.872

5

y 16 phút). V i lý do ti t

3.1.4. Th tích tiêm

E/19.018

Vit A

35

c nh n,

không doãng chân, th i gian phân tích phù h

D/14.515

25

(b) Vit D

Vit D

30

40

E/20.910

35

45

Vit E

(a)

Vit A

40

THF 3-5% là thích h

H2O : THF = 92 : 5 : 3.

50

45

trên cho th y n

c

nh pic nh n. M

t nhi

c t

nh c a k t qu s c ký gi a các ngày khác nhau do

45

không ch n nhi mAU 55 Ch1-265nm4nm (1.00) Ch2-292nm4nm (1.00) Ch3-325nm4nm (1.00) 50

mAU Ch1-265nm4nm (1.00) 55 Ch2-292nm4nm (1.00) Ch3-325nm4nm (1.00) 50

45

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

9.0

10.0

11.0

12.0

13.0

14.0

min

25

(a)

20

ng MeOH : H2O : THF

10

(a) 95: 5: 0; (b) 94: 5: 1; (c) 92: 5: 3; (d) 90: 5: 5; (e) 85: 5: 10

Nh c

ng làm gi

nh

quá cao gây t

ch iv

30 25

phân c c

15 10 5

ng, th i

0

0

-5

-5

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

17.5

20.0 min

0.0

Hình 3.3. K t qu kh o sát (a) Pic s

nhi

phòng

2.5

5.0

7.5

ng c a nhi (b) Pic s

m b o các pic tách r i nhau hoàn toàn. Quan sát các

24

(b)

20

5

ng, rút ng n th i gian phân tích c a các ch t. Tuy nhiên không nên s

d ng THF n

35

D/12.942

Hình 3.2. K t qu kh o sát t l

15

40

E/15 .140

30

E /17.05 6

-5

Vit D

35

Vit E

Vit A

40 0

Vit E

45

5

Vit D

10

D/11.57 1

D/8.951

15

c t là 40ºC. A /4.03 6

20

ng. Do v y, chúng tôi

Vit A

25

ng b i s bi n thiên nhi

A/4.414

(e) Vit D

30

Vit E

35

E/11.756

Vit A

40

25

10.0

12.5

c t 40ºC

15.0

min


Kh o sát t u ki n s

dòng t th

it

c l a ch n

trên.

Vit A

45 40

25

(a)

30

15 10

(b)

25 20

D/21.334

20

35

15 10

5

dòng 0,8ml/

phút gây hi

ng th i th i

ng doãng chân pic, nh t là pic c

dòng 1,5ml/ phút

m b o th i gian phân tích v a ph i (15 phút), các pic s c ký nh n, tách

nhau rõ ràng. u ki n s

a ch

ng th i c 3

5

0

0

-5

-5

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

17.5

20.0

22.5

25.0

27.5

30.0

32.5

min

-C ts

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

17.5

20.0

22.5

25.0

A/4.036

25

30

(d)

25

-T

3.2. T

10

D/11.571

D/14.496

15

15 10

ng: MeOH: H2O:THF = 92:5:3 dòng: 1,5ml/ phút, nhi

c t: 40ºC.

- Th tích tiêm m u: 20µl.

20

20

c c t 4,6mm* 250mm, c h t 5µm.

E/15.14 0

Vit D

(c)

30

40 35

Vit D

35

45

E/18.986

40

Vit E

Vit A

45

Vit A

50

50

Vit E

A/5.055

mAU Ch1-265nm,4nm (1.00) 55 Ch2-292nm,4nm (1.00) Ch3-325nm,4nm (1.00)

o C18 Shodex,

min

mAU Ch1-265nm4nm (1.00) 55 Ch2-292nm4nm (1.00) Ch3-325nm4nm (1.00)

3.2.1.

u ki n x lý m u phân tích ng c

n quá trình th y phân

5

5 0

0

-5

-5

7.5

10.0

12.5

15.0

17.5

mAU Ch1-265nm4nm (1.00) 55 Ch2-292nm4nm (1.00) Ch3-325nm4nm (1.00)

20.0

0.0

min

2.5

5.0

12.5

15.0

min

kh

ng m i l n cân kho ng 2,5g vào l nh a có n p kín, thêm vào m i

35

Vit D

(e)

30 25

0,25ml; 0,5ml; 0,75ml; 1ml; 1,5ml. Ti n hành th y phân và phân tích trên h th ng HPLC v

D/14.496

20 15 10

phân tán m u,

50ml KOH 20%/ethanol và enzym protease v i th

E /18.986

40

10.0

m u kho ng 0,1g ch t ch

50 45

7.5

Vit E

5.0

A/5.055

2.5

Ti n hành thí nghi m song song 06 l n trên m t m u s a công th c,

Vit A

0.0

t c

pic c a vitamin A b dính chân v i m t s pic t p m u. T

v

E/22.548

30

Vit D

Vit D

35

u gi m.

D/17.238

40

E/27.881

45

-10 0.0

A/6.033

50

50

a c 3 ch

gian phân tích khá dài (g n 28 phút). Chúng tôi ch n t Vit A

55

dòng, th

dòng cao quá (2ml/ phút), các ch t phân tích b r a gi i nhanh ra kh i c t,

n 2ml/ phút v i các

mAU 60 Ch1-265nm4nm (1.00) Ch2-292nm4nm (1.00) Ch3-325nm4nm (1.00) 55

A/7.505

mAU Ch1-265nm4nm (1.00) 60 Ch2-292nm4nm (1.00) Ch3-325nm4nm (1.00)

Nh

ng

Vit E

3.1.6. L a ch n t

u ki n s

k t qu

5 0 -5

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

Hình 3.4. K t qu kh o sát t

15.0

17.5

20.0

min

dòng

(a) 0,8ml/ phút; (b) 1ml/ phút;(c) 1,2ml/ phút;(d) 1,5ml/ phút;(e) 2ml/ phút

26

27

i t 0ml; 60ºC trong 40 phút a ch n

trên,


(a)

(b)

Th tích KOH (ml)

Hình 3.5. K t qu kh o sát hi u qu s d ng enzym (a) K t qu

ng vitamin A

n k t qu

(b) K t qu

ng vitamin D, E

Nh n xét: S d

chi m kho ng 20% so v i kh t hi u qu t t nh

ng m

ng vitamin trong m u l n nh t. Khi th tích KOH/EtOH

t) thì quá trình th y phân

c 70ml, không có s

ng enzym lên, k t qu

enzym. ng m u v

a ch n th tích enzym m b o ti t ki m enzym, v a d lo i t p

gi

i t l cân b ng gi

th c hi n là 1ml, thay

này ph

ng

th c hi n xà phòng m b o quá trình xà

phòng hóa di n ra hoàn toàn. 3.2.3. Kh o sát nhi

n hành các qui trình th y phân, tách

th y phân

Quá trình xà phòng hóa có th di n ra cách th y gia nhi nhi

th

nhi

phòng ho c s d ng

c a ph n ng. N u xà phòng hóa i 50ºC), th i gian ph n ng ph i kéo dài t 12 gi

gi thì quá trình xà phòng hóa m i di n ra hoàn toàn [2, 3, 36]. tôi l a ch n kh

u ki n nhi

n 48 chúng

th y phân trong kho ng t 50ºC

90ºC trên 05 m u v i các thông s

28

ng

ng. Do v y, v

ti t ki m hóa ch t phân tích và v

tích KOH 20%/ EtOH, chu n b 06 m u s a có kh i

ng b ng HPLC. K t qu

n 2 l n so v i

dung môi h

m u kho ng 5g, chúng tôi ch n th

nh th tích enzym b

d ng 50ml

c và pha dung môi, quá trình

phân l p di n ra không hoàn toàn, mu n c i thi n v

3.2.2. Kh o sát th tích KOH 20%/ EtOH

i th tích KOH 20%/EtOH

khác bi t so v i m u s

c th tích KOH/EtOH lên 100ml, hi u su t chi t c mu i

trong quá trình chi t và làm s ch m u.

ng kho ng 5g, c

ng c a th tích KOH 20% / EtOH.

n m c 50ml, k t qu phân

tích enzym

k ; tuy nhiên quá trình chi t c n làm s ch nhi u l

chi m 20% kh

Hình 3.6. K t qu kh o sát

Nh n xét: N u th tích KOH/ EtOH quá ít, quá trình xà phòng hóa di n ra

u su t th y phân m u

t 8-18% so v i m u không s d

lo i b tri

ng

n

i (th tích enzym

29


protease 1ml, th tích KOH/EtOH 50ml, th i gian th y phân 60 phút) c nhi

ch

th y phân thích h p v

phòng hóa, v

mb

u ki n nhi

l a

m b o ti t ki m th i gian xà không làm

ng các vitamin trong m u. K t qu th hi n

n hàm

b ng 3.7.

Th i gian (phút)

Hình 3.8. K t qu kh o sát

ng c a th i gian th y phân.

L a ch n th i gian th

ng vitamin D3 và E

cao nh t, n u kéo dài th i gian th y phân

ng vitamin

ng vitamin D l i gi Hình 3.7. K t qu kh o sát

Nh n xét: Nhi nh t. Nhi

ng c a nhi

th y phân là 60º

c cao

th p quá thì vitamin A và E

hoàn toàn, k t qu

ng th p; nhi

kéo dài khi n cho k t qu không b n v i nhi

d

th y phân cao trong th i gian o

th y phân

u ki n thu n l i cho

nhi

m ho t l c và b t

m b o s

l

ºC

45 phút [1, 2, 3] tuy nhiên nhi

100ºC).

là h

ng nhi

y, k t qu kh o sát c a chúng tôi th th y phân t l thu n v i t

c chi t l ng

ng s d ng các dung môi h

c

ph n ng.

l

c các vitamin.

a tan t t các vitamin A, D, E

nh các

-hexan, petroleum ether, diethyl ether [11-18, 36, 41]. Chúng tôi l a

th y phân

ch n kh o sát trên dung môi chi t là n-hexan, petroleum ether vì tính s n có

i 30 phút, 45 phút, 60 phút, 75 phút, 90 phút. K t

và chi phí th p. Ti n hành phân tích 03 m u s a công th c v

qu ct

trên v i dung môi chi

u ki n th

i n-hexan, petroleum ether, h n h p

các dung môi trên.

30

th y phân

3.2.5. Kh o sát dung môi chi t và t l dung môi chi t

3.2.4. Kh o sát th i gian th y phân thông s : th tích enzym kho ng 1ml, th tích KOH 50ml, nhi

ng d n c a AOAC,

c l p vitamin A, D, E có s d ng k thu t xà phòng

M u sau khi th

Ti n hành th y phân 05 m u s a, m i m u kho ng 5g, c

th

nh c a k t qu phân tích.

TCVN v

ho t nhanh chóng [29, 40, 46].

60ºC, th i gian th

, ánh sáng nên quá trình x lý m u c n

u ki n th i gian ng n, nhi

hóa, th i gian th y phân t 30

ng gi m

cho các nghiên c u sau này. Nhi

u nh y c m v i nhi

ti

c th y phân

cao; do v y chúng tôi ch n 60 C là nhi

enzym protease làm vi c,

kh

th y phân.

. Do các vitamin

31


R ab

c mu i lo i ki m,enzym.

Cô quay chân không 40ºC môi chi t ng methanol t 2-5ml (*)

+ Hòa tan c n v L cm u Hình 3.9. K t qu kh o sát

Hình 3.10. Quy trình x lý m u phân tích các vitamin A, D3, E

ng c a dung môi chi t.

Nh n xét: K t qu cho th y s d ng n-hexan: petroleum ether theo t l 50:50

(*) Th tích hòa c n ph thu 3.3. Th

cho hi u qu tách vitamin cao nh

* N n m u th

ng th i trong quá trình chi t, cân b ng

gi a hai pha di

n s d ng h n h p 2 dung

môi theo t l 1 : 1 làm dung môi chi

n cáo

r ng n u ch n n-hexan làm dung môi chi t thì nên b sung m t lo i dung môi h

mu

cr ab c làm s

c

c cô quay

lo i dung môi và hòa c n, l c qua màng l c và tiêm vào h th ng HPLC. y qui trình x lý m u

nh l

xác nh n giá tr s d ng d a vào nh ng

thông s sau: 3.3.1. Tính thích h p c a h th ng Tiêm l p l i 6 l n các dung d ch chu

c chi t b ng dung môi h lo i ki m và enzym. D ch chi

nh: Th c ph m b sung và s a công th c. c th

thu h i không th M

ng ch t phân tích trong m u.

c tóm t t

chính xác

kho ng 0,5 ppm v i vitamin A; 15 ppm v i vitamin E; 0,7 ppm v i vitamin D3, ghi l i các giá tr v th

n tích pic. K t qu cho th y giá tr

RSD (%) c a th

t yêu c u (RSD <2%).

v y h th

o sát thích h

phân tích 3 vitamin A, D3, E.

B ng 3.3. K t qu

p c a h th ng

M u cân 5 g TT + 0,1 g BHT + 0,5 1,0ml enzym protease > 500U/g Siêu âm 15 phút

L1

L2

L3

L4

L5

L6

TB

Vitamin S pic 35733 35825 35806 35812 36019 35914 35851 A

tR (ph)

4,03

4,02

4,06

4,11

4,08

4,09

4,07

RSD % 0,278 0,86

+ 50 ml KOH 20%/ Ethanol Vitamin S pic 19901 19805 19791 20016 20129 19981 19937

Th y phân 60 C/60 phút

D3 + n-hexan : petroleum ether (50:50) × 2 l n(100 ml + 50 ml) Chi t l ng

l ng

32

11,59

0,210

Vitamin S pic 78651 78012 80012 81572 79986 80314 79757

1,585

E

tR (ph)

0,654

tR (ph)

11,57

15,14

11,55

15,11

11,59

11,62

15,17

15,21

33

11,60

15,20

11,60

15,21

15,17

0,27


3.3.2.

So sánh pic c a ch t phân tích t i cùng m t th

c hi u Ti n hành phân tích m u tr ng, m u th và m u chu n có n

chu n và m u th . K t qu cho th y t i th

vitamin A là 0,75ppm, vitamin D là 1,1ppm, vitamin E là 26,2ppm hi u th hi n kh

t ch t phân tích và n n m u. Các s

c a các m u th hi n trình bày

hình 3.11.

c

m th

a m u a ch t chu n

u xu t hi n pic c a ch t phân tích trên các m u th , m u tr ng thêm chu n tinh khi t c

t trên 99%. M u tr ng

không xu t hi n pic phân tích t

m th

ng v i th i

a ch t phân tích trên m u chu n.

(a) (b)

(c) mAU Ch1-325nm,4nm (1.00) Ch2-292nm,4nm (1.00) 50 Ch3-265nm,4nm (1.00) 40

30

Vit E

Vit D

Vit A

(c )

20

10

0 2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

17.5

min

Hình 3.12. K t qu Hình 3.11. K t qu c hi u v i t l ng MeOH:H2O:THF = 92:5:3; t dòng 1,5ml/ phút, nhi c t 40°C, th tích tiêm 20µl. (a) S

m u chu n (b) S

m u th

(c) S

m u tr ng

(a) Vitamin A

tinh khi t pic trên ph n m m thi t b HPLC (b) Vitamin D

T dung d ch chu n g c và chu n trung gian, pha các dãy dung d ch chu n có n

34

(c) Vitamin E

3.3.3. Kho ng tuy n tính nh kho ng

35


n

c a ch

ph thu c tuy n tính gi a t l di n

tích pic ch t phân tích/di n tích pic ch t chu n v i n K t qu kh o sát s tuy

c a ch

nh kho ng tuy n tính c a t ng

ch B ng 3.4. K t qu kh o sát và Vitamin A

STT

Cppm

Cppm

B ng 3.6. B ng k t qu

Vitamin E

Spic

Cppm

Spic

1

0,0408

2949

0,1385

4195

3,0175

8166

2

0,204

16522

0,277

8268

6,035

30252

3

0,510

37243

0,6925

19015

15,0875

80357

4

2,040

149955

2,77

79870

60,35

343708

5

5,10

357916

6,925

195558

150,875

765104

6

20,40

1467157

27,70

790235

603,5

3243316

i quy:

i quy:

y = 71846x-189,83

28522x

H s R2: 0,9999

i quy:

173,77

y = 5372,1x

H s R2: 1,0000

3.3.4. Gi i h n phát hi n và gi i h

ng

n khi k t qu trên s

Gi i h iv

ng gi m d n

c pic c a ch t phân tích

có chi u cao g p kho ng 3 l n nhi

ng n n.

ng LOQ = 10/3 * LOD. Các giá tr LOD, LOQ tính ng m u tr ng kho ng 5g. S c th hi n Ph l c 2. B ng 3.5. K t qu Vitamin A

nh LOD, LOQ

Vitamin D3

N thêm chu n (ppm)

(µg/100g m u)

LOD

0,015

LOQ

0,05

Vitamin E

N thêm chu n (ppm)

(µg/100g m u)

N thêm chu n (ppm)

1,2

0,01

0,21

0,45

36

4

0,035

0,7

1,5

120

36

Ch tiêu

(µg/100g m u)

Kh i ng cân (g)

2,5073 2,5421 2,6036 Vitamin A 2,5960 2,4767 2,6137

5930,5

H s R2: 0,9997

nh b ng cách thêm chu n v i hàm vào m u tr

ng cân g n Phân tích l p l i 6 l n m u th c ph m b sung có kh ng vitamin A, D3, E và các giá tr l ch chu c tính t i B ng 3.6. cho th l pl t yêu c u theo AOAC [19]. b

nh kho ng tuy n tính

Vitamin D Spic

l pl i

Ch tiêu

Kh i ng cân (g)

2,5073 2,5421 2,6036 Vitamin D 2,5960 2,4767 2,6137

Ch tiêu

Kh i ng cân (g)

2,5073 2,5421 2,6036 Vitamin E 2,5960 2,4767 2,6137

l p l i.

Th tích nh m c (ml)

Di n tích pic

Hàm ng (µg/100g)

Trung bình (µg/100g)

4 4 4 4 4 4

98351 103360 105445 112554 100330 116880

219 227 226 242 226 249

231,5

Th tích nh m c (ml)

Di n tích pic

Hàm ng (µg/100g)

Trung bình (µg/100g)

4 4 4 4 4 4

2539 2277 2512 2553 2494 2309

15,4 13,6 14,7 14,9 15,3 13,4

14,6

Th tích nh m c (ml)

Di n tích pic

4 4 4 4 4 4

238656 257048 251954 258401 229302 260112

Hàm Trung ng bình (mg/100g) (mg/100g)

7,3 7,7 7,4 7,6 7,1 7,6

37

7,5

RSD (%)

Yêu c u c a AOAC

11,6 5,00

< 11%

SD

RSD (%)

Yêu c u c a AOAC

0,8

5,82

< 15%

SD

RSD (%)

Yêu c u c a AOAC

SD

0,23 3,15 < 5,3%


Kh i ng cân (g)

Th tích thêm chu n 13,85 ppm (ml)

Th tích nh m c (ml)

Di n tích pic

(µg/ml)

Hàm ng (µg/100g)

thu h i thu h i b

ng chu

vitamin A, D3, E vào n n m u th c ph m b sung b ng kho ng 120% so v

c các

Vitamin

ng chu n thêm vào

ng ch t phân tích có trong m u th . Tính hi u

N ng

thu h i (%)

3,1120

0,05

4

6997

0,27

34,2

88,1

su t thu h i và so sánh v i tiêu chu n AOAC [19].

3,0881

0,05

4

7112

0,27

35,0

91,1

B ng 3.7. K t qu

3,0293

0,05

4

6721

0,26

33,7

83,8

Vitamin

Vitamin A

thu h i c a vitamin A

Th tích thêm chu n 20,4 ppm (ml)

Th tích nh m c (ml)

2,5087

0,5

4

292771

4,08

650

103

2,5252

0,5

4

290825

4,05

642

102

2,9792

0,5

4

321237

4,47

601

108

2,8907

0,5

4

315465

4,39

608

107

2,9463

0,5

4

314561

4,38

595

105

Kh i ng cân (g)

Di n tích pic

N ng (µg/ml)

0,5

4

305924

4,26

540

95,5

3,1120

0,5

4

300782

4,19

539

93,7

3,0881

0,5

4

323523

4,50

590

107

0,5

4

297874

4,15

B ng 3.8. K t qu

Vitamin D

thu h i (%)

3,1537

3,0293

Vitamin

Hàm ng (µg/100g)

548

thu h i TB (%)

101,7 %

RSD (%)

Yêu c u AOAC

B ng 3.9. K t qu

Vitamin

5,73 %

t 80110% (1 10 ppm)

Vitamin E

Kh i ng cân (g)

Th tích thêm chu n 13,85 ppm (ml)

Th tích nh m c (ml)

Di n tích pic

(µg/ml)

Hàm ng (µg/100g)

2,5087

0,05

4

6691

0,25

40,5

94,1

thu h i c a vitamin E

Kh i ng cân (g)

Th tích thêm chu n 6035ppm (ml)

Th tích nh m c (ml)

Di n tích pic

(µg/ml)

2,5087

0,05

4

641227

2,5252

0,05

4

2,9792

0,05

2,8907

0,05

2,9463

Hàm ng (mg/100 g)

thu h i (%)

119,83

19,1

97,2

629283

117,62

18,6

93,9

4

641752

119,92

16,1

85,8

4

665184

124,25

17,2

93,7

0,05

4

661674

123,61

16,8

91,5

3,1537

0,05

4

658395

123,00

15,6

85,6

3,1120

0,05

4

649328

121,32

15,6

84,4

3,0881

0,05

4

647247

120,94

15,7

84,4

3,0293

0,05

4

641227

119,83

19,1

97,2

N ng

2,5252

0,05

4

6680

0,25

40,2

93,5

2,9792

0,05

4

7034

0,27

35,9

91,7

2,8907

0,05

4

7215

0,27

37,9

97,6

2,9463

0,05

4

7186

0,27

37,1

95,8

3,1537

0,05

4

6857

0,26

33,0

84,2

thu h i (%)

thu h i TB (%)

RSD (%)

Yêu c u AOAC

Nh

thu h i TB (%)

RSD (%)

90,4%

m b o, th hi n ng yêu c u c

i v i vitamin A k t qu

t yêu c u c a AOAC vitamin D k t qu

91,1%

38

Yêu c u AOAC

RSD (%)

5,96%

Yêu c u AOAC

t 80107% (10 100 ppm)

93,9

thu h i c a vitamin D N ng

thu h i TB (%)

5,34%

t 80110% (10 10 0 ppb)

ng n

ng n

1

c t 83,8

10 t yêu c u c a AOAC

thu h i n m c t 93,7 iv i

t yêu c u c a AOAC

i v i vitamin E k t qu ng n

39

10

100ppm.

c t 84,4


3.4. K t qu phân tích m u th c

PH N 4. BÀN LU N

Ti n hành phân tích trên m t s m u s a công th c và th c ph m b sung vitamin A, D, E trên th

ng Vi t Nam. M i m lý m

enzym, xà phòng hóa

c ti n hành theo ng không b

80ºC/ 40 phút [1, 2, 3]

b sung enzym, xà phòng hóa

sung

lý m u có u ki n s

4.1. V

a ch n

m c 3.1. K t qu

u ki n s c ký Hi n nay tiêu chu n qu c gia Vi

tích riêng bi t t ng lo i vitamin A, D, E trong th c ph m/ ch ph m s a [1, 2, 3, 11, 12, 13]; trong

ng s

d ng c t s c ký pha thu n, dung

B ng 3.10. K t qu phân tích m t s m u trên th

ng là n-hexan, isooctan. Lu

nghiên c u

ng

ng d n phân

u ki n s c ký s d ng c

C18, chi u dài c t 25cm, h t nh i c 5µm; v Tên m u

Nhà s n xu t

u ki n x lý m u

Vitamin A (µg/100g)

Vitamin D3 (µg/100g)

Vitamin E (mg/100g)

Có enzym

504

12,1

13

Không enzym

477

10,9

13,1

Hàm ng trên nhãn

540

13

10,9

Có enzym

469

6,8

12,4

Không enzym

439

6,6

12,1

ng trên nhãn

539

7

12,1

Có enzym

744

8,8

5,9

Không enzym

845

7,7

5,8

ng trên nhãn

617

8,8

7,4

Có enzym

417

9,8

8,6

397

9,7

7,8

442

11

8,2

H2O : THF v i t l là 92 : 5 : 3; t c c 3 ch

TPBS Lean Max Adult NSX: 7/5/2016

Công ty TNHH ng Nutricare

HSD: 7/5/2018

TPBS Meta care NSX: 03/6/2016 HSD: 03/6/2018

TPBS Nutricare Mom NSX: 04/7/2016

Công ty TNHH ng Nutricare

Công ty TNHH ng Nutricare

HSD: 04/7/2018 S a công th c Friso gold 4 NSX: 18/3/2016

Công ty TNHH Friesland Campina.

HSD: 18/3/2018

S

các m u th

Không enzym ng trên nhãn

c th hi n

b

i ng n (g n 16 phút), các pic tách r i nhau và không

ng b i n n m u. Lu

os

v nhi

c t, cho th y v i nhi

c t 40ºC, th i gian phân tích t t, th ki

c t

u này có th gi

d

u

ng là nh ng ch t

u ki n nhi

phòng thí nghi m t i Vi t Nam có s

i l n theo mùa s

l p l i c a th

t phân

tích. 4.2. V x lý m u Trong m t s nghiên c

c s d ng trong th y phân m u

phân tích vitamin K vì vitamin này không b

ng v a s d

pháp xà phòng hóa v a s d c tri

ng ki m nên V i m c tiêu c i thi n

quá trình x lý m

.V in nm

h tr quá trình th y phân m u l a ch n có thành ph n ch y u là protein nên

s d ng enzym protease, k t qu cho th y s d ng enzym khá hi u qu trong quá trình x lý m u. B ng vi c s d ng enzym, quá trình xà phòng hóa ch c n di n ra

40

ng là MeOH :

dòng 1,5ml/ phút; th i gian phân tích

không th áp d

Ph l c 3.

o Shodex

u ki n nhi

th p (60º) v i kho ng th i gian v a ph i (60

41


u ki n th y phân m u không kh c nghi t giúp h n ch quá trình th y phân các t p khác trong m

ng th i h n ch

h y các vitamin. K t qu kh o sát ho

c s m t mát, phân

p v i m t s nghiên c u v

u ki n làm vi c c a enzym protease ki m [40, 46]. K t qu

kh o sát dung môi chi

y, vi c s d ng n-hexan : petroleum

ether cho hi u qu chi t t

c s d ng ch m t lo i dung môi, k t qu

p v i nh ng khuy n cáo c a TCVN 8276:2010.

m u th c ph

ng qui trình th y phân

phân tích vitamin A, E trong s a b t

gian th

c a tác gi Cao Công Khánh [8], th

u ki n 80ºC, th i

i ti n qui trình x lý m

ng b ng cách

c i thi n hi u su t th y phân, s d ng h n h p dung môi chi t n-he

ng th i c 3 lo i vitamin

A, D, E. Vitamin A, D, E là các vitamin không b n v i nhi

Trong kho ng kh o sát, t t c các vitamin nghiên c

, ánh sáng và

ng th i các k thu t chi t tách c n ti

u ki n

này phù h

c, ti n

sung trong th c ph m th

nh

ng th i vitamin A, D3, E c n có k thu t x lý m u, làm s ch m u t t thu h i c a vitamin D3 m i c a vitamin D3, E t 84

t yêu c u. K t qu

t yêu c u v

tinh khi

t trên 99%, th

chu n, m u tr ng thêm chu n có s sai l Th

am u .

n m u tr ng thêm chu n, nh n th y

thu h i c a vitamin A t 93

ng yêu c u c a AOAC [19],

thu h i c a vitamin D cao

t

qu phân tích c a m t s tác gi [52,59]. 4.4. K t qu phân tích m u th c ng d

phân tích m t s m u

th c ph m b sung, s a công th c trên th

ng th i so sánh hi u qu

i v i các m u có s d

do nhi

, quá trình th y phân di n ra n chi t l ng

nh

l ng không g p các hi n i

nhanh, các pic d nh n bi t, không b dính chân v i các pic l khác. Các vitamin A, D3 nên nh y c m v i nhi

c xà phòng hóa s t n t i

d ng ancol

, vi c s d ng quá trình th y phân có b sung

ng th i c 3 vitamin A, D3, E v i 42

thu h i

. Th i gian phân tích cho c 3 vitamin là g

, k t qu

hành th

ng các vitamin

ng b

th y phân cho k t qu phân tích t

4.3. V th

c hi

phát hi

v ir

Vitamin D3 có ho t l

xà phòng hóa. K t qu cho th

u ki n s c ký l

u có m

x lý m u gi a các m u có b sung và không b sung enzym trong quá trình

h n ch s phân h y các vitamin.

V i quy trình x lý m

nh c a tác gi

quan tuy n tính ch t ch gi a t s di n tích pic c a vitamin v i n

d b oxy hóa b i oxy trong không khí. Quá trình th y phân c n b sung ch t ch

t qu th

nh

Semahat K. [49].

u ki n không b sung enzym, dung môi chi t

là n-

i k t qu th

nghiên c u trong th c ph m b sung và s a công th c.

m là giá thành th p. K t qu

nghiên c u c a tác gi

vitamin E là 0,45ppm. K t qu

> 0,995. Kho ng n

c s d ng trong các nghiên c u c a các tác gi chi t các vitamin tan trong d u, l

LOD c a vitamin A là 0,015ppm, LOD c a vitamin D3 là 0,01ppm, LOD c a

43


enzym, nhi

th y phân th p s h n ch

quá trình th y phân

nhi

th

ng c a nhi

ng th i

K T LU N VÀ KI N NGH

y khi phân tích b ng s c ký K T LU N

xu t hi n tín hi u t

Thông qua k t qu

ts k t

lu n sau: ng th i ba vitamin A, D3, E trong s a công th c và th c ph m b sung bao g - X lý m u: M m

n sau:

cb

ng nh t

n hành th y phân trong dung d ch KOH 20%/Ethanol 60ºC trong 60 phút. M u sau khi th

c chi t l p 2 l n b ng dung

môi n-hexan + petroleum ether theo t l 1:1. D ch chi dung d ch NaCl loãng r

nhi

c r a s ch v i

40ºC

n c n. Hòa c n b ng

methanol, l c qua màng l -

nhi t

th ng HPLC.

u ki n s c ký: + C t s c ký: Shodex C18 (250mm*4,6mm), c h t nh i 5µm . ng: MeOH : H2O: THF = 92 : 5 : 3.

+

+ Detector PDA t i 265nm (vitamin D), 292nm (vitamin E) và 325nm (vitamin A). +T

bu ng c t: 400C.

dòng: 1,5 ml/phút, nhi

quy trình phân tích t i Ph l c 4). * Th

xây d

th y có tính ch n l

c th

l pl

nh cho

thu h i t

ng yêu c u c a AOAC, có th áp d ng vào th c t . * d

ng d ng trong phân tích m u th c: Áp d c

n

ng vitamin A, D3, E

trong m t s m u th c ph m b sung và s a công th c trên th

44

45

ng.


KI N NGH

TÀI LI U THAM KH O

- S d ng enzym trong th y phân các m u th c ph nhi u h a h n vì thân thi n v

ng nghiên c u có i làm thí nghi m, m t s

nghiên c u th m chí ch c n s d ng enzym là tác nhân duy nh m u mà không c t

1. B Khoa h c và Công ngh (2010), Tiêu chu n qu c gia TCVN 8276 :

th y phân

ng n n m u c th . ng cho k t qu

Th c ph m

ng vitamin E b ng s c ký l ng hi u ng

-, -, -, và - tocopherol.

2. B Khoa h c và Công ngh (2011), Tiêu chu n qu c gia TCVN 8972ng vitamin A, D3, E

tin c y cao, c n ti p t c nghiên c u m r

1:2011

pho mát,....

Th c ph m

ng vitamin A b ng s c ký l ng hi u

ph

i

c, s a chua, váng s a và các s n ph m t s

nh 13-cis-retinol và t t c

ng phân trans-

retinol. 3. B Khoa h c và Công ngh (2011), Tiêu chu n qu c gia TCVN 8973 :

- M c dù hi n nay có nhi

ng vitamin b ng

s c ký l ng kh i ph , s d ng k thu t chi t pha r m chi phí, s d ng trang thi t b thí nghi m trong c

2010

ng nghiên c u này c n ti p

v

Tài li u Ti ng Vi t

n, phù h p v

c.

2011

Th c ph m

ng vitamin D b ng s c ký l ng hi u

nh cholecalciferol (D3) ho c ergocalciferol (D2).

làm s ch và làm giàu n, ti t ki m

4. B Y t (2006),

c lâm sàng, Nhà xu t b n Y h c, Hà N i.

u ki n c a nhi u phòng

5. B Y t (2006),

c t p 2, Nhà xu t b n Y h c, Hà N i.

6. B Y t (2009),

n Vi t Nam IV, Nhà xu t b n Y h c, Hà N i.

7. Nguy n Kim Hùng (1986), Bài gi ng vitamin, Nhà xu t b n Y h c, Thành ph H Chí Minh. 8. Cao Công Khánh (2010), "Nghiên c u xây d ng quy trình xác

ng

th i vitamin A và vitamin E trong s a b ng k thu t HPLC", Lu ch 9. Mai T t T

ih

c Hà N i.

Trâm (2007),

c lý h c t p 2, Nhà xu t b n Y h c,

Hà N i. 10. Vi n Ki m nghi m an toàn v sinh th c ph m qu c gia (2010), Th

nh

c và vi sinh v t, Nhà xu t b n khoa h c và k thu t.

46


Tài li u Ti ng Anh

22. Ball G. F. M. (2006), Vitamins in Food

Analysis, Bioavailability, and

11. AOAC Offical method 992.03 (1996), "Vitamin E activity (all-rac- -

Stability, Taylor & Francis, US.

tocoferol) in milk-based infant formula". Liquid chromatographic method.

23. Blake J. C. (2007), "Status of Methodology for the Determination of Fat-

12. AOAC Offical method 992.06 (1992), "Vitamin A (retinol) in milk

Soluble Vitamins in Foods, Dietary Supplements, and Vitamin Premixes",

based infant formulas". Liquid chromatographic method.

Journal of AOAC international, 90 (4), p. 897-910.

13. AOAC Offical method 995.05 (1995), "Vitamin D in infant formulas and

24. Blanco M., Coello J., Iturriaga H., Maspoch S., Gómez-Cotín T.,

enteral products". Liquid chromatographic method.

Alaoui-

14. AOAC Offical method 999.15 (2006), Vitamin K in milk and infant

determination of fat-soluble vitamins in multivitamin pharmaceutical , Springer-Verlag

15. AOAC Offical method 2001.13 (2001), "Vitamin A (retinol) in foods".

1995.

Liquid chromatographic method.

25. Blanco M., Coello J., Iturriaga H., Maspoch S. (1995), "Simultaneous

16. AOAC Offical method 2002.06-2005 (2005), Retinyl palmitate (vitamin

spectrophotometric determination of fat-soluble vitamins in multivitamin pharmaceutical preparations", Fresenius Journal of Analytical Chemistry,

17.

351, p.315 319. 26. Britten G. (1995), UV-Visible spectroscopy in carotenoids, Spectroscopy.

Fluorescence Detection.

27. Carroll K. K., Herting D.C. (1964): "Gas

18.

soluble vitamins",

of 13-cis and all-trans Vitamin A Palminate (Retinyl Palminate), Vitamin

474.

A Acetate (Retinyl Acetate), and Total Vitamin E (dl- -Tocopherol and dl-

28. Chen L., Liu Z., Kang X. (2011), "Determination of Fat-soluble Vitamins

-Tocopherol Acetate) in Infant Fo

-

liquid chromatography of fat , 41, p 473-

in Food and Pharmaceutical Supplements Using Packed-fiber Solid Phase

Phase HPLC

Extraction (PFSPE) for Sample Preconcentration/ Clean-up", Procedia

19.

Environmental Sciences, 8, p. 588

595.

29. Chen Xq., Bi C., et al 20. Arbatskii A. P., Afon'shin G. N., Vostokov V. M. (2004): "Determination

of an extracellular alkaline serine protease from a newly isolated

of Vitamins in Feed and Foodstuffs by High-Performance Liquid

Stenotrophomonas maltophilia

Chromatography", Journal of Analytical Chemistry, 59 (12), p.1186-1189.

Research, Vol.7(33), pp. 4244-4250.

21. Ball G. F. M. (1998), Bioavailability and Analysis of Vitamins in Foods,

30. Delgado

Springer, US.

Carabias

Zamarreno M.M., Gonza'lez

African Journal of Microbiology

Maza I., Sa'nchez

Pe'rez A.,

Martinez R. (2002): "Seperation and simutaneous determination of


water soluble and fat soluble vitamins by electrokinetic capillary

40. Li

Jung Y., Ya

Hui C. and Shann

chromatography", Journal of chromatography A, 953, p. 257-262. 31. Dionex (2009), Determination of Water- and Fat-Soluble Vitamins in

Journal of Marine Science and Technology, 21, p.105-110.

Functional Waters by HPLC with UV-PDA Detection, Application Note 216.

41. Luque G., Luque de C. (2001), "Review: Extraction of fat-soluble

32. Donald B. P. (2009), Determination of Vitamin D in foods: a review,

vitamins", Journal of Chromatography A, 935, p. 3 11.

Mortimer House, UK.

42. Nolet L.M.N (1992): "Food analys by HPLC", Marcel Dekker, p.276-339.

33. Granado-Lorencio F., Olmedilla-Alonso B., Herrero-Barbudo C., Blanco-

43

Navarro I. (2006), "Simultaneous determination of vitamins A, E and 25-OH-

Fruits, Fruit Vegetable Juices, and Diet Supplements", Food Analytical

vitamin D: Application in clinical assessments", Clinical Biochemistry, 39,

Methods, 5, p. 1167 1176.

p.180 182.

44. Rizzolo A., Polesello S. (1992): "Review: Chromatographic determination

34. L.T.H. Duong, Kraak J.C. (2000), "Application of micellar electrokinetic

of Vitamins in foods", Journal of Chromatography, 624, p. 103-152.

chromatography for the separation of retinoids", Journal of pharmaceutical

45. Rychlik M. (2011), Fortified Foods with vitamins, Wiley-vch, US.

and biomedical analysis, 22 (5), p. 879-885.

46. Ruan J. S. de C. and Helia H. S.

35. Hsiang-chi H. (2013), Analyses of multivitamins in nutraceuticals by

oryzae: Biochemical characterization and application as a Potential

reverse phase HPLC with DAD, ELSD and MS, Clemson University.

biocatalyst for production of prote

36. Jedlicka A., Klimes J. (2005), "Review: Determination of Water- and Fat-

Journal of food processing, volume 2014.

Soluble Vitamins in Different Matrices Using High-Performance Liquid

47. Salvador A., Jaime M.A., Guardia M. de la, Becerra G. (1998):

Chromatography", Chemical Papers., 59 (3), p. 202

222.

, "Multivitamin Analysis of

Supercritical fluid extraction and supercritical fluid chromatography of

37. Kmostak S., Kurtz DA. (1993), Rapid determination of supplemental

vitamin E in pharmaceutical

vitamin E acetate in feed premixes by capillary gas chromatography, Journal

53-55.

Association of Official analytical chemist, 76, p.735-741.

48. Schiewe J., Mrestani Y., Neubert R. (1995), "Application and

38. Kucukkolbasi S., Ires N., Kara H.

optimization of CZE in vitamins analysis", Journal of Chromatography A,

Simultaneous Determination of Some Water and Fat Soluble Vitamins in

717, p. 255.

Journal of Selcuk University Natural and Applied

Analytical Communication, 35, p

49. Semahat K., Onur B. (2013): "Simultaneous and accurate determination of

Science, Online ISSN: 2147-3781.

water and fat soluble vitamins in multivitamins tablets using an RP-HPLC

39

method",

vitamin determinations pp.34-106.

-bioavailablity and analysis vitamins in food,

, 36 (7), p. 1044-1051.

50. Sheng M., Qian H. (1998): "Simultaneous determination of fat soluble vitamins A, D and E and pro-vitamin D in animal feeds by one- step


extraction and high-performance liquid chromatography analysis", Journal of

PH

L C1

chromatography A, 825, p. 127-133. 51. Sheppard A. J., Prosser A. R., Hubbard W. D. (1972): "Gas chromatography of the fat

PL 1.1. Ph h p th UV c a vitamin A

soluble vitamins: A review", Journal of the

American Oil Chemists Society, 49 (11), p. 619-633. 52.

-soluble vitamins from food maxtrix for Agilent Application Solution, Application Note.

milk powder using supercritical fluid extraction for sample cleanElsevier, Journal of Chromatography A 874, pp.275-283. 54. Turner C., Persson M., Mathiasson L., Adlercreutz P. and J.W. King

PL 1.2. Ph h p th UV c a vitamin D

-catalyzed reactions in organic and supercritical solvents: application to fat-soluble vitamin determination in milk powder and infant Enzyme and Microbial Technology, 29, p.111 121. 55. US Pharmacopeia 36 and National Formulary 31, The Stationary Office, USA. 56. Walter K. (1967): "Gas Chromatography of Vitamin B6 and Other Vitamins", Lectures on Gas Chromatography, p. 89-104. 57. Waters Coporation (2012): "Extraction of Fat Soluble vitamins from PL 1.3. Ph h p th UV c a vitamin E

fortified food using Oasis HLB", Application Note, p.2. 58. Xiuping X., Jinming Y., Pingly H. (2008): "Silmutaneous determination of five fat soluble vitamins in feed by high performance liquid chromatography

following

solid

phase

extraction",

Journal

of

Chromatographic Science, 46, p.345-350. 59. Zhang Y., Jin Y., Xu Q. and Jeffrey R. of Vitamins A, E, and D 3 in Milk-Based Nutritionals by On-Line TwoThermo Scientific, Application Note 1117.

i


PH

L C2

PH L C 3

m u tr ng

PL 2.1. S

PL 3.1. S

mAU 292nm4nm (1.00)

m u TPBS Lean Max Adult kh

ng cân 5,6898g, x lý

m u b ng cách th y phân b ng enzym protease + KOH/EtOH trong 60 phút

10

ng MeOH: H2O: THF = 92: 5: 3, t

5

tích tiêm 20µl, nhi

dòng 1,5ml/ phút, th

c t 40ºC.

0 2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

min

mAU Ch1-265nm,4nm (1.00) Ch2-292nm,4nm (1.00) Ch3-325nm,4nm (1.00)

275 250

PL 2.2. S

m u tr ng thêm chu n vitamin A

n

225

LOQ

200

/4.082/3060

150

1

125 100 75

0

/11.609/6910

2

/15.198/852945

/4.036/761093

175

mAU 3 325nm,4nm (1.00)

50 25

-1

0

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

min

-25 0.0

PL 2.3. S 2.0

m u tr ng thêm chu n vitamin D

n

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

min

LOQ. PL 3.2. S

mAU 265nm,4nm (1.00)

m u TPBS Lean Max Adult kh

ng cân 5,7691g, x lý

m u b ng cách th y phân b ng KOH/EtOH trong 40 phút

ng

1.5

MeOH: H2O: THF = 92: 5: 3, t

/11.921/1901

1.0 0.5

nhi

dòng 1,5ml/ phút, th tích tiêm 20µl,

c t 40ºC.

0.0 0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

mAU Ch1-265nm,4nm (1.00) Ch2-292nm,4nm (1.00) Ch3-325nm,4nm (1.00)

275

min

250

m u tr ng thêm chu n vitamin E

PL 2.4. S

n

225

LOQ

200

mAU 292nm,4nm (1.00) 4

/4.043/659716

150

3 /15.121/6578

125 100 75 50

0

25

/14.528/3825

1

/11.636/6526

2

/15.256/874029

175

0

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

min -25

u ki n s

ng MeOH: H2O:THF = 92:5:3, t 1,5ml/ phút, th tích tiêm 20µl, nhi c t 40ºC.

ii

dòng

0.0

2.5

5.0

7.5

iii

10.0

12.5

15.0

min


PL 3.3. S

m u s a công th c Friso Gold 4 kh

ng cân 5,5703g,

PH L C 4 QUY TRÌNH PHÂN TÍCH VITAMIN A, D, E

x lý m u b ng cách th y phân b ng enzym protease + KOH/EtOH trong 60 phút

ng MeOH: H2O: THF = 92: 5: 3, t

th tích tiêm 20µl, nhi

dòng 1,5ml/ phút, M u cân 5 g

c t 40ºC.

mAU Ch1-265nm,4nm (1.00) Ch2-292nm,4nm (1.00) Ch3-325nm,4nm (1.00)

275

+ 0,1 g BHT + 0,5 1,0ml enzym protease > 500U/g Siêu âm 15 phút

250 225 200 175

+ 50 ml KOH 20%/ Ethanol

125 100

/11.678/3581

75 50 25

Th y phân 60 C/60 phút

/15.329/551558

/4.049/615614

150

+ n-hexan : petroleum ether (50:50) × 2 l n(100 ml + 50 ml)

0 -25 0.0

2.5

PL 3.4. S

5.0

7.5

10.0

12.5

m u s a công th c Friso Gold 4 kh

20µl, nhi

Chi t l ng

min

ng cân 5,3306g,

x lý m u b ng cách th y phân b ng KOH/EtOH trong 40 phút ng MeOH: H2O: THF = 92: 5: 3, t

15.0

R ab

80ºC, pha

c mu i lo i ki m,enzym.

dòng 1,5ml/ phút, th tích tiêm Cô quay chân không 40ºC môi chi t

c t 40ºC.

mAU Ch1-265nm,4nm (1.00) Ch2-292nm,4nm (1.00) Ch3-325nm,4nm (1.00)

275

l ng

250

+ Hòa tan c n v

225

ng methanol t 2-5ml (*)

200 175

L cm u

Ch y HPLC

125 100

/11.656/5843

75

/15.255/460960

/4.043/560964

150

50 25

(*) Th tích hòa c n ph thu

ng vitamin trong m u

u ki n s c ký:

0 -25 0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

min

c sóng phân tích: Vitamin A (325nm), Vitamin D (265nm); Vitamin E (292nm). - C t s c ký: C -T - Nhi

iv

o Shodex C18 (250mm * 4,6mm), c h t nh i 5µm.

ng: MeOH : H2O : THF = 92: 5: 3. dòng: 1,5ml/ phút; Th tích tiêm: 20µl. c t: 40ºC.

v


Vitamin a, d, e trong sữa công thức và thực phẩm bổ sung vi chất dinh dưỡng bằng hplc