Xây dựng phương pháp định lượng acid chlorogenic trong viên nang mềm bổ gan bằng HPLC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ MAI

XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG ACID CHLOROGENIC TRONG VIÊN NANG MỀM BỔ GAN BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

HÀ NỘI 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ MAI

XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG ACID CHLOROGENIC TRONG VIÊN NANG MỀM BỔ GAN BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 8720210

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học : PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh

HÀ NỘI 2018

LỜI CẢM ƠN Trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn tôi đã nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ và góp ý tận tình của quý thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và lời cảm ơn chân thành nhất đến PGS TS. Nguyễn Thị Kiều Anh trường Đại học Dược Hà Nội đã dành nhiều thời gian, tâm huyết hướng dẫn chỉ dạy tận tình trong suốt quá trình nghiên cứu tài liệu, thực nghiệm để tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ dược học.

Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô trong ban Giám hiệu, phòng sau Đại học, bộ môn Hóa phân tích - trường Đại học Dược Hà Nội, cảm ơn ban lãnh đạo và cán bộ phòng phân tích Kiểm nghiệm - Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc Gia và thầy cô bộ môn Hóa lý đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành chương trình học tập và quá trình thực hiện nghiên cứu đề tài.

Tôi xin cảm ơn công ty cổ phần Traphaco đã tạo điều kiện về thời gian, hỗ trợ mẫu nghiên cứu giúp tôi hoàn thành luận văn này Cảm ơn các bạn bè đồng nghiệp, bố mẹ, anh chị em trong gia đình, chồng và con gái - những người luôn động viên, là chỗ dựa tinh thần giúp đỡ tôi hoàn thiện luận văn.

Trong phạm vi khả năng của mình, tôi đã cố gắng hoàn thành luận văn một cách tốt nhất có thể, tuy nhiên cũng không tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận được sự góp ý quý báu của quý thầy cô, các anh chị em và các bạn đồng nghiệp.

Hà Nội, ngày 03 tháng 4 năm 2018 Học viên

Nguyễn Thị Mai

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ...........................................

DANH MỤC CÁC BẢNG ....................................................................................

DANH MỤC CÁC HÌNH ..................................................................................... ĐẶT VẤN ĐỀ ...................................................................................................... 1 PHẦN 1: TỔNG QUAN...................................................................................... 3 1.1. Tổng quan về các dược liệu trong thành phần chế phẩm viên nang mềm Bổ

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

gan ......................................................................................................................... 3 1.1.1. Actiso........................................................................................................... 3 1.1.2. Rau đắng đất ................................................................................................ 4 1.1.3. Bìm bìm biếc ............................................................................................... 5 1.2. Acid chlorogenic ............................................................................................ 6 1.2.1. Công thức cấu tạo, đặc điểm vật lý hóa học ............................................... 6 1.2.2. Tác dụng ...................................................................................................... 7 1.2.3. Các phương pháp xác định acid chlorogenic .............................................. 7 1.3. Tổng quan về cao thuốc ............................................................................... 11 1.3.1. Định nghĩa ................................................................................................. 11 1.3.2. Phương pháp điều chế ............................................................................... 12 1.3.3. Yêu cầu chất lượng.................................................................................... 13 1.4. Tình hình tiêu chuẩn hóa trong chế phẩm Đông Dược ................................ 14 1.5. Tổng quan về phương pháp nghiên cứu sắc ký lỏng hiệu năng cao ............ 15 PHẦN 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 20 2.1. Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu và trang thiết bị ............................. 20 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu................................................................................ 20 2.1.2. Chất chuẩn, hóa chất, dung môi ................................................................ 20 2.1.3. Phương tiện, thiết bị nghiên cứu ............................................................... 20 2.2. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 21 2.2.1. Nghiên cứu phương pháp xử lý mẫu ......................................................... 21

2.2.2. Khảo sát điều kiện sắc ký .......................................................................... 22 2.2.3. Thẩm định phương pháp định lượng acid chlorogenic trongmẫu cao Actiso và viên nang mềm Bổ gan ....................................................................... 23 2.2.4. Ứng dụng .................................................................................................. 24 2.2.5. Phương pháp xử lý số liệu ......................................................................... 24 PHẦN 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ............................................................... 26 3.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện xử lý mẫu ................................................... 26 3.1.1. Khảo sát dung môi loại chất béo ............................................................... 26

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

3.1.2. Khảo sát dung môi chiết ............................................................................ 27 3.1.3. Khảo sát thời gian chiết ............................................................................. 28 3.2. Thẩm định phương pháp .............................................................................. 37 3.2.1. Độ chọn lọc: .............................................................................................. 37 3.2.2. Tính thích hợp của hệ thống sắc ký .......................................................... 39 3.2.3. Khoảng nồng độ tuyến tính ....................................................................... 39 3.2.4. Độ chính xác.............................................................................................. 40 3.2.5. Độ đúng ..................................................................................................... 42 3.2.6. Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) ......... 44 4. Ứng dụng ......................................................................................................... 45 4.1. Định lượng acid chlorogenic trong cao actiso ............................................. 45 4.2. Định lượng acid chlorogenic trong một số lô chế phẩm viên nang mềm Bổ gan trên thị trường ............................................................................................... 46 PHẦN 4. BÀN LUẬN ........................................................................................ 49 1. Lựa chọn phương pháp phân tích .................................................................... 49 2. Về xây dựng phương pháp phân tích .............................................................. 50 3. Về thẩm định phương pháp phân tích ............................................................. 51 4. Về ứng dụng phương pháp xây dựng được trong phân tích mẫu thực ........... 51 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................... 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ACG

Acid chlorogenic

AOAC

Hiệp hội các nhà hóa học phân tích chính thức (Association of Official Analytical Chemists)

HPTLC

Sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao (High Performance Thin Layer Chromatography)

HPLC

Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography)

LOD LOQ MeCN MeOH PTFE RSD YHCT

International Conference on Harmonisation

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

ICH

Giới hạn phát hiện (Limit of detection)

Giới hạn định lượng (Limit of quantitation) Acetonitril Methanol

Polytetrafluoroethylene

Độ lệch chuẩn tương đối ( Relative Standard Deviation) Y học cổ truyền

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. Kết quả khảo sát dung môi loại béo khi xử lý mẫu viên nang

26

mềm Bổ gan 27

Bảng 3. Kết quả khảo sát thời gian chiết

28

Bảng 4. Các hệ gradient tỷ lệ pha động và tốc độ dòng

32

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Bảng 2. Kết quả khảo sát dung môi chiết

Bảng 5. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính

39

Bảng 6. Tính thích hợp của hệ thống sắc ký

39

Bảng 7. Kết quả đánh giá độ chính xác của phương pháp trên cao

40

actiso

Bảng 8. Kết quả đánh giá độ chính xác của phương pháp trên viên

41

nang mềm Bổ gan

Bảng 9. Kết quả khảo sát độ đúng trên cao actiso

42

Bảng 10. Kết quả khảo sát độ đúng trên viên nang mềm Bổ gan

43

Bảng 11. Kết quả giới hạn phát hiện

44

Bảng 12. Kết quả định lượng acid chlorogenic trên mẫu cao actiso

45

Bảng 13. Kết quả định lượng acid chlorogenic trên mẫu viên nang

47

mềm Bổ gan

DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. Công thức cấu tạo acid chlorogenic

6

Hình 2. Sơ đồ hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

15

Hình 3. Biểu đồ kết quả khảo sát nồng độ dung môi chiết acid

28

chlorogenic trong viên nang mềm Bổ gan (n = 2) Hình 4. Kết quả khảo sát thời gian chiết acid chlorogenic trong viên

29

nang mềm Bổ gan (n=2) 30

Hình 6 . Sắc ký đồ khảo sát gradient pha động chương 1(a), hệ 2(b) và

33

hệ 3(c)

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Hình 5. Sắc ký đồ tách chất phân tích với các hệ pha động

Hình 7. Sắc ký đồ đánh giá ảnh hưởng của nhiệt cột

34

Hình 8. Phổ UV của pic acid chlorogenic

35

Hình 9. Sắc ký đồ mẫu thử cao actiso

36

Hình 10. Sắc ký đồ của mẫu thử viên nang mềm Bổ gan A.01.0872017

37

(a), mẫu chuẩn (b), mẫu placebo (c), mẫu thử thêm chuẩn (d)

Hình 11. Sắc ký đồ của mẫu cao actiso (a), mẫu chuẩn (b), mẫu

37

placebo (methanol 60%) (c), mẫu thử thêm chuẩn (d) Hình 12. Chồng phổ UV và tinh khiết píc của mẫu viên nang mềm Bổ

38

gan Hình 13. Chồng phổ UV và tinh khiết píc của mẫu cao actiso

38

Hình 14. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và diện tích

40

pic

Hình 15. Sắc ký đồ xác định LOD của phương pháp dung dịch

44

chuẩn/placebo (a) và dung dịch chuẩn/MeOH 60% (b) 45

Hình 17. Sắc ký đồ của mẫu thử viên nang mềm Bổ gan

47

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Hình 16. Sắc ký đồ của mẫu cao actiso AC04

ĐẶT VẤN ĐỀ Từ ngàn năm các bài thuốc YHCT phòng và chữa bệnh lưu truyền trong dân gian đã trở thành nhu cầu của con người và cho đến nay nó vẫn giữ một vai trò rất quan trọng trong nhiệm vụ chăm sóc và bảo vệ sức khỏe nhân dân. Sử dụng thuốc có nguồn gốc tự nhiên có tác dụng chữa bệnh tốt, giúp điều hòa, cân bằng hoạt động các cơ quan, bộ phận trong cơ thể. Với xu hướng “trở về thiên nhiên” thì việc sử dụng các thuốc từ dược liệu của người dân ngày càng gia tăng do thuốc ít độc hại và ít gây tác dụng phụ so với thuốc tân dược.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Thuốc Đông dược nói chung và dược liệu nói riêng cần phải qua chế biến trước khi đưa vào sử dụng. Trước đây, dược liệu được dùng dưới dạng cây tươi hoặc phơi sấy khô, chế biến (trích, tẩm, sao…) sau đó được hãm, sắc uống và dùng theo kinh nghiệm nên không kiểm soát được hàm lượng, chất lượng cũng như hiệu quả điều trị. Ngày nay, với thành tựu vượt bậc của công nghiệp hóa, hiện đại hóa trong ngành Dược đã nghiên cứu, phát triển và ứng dụng bào chế các dạng chế phẩm như viên nang, viên nén… từ bột dược liệu, cao dược liệu và dịch chiết dược liệu. Việc tiêu chuẩn hóa ổn định chất lượng các sản phẩm này cần tiêu chuẩn hóa nguồn nguyên liệu đầu vào. Tuy nhiên, nguyên liệu sản xuất được lấy từ nhiều nguồn nên mức hàm lượng hoạt chất chính giữa các lô nguyên liệu không đồng nhất. Do đó, để ổn định chất lượng sản phẩm cần tiêu chuẩn bán thành phẩm trước khi đưa vào sản xuất.

Actiso được trồng trên quy mô lớn và được sử dụng làm nguyên liệu chính trong nhiều chế phẩm Đông dược. Cao Actiso cùng với cao Rau đắng đất và cao Bìm bìm biếc có trong công thức bào chế các chế phẩm Bổ gan như viên nang mềm và viên bao đường Boganic của công ty CP Traphaco, viên nang mềm Giadogane của HD Pharma, viên nang cứng Chobil của DHG Pharma, nang mềm (cứng) Liverbil của công ty CP Dược OPC,... Sự phối hợp của 3 vị thuốc quý này có tác dụng tăng cường chức năng gan - giải độc - mát gan.

Hoạt chất acid chlorogenic có trong Actiso có tác dụng chống oxy hóa, chống viêm, ức chế sự phát triển của khối u; chống sự đột biến gen của tế bào; 1

tiêu diệt chất gây ung thư, có tác dụng chống virus, kháng khuẩn và chống nấm đi kèm độc tính ở mức độ thấp.

Acid chlorogenic là hoạt chất được yêu cầu định lượng trong nhiều dược liệu như kim ngân hoa trong Dược điển Trung Quốc 2015 [13]; Dược điển Mỹ 38 [26], yêu cầu định lượng phenol tổng (trong đó có thành phần acid chlorogenic) trong Echinacea angustifolia DC.(Fam. Asteraceae) và Echinacea pallida (Nutt.) (Fam. Asteraceae) bằng HPLC; Dược điển Châu Âu [14] quy định định lượng ACG trong lá và cao khô chiết xuất từ lá actiso bằng phương

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

pháp HPLC, với yêu cầu hàm lượng CGA không ít hơn 0,8% trong lá và 0,6% trong cao khô chiết xuất từ lá. Nhưng chuyên luận actiso trong Dược điển Việt Nam IV [1] mới chỉ yêu cầu định lượng cynarin trong lá và cao đặc bằng phương pháp quang phổ.

Để góp phần nâng cao tiêu chuẩn chất lượng của chế phẩm viên nang mềm có thành phần chứa Actiso, Rau đắng đất và Bìm bìm biếc chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu: “Xây dựng phương pháp định lượng acid chlorogenic trong viên nang mềm Bổ gan bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao”, với các mục tiêu sau:

- Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng acid chlorogenic trong cao Actiso và viên nang mềm Bổ gan bằng HPLC.

- Ứng dụng phương pháp đã xây dựng định lượng acid chlorogenic trong một số mẫu cao Actiso và chế phẩm viên nang mềm Bổ gan đang lưu hành trên thị trường.

2

PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về các dƣợc liệu trong thành phần chế phẩm viên nang mềm Bổ gan 1.1.1. Actiso 

Đặc điểm thực vật, phân bố của cây actiso.

Actiso có tên khoa học là Cynara scolymus L., thuộc họ Cúc

(Asteraceae). Cây thảo lớn, sống hai năm hoặc lâu năm, cao 1 - 1,2 m, có thể đến 2 m. Thân ngắn, thẳng và cứng, có khía dọc, phủ lông trắng như bông. Lá

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

to, dài, mọc so le, phiến lá xẻ thùy sâu và có răng không đều, mặt trên xanh lục, mặt dưới có lông trắng; cuống lá to và ngắn.

Cụm hoa to mọc ở ngọn thân thành đầu màu đỏ tím hoặc tím lơ nhạt; lá bắc ngoài của cụm hoa rộng, dày và nhọn, đế cụm hoa nạc, phủ đầy lông tơ, mang toàn hình ống.

Quả nhẵn bóng, màu nâu sẫm, có mào lông trắng [6], [2], [4].

Hiện nay cây được trồng nhiều nhất ở Đà Lạt (Lâm Đồng) và Sa Pa (Lào Cai), tổng diện tích lên tới vài trăm hecta. 

Bộ phận dùng

Lá, hoa (phần trên mặt đất)

Dược điển Việt Nam IV [1], quy định dùng lá đã phơi hoặc sấy khô.

Rễ và thân cũng được dùng làm thuốc [3]. 

Thành phần hóa học Lá actiso chứa: - Acid hữu cơ bao gồm: Acid phenol: Cynarin (acid 1-3 dicafeyl quinic)

và các sản phẩm thủy phân (acid cafeic, acid chlorogenic, acid neo chlorogenic).Acid alcol: acid hydroxymethylacrilic, acid malic, acid lactic, acid fumaric,…

3

- Hợp chất flavonoid (dẫn chất của luteolin) bao gồm cynarosid (luteolin 7 - D - glucopyrano - sid), scolymosid (luteolin - 7 - rutinosid) và cynarotriosid (luteolin - 7 - rutinosid - 3’ - glucosid).

- Thành phần khác: Cynaropicrin, enzym: oxidase, peroxidase, oxigenase, catalase. Các enzym hoạt động mạnh ở pH 4-7,6 và dễ phá hủy hoạt chất trong quá trình phơi, sấy, chế biến. Nhiều chất vô cơ.

Dược điển châu Âu (EP) 8.0 qui định hàm lượng acid chlorogenic trong lá actiso khô phải không dưới 0,8% [14].

Công dụng của actiso

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T



Ngoài việc có thể dùng đế hoa hoặc lá bắc để ăn, actiso dùng làm thuốc thông tiểu tiện, thông mật, các bệnh yếu gan, thận, viêm thận cấp tính và kinh niên, sưng đau khớp.

Nhuận và tẩy nhẹ đối với trẻ em.

Lá tươi và khô dùng dưới hình thức thuốc sắc 5-10% hoặc cao lỏng 210/ngày.

Có thể chế thành cao mềm hay khô để chế thuốc viên...

1.1.2. Rau đắng đất 

Đặc điểm thực vật, phân bố của cây rau đắng đất

Rau đắng đất có tên khoa học là Glinus oppositifolius (L) A.DC. Thuộc họ rau đắng đất (Aizoaceae). Cây cỏ nhỏ, mọc bò, thân và cành mọc tỏa tròn gần sát mặt đất, màu đỏ tím, đôi khi mọc cao tới 10 - 30cm. Lá nhỏ, mọc so le, có bẹ chìa. Phiến lá dài 1,5 - 2 cm, rộng 0,4cm. Hoa nhỏ, màu hồng tím, mọc tụ từ 1 đến 5, thường 3 - 4 hoa ở kẽ lá.Quả ở cạnh, chứa một hạt đầu đen.Mùa hoa từ tháng 5 - 6, kéo dài suốt mùa hè.

Tên gọi khác: rau đắng lá vòng. Phân bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, cây mọc nhiều ở các tỉnh như Cao Bằng, Lạng Sơn, Bắc Ninh, Bắc Giang... 

Bộ phận dùng: toàn cây.

4



Thành phần hóa học: Theo các tài liệu [3], [6] rau đắng đất chứa chủ yếu

là saponin và flavonoid. Một số tác giả đã phân lập được Spergulagenin. Theo một số nghiên cứu gần đây, trong Rau đắng đất có chứa acid chlorogenic. 

Công dụng: Theo Đông y rau đắng đất có vị đắng, tính bình, có tác dụng lợi tiêu hoá,

khai vị, kháng sinh, lợi tiểu và nhuận gan.

Rau đắng làm mát gan do kích thích tiết mật, thông tiểu, nhuận tràng; dùng trong trường hợp nóng nảy trong người làm lở miệng, viêm nha chu, chảy

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

máu răng; dùng lá rau đắng xông hơi trị ho cảm và viêm phổi; nước rau đắng uống nhiều lần trong ngày trị ngừa sạn thận và sỏi mật...

Trong nhân dân, rau đắng đất được dùng làm thuốc lợi tiểu, chữa đái buốt, sỏi thận [3], [6].

1.1.3. Bìm bìm biếc 

Đặc điểm thực vật, phân bố của cây bìm bìm biếc

Bìm bìm biếc có tên khoa học là Pharbitis nil, thuộc họ Bìm bìm (Convovulaceae). Bìm bìm biếc là một loại dây leo, cuốn, thân mảnh, có điểm những lông hình sao. Lá hình tim, xẻ 3 thùy, nhẵn và xanh ở mặt trên, xanh nhạt và có lông ở mặt dưới, dài 14cm, rộng 12cm, cuống dài 5 - 9cm, gầy, nhẵn. Hoa màu hồng tím hay lam nhạt, lớn, mọc thành xim 1 - 3 hoa, ở kẽ lá. Quả nang hình cầu, nhẵn, đường kính 8mm, có 3 ngăn. Hạt 2 - 4, hình 3 cạnh, lưng khum, hai bên dẹt, nhẵn nhưng ở tễ hơi có lông, màu đen hay trắng tùy theo loài, dài 5 8mm, rộng 3 - 5mm.

Tên gọi khác: Khiên ngưu tử, Hắc sửu.

Phân bố, thu hái và chế biến: mọc hoang ở nhiều tỉnh nước ta. Vào các tháng 7 - 10 quả chín, người ta hái về, đập lấy hạt phơi khô. 

Bộ phận dùng: hạt.

5



Thành phần hóa học: có acid chlorogenic và khoảng 2% glucosid:

pharbitin, 11% chất béo,...

Pharbitin được cấu tạo bởi acid pharbatic, acid tiglic, acid nilic, acid valeric, acid d-α-methylbutyric.

Hạt chưa chín của Bìm bìm biếc chứa giberelin A3, giberelin A5, giberelin A20, giberelin A26, giberelin A27, giberelin glucosid. 

Công dụng: bìm bìm có vị cay, tính nóng hơi có độc dùng để chữa tiện bĩ,

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

cước khí, lợi tiểu tiện, sát trùng [3], [6].

1.2. Acid chlorogenic

1.2.1. Công thức cấu tạo, đặc điểm vật lý hóa học

Hình 1. Công thức cấu tạo acid chlorogenic

Công thức phân tử: C16H18O9 Trọng lượng phân tử: 354,31

Tên khoa học theo hệ thống IUPAC: acid 3R-[[3-(3,4-dihydroxyphenyl)1-oxo-2- propenyl]oxy]-1S,4R,5R-trihydroxy-cyclohexanecarboxylic.

Tên khác: acid 3-0-Caffeoylquinic.

Acid chlorogenic có dạng bột màu trắng hoặc hơi ngà vàng, tan được trong nước và trong dung môi hữu cơ như ethanol, methanol, dimethyl sulfoxyd, dimethylformamid…Nhiệt độ nóng chảy: 210ºC. Acid chlorogenic là một chất khá bền vững, điều kiện bảo quản tốt nhất là ở 4ºC. 6

1.2.2. Tác dụng Acid chlorogenic có tác dụng chống oxy hóa, chống viêm, ức chế sự phát triển của khối u, chống sự đột biến gen của tế bào; tiêu diệt chất gây ung thư, làm chậm quá trình giải phóng glucose vào tuần hoàn sau bữa ăn; có tác dụng kháng virus, kháng khuẩn và chống nấm đi kèm độc tính ở mức độ thấp.

Acid chlorogenic được ứng dụng trong dược phẩm (ngăn bệnh đái tháo đường typ 2, bệnh tim mạch…), được thương mại hóa dưới tên Sveltol (tại Anh và Na uy). Là một thành phần thêm vào thực phẩm để thúc đẩy quá trình giảm

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

cân và dùng trong mỹ phẩm để làm đẹp [12], [16], [20].

Tất cả các nghiên cứu riêng lẻ các hợp chất trong actiso cho thấy acid chlorogenic, lutein, luteolin-7-O-glucoside có hiệu quả chống oxy hoá cao, trong đó acid chlorogenic là hợp chất chống oxy hóa mạnh nhất.

1.2.3. Các phương pháp xác định acid chlorogenic

Schütz K (2004) đã phát triển phương pháp định tính và định lượng các hợp chất phenolic từ nước ép và bã của búp actiso bằng HPLC với detector mảng diod và khối phổ [23]. Hàm lượng phenolic toàn phần xấp xỉ 12 g/kg trên dược liệu khô cho thấy actiso là một nguồn các hợp chất phenolic triển vọng để sử dụng làm chất chống oxy hoá tự nhiên hoặc là thành phần thực phẩm chức năng.

Qing LI cùng cộng sự (2005) đã nghiên cứu xác định đồng thời Protocatechuic Acid, Syringin, Chlorogenic Acid, Caffeic Acid, Liriodendrin and Isofraxidin trong bột dược liệu Acanthopanax senticosus bằng phương pháp HPLC – DAD [22]. Bột dược liệu siêu âm với nước, bốc hơi lấy cắn, hòa tan trong MeOH. Điều kiện sắc ký: cột Agilent SB-C18 column (250 x 4.6mm; 5 μm), nhiệt độ cột được duy trì ở 35°C, pha động (gradient nước (0,05% v/v phosphoric acid) - acetonitrile (0,01 phút, 94: 6, 50 phút, 65:35)), tốc độ dòng : 0,9 ml/phút, detector: DAD 200 - 370 nm, thời gian lưu của pic CGA khoảng 15,5 phút.

7

Yuan và cộng sự đã nghiên cứu định lượng đồng thời arctiin, acid chlorogenic và glycyrrhizin trong một số thuốc viên của 7 thương hiệu khác nhau của “Yin Qiao Jie Du” bằng phương pháp HPLC [27]. Mẫu được xử lý bằng ethanol 50%. Sử dụng cột Phenomenex (Lichrosorb 10RP18, 240x4mm, 10µm, USA), thể tích tiêm 10µl, tốc độ dòng 1 ml/min. Pha động gồm: hỗn hợp dung dịch B gồm 0,4% acetic acid và 4,5% tetrahydrofuran (dd B); acetonitril (dd A). Chạy theo chương trình gradient, bước sóng phát hiện: 254nm, 280nm và 326nm. Pic của acid chlorogenic phát hiện ở 15 phút đầu tiên.

Năm 2007, Zhang và các cộng sự đã nghiên cứu tiến hành định lượng

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

đồng thời acid chlorogenic, linarin và luteolin trong viên đạn Flos chrysantheni Indici [28]. Sau khi xử lý mẫu, hòa tan mẫu thử vào dung dịch acetonitril – nước (20: 80). Dùng cột Hypesil ODS (4,6mm x 250mm, 5µm), detetor UV phát hiện trong khoảng từ 210 – 400nm, nhiệt độ cột 250C, thể tích tiêm 20µl, tốc độ dòng 1ml/min [23]. Chạy theo chương trình gradient.

Li-Mei Wang và các cộng sự (2009) đã tiến hành định lượng acid chlorogenic trong kim ngân [20] như sau: Hoa tươi được cắt nhỏ thành miếng nhỏ (5 mm). Thêm ethanol 70o vào 0,50 g mẫu thử theo cái tỷ lệ dung môi và mẫu 20:1 (tt/kl). Siêu âm mẫu thử trong 30 phút. Tiến hành chiết lặp lại 2 lần.

Lấy dịch chiết và cô đặc để thu được dung dịch acid chlorogenic đặc. Tiếp tục làm khô ở 45ºC trong chân không. Lấy 4 mg cắn hòa tan trong 20 ml methanol và lọc. Mẫu thử được phân tích bằng HPLC với điều kiện là cột XDB-C18 (4,6 ×150mm, 5µm), pha động là methanol/nước/acid acetic (15:85:0,4) phát hiện ở bước sóng 327 nm, khoảng nồng độ của acid chlorogenic khảo sát (10-50 µg/ml) với R2: 0,9994.

Các nhà khoa học Trung Quốc Tingting Wang, Xinhang Jiang, Lu Yang, Shihua Wu đã định lượng acid chlorogenic trong hoa kim ngân bằng HPLC [25] với điều kiện là cột Zorbax Eclipse XDB-C18 (150 × 2,1mm, 3,5µm). Pha động methanol - dung dịch acid trifluoroacetic 0,03% theo chế độ gradient methanol 5-80% trong 20 phút, tốc độ dòng 0,3 ml/phút, phát hiện ở bước sóng 330 nm, tiêm mẫu 2 µm, thời gian lưu khoảng 10 phút [20].

8

Mirna Leonor Sua rez-Quiroz và các cộng sự đã phân lập acid chlorogenic trong cà phê xanh sử dụng than hoạt tính [21]. Phương pháp TLC được thực hiện trên bản mỏng silica gel 60 F254 (4 cm x 6,6 cm), thể tích mẫu 5 µl, dung môi khai triển gồm butanol - nước - acid acetic (6: 2: 2), hiện màu bằng thuốc thử iod và quan sát ở 254 và 366 nm. Phương pháp HPLC: Mẫu pha loãng được lọc qua màng lọc 0,45µm, thể tích tiêm 10 µl, dùng cột C18 (5 µm; 250 mm 4,6 mm), bước sóng phát hiện tại UV 276 nm. Pha động sử dụng nước methanol nước(70:30) với tốc độ dòng 1 ml / phút [17].

Jiagen Wen và cộng sự (2012), nghiên cứu định lượng acid chlorogenic

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

trong bột dược liệu Lepidogrammitis drymoglossoides (Baker) Ching, Polypodiaceae bằng HPLC – UV [19]. Chiết siêu âm với nước sau đó thêm MeOH cất quay. Điều kiện sắc ký: cột Phenomenex Luna C18 (250 × 4,6 mm, 5μm), pha động: acetonitrile (acid phosphoric 0,5% (11,5:88,5 tt/tt), tốc độ dòng : 1ml/phút, detector: UV 327 nm. Thời gian lưu của pic CGA khoảng 15,7 phút.

Hàm lượng CGA trong L.drymoglossoides xấp xỉ đạt 0,24%.[29] Jan Fritsche đã sử dụng các kỹ thuật sắc ký cột (Sephadex LH-20) kết hợp với các phương pháp phân tích (HPLC-DAD-MS và HPLC-DAD) để phân tách, định tính và định lượng các hợp chất trong actiso [18]. Nồng độ acid chlorogenic trong khoảng 0,35-18,34 mg/g dịch chiết nước.

Abdul Mutalib A.G Nasser và cộng sự đã tiến hành xác định Cynarin và acid chlorogenic trong Cynara scolymus L. bằng HPLC [10]. Mẫu thử dược liệu được chiết bằng methanol 80%, sau đó tách 2 polyphenol bằng cột C18, tốc độ dòng 1,3ml/ phút; pha động là nước: methanol: acid acetic (78,5:20:2,5); thể tích tiêm 20 µl, phát hiện tại UV 316nm, thời gian lưu của cynarin và acid chlorogenic lần lượt là 4,78 và 5,47 phút.

Florinda Fratianni và cộng sự đã nghiên cứu xác định polyphenol và hoạt tính sinh học của Cynara cardunculus var.scolymus [15] bằng HPLC sử dụng cột pha đảo (BEH C18; 1,7µm; 2,1×100mm); pha động gồm dung môi A (acid acetic 7,5 mM) và dung môi B (acetonitril) với tốc độ dòng 250 µl/phút, rửa giải theo chế độ gradient. Phát hiện bằng detectơ phạm vi quét: 210-400nm, thể tích 9

tiêm là 5 µl. Kết quả phân tích sắc ký đã xác định các polyphenol khác nhau, gồm acid gallic, chlorogenic, caffeic, p-coumaric, ferulic, 1-3 dicaffeoylquinic (cynarin), cũng như epicatechin, rutin và luteolin.

Theo Dược điển Trung Quốc [13], acid chlorogenic trong dược liệu kim ngân hoa được định lượng bằng HPLC với cột tách C18 (250 × 4,6 mm; 5 µm) duy trì ở 40oC; hệ pha động là gồm A: acetonitil, B: acid phosphoric 0,4% chạy đẳng dòng theo tỷ lệ acetonitril:acid phosphoric 0,4% (13:87), phát hiện bằng detector UV ở 330 nm, thời gian phân tích khoảng 15 phút. Pic của acid chlorogenic được tách ra và có thời gian lưu khoảng 7 phút.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Theo Dược điển châu Âu EP 8.0 [14], acid chlorogenic trong lá và cao actiso được định lượng bằng HPLC với cột tách C18 (250 × 4,6 mm; 5 µm) duy trì ở 40oC; hệ pha động là gồm A: acid phosphoric – nước (0,5:99,5), B: acid phosphoric – acetonitril (0,5:99,5) chạy theo chế độ gradient thành phần pha động, phát hiện bằng detectơ UV ở 330 nm, thời gian phân tích khoảng 40 phút.

Pic của acid chlorogenic được tách ra và có thời gian lưu khoảng 9,1 phút. Hàm lượng acid chlorogenic yêu cầu không nhỏ hơn 0,8% tính theo dược liệu khô.

Theo Dược điển Mỹ 38 [26], acid chlorogenic trong một số dược liệu được định tính bằng phương pháp HPTLC với điều kiện tương tự như trong EP 8.0 về pha tĩnh, cách phát hiện; cách xử lý mẫu và pha động có thay đổi, cụ thể là đối với Echinacea angustifolia DC. (Fam. Asteraceae), Echinacea pallida (Nutt.)Nutt.(Fam. Asteraceae) và Echinacea purpurea (L.) Moench (Fam. Asteraceae) thì mẫu thử được chiết với methanol bằng siêu âm trong 10 phút; pha động gồm ethyl acetat, methylethyl ceton, nước, - acid formic (5:3:1:1). Còn với Ginkgo biloba L. (Fam. Ginkgoaceae) thì mẫu thử được chiết với methanol hồi lưu cách thủy trong 5-10 phút, pha động là acid formic khan – acid acetic – nước – ethyl acetat (1,1:1,1:2,6:10). Đồng thời, định lượng phenol tổng (trong đó có thành phần acid chlorogenic) trong Echinacea angustifolia DC.(Fam. Asteraceae) và Echinacea pallida (Nutt.)Nutt.(Fam. Asteraceae) bằng HPLC được thực hiện với điều kiện tương tự EP 8.0.

10

Lê Thị Thu Hiền và cộng sự (2010), Nghiên cứu thiết lập chất chuẩn acid chlorogenic từ kim ngân hoa phục vụ công tác kiểm tra chất lượng [5]. Trong đó định lượng acid chlorogenic sử dụng cột Phenomenex RP 18, (5µm, 5mm x 250mm), pha động (Acetonitril : Dung dịch acidphosphoric 0,4% tỷ lệ 13 : 87 (v/v)) tốc độ dòng: 1 ml/phút, thể tích tiêm: 20 µl, detector UV : 327 nm.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Vũ Bình Dương và cộng sự đã nghiên cứu định lượng acid chlorogenic trong ngũ gia bì chân chim (Schefflera heptaphylla) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao [9], bột dược liệu được chiết siêu âm bằng MeOH. Acid chlorogenic trong mẫu thử được tách bằng cột C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm, Phenomenex, Mỹ), pha động: hệ dung môi acid acetic 0,1% : Acetonitril tỷ lệ 70 : 30 (v/v), tốc độ dòng: 1,2 ml/phút, thể tích tiêm: 10 µl, detector UV: 320. Thời gian lưu của pic ACG khoảng 6,7 phút.

Nguyễn Thị Ánh Nguyệt và cộng sự (2016) đã phân lập và thiết lập chất chuẩn acid chlorogenic từ actiso đạt độ tinh khiết 92,39% [7].

Phí Thị Bảo Thoa (2017) đã tiến hành định lượng acid chlorogenic trong cao actiso bằng sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao, acid chlorogenic trong cao actiso được chiết siêu âm bằng MeOH 60%, tách trên bản mỏng silica gel 60 F254, pha động etylacetat: acid acetic: acid formic: nước (10: 1,1: 1,1: 2,7), thể tích chấm 25 µl, bước sóng phân tích 330nm. Kết quả hàm lượng acid chlorogenic trong cao actiso từ 0,7 đến 4,57% [8].

1.3. Tổng quan về cao thuốc 1.3.1. Định nghĩa

Theo Dược điển Việt Nam IV [1] cao thuốc là chế phẩm được chế bằng cách cô hay sấy đến thể chất quy định các dịch chiết thu được từ dược liệu thực vật hay động vật với các dung môi thích hợp.

Các dược liệu trước khi chiết xuất cần được xử lý sơ bộ (sấy khô và chia nhỏ đến kích thước thích hợp). Đối với một số dược liệu đặc biệt có chứa men làm phân hủy hoạt chất cần phải diệt men trước khi đưa vào sử dụng bằng cách dung hơi cồn sôi, hơi nước sôi hoặc bằng phương pháp thích hợp khác.

Cao thuốc được chia làm 3 loại: 11

 Cao lỏng: là chất lỏng hơi sánh, có mùi vị đặc trưng của dược liệu sử dụng trong đó cồn và nước đóng vai trò dung môi chính (hay chất bảo quản hay cả hai). Nếu không có chỉ dẫn khác quy ước 1 ml cao lỏng tương ứng với 1 g dược liệu dung để chế cao thuốc.  Cao đặc: là khối đặc quánh. Hàm lượng dung môi sử dụng còn lại trong cao không quá 20%  Cao khô: là khối hoặc bột khô, đồng nhất nhưng rất dễ hút ẩm. Cao khô không được có độ ẩm lớn hơn 5%.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

1.3.2. Phương pháp điều chế Quá trình điều chế cao thường có 2 giai đoạn: Giai đoạn I

Chiết xuất dược liệu bằng dung môi thích hợp. Tùy theo bản chất dược liệu, dung môi, tiêu chuẩn chất lượng của thành phẩm cũng như các điều kiện về quy mô sản xuất và trang thiết bị, có thể sử dụng các phương pháp chiết xuất: ngâm, hầm, hãm, sắc, ngâm kiệt, …Phương pháp ngâm nhỏ giọt thường được sử dụng. Khi đó, dược liệu thô được chia nhỏ đến kích thước phù hợp, được làm ẩm với một lượng dung môi vừa đủ rồi đậy kín để yên trong 2 - 4h. Sau đó, chuyển khối dược liệu vào bình ngấm kiệt, thêm lượng dung môi vừa đủ đến khi ngập hoàn toàn khối dược liệu. Thời gian ngâm lạnh và tốc độ chảy trong quá trình chiết có thể thay đổi theo khối lượng và bản chất của dược liệu thô đem chiết.

Giai đoạn II Cao lỏng: Sau khi thu được dịch chiết, tiến hành lọc và cô dịch chiết bằng các phương pháp khác nhau để thu được cao lỏng có tỷ lệ theo như quy ước (1 ml cao lỏng tương ứng với 1 g dược liệu). trong trường hợp điều chế cao lỏng bằng phương pháp ngâm nhỏ giọt, tốc độ chảy của dịch chiết có thể chậm, vừa hay nhanh. Nếu chiết xuất 1000 g dược liệu thì: Ở tốc độ chậm: không quá 1 ml dịch chiết/ phút 12

Ở tốc độ vừa: 1 - 3 ml dịch chiết/ phút Ở tốc độ nhanh: 3 - 5 ml dịch chiết/ phút Để riêng phần dịch chiết đầu đậm đặc bằng 4/5 lượng dược liệu đem chiết. Sau đó đem cô các phần dịch chiết tiếp theo trên bếp cách thủy hoặc cô dưới áp suất giảm ở nhiệt độ không quá 600C cho đến khi loại hết dung môi. Hoà tan cắn thu được trong dịch chiết đầu đậm đặc nếu cần thêm dung môi vào để thu được cao lỏng đạt tỷ lệ quy định. Cao lỏng có khuynh hướng bị lắng cặn vì vậy để cao lỏng ở chỗ mát trong thời gian ít nhất 3 ngày rồi lọc.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Cao đặc và cao khô: Dịch chiết được cô đặc đến khi độ ẩm còn lại không quá 20%. Trong trường hợp điều chế cao khô, tiếp tục sấy đến khi độ ẩm còn lại không quá 5%. Để đạt được thể chất quy định , quá trình cô đặc và sấy khô dịch chiết thường được tiến hành trong các thiết bị cô dưới áp suất giảm ở nhiệt độ không quá 600C.

Trường hợp muốn thu cao có tỷ lệ tạp chất thấp, phải tiến hành loại tạp bằng các phương pháp thích hợp tùy thuộc vào bản chất của dược liệu, dung môi và phương pháp chiết xuất. Có thể thêm chất bảo quản hoặc các chất trơ để làm chất mang hay để cải thiện tính chất vật lý. Đối với cao khô có thể sử dụng bột trơ thích hợp hay cao khô của dược liệu sử dụng để điều chỉnh nồng độ hoạt chất đến tỷ lệ quy định.

1.3.3. êu cầu chất lượng

Đạt các yêu cầu theo quy định trong chuyên luận riêng và đạt các yêu cầu chung sau đây: Độ trong, mùi vị, độ đồng nhất và màu sắc: Cao thuốc phải đúng màu sắc đã mô tả trong chuyên luận riêng, có mùi và vị đặc trưng của dược liệu sử dụng.

Ngoài ra, cao lỏng còn phải đồng nhất, không có váng mốc, không có cặn bã dược liệu và vật lạ.

13

Độ tan: Cao lỏng phải tan hoàn toàn trong dung môi đã sử dụng để điều chế cao.

Mất khối lượng do làm khô (nếu không có chỉ dẫn khác): Cao đặc không quá 20 %. Cao khô không quá 5 %.

Hàm lượng cồn: Đạt từ 90 % đến 110 % lượng ethanol ghi trên nhãn (áp dụng cho cao lỏng và cao đặc).

Kim loại nặng: Đáp ứng yêu cầu qui định trong chuyên luận riêng.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Dung môi tồn dư: Nếu điều chế với dung môi không phải là cồn, nước hay hỗn hợp cồn - nước, dư lượng dung môi sử dụng phải đáp ứng yêu cầu qui định trong DĐVN IV.

Dư lượng hóa chất

o vệ thực vật: Đáp ứng yêu cầu quy định trong

DĐVN IV.

Giới hạn nhiễm khuẩn: Đáp ứng yêu cầu qui định trong DĐVN IV. o qu n Cao thuốc được đựng trong bao bì kín, để nơi khô, mát, tránh

ánh sáng, nhiệt độ ít thay đổi.

1.4. Tình hình tiêu chuẩn hóa trong chế phẩm Đông Dƣợc

Dược liệu và các sản phẩm có nguồn gốc dược liệu thường có rất nhiều thành phần, nên việc đặt ra tiêu chuẩn cho tất cả các chế phẩm Đông Dược gặp nhiều khó khăn, không thống nhất. Mỗi chế phẩm do một công ty sản xuất đều có tiêu chuẩn riêng.

Dược điển Việt Nam là một văn bản quy phạm kỹ thuật quan trọng, là cơ sở xem xét đánh giá, và xác định chất lượng thuốc ở phần lớn các cơ sở sản xuất trên cả nước. Trong đó, có nhiều chuyên luận quy định tiêu chuẩn chất lượng dược liệu (phần lớn là dược liệu chưa chế biến), một số bài thuốc.... Tuy nhiên, việc đi vào thực tế để kiểm tra chất lượng dược liệu đã vấp phải rất nhiều khó khăn như: nguồn dược liệu lưu hành trên thị trường chủ yếu là dược liệu chế, 14

dược liệu được nhập từ nhiều nguồn khác nhau, tiêu chuẩn quy định trong dược điển ít đề cập tới việc xác định hoạt chất chính hay hoạt chất có tác dụng dược lý. Vài năm trở lại đây vấn đề kiểm tra chất lượng dược liệu, các chế phẩm Đông dược càng đặt ra nhiều thách thức hơn với công tác kiểm nghiệm, một phần do nguồn dược liệu ngày càng phức tạp, công tác tiêu chuẩn hóa gặp nhiều khó khăn.

Trên thực tế, việc sử dụng các phương pháp hiện đại như HPLC, sắc ký lớp mỏng siêu hiệu năng, sắc ký khối phổ có sử dụng chất đối chiếu chưa được

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

sử dụng nhiều, giá thành chất chuẩn, dược liệu chuẩn cao. Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ương là đơn vị đứng đầu trong ngành kiểm nghiệm đã và đang nghiên cứu bổ sung nguồn dược liệu chuẩn, tinh chế chất chuẩn dược liệu. Tuy nhiên, với tốc độ phát triển của thị trường ngày càng có nhiều dạng chế phẩm khác nhau lưu hành, thành phần cũng ngày càng đa dạng hơn đặt ra dấu hỏi lớn về chất lượng sản phẩm. Do vậy, xu hướng hiện nay là cần phải xây dựng các phương pháp tối ưu đảm bảo độ chính xác, tính khách quan và khả thi để nâng cao tiêu chuẩn cũng như chất lượng của chế phẩm đông dược.

1.5. Tổng quan về phƣơng pháp nghiên cứu sắc ký lỏng hiệu năng cao Nguyên tắc

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là phương pháp tách sắc ký các chất dựa trên sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha không trộn lẫn, trong đó pha động là một chất lỏng chảy qua pha tĩnh chứa trong cột.

Hình 2. Sơ đồ hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 15

Pha tĩnh Pha tĩnh trong sắc ký lỏng hiệu năng cao là chất nhồi cột để tách sắc ký chất phân tích. Nó là những chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ, đường kính hạt từ 3 - 10µm. Các hạt có hình cầu hoặc không có hình dạng nhất định, có độ xốp khác nhau và diện tích bề mặt đặc hiệu.

Cột thường được làm bằng thép không gỉ, có chiều dài và đường kính trong khác nhau được sử dụng cho phân tích sắc ký. Cột có đường kính

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

trong nhỏ hơn 2 mm thường được coi là vi cột. Nhiệt độ của cột phải được giữ ổn định trong suốt thời gian phân tích (nhiệt độ cột không được quá 60oC).

Trong sắc ký lỏng pha đảo, pha tĩnh gồm nhiều chất dạng biến đổi hóa học được chế tạo từ polymer, silica gel hoặc than graphit xốp. Thường các cột sắc ký pha đảo chế tạo trên nền silica được coi là ổn định với pha động có pH từ 2,0 đến 8,0. Cột chứa than graphit xốp hoặc các hạt vật liệu polymer ổn định ở khoảng pH rộng hơn.

Pha động

Pha động là hệ dung môi dùng để rửa giải các chất phân tích ra khỏi cột tách để thực hiện quá trình sắc ký. Thành phần pha động có thể chỉ gồm một dung môi hay hỗn hợp dung môi trộn với nhau theo tỷ lệ thích hợp của acetonitril, methanol với nước hoặc dung dịch đệm, …

Các yếu tố thuộc về pha động ảnh hưởng đến kết quả tách sắc ký gồm : + Bản chất của dung môi pha chế pha động : Đối với sắc ký lỏng pha thuận thường sử dụng dung môi ít phân cực. Đối với sắc ký lỏng pha đảo sử dụng pha đảo chứa nước với dung môi hữu cơ. Dựa vào chỉ số phân cực P’ và UV cut-off của dung môi để lựa chọn dung môi pha động phù hợp rửa giải chất phân tích và dung môi không hoặc ít hấp thụ quang ở vùng bước sóng phát hiện nếu như sử dụng detector tử ngoại.

16

+ Thành phần các chất trong pha động : làm thay đổi thời gian lưu của chất phân tích, độ phân giải của hệ pha và chiều cao của pic sắc ký. + pH của pha động có ảnh hưởng rõ rệt trong các hệ pha động phân cực, nhất là pha động có chứa nước. Cần kiểm soát pH chính xác để hạn chế tối đa sự ion hóa của chất phân tích. Dung dịch đệm hay dùng : đệm phosphat, đệm acetat. + Tốc độ của pha động ảnh hưởng đến thời gian rửa giải và khả năng tách các chất.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Các thành phần của pha động phải loại tiểu phân lớn hơn 0,45µm. Pha động phải được loại khí trước khi đưa vào hệ thống sắc ký.

Khi tiến hành sắc ký, phải cân bằng cột với pha động ở tốc độ dòng theo quy định, ở nhiệt độ phòng hoặc nhiệt độ quy định trong chuyên luận riêng, cho đến khi đường nền ổn định. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn và dung dịch thử theo yêu cầu và tiến hành sắc ký.

Các thông số đặc trưng cho quá trình sắc ký : 

Thời gian lưu (tR) là thời gian được tính từ lúc nạp mẫu cho đến lúc chất

được rửa giải ra khỏi cột ở thời điểm có nồng độ cực đại. Thời gian lưu là thông số sử dụng để định tính chất phân tích. Nó phụ thuộc vào bản chất của pha tĩnh, kích thước, độ xốp, cấu trúc xốp; bản chất, thành phần, pH của pha động; cấu tạo và bản chất phân tử của chất phân tích. 

Hệ số dung lượng k’ thể hiện sứa chứa của cột tách sắc ký, cho biết khả

năng phân bố của chất phân tích trong 2 pha và được tính theo sức chứa của cột. k’ cho biết tỷ số khối lượng của chất tan phân bố trong pha tĩnh so với pha động. k’=

= k.

=

–

Nếu k’ nhỏ thì tR nhỏ nên sự tách kém, k’ lớn thì pic doãng, độ nhạy kém. 

Hệ số chọn lọc (α): đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỷ đối của 2 chất KA 17

α=

=

=

Quy ước B là chất lưu giữ mạnh hơn, để tách 2 chất thường chọn α dao động từ 1,05 đến 2. 

Hiệu lực của cột sắc ký được biểu thị thông qua số đĩa lý thuyết trên cột

(N). Số đĩa lý thuyết được tính theo công thức: =

hay

=

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Trong đó: tR: thời gian lưu chất phân tích W: độ rộng đáy pic

W1/2: độ rộng pic ở ½ chiều cao pic.



=

Hệ số bất đối AF:

Trong đó: W1/20: độ rộng pic ở chiều cao 1/20.

A là khoảng cách từ đường cao hạ từ đỉnh pic tới đường cong phía

trước của pic ơ 1/20 chiều cao pic. 

Hệ số phân giải Rs: là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau

trên cùng một điều kiện sắc ký đã chọn. Độ phân giải của hai chất cạnh nhau được tính theo công thức: Rs = 2.

–

–

= 1,18.

=

–

.

Nếu Rs nhỏ các píc chưa tách hẳn. Nếu Rs quá lớn, thời gian phân tích lâu, tốn dung môi pha động, độ nhạy giảm. thông thường Rs 1,5 là phù hợp.

Các phƣơng pháp định lƣợng trong sắc ký: 

Phương pháp chuẩn ngoại



Phương pháp chuẩn nội



Phương pháp chuẩn hóa điện tích 18

Trong khuôn khổ của luận văn này tôi xin trình bày cụ thể về phương pháp chuẩn ngoại. Đây là phương pháp định lượng cơ bản, trong đó cả 2 mẫu chuẩn và thử đều được tiến hành sắc ký trong cùng một điều kiện, so sánh diện tích pic của mẫu thử với diện tích pic của mẫu chuẩn sẽ tính được nồng độ của các chất trong mẫu thử.

Có thể sử dụng phương pháp chuẩn hóa một điểm hay chuẩn hóa nhiều điểm: Chuẩn hóa 1 điểm: chọn nồng độ của mẫu chuẩn xấp xỉ nồng độ của mẫu thử.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Tính nồng độ của mẫu thử theo công thức: Cx = Cs. Cx, Cs lần lượt là nồng độ mẫu thử, mẫu chuẩn

Sx, Ss là diện tích của chất phân tích trong mẫu thử, mẫu chuẩn.

Chuẩn hóa nhiều điểm: chuẩn bị một dãy chuẩn với các nồng độ chất chuẩn tăng dần rồi tiến hành sắc ký. Các đáp ứng thu được là các diện tích pic ở mỗi điểm nồng độ chuẩn. Thiết lập mối tương quan giữa diện tích pic với nồng độ của chất chuẩn. Sử dụng đoạn tuyến tính của đường chuẩn để tính toán nồng độ của chất cần xác định. Có thể tính theo 2 cách:

+ Dựa vào dữ liệu diện tích pic của chất thử trên đường chuẩn sẽ suy ra được nồng độ của chất đó.

+ Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính mô tả mối quan hệ giữa diện tích pic hoặc chiều cao với nồng độ chất cần xác định: Y = a + bCx Y là diện tích pic a là giao điểm của đường chuẩn với trục tung b là độ dốc của đường chuẩn Cx là nồng độ của chất thử Dựa vào phương trình hồi quy này ta tính được nồng độ của chất thử Cx.

19

PHẦN 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu, nguyên vật liệu và trang thiết bị 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu - Mẫu cao Actiso: gồm các mẫu cao actiso mua ở nhiều nơi và được mã hóa nơi mua (CA) số thứ tự mẫu (01, 02, 03...) và ngày lấy mẫu (ngày/ tháng/ năm); cách nhau bằng dấu chấm. Sử dụng mẫu CA.06.0192017 trong xây dựng và thẩm định phương pháp

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

- Mẫu chế phẩm viên nang mềm Bổ gan có thành phần công thức gồm: cao actiso, cao rau đắng đất, cao bìm bìm biếc của 2 công ty, mỗi công ty lấy 3 5 mẫu được mã hóa công ty (A, B), số thứ tự mẫu (01, 02, …) và ngày lấy mẫu (ngày/ tháng/ năm); cách nhau bằng dấu chấm. Sử dụng mẫu A.01.0872017 trong xây dựng và thẩm định phương pháp.

- Mẫu placebo gồm Sáp ong trắng, Palm oil, Lecithin, Colloidan silicon dioxid, Dầu đậu nành với tỷ lệ theo công thức công bố.

2.1.2. Chất chuẩn, hóa chất, dung môi

- Chất chuẩn: Acid chlorogenic (C16H18O9) hàm lượng 99,60% (nguyên trạng); SKS: 71121F của AK Scientific, TnC, Mỹ.

Hóa chất, dung môi: Cloroform, n- hexanloại thuốc thử (Trung quốc); acid phosphoric 85% loại PA của JTBaker, Mỹ; acetonitril và methanol loại HPLC của Merck, Đức.

2.1.3. Phương tiện, thiết bị nghiên cứu - Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1200 series với detector DAD, phần mềm điều khiển Chemstation.

- Cân phân tích Metller Toledo (Thụy Sỹ) AB204 (d = 0,1),cân phân tích Metller Toledo (Thụy Sỹ) XPE105 (d =0,01) - Máy siêu âm Daihan WUC - A06H 20

- Dụng cụ: các loại pipet, micropipet, bình định mức, ống đong, màng lọc mẫu (syringe filter), bình gạn (Đức), cốc có mỏ, vial,…

- Máy ly tâm Hermile 2306, tủ sấy Memmert ULM – 500.

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Nghiên cứu phương pháp xử lý mẫu 2.2.1.1. Với nền mẫu cao Actiso Tham khảo tài liệu [8], tiến hành nghiên cứu quy trình xử lý mẫu: Cân

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

chính xác khoảng 0,24g cao Actiso vào cốc có mỏ 100ml, thêm khoảng 30 ml MeOH 60%. Siêu âm 15 phút. Chuyển toàn bộ vào bình định mức 50 ml, tráng cốc 3 lần bằng MeOH 60% mỗi lần 5ml. Thêm MeOH 60% đủ đến vạch, lắc đều. Ly tâm dịch thu được ở 6000 vòng/ phút, trong 10 phút, lọc qua màng lọc 0,22 μm PTFE.

2.2.1.2. Với mẫu viên nang mềm Bổ gan

Dựa vào độ tan của acid chlorogenic, phương pháp xử lý mẫu với nang mềm trong Dược điển Việt Nam IV [1] và các tài liệu công bố như Dược điển Trung Quốc [13], Dược điển châu Âu [14], Dược điển Mỹ 38 [26] và tiến hành khảo sát khả năng chiết acid chlorogenic trong mẫu như sau:

- Cân từng viên với 20 viên nang mềm, cắt hở vỏ nang khoảng 0,5 cm, bóp thuốc trong nang ra cốc có mỏ. Dùng kẹp giữ vỏ nang và cắt tiếp vỏ nang để bộc lộ hết phía trong của nang, lau sạch thuốc dính ở vỏ nang, lau vỏ nang bằng cloroform, để khô tự nhiên, cân vỏ nang. Tính khối lượng thuốc trung bình trong nang.

- Cân lượng dịch thuốc tương ứng 1 viên vào cốc có mỏ, thêm nước, siêu âm. Chuyển toàn bộ vào bình gạn 100ml, tráng rửa cốc đựng thuốc 2 lần với dung môi chiết và tập trung vào bình gạn. Chiết, dịch chiết nước chuyển vào bình định mức 50ml, thêm methanol, lắc siêu âm sau đó để nguội ở nhiệt độ phòng, thêm tiếp methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều.

21

- Ly tâm dịch chiết, thu lấy phần dung dịch.

- Lọc mẫu qua màng lọc 0,22 μm PTFE. Kh o sát các điều kiện chiết: - Dung môi chiết: sử dụng hỗn hợp dung môi methanol - nước với tỷ lệ methanol từ 50 - 100% với C = 10%.

- Khảo sát dung môi loại dầu béo: n-hexan và cloroform, đồng thời khảo sát số lần chiết.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

-Thời gian lắc siêu âm: 5, 10, 15, 20 phút

Mỗi điều kiện khảo sát tiến hành lặp lại 2 lần lấy kết quả trung bình. Lựa chọn điều kiện chiết cho hiệu suất chiết cao.

2.2.2. Khảo sát điều kiện sắc ký

Lựa chọn cột và tỷ lệ pha động

Tham khảo các tài liệu [5], [7], [13], [29] lựa chọn sắc ký lỏng pha đảo với cột C18 để phân tích acid chlorogenic.

Khảo sát các hệ pha động và tỷ lệ như sau:

- Hệ 1: MeCN và dung dịch acid acetic 0,1%, tỷ lệ 30: 70%; - Hệ 2: MeCN và acid formic 0,1%, tỷ lệ (10: 90);

- Hệ 3: MeCN và dung dịch acid phosphoric 1,0%, với tỷ lệ (10: 90); - Hệ 4: MeCN và dung dịch acid phosphoric 0,4%, với tỷ lệ (10: 90); - Hệ 5: MeCN và dung dịch acid phosphoric 0,1%, với tỷ lệ của MeCN từ 5 - 20% (C = 5%).

Thực nghiệm trên mẫu chuẩn và mẫu thử.

Tốc độ dòng: Thay đổi tốc độ dòng để pic của acid chlorogenic tách tốt, pic cân đối, thời gian sắc ký phù hợp.

22

Thể tích tiêm mẫu: Thay đổi thể tích tiêm để pic của acid chlorogenic tách tốt, pic cân đối, pic có đáp ứng (diện tích) phù hợp. ước sóng phân tích: Quét phổ của pic ứng với acid chlorogenic trong khoảng UV, lựa chọn bước sóng ứng với cực đại hấp thụ.

2.2.3. Thẩm định phương pháp định lượng acid chlorogenic trongmẫu cao Actiso và viên nang mềm Bổ gan Xử lý mẫu theo qui trình đã lựa chọn, sắc ký các dung dịch thu được theo điều kiện đã khảo sát, tiến hành thẩm định phương pháp phân tích theo hướng

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

dẫn của ICH [17]. Đánh giá tính thích hợp hệ thống, độ chọn lọc, khoảng tuyến tính, độ chính xác, độ đúng, LOD và LOQ của phương pháp. Độ phù hợp của hệ thống

Tiến hành: sắc ký 6 lần liên tiếp 1 dung dịch chuẩn acid chlorogenic.

Yêu cầu: RSD của thời gian lưu và diện tích pic không lớn hơn 2%. Độ chọn lọc:

Tiến hành sắc ký lần lượt với mẫu trắng (dung môi chiết), mẫu placebo, mẫu chuẩn và mẫu thử, ghi lại sắc ký đồ.

Yêu cầu: tại thời gian lưu của acid chlorogenic không xuất hiện pic lạ trên mẫu trắng, mẫu placebo. Độ tuyến tính:

- Chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn acid chlorogenic có nồng độ thích hợp, tiến hành sắc ký.

- Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính giữa đại lượng đo được (diện tích pic) và nồng độ acid chlorogenic, xác định hệ số tương quan r.

Yêu cầu: đường hồi qui phải dạng đường thẳng với r ≥ 0,99. Độ chính xác gồm Độ lặp lại và độ chính xác trung gian 23

Độ lặp lại của phương pháp: - Phân tích 1 mẫu 6 lần song song.

- Tính độ lặp lại bằng cách tính độ lệch chuẩn tương đối giữa các giá trị của các lần định lượng.

Yêu cầu: (RSD) phải ≤ 2,0%. Độ chính xác trung gian: định lượng lặp lại trên 6 mẫu thử độc lập, thực hiện trên cùng một thiết bị, trên 2 ngày khác nhau với cách tiến hành và điều

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

kiện sắc ký như trên. Yêu cầu RSD phải ≤ 3,0% (n = 12). Độ đúng: độ đúng phản ánh sự phù hợp giữa kết quả thu được với giá trị thực. Độ đúng được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn. Thêm một lượng chính xác chất chuẩn thích hợp vào mẫu thử sao cho tổng lượng chất phân tích trong dung dịch (sau khi xử lý) nằm trong khoảng tuyến tính của đường chuẩn.

Tiến hành phân tích theo điều kiện đã chọn. Dựa vào hàm lượng acid chlorogenic đã biết trong mẫu thử, lượng chất chuẩn thêm vào và diện tích pic thu được của mẫu thử thêm chuẩn, tính được lượng acid chlorogenic thu hồi lại trong mẫu thử. Yêu cầu lượng chuẩn tìm lại nằm trong khoảng 98 – 102%.

Giới hạn phát hiện LOD, giới hạn định lượng LOQ

Pha loãng dung dịch chuẩn gốc bằng dịch chiết từ mẫu placebo được dung dịch có nồng độ chính xác. Pha loãng lần lượt gấp đôi dung dịch thu được bằng dịch chiết từ mẫu placebo. Tiến hành sắc ký. Nồng độ tại đó có tỷ lệ S/N lần lượt bằng 3 và bằng 10 được coi là LOD và LOQ của phương pháp.

2.2.4. Ứng dụng Xác định hàm lượng acid chlorogenic trong một số mẫu cao Actiso và chế phẩm viên nang mềm Bổ gan đang lưu hành trên thị trường.

2.2.5. Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu được xử lý dựa vào một số hàm trong Microsoft Excel.

24

Giá trị trung bình (X): Hàm AVERAGE Độ lệch chuẩn (SD): Hàm STDEV RSD 

Độ lệch chuẩn tương đối RSD:

100  SD __

%

X

* Tương quan hồi quy tuyến tính: Phương trình hồi quy tuyến tính thể hiện quan hệ giữa diện tích pic sắc ký (Y) và nồng độ chất phân tích (C):

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Y = aC + b Trong đó:

Hệ số góc a: Hàm SLOPE

Hệ số chắn b: Hàm INTERCEPT

Hệ số tương quan r: Hàm CORREL

25

PHẦN 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Khảo át và l a chọn điều kiện

lý mẫu

3.1.1. Khảo sát dung môi loại chất béo Viên nang mềm Bổ gan trong thành phần chế phẩm có một lượng lớn dầu béo nên cần loại để giảm thiểu ảnh hưởng tới độ bền cột tách, cũng như cản trở tách trong quá trình sắc ký. Dung môi loại béo khảo sát gồm cloroform và nhexan.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Cố định các thông số chiết: số lần chiết (02 lần); dung môi chiết: MeOH 60%; thể tích dung môi: 50 ml; lượng mẫu thử: 01 viên. Sau khi chiết, thu dịch chiết nước vào bình định mức 50ml, thêm methanol vừa đủ đến vạch. Lắc đều, lọc qua màng lọc PTFE 0,22 µm.

Mỗi dung môi tiến hành lặp lại 2 lần, lấy kết quả trung bình. Khả năng chiết acid chlorogenic từ mẫu viên nang mềm Bổ gan được biểu diễn bằng thông số diện tích pic acid chlorogenic (A) và khối lượng dược liệu của mẫu thử (m).

Kết quả được thể hiện trong bảng 1.

Bảng 1. Kết qu kh o sát dung môi loại éo khi xử lý mẫu viên nang mềm Bổ gan

Lần 1

Dung môi

Lượng cân

m (mg)

Diện tích pic (A)

Lần 2

Lượng cân

A/m

m(mg)

Diện tích pic (A)

Trung bình

A/m

(A/m)

Cloroform

804,6

970,6

1,206

805,1

977,3

1,214

1,210

n-hexan

803,5

1056,3

1,315

808,3

1078

1,334

1,324

26

Kết quả cho thấy cả 2 dung môi đều có khả năng loại chất béo tốt, nhưng cloroform có thể tạo nhũ gây khó khăn trong quá trình chiết và làm mất một phần hoạt chất ở lớp dung môi cloroform nên lựa chọn n-hexan làm dung môi chiết loại béo. Để làm sạch tốt mẫu thử thực hiện chiết bằng n-hexan lặp lại 2 lần trong quá trình xử lý mẫu.

3.1.2. Khảo sát dung môi chiết Do acid chlorogenic dễ tan trong MeOH, nước nên dùng dung môi này làm dung môi chiết, khảo sát tỷ lệ dung môi MeOH và nước, với thể tích 50ml,

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

lượng mẫu thử tương ứng 01 viên. Cố định thời gian siêu âm 20 phút, dung môi loại béo là n-hexan. Mỗi điều kiện khảo sát lặp lại 2 lần, lấy kết quả trung bình.

Kết quả được trình bày trong bảng 2 và hình 3.

Bảng 2. Kết qu kh o sát dung môi chiết

MeOH (%)

50

m (g)

Lần 1

Lần 2

A

A

(mAU.s)

A/m

m (g)

(mAU.s)

A/m Trung A/m

bình

0,8023

1038,6

1294,5

0,8163

1053,2

1290,2

1292,4

0,8124

1088,2

1339,5

0,827

1108,5

1340,4

1339,9

0,8083

1012,3

1252,4

0,8181

1018,5

1245,0

1248,7

80

0,8016

960

1197,6

0,8095

954,6

1179,2

1188,4

90

0,8204

853,5

1040,3

0,8182

846,5

1034,6

1037,5

100

0,8186

742,3

906,8

0,8106

735,4

907,2

907,0

60 70

27

1600 1400

50%

1200

60%

A/m

1000 800

70%

600

80%

400

90%

200

100%

0 Nồng độ MeOH (%)

Hình 3. Biểu đồ kết qu kh o sát nồng độ dung môi chiết acid chlorogenic trong

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

viên nang mềm Bổ gan (n = 2) Kết quả cho thấy đối với mẫu viên nang mềm Bổ gan, khi sử dụng dung môi chiết MeOH 60%, lượng acid chlorogenic thu được đều cao hơn rõ rệt khi sử dụng các dung môi còn lại. Vì vậy, lựa chọn hỗn hợp dung môi chiết là MeOH 60%.

3.1.3. Khảo sát thời gian chiết

Cố định các thông số: dung môi loại béo n-hexan, số lần chiết là 2 lần, dung môi chiết: MeOH 60%, thể tích 50ml. Khảo sát thời gian chiết siêu âm từ 5 - 20 phút (t = 5 phút), mỗi khảo sát tiến hành lặp lại 2 lần, lấy kết quả trung bình. Kết quả được thể hiện ở bảng 3 và hình 4.

Bảng 3. Kết qu kh o sát thời gian chiết

Lần 1

Lần 2

Thời gian (phút)

m (g)

A (mAU.s)

A/m

m (g)

A (mAU.s)

A/m

A/m Trung bình

5

0,8032

875,5

1090,0

0,8048

880,2

1093,7

1091,9

10

0,8014

991,2

1236,8

0,8034

992,5

1235,4

1236,1

15

0,8021

1068,5

1332,1

0,8045

1060,2

1317,8

1325,0

20

0,8045

1066,9

1326,2

0,8028

1057,6

1317,4

1321,8

28

A/m

1400 1200 1000 800 600 400 200 0

0

5

10 15 Thời gian (phút)

20

Hình 4. ết qu kh o sát thời gian chiết acid chlorogenic trong viên nang mềm

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

ổ gan (n=2) Khi thời gian siêu âm tăng, lượng acid chlorogenic chiết được tăng, với thời gian chiết 15 phút lượng acid chlorogenic chiết được tương đương với siêu âm 20 phút. Do đó, tôi lựa chọn thời gian siêu âm 15 phút.

 Kiểm tra lƣợng acid chlorogenic còn lại trong cắn:

Cân chính xác 1 lượng dịch thuốc tương ứng 1 viên nang mềm vào cốc có mỏ, thêm 20 ml nước, siêu âm 15 phút. Chuyển toàn bộ mẫu vào bình gạn 100 ml, tráng cốc bằng 25 ml n-hexan và tập trung vào bình gạn. Lắc 5 phút, để lắng, bỏ lớp n-hexan.Tiếp tục chiết như vậy thêm 1 lần nữa với 25 ml n-hexan.

Chuyển dịch chiết nước vào bình định mức 50 ml, thêm khoảng 20 ml methanol, siêu âm 15 phút, lọc lấy dịch lọc, tráng rửa phễu và bình bằng methanol, thêm methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng 0,22 μm.

Lấy phần cắn còn lại ở trên, thêm 10ml methanol 60%, siêu âm 15 phút, sau đó lý tâm 6000 vòng/ phút thu được dịch lọc, lọc qua màng 0,22 μm, sau đó tiêm vào hệ thống sắc ký. Kết quả: trên sắc ký đồ không thấy xuất hiện pic acid chlorogenic. Do đó, chiết một lần bằng MeOH 60% đảm bảo chiết được hết acid chlorogenic trong viên nang mềm Bổ gan.

Từ kết quả khảo sát, qui trình xử lý mẫu được lựa chọn như sau: Lấy 20 viên nang mềm, cân và tính khối lượng trung bình thuốc trong viên. Trộn đều. Cân chính xác một lượng dịch thuốc tương ứng 1 viên vào cốc 29

có mỏ, thêm 20 ml nước, siêu âm 15 phút. Chuyển toàn bộ mẫu vào bình gạn 100 ml, tráng cốc bằng 25 ml n-hexan và tập trung vào bình gạn. Lắc 5 phút, để lắng, bỏ lớp n-hexan.Tiếp tục chiết như vậy thêm 1 lần nữa với 25 ml n-hexan.

Chuyển dịch chiết nước vào bình định mức 50 ml, thêm khoảng 20 ml methanol, siêu âm 15 phút, thêm methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều. Ly tâm dịch chiết 6000 vòng/phút trong 10 phút, thu lấy phần dịch trong. Lọc qua màng 0,22 μm PTFE. 3.1.4. Khảo sát điều kiện sắc ký

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Thực hiện trên cột C18, tốc độ dòng 1,0 ml/phút, thể tích tiêm 10 µl, bước sóng phát hiện 330 nm. Khảo sát trên mẫu chuẩn acid chlorogenic (ACG), qua tham khảo một số tài liệu tiến hành khảo sát các hệ pha động sau: - Hệ 1: MeCN và dung dịch acid acetic 0,1% tỷ lệ 30: 70; - Hệ 2: MeCN và acid formic 0,1%, tỷ lệ 10: 90;

- Hệ 3: MeCN và dung dịch acid phosphoric 1,0% tỷ lệ 10: 90; - Hệ 4: MeCN và dung dịch acid phosphoric 0,4% tỷ lệ 10: 90; - Hệ 5: MeCN và dung dịch acid phosphoric 0,1%, với tỷ lệ của MeCN từ 5 - 20% (C = 5%).

Kết quả được trình bày ở hình 5.

(a) Hệ 1

30

(b)

(c)

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Hệ 2

Hệ 3

(d)

Hệ 4

(e) Hệ 5 MeCN 10% Hình 5. Sắc ký đồ tách chất phân tích với các hệ pha động 31

Trên sắc ký đồ phân tích với hệ pha động 1; 2 và 3, pic của acid chlorogenic được rửa giải sớm (Hình 5a, 5b, 5c). Khi phân tích mẫu thử là dược liệu hoặc chế phẩm đông dược, nhiều chất thường được rửa giải nhanh nên không lựa chọn hệ 1, hệ 2 và hệ 3 trong nghiên cứu.

Với hệ pha động 4 và 5 pic của acid chlorogenic cân xứng, thời gian lưu đều khoảng 16 phút (Hình 5d và 5e) thích hợp để phân tích acid chlorogenic.

Lựa chọn hệ 5 do hệ 4 có nồng độ dung dịch acid phosphoric cao hơn nên có thể gây ảnh hưởng tới cột sắc ký nhiều hơn so với hệ 5.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Khi tỷ lệ MeCN thay đổi từ 5 – 20% (C = 5%): trên sắc ký đồ thấy xuất hiện 01 pic, khi giảm tỷ lệ dung môi hữu cơ, thời gian rửa giải của pic cũng tăng dần, pic cân xứng. Từ kết quả khảo sát trên với hệ pha động MeCN - acid phosphoric 0,1% với tỷ lệ 10: 90, tt/tt là phù hợp để tách chất phân tích trong dung dịch chuẩn acid chlorogenic.

Sử dụng hệ pha động này để phân tích mẫu thực với mẫu thử là viên nang mềm ổ gan. Kết quả cho thấy giữa các lần tiêm mẫu, sắc ký đồ không ổn định, có thể các chất chưa được rửa giải hết ở lần tiêm trước đó. Vì vậy, với tỷ lệ pha động lựa chọn theo cách rửa giải đẳng dòng không phù hợp để tách acid chlorogenic nên tiếp tục khảo sát chương trình rửa giải gradient, ảnh hưởng của nhiệt độ cột và tốc độ dòng.

Cố định thể tích tiêm 10µl, bước sóng phân tích 330nm, khảo sát chế độ gradient tỷ lệ pha động và tốc độ dòng theo bảng sau:

Bảng 4. Các hệ gradient tỷ lệ pha động và tốc độ dòng

Chương trình 1

B

Thời gian (phút)

A (%)

(%)

0 → 14

10

14,0→ 14,5 14,5→ 21,0

Tốc độ dòng

B (%)

Tốc độ dòng

(ml/ phút)

Thời gian (phút)

A (%)

90

1,0

24,0→ 24,5

10 → 90

90 → 10

1,0

10

90

1,0 → 1,5

24,5→ 28,0

90

10

1,0

10

90

1,5

28,0→ 28,5

90 → 10

10 → 90

1,0

32

(ml/ phút)

trình

2

Chương trình

3

10

90

1,5 → 1,0

28,5→ 30,0

10

Thời gian (phút)

A (%)

B

Tốc độ dòng

(%)

(ml/ phút)

Thời gian (phút)

A (%)

0 → 12.5

10

90

1,0

24,0→ 24,5

10 → 90

90 → 10

1,0

12,5→ 13,0

10

90

1,0 → 1,5

24,5→ 28,5

90

10

1,0

13,0→ 18,0

10

90

1,5

28,5→ 29,0

90 → 10

10 → 90

1,0

18,0→ 18,5

10

90

1,5 → 1,0

29,0→ 30,0

10

90

1,0

Thời gian (phút)

A (%)

B

Tốc độ dòng

Thời gian (phút)

B (%)

Tốc độ dòng

A (%)

(%)

(ml/ phút)

Chương trình

1

B (%)

Tốc độ dòng (ml/ phút)

(ml/ phút)

10

90

1,5

22,0→ 22,5

10 → 90

90 → 10

1,5

14,0→ 14,5

10

90

1,5 → 1,0

22,5→ 27,0

90

10

1,5

14,5→ 21,0

10

90

1,0

27,0→ 27,5

90 → 10

10 → 90

1,5

21,0→ 21,5

10

90

1 → 1,5

27,5→ 30,0

10

90

1,5

(b) Chương trình

1,0

0 → 14

Kết quả được trình bày ở hình 6

(a)

90

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Chương

21,0→ 21,5

2

33

(c) Chương trình

3

Hình 6. Sắc ký đồ kh o sát gradient pha động chương 1(a), hệ 2(b) và hệ 3(c)

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Kết quả khảo sát qua 3 Chương trình gradient cho thấy trên sắc ký đồ hình 6c cho pic tách tốt, cân xứng, thời gian lưu của pic acid chlorogenic khoảng 17 phút, pic ACG tách rời khỏi pic liền kề nên chọn Chương trình 3. h o sát nhiệt độ cột ở các mức lần lượt 20; 25; 30; 35oC. Kết quả trình

bày ở hình 7. (a)

nhiệt độ cột 200C

(b) nhiệt độ cột 250C

34

(c) nhiệt độ cột 300C

(d)

cột 350C

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

nhiệt độ

Hình 7. Sắc ký đồ đánh giá nh hưởng của nhiệt cột

Kết quả ở hình 7 cho thấy, khi kiểm soát nhiệt độ cột ở 25oC, khả năng tách pic acid chlorogenic tốt nhất (Rs= 2,06) (hình 7b) và rửa giải hoàn toàn ở phút thứ 20; ở 20oC pic acid chlorogenic chưa tách hoàn toàn khỏi pic liền kề (hình 7a) và khi tăng điều nhiệt cột trên 30oC thì pic CGA bị xen phủ nhiều (hình 7c và 7d) do đó nhiệt độ cột thích hợp để phân tích CGA là 25oC. Quét phổ UV tại vị trí ứng với thời gian lưu pic acid chlorogenic trên sắc ký đồ, cho kết quả bước sóng cực đại là 330 nm (hình 8).

Hình 8. Phổ UV của pic acid chlorogenic 35

Sử dụng điều kiện sắc ký phân tích đã khảo sát đối với mẫu thử cao actiso. Kết quả cho thấy pic acid chlorogenic được tách hoàn toàn khỏi các pic

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

liền kề (hình 9).

Hình 9. Sắc ký đồ mẫu thử cao actiso

Từ kết quả khảo sát, điều kiện sắc ký được lựa chọn như sau:

- Cột Inertsil ODS (250 x 4,6mm, 5µm); nhiệt độ cột: 25oC - Pha động: Acetonitril (A) - dung dịch acid phosphoric 0,1% (B) theo chương trình gradient: B

Thời gian (phút)

Tốc độ

A

(%)

Thời gian

dòng

(%)

(phút)

B (%)

Tốc độ dòng

A (%)

(ml/ phút)

(ml/ phút)

0 → 14

10

90

1,5

22,0→ 22,5

10 → 90

90 → 10

1,5

14,0→ 14,5

10

90

1,5 → 1,0

22,5→ 27,0

90

10

1,5

14,5→ 21,0

10

90

1,0

27,0→ 27,5

90 → 10

10 → 90

1,5

21,0→ 21,5

10

90

1 → 1,5

27,5→ 30,0

10

90

1,5

- Detector UV bước sóng 330 nm; - Thể tích tiêm: 10µl.

36

3.2. Thẩm định phƣơng pháp 3.2.1. Độ chọn lọc: Tiến hành tiêm vào hệ thống sắc ký lần lượt các dung dịch sau: - Đối với cao: mẫu placebo (MeOH 60%); mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn.

- Đối với viên: mẫu placebo (chuẩn bị tương tự mẫu thử); mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Kết quả được trình bày ở hình 10 và hình 11.

Hình 10. Sắc ký đồ của mẫu thử viên nang mềm Bổ gan (a), mẫu chuẩn (b), mẫu placebo (c), mẫu thử thêm chuẩn (d)

37

Hình 11. Sắc ký đồ của mẫu cao actiso (a), mẫu chuẩn (b), mẫu placebo (methanol 60%) (c), mẫu thử thêm chuẩn (d) Kết quả ở hình 10 và hình 11 cho thấy trên sắc ký đồ của mẫu thử có pic có cùng thời gian lưu với pic acid chlorogenic trong sắc ký đồ của mẫu chuẩn; pic ứng với acid chlorogenic trong sắc ký đồ của mẫu thử thêm chuẩn tăng lên, còn sắc ký đồ của mẫu placebo không xuất hiện pic ứng với thời gian lưu của acid chlorogenic. Tiến hành chồng phổ UV của pic acid chlorogenic trên sắc ký đồ của dung dịch thử và chuẩn, hệ số match thu được lần lượt là 999,98 và

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

1000,0. Độ tinh khiết của pic acid chlorogenic trên sắc ký đồ mẫu viên nang mềm Bổ gan và cao actiso là 999,753 và 999,751 cho thấy pic thu được trên sắc ký đồ của mẫu thử là tinh khiết (hình 12 và 13)

Hình 12. Chồng phổ UV và tinh khiết píc của mẫu viên nang mềm Bổ gan

Hình 13. Chồng phổ UV và tinh khiết píc của mẫu cao actiso Như vậy, phương pháp đạt yêu cầu về độ chọn lọc.

38

3.2.2. T nh th ch hợp của hệ thống sắc ký Tiêm vào hệ thống sắc ký 6 lần dung dịch chuẩn được chuẩn bị như trên.

Ghi lại sắc ký đồ. Kết quả trình bày ở Bảng 5.

Bảng 5. Tính thích hợp của hệ thống sắc ký Thời gian lưu (phút)

Diện tích pic (mAU.s)

1

17,276

1054,6

2

17,253

1056,5

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

STT

3

17,282

1055,9

4

17,281

1062,1

5

17,355

1059,9

6

17,317

1059,9

TB

17,291

1058,15

RSD (%)

0,173

0,274

Kết quả ở bảng 5 cho thấy hệ thống HPLC sử dụng là phù hợp và đảm bảo sự ổn định với độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của thời gian lưu và diện tích pic đều nhỏ hơn 2,0%.

3.2.3. Khoảng nồng độ tuyến t nh Từ dung dịch chuẩn gốc pha loãng chính xác để thu được dãy các dung dịch chuẩn trong MeOH 60% có nồng độ acid chlorogenic là 50%, 80%, 100%, 120%, 150% so với nồng độ định lượng (35 µg/ml). Tiến hành sắc ký. Kết quả được thể hiện ở Bảng 6 và Hình 14.

Bảng 6. Kết qu kh o sát kho ng tuyến tính

39

Nồng độ ACG (µg/ml)

17,9

28,6

35,7

42,8

53,6

Diện tích pic (mAU.s)

530,3

843,7

1058,4

1260,0

1568,4

Phương trình hồi quy: y = 29.111x + 12,333 Hệ số tương quan: 0.99995

y-Hệ số chắn (y-intercept): 1,17%

Độ tuyến tính 1,800.00 1,600.00 1,400.00 1,200.00 1,000.00 800.00 600.00 400.00 200.00 0.00

D Diện tích pic (m.AU.s) ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

y = 29.111x + 12.333 R² = 0.9999

0.00

10.00

20.00

30.00

40.00

50.00

60.00

Nồng độ (µg/ml)

Hình 14. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic CGA Kết quả cho thấy trong khoảng nồng độ khảo sát có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa nồng độ acid chlorogenic và diện tích pic với hệ số tương quan r  1.

3.2.4. Độ ch nh xác

Tiến hành định lượng lặp lại trên 6 mẫu thử độc lập, trên 2 ngày khác nhau với cách tiến hành và điều kiện sắc ký như trên. Kết quả được trình bày ở Bảng 7 và 8.

Bảng 7. Kết qu đánh giá độ chính xác của phương pháp trên cao actiso Ngày

STT

Ngày 1

Lượng cân (g)

Diện tích pic (mAU.s)

Hàm lượng (mg)

Ngày 2 Hàm lượng

40

Lượng cân (g)

Diện tích pic (mAU.s)

Hàm lượng (mg)

Hàm lượng

(%)

(%)

0,244

1067,3

1,8756

0,7241

0,2446

1052,5

1,8483

0,7120

2

0,2418

1036,5

1,8215

0,7096

0,244

1073,4

1,8850

0,7279

3

0,2429

1050,1

1,8454

0,7157

0,245

1056,1

1,8547

0,7133

4

0,243

1049,9

1,8450

0,7153

0,2426

1048,9

1,8420

0,7154

5

0,2409

1049,9

1,8450

0,7215

0,2422

1050

1,8439

0,7174

6

0,2441

1053

1,8505

0,7141

0,2437

1053,3

1,8497

0,7152

1,8472

0,7167

0,2437

1,8540

0,7169

TB RSD

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

1

0,80

0,73

Độ chính xác trung gian TB ± RSD%: 0,7168 ± 0,73% (n=12)

Bảng 8. Kết qu đánh giá độ chính xác của phương pháp trên viên nang mềm Bổ gan

Ngày 1

Ngày 2

Lượng cân (g)

Diện tích pic (mAU.s)

Hàm lượng (mg)

Lượng cân (g)

Diện tích pic (mAU.s)

Hàm lượng (mg)

0,8277

1093,3

1,831

0,8264

1095,3

1.834

0,8276

1093,6

1,832

0,8238

1054,7

1.772

3

0,8247

1057,9

1,778

0,8222

1042,4

1.754

4

0,8252

1069,8

1,797

0,8224

1058,2

1.781

5

0,8248

1058,6

1,779

0,8215

1034,6

1.743

6

0,8232

1043,1

1,756

0,8235

1066,5

1.792

Mẫu thử 1 2

TB

1,796 ± 1,7% Độ chính xác trung gian TB ± RSD%: 1,791 ± 1,70 % (n=12)

41

1,779 ± 1,81%

Kết quả ở bảng 7 và 8 cho thấy phương pháp có độ chính xác tốt với độ lặp lại trong ngày (n = 6) có RSD < 2,0% đối với cả 2 nền mẫu (n = 6) và độ chính xác trung gian (n=12) có RSD < 3,0%. Như vậy phương pháp có độ chính xác đạt yêu cầu đối với cả cao và chế phẩm viên nang mềm.

3.2.5. Độ đúng Độ đúng của phương pháp được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn.

Thêm vào mẫu thử một lượng chất chuẩn acid chlorogenic tương ứng với 3 mức nồng độ 70%, 100%, 130% so với nồng độ định lượng. Tại mỗi mức nồng độ

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

thực hiện trên 3 mẫu độc lập. Tiến hành xử lý mẫu, phân tích mẫu theo quy trình. Song song tiến hành một mẫu chuẩn.

Mẫu viên nang mềm Bổ gan: khối lượng trung bình là 0,8242g, hàm lượng acid chlorogenic là 1,796 mg/viên.

Mẫu cao actiso: độ ẩm 5,72%, hàm lượng 0,7167% tính theo cao khô kiệt.

- Dựa vào hàm lượng hoạt chất đã biết trong mẫu thử, hàm lượng chất chuẩn thêm vào và căn cứ vào diện tích pic trên sắc ký đồ để tính hàm lượng thu hồi của acid chlorogenic. Kết quả đánh giá độ đúng được trình bày ở bảng 9 và 10.

Bảng 9. Kết qu đánh giá độ đúng cao actiso

T

Lượng mẫu thử (g)

Lượng có sẵn (mg)

Lượng thêm vào (mg)

Diện tích pic (mAU.s)

Lượng tìm thấy (mg)

Độ thu hồi (%)

1

0,1271

0,9669

0,3904

776

1,3628

101,38

2

0,1225

0,9319

0,3904

750,1

1,3173

98,69

3

0,1247

0,9487

0,3904

760,7

1,3359

99,17

4

0,1207

0,9183

0,8964

1023,8

1,7979

98,13

T

42

Trung bình (%)

99,75

100,35

RSD (%)

1,44

1,91

5

0,1275

0,9700

0,8964

1069,8

1,8787

101,38

6

0,1298

0,9875

0,8964

1080,6

1,8977

101,54

7

0,1258

0,9571

1,3844

1326,4

2,3293

99,12

8

0,1271

0,9669

1,3844

1323,5

2,3242

98,04

9

0,1254

0,9540

1,3844

1325,9

2,3285

99,28

98,81

0,68

Bảng 10. Kết qu đánh giá độ đúng trên viên nang mềm Bổ gan Lượng

Lượng

Diện tích

mẫu

có sẵn

thêm vào

pic

thử (g)

(mg)

(mg)

(mAU.s)

1

0,4154

0,9052

0,5303

854,3

1,4379

100,46

2

0,4152

0,9047

0,5303

848,3

1,4277

98,63

3

0,4148

0,9039

0,5303

846,9

1,4255

98,35

4

0,4125

0,8988

0,8839

1063,7

1,7904

100,86

5

0,4124

0,8986

0,8839

1065,5

1,7934

101,23

6

0,413

0,8999

0,8839

1069,7

1,8005

101,88

7

0,4127

0,8993

1,1883

1241,1

2,0890

100,12

8

0,4123

0,8984

1,1883

1227,9

2,0668

98,33

9

0,413

0,8999

1,1883

1235,9

2,0802

99,33

T

Lượng

Lượng tìm % thu

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

T

thấy (mg)

hồi

%

RSD

Trung bình

(%)

99,15

1,55

101.33

0,51

99,26

0.9

Kết quả thực nghiệm cho thấy % thu hồi ở mỗi mức nồng độ từ 98,33% đến 101,88% đối với mẫu viên nang mềm Bổ gan và 98,04% đến 101,54% đối với mẫu cao actiso với độ lệch chuẩn tương đối ở 3 mức nồng độ đều nhỏ hơn 2,0%. Như vậy, phương pháp phân tích có độ đúng tốt đối với hoạt chất nghiên cứu trong mẫu viên nang mềm Bổ gan và mẫu cao actiso.

43

3.2.6. Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) Pha loãng dung dịch chuẩn gốc lần lượt bằng dung dịch placebo và MeOH 60% thành các dung dịch có nồng độ CGA giảm dần từ 0,784 – 0,098 µg/ml.

Tiến hành sắc ký. Nồng độ tại đó có tỷ lệ S/N khoảng 3 và bằng 10 được coi là LOD và LOQ của phương pháp. Kết quả được trình bày trong bảng 11, hình 15 Bảng 11. ết qu giới hạn phát hiện

(a)

(b)

Dung dịch chiết từ placebo Nồng độ S/N (µg/ml) 0.784 11.9 0.392 6.1 0.196 2.8 0.098 -

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

MeOH 60% Nồng độ S/N (µg/ml) 0.784 12.2 0.392 5.8 0.196 3.0 0.098 -

Hình 15. Sắc ký đồ xác định LOD của phương pháp dung dịch chuẩn/placebo (a) và dung dịch chuẩn/MeOH 60% (b) Kết quả thu được cho thấy khi dung dịch chuẩn trong dung dịch chiết từ placebo (nền mẫu nang mềm) ảnh hưởng không đáng kể tới đáp ứng của pic 44

CGA. LOD và LOQ của phương pháp định lượng acid chlorogenic trong cao và viên nang mềm đều là 0,196 µg/ml và 0,647 µg/ml.

Từ các kết qu thẩm định cho thấy phương pháp đáp ứng các yêu cầu về độ chọn lọc, kho ng tuyến tính, độ đúng, độ chính xác theo qui định của ICH; phương pháp có độ nhạy cao, kho ng làm việc là 70-130% nồng độ định lượng 35 µg/ml.

4. Ứng dụng

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

4.1. Định lượng acid chlorogenic trong cao actiso Định lượng acid chlorogenic trong cao actiso theo qui trình được trình bày trong mục 4.1, làm lặp lại 3 lần. Dựa vào nồng độ acid chlorogenic trong dung dịch chuẩn, diện tích pic acid chlorogenic trong sắc ký đồ của dung dịch chuẩn làm song song, lượng cân và độ ẩm của mẫu thử tính được hàm lượng acid chlorogenic trong cao actiso theo chế phẩm khô kiệt. Kết quả thể hiện trong Bảng 12 và minh họa ở hình 16.

Bảng 12. Kết qu định lượng acid chlorogenic trên mẫu cao actiso

Mẫu

Độ ẩm

Lượng cân thử (g)

Diện tích píc (mAU.s)

Hàm lượng (mg)

0,2487

1256,7

2,2056

(%)

Hàm lượng (%) 0,6364

4,89

CA01

CA02

0,2396

1225,5

2,1509

0,6290

0,2392

1226,2

2,1521

0,6305

0,2425

1194,6

2,0966

0,2474

1212,6

2,1282

0,8603

0,24

1168,7

2,0512

0,8622

0,2433

1116,3

1,9604

0,2415

1106,4

1,9430

4,17

4,31

0,6320 ± 0,62

0,8499

0,8273

CA03

45

Trung bình (%) ± RSD%

0,8232

0,8574 ± 0,77

0,8228 ± 0,58

0,2443

1098,2

1,9286

0,244

1067,3

1,8732

0,8178 4,57

0,7685 0,7629

CA04

0,2418

1036,5

1,8191

0,7673

0,2429

1050,1

1,8430

0,7529

0,2496

1042,7

1,8311

4,56

± 1,14

0,6998 0,6984

0,2447

1020

1,7913

0,2447

1018,4

1,7884

0,6971

0,2429

CA06

CA07

5,72

926,1

1,6264

0,2485

936,4

1,6444

0,7093

0,2402

907,3

1,5933

0,7154

0,2422

793,6

1,3928

4,36

± 0,19

0,7238

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

CA05

0,6982

0,7162 ± 1,02

0,5500

0,2495

814,3

1,4292

0,5478

0,2475

804,8

1,4125

0,5458

0,5479 ± 0,38

Hình 16. Sắc ký đồ của mẫu cao actiso CA04 4.2. Định lượng acid chlorogenic trong một số lô chế phẩm viên nang mềm Bổ gan trên thị trường

46

Định lượng acid chlorogenic trong chế phẩm viên nang mềm Bổ gan theo qui trình được trình bày trong mục 4.1, làm lặp lại 3 lần. Dựa vào nồng độ acid chlorogenic trong dung dịch chuẩn, diện tích pic acid chlorogenic trong sắc ký đồ của dung dịch chuẩn làm song song, lượng cân và khối lượng trung bình viên của mẫu thử tính được hàm lượng acid chlorogenic trong chế phẩm. Kết quả thể hiện trên Bảng 13 và minh họa ở hình 17.

Bảng 13. Kết qu định lượng acid chlorogenic trên mẫu viên nang mềm Bổ gan Trung bình Lượng cân thử (g)

mtb (g)

Diện tích píc (mAU.s)

Hàm lượng (mg/ viên)

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Mẫu thử

0,8108

A.03.1992017

A.01.0872017

A.02.1592017

A.02.1692017

A.01.2872017

1082,3

1,809

1100,6

1,839

0,8131

1103,3

1,839

0,8277

1093,3

1,831

1093,6

1,832

0,8247

1057,9

1,778

0,8225

1037,9

1,730

1043,4

1,737

0,8245

1020

1,696

0,8193

999

1,658

1006,3

1,680

0,816

1011,8

1,686

0,8097

905,5

1,500

900,3

1,496

899,9

1,495

933,2

1,6191

0,8114

0,8276

0,8234

0.8143

0,8071

0,8143

0,82423

0,82342

0,8168

0,8055

0,8072 B.01.2292017

0,8347

0,8312

47

(mg/viên) ±RSD (%)

1,829 ± 0,95%

1,814 ± 1,70%

1,721 ± 1,27%

1,675 ± 0,88%

1,497 ± 0,18%

0,8353

924,8

1,6033

1,604mg ± 0,89%

B.02.0872017

B.03.0982017

0,8398

922,4

1,5906

0,8245

912,3

1,5958

899,4

1,5641

0,8277

893,7

1,5572

0,8316

898

1,5661

889,5

1,553

866,7

1,5123

0,8293

0,8307

0,8278

0,8324

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

0,8312

Hình 17. Sắc ký đồ của mẫu thử viên nang mềm Bổ gan

48

1,572mg ± 1,31%

1,544mg ± 1,82%

PHẦN 4. BÀN LUẬN 1.

L a chọn phƣơng pháp phân tích Hoạt chất acid chlorogenic là một chất có tác dụng chống oxy hóa, chống

viêm, ức chế sự phát triển của khối u; chống sự đột biến gen của tế bào; tiêu diệt chất gây ung thư, làm chậm quá trình giải phóng glucose vào tuần hoàn sau bữa ăn; có tác dụng chống virus, kháng khuẩn và chống nấm đi kèm độc tính ở mức độ thấp. Có nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước đề cập đến định lượng acid chlorogenic trong mẫu dựơc liệu và cao dược liệu: Dược điển châu Âu 8.0 [14],

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

chuyên luận actiso, cao actiso yêu cầu định lượng acid chlorogenic; Dược điển Trung Quốc 2015 [13] chuyên luận kim ngân hoa có yêu cầu định tính và định lượng acid chlorogenic; Dược điển Mỹ 38 [26] có 17 chuyên luận yêu cầu định tính, định lượng acid chlorogenic trong một số dược liệu, bột dược liệu và dịch chiết của cây: Echinacea angustifolia, Echinacea pallida, Echinacea pupurea, Ginkgo, Hawthorm Leaf with flower, St. John’s Wort;…Nguyễn Thị Ánh Nguyệt và cộng sự [7] định lượng acid chlorogenic trong kim ngân hoa bằng HPLC; Vũ Bình Dương và cộng sự (2015) [9] đã xây dựng phương pháp định lượng acid chlorogenic trong ngũ gia bì chân chim bằng HPLC… Dược điển Việt Nam IV [1] chưa có chuyên luận nào yêu cầu định lượng acid chlorogenic trong dược liệu và chế phẩm từ dược liệu. Do đó, tiêu chuẩn hóa cao actiso và chế phẩm chứa actiso (viên nang mềm Bổ gan) dựa trên hàm lượng ACG là cần thiết nhằm nâng cao tiêu chuẩn chất lượng các chế phẩm này.

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một trong những phương pháp được sử dụng nhiều nhất trong lĩnh vực phân tích, đặc biệt là kiểm nghiệm thuốc. Sắc ký lỏng hiệu năng cao với nhiều detector khác nhau cho phép phân tích nhiều hoạt chất có cấu trúc và tính chất đa dạng. Hiện nay, với sự phát triển mạnh mẽ của khoa học kỹ thuật lĩnh vực điện tử và công nghệ thông tin, thiết bị HPLC đã dần hoàn thiện và khẳng định tầm quan trọng trong lĩnh vực phân tíchtrên nhiều nền mẫu khác nhau: dược liệu, chế phẩm tân dược, đông dược….

Mặt khác, phương pháp này cho phép vừa tách vừa định tính, định lượng đồng 49

thời chất phân tích trong cùng một phép thử với độ chọn lọc và độ chính xác cao, cần ít mẫu nên ngày càng được áp dụng phổ biến.

2.

Về ây d ng phƣơng pháp phân tích Theo Dược điển châu Âu EP 8.0 [14], acid chlorogenic trong lá được

chiết hồi lưu bằng methanol lặp lại 2 lần trong 2 giờ và chiết bằng hỗn hợp methanol – nước (30:70) đối với cao actiso, sử dụng cột tách C18 (250 × 4,6 mm; 5 µm) duy trì ở 40oC; hệ pha động là gồm A: acid phosphoric – nước (0,5:99,5), B: acid phosphoric – acetonitril (0,5:99,5) chạy theo chế độ gradient

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

thành phần pha động, phát hiện bằng detectơ UV ở 330 nm, thời gian phân tích khoảng 40 phút. Pic của acid chlorogenic được tách ra và có thời gian lưu khoảng 9,1 phút. Tuy nhiên, khi lặp lại điều kiện chiết này đối với mẫu nghiên cứu, hiệu suất thu được thấp hơn khi chiết với hỗn hợp methanol – nước (60:40), điều kiện sắc ký không tách được acid chlorogenic trong mẫu nang mềm. Li-Mei Wang và cộng sự chiết acid chlorogenic trong kim ngân hoa với dung môi ethanol 70o bằng cách siêu âm 30 phút; lọc lấy dịch chiết; dịch được cô đặc và làm khô ở 45ºC trong chân không; sau đó hòa tan cắn trong methanol và định lượng bằng HPLC [20]. Quy trình xử lý mẫu khá phức tạp có thể gây mất mẫu.

Theo Dược điển Trung Quốc [13] và Nguyễn Thị Ánh Nguyệt và cộng sự định lượng acid chlorogenic trong kim ngân hoa bằng HPLC với hệ pha động chạy đẳng dòng với hệ dung môi acetonitril : dung dịch acid phosphoric 0,4% (13:87) [7]. Với hệ này khi áp dụng chạy với viên nang mềm Bổ gan không đảm bảo rửa giải được hết các chất như chương trình gradient mà chúng tôi xây dựng. Nghiên cứu này đã khảo sát và lựa chọn được điều kiện sắc ký và quy trình xử lý mẫu tối ưu để tách acid chlorogenic (tR khoảng 17,3 phút, Rs = 1,73 và As = 0,97) trong các chế phẩm viên nang mềm Bổ gan và cao actiso với thời gian phân tích 30 phút. Nghiên cứu sử dụng pha tĩnh là cột Inertsil ODS có điều nhiệt cột ở 25oC và pha động là hỗn hợp MeCN - dung dịch acid phosphoric 0,1% với chương trình rửa giải gradient, gradient tốc độ dòng, đây là điều kiện phân tích sắc ký lỏng có thể dễ dàng áp dụng. Chế độ gradient pha động nhằm tách được 50

chất cần phân tích, rửa giải được chất ít phân cực đồng thời đưa điều kiện pha động về trạng thái ban đầu để phân tích các mẫu tiếp theo cho kết ổn định.

Gradient tốc độ dòng nhằm giảm thời gian phân tích mẫu.

3.

Về thẩm định phƣơng pháp phân tích Kết quả thẩm định theo hướng dẫn của ICH [17] trên nền mẫu viên nang

mềm Bổ gan và cao khô actiso cho thấy, quy trình đảm bảo tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính được xây dựng nồng độ acid chlorogenic trong khoảng 17,9 53,6 µg/ml, kết quả cho thấy có sự tương quan chặt chẽ giữa nồng độ hoạt chất

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

và diện tích pic tương ứng với hệ số tương quan xấp xỉ 1. Độ chính xác trong ngày (n=6) và giữa 2 ngày (n=12) đều có giá trị RSD < 2%. Độ đúng thực hiện theo phương pháp thêm chuẩn tại các mức nồng độ 70%, 100%, 130% so với nồng độ định lượng với n=3 đều nằm trong khoảng 98,0 - 102,0%. Phương pháp có độ nhạy cao với giới hạn định lượng 0,647 µg/ml.

4.

Về ứng dụng phƣơng pháp ây d ng đƣợc trong phân tích mẫu th c Phương pháp xử lý mẫu khá đơn giản với điều kiện sắc ký không quá

phức tạp nên dễ thực hiện trong điều kiện phòng thí nghiệm, không đòi hỏi trang thiết bị đặc biệt, dễ dàng triển khai áp dụng và tiết kiệm chi phí, thời gian.

Nghiên cứu đề cập phân tích đánh giá hàm lượng acid chlorogenic từ nguyên liệu đầu vào (cao Actiso) và thành phẩm (viên nang mềm Bổ gan).

Việc đánh giá nguyên liệu đầu vào bao hàm 2 đối tượng là cao Actiso và dược liệu Actiso. Tuy nhiên, dược liệu Actiso được trồng ở vùng khác nhau, thời điểm thu hái khác nhau, bộ phận thu hái cũng có sự khác biệt (nơi thì thu hái toàn cây, nơi thu lá, có nơi thu riêng hoa) nên hàm lượng chất phân tích có sự khác nhau nhiều khó có thể chuẩn hóa được dược liệu. Hơn nữa, có thể thấy trên thị trường lưu hành song song cả cao Actiso và dược liệu Actiso dạng hoa đã phơi sấy khô và thái lát. Do đó, nghiên cứu của này chỉ đề cập trên 2 đối tượng là viên nang mềm Bổ gan và cao Actiso. Chúng tôi đã tiến hành định lượng acid chlorogenic trong 07 mẫu cao Actiso mua trên 51

thị trường và 08 mẫu viên nang mềm Bổ gan do 2 công ty khác nhau sản xuất được mua tại các nhà thuốc trên địa bàn Hà Nội theo phương pháp đã xây dựng. Kết quả cho thấy hàm lượng acid chlorogenic trong các mẫu thử rất khác nhau giữa các lô trong cùng công ty và giữa các công ty (mẫu viên nang mềm Bổ gan công ty A hàm lượng acid chlorogenic từ 1,497 đến 1,829 mg/viên, công ty B hàm lượng acid chlorogenic từ 1,544 đến 1,604 và mẫu cao Actiso từ 0,548% đến 0,857%). Từ đó cho thấy cần kiểm soát chất lượng thành phẩm và bán thành phẩm từ dược liệu phục vụ sản xuất và đảm bảo chất lượng sản phẩm phục vụ tốt hơn cho người bệnh và tiến tới xuất

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

khẩu để nâng cao giá trị sản phẩm dược liệu của Việt Nam.

52

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Từ kết quả thu được, chúng tôi đưa ra kết luận sau: 1. Đã xây dựng được phương pháp định lượng acid chlorogenic trong cao Actiso và viên nang mềm Bổ gan bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao. Phương pháp đơn giản, dễ áp dụng tại các đơn vị kiểm nghiệm tại Việt Nam. Cụ thể như sau: Mẫu thử viên nang mềm được loại béo bằng n-hexan, ACG được chiết siêu âm bằng methanol 60% (với cả cao và viên nang mềm) và

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

phân tích bằng cột C18 Inersil ODS (250 mm x 4,6 mm; 5 µm); pha động gồm acetonitril và dung dịch acid phosphoric 0,1% chạy theo chế độ gradient; phát hiện bằng detector UV tại bước sóng 330 nm.

2. Phương pháp thẩm định đáp ứng yêu cầu của ICH chứng tỏ phương pháp có độ chọn lọc tốt, có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa đáp ứng phân tích và nồng độ ACG trong khoảng khảo sát với hệ số tương quan r  1, độ chính xác trong ngày và giữa hai ngày đều đạt yêu cầu RSD đều nhỏ hơn 2,0% đối với cả 2 loại mẫu thử. Độ thu hồi từ 98,33% đến 101,88% đối với mẫu viên nang mềm Bổ gan và 98,04% đến 101,54% đối với mẫu cao Actiso với độ lệch chuẩn tương đối ở 3 mức nồng độ đều nhỏ hơn 2,0%. Phương pháp có độ nhạy cao với giới hạn định lượng 0,647 µg/ml.

3. Kết quả phân tích trên 08 mẫu viên nang mềm Bổ gan do 2 công ty khác nhau sản xuất được mua tại các nhà thuốc trên địa bàn Hà Nội và 07 mẫu cao Actiso mua trên thị trường cho thấy phương pháp đã xây dựng phù hợp để phân tích định lượng hoạt chất acid chlorogenic trong 2 nền mẫu đã thẩm định nên có thể đưa chỉ tiêu định lượng acid chlorogenic vào tiêu chuẩn chất lượng cho những chế phẩm này.

53

Kiến nghị Trên cơ sở nghiên cứu thực nghiệm và tính khả thi của phương pháp đã xây dựng chúng tôi đề xuất: - Cần phải nâng cấp tiêu chuẩn chất lượng chế phẩm đưa chỉ tiêu định lượng acid chlorogenic vào cao, chế phẩm viên nang mềm Bổ gan.

- Cần mở rộng quy mô nghiên cứu phương pháp định lượng acid chlorogenic trên các chế phẩm Bổ gan có thành phần tương tự nhưng ở dạng bào chế khác viên nang mềm Bổ gan lưu hành trên thị trường nhằm phục vụ công tác

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

giám sát chất lượng thuốc và thực phẩm chức năng.

54

TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1.

Bộ Y Tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, NXB Y Học, tr. 681, 695; PL 9, 127

2.

Bộ môn dược liệu (1998), ài gi ng dược liệu tập I, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr. 304 - 309.

3.

Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam (2004), NXB khoa học và kỹ thuật, tr. 79 - 81.

Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y Học, Hà Nội, tr. 33.

5.

Lê Thị Thu Hiền (2010), Nghiên cứu thiết lập chất chuẩn acid chlorogenic từ

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

4.

kim ngân hoa phục vụ công tác kiểm tra chất lượng thuốc, Luận văn thạc sĩ, Đại học Dược Hà Nội.

6.

Đỗ Tất Lợi (2005), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y Học, tr. 221 - 222.

7.

Nguyễn Thị Ánh Nguyệt, Lê Phan Kim Trang, Phạm Đông Phương (2016), "Phân lập và thiết lập chất chuẩn acid Chlorogenic", Tạp chí Dược học, (56 (487)), tr. 22 - 27.

8.

Phí Thị Bảo Thoa (2017), "Xây dựng phương pháp định lượng acid chlorogenic trong cao actiso bằng sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao"

9.

Vũ Bình Dương (2015), "Xây dựng phương pháp định lượng acid chlorogenic trong ngũ da bì chân chim ( Schefflera heptaphylla) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao", Tạp chí Dược học, (468 (55)), tr. 46 - 50.

TIẾNG ANH 10.

Abdul Mutalib A.G Nasser (2012), "Phytochemical Study of Cynara scolymus L. (Artichoke) (Asteraceae) Cultivated in Iraq, Detection and Identification of Phenolic Acid Compounds Cynarin and Chlorogenic Acid", Phytochemical study of cynara scolymus L.cultivated in Iraq, (21(1)), pp. 6-13.

11.

AOAC International (2016), "Appendix F: Guidelines for Standard Method Performance Requirements".

12.

Bin Zhang, BB Ruiyuan Yang, BB Yan Zhao (2008), "separation of chlorogenic acid honeysuchle crude extracts by macroporous resin", Journal of chromatography B, (867), pp. 253 - 258.

13.

Chinese pharmacopoeia 2015, pp. 270 - 271.

14.

European Pharmacopoeia, 8.0, pp. 1154-1156.

15.

Florinda Fratianni, BB Rosa Pepe, BB Filomena Nazzaro (2014), "Polyphenol Composition, Antioxidant, Antimicrobial and Quorum Quenching Activity of the “Carciofo di Montoro” (Cynara cardunculus var. scolymus) Global

16.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Artichoke of the Campania Region, Southern Italy", (5), pp. 2053-2062.

Hisae Oku, BB Yuko Ogawa, BB Emiko IWAOKA, BB Kyoko ISHIGURO (2011), "Allergy - Preventive Effects of Chlorogenic Acid and Iridoid Derivatives from Flower Buds of Lonicera japonica", Pharmaceutical Society of Japan, (34(8)), pp. 1330-1333.

17.

ICH (2005), Validation of analytical procedures: Text and Methodology Q2 (R1)

18.

Jan Fritsche , BB Christaan M, BB Beindorff , BB Markus Dachtler , BB Hui Zhang , BB Jan G. Lammers (2002), "Isolation, characterization and determination of minor artichoke (Cynara scolymus L.) leaf extract compounds", Eur Food Res Technol (215), pp. 149 - 157.

19.

Jiagen Wen, Liqun Kang, Huan Liu, Yiyun Xiao, Xiuzhen Zhang, Yuxiang Chen (2012), &quot;A validated UV-HPLC method for determination of chlorogenic acid in Lepidogrammitis drymoglossoides (Baker) Ching, Polypodiaceae&quot;, Pharmacognosy Research 4(3), pp. 148 - 153.

20.

Li-Mei Wang, BB Mao-Teng Li, BB You-Yu Yan, BB Ming-Zhang Ao, BB GengWu, BB Long-Jiang Yu (2009), "Influence of flowering stage of Lonicera japonica Thunb. On variation in volatiles and chlorogenic acid", Research Article, (98), pp. 953-957.

21.

Mirna Leonor Sua rez-Quiroz, BB Angelina Alonso Campos\, BB Gerardo Valerio Alfaro, BB Oscar Gonzalez-Rıos, BB Pierre Villeneuve, BB Maria Cruz Figueroa-Espinoza (2014), "Isolation of green coffee chlorogenic acids using activated carbon”, Journal of Food Composition and Analysis", (33), pp. 55-58.

22.

Qing LI, Ying JIA, Liang XU, Xiaohui WANG, Zhenduo SHEN, Yulei LIU, Kaishun BI (2005), Simultaneous Determination of Protocatechuic Acid, Syringin, Chlorogenic Acid, Caffeic Acid, Liriodendrin and Isofraxidin in Acanthopanax senticosus HARMS by HPLC-DAD, Biol. Pharm. Bull, (29 (3)),

23.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

pp. 532 - 534.

Schütz K, BB Kammerer D, BB Carle R, BB Schieber A (2004), "Identification and quantification of caffeoylquinic acids and flavonoids from artichoke (Cynarascolymus L.) heads, juice, and pomace by HPLC-DAD-ESI/MS(n)", J Agric Food Chem, (52(13): ), p. 4090-6.

24.

sigmaaldrich.com, Retrieved, from.

25.

Tingting Wang, BB Xinhang Jiang, BB Lu Yang, BB Shihua Wu (2007), "pHgradient counter-current chromatography isolation of natural antioxidant chlorogenic acid from Lonicera japonica Thumb. using an upright coil planet centrifuge with three multi-layer coils connected in series", Journal of Chromatography A, (1180), pp. 53-58.

26.

USP 38, online.

27.

Yuan X., Koh H. L., Chui W. K. (2005), "A high performance liquid chromatography method for the simultaneous determination of arctiin, chlorogenic acid and glycyrrhizin in a Chinese proprietary medicine", J Pharm Biomed Anal, 39(3-4), pp. 697-704.

28.

Zhang Q., Li J., Wang C., Sun W., Zhang Z., Cheng W. (2007), "A gradient HPLC method for the quality control of chlorogenic acid, linarin and luteolin in Flos Chrysanthemi Indici suppository", J Pharm Biomed Anal, 43(2), pp. 753755.

PHỤ LỤC Phụ lục 1. Sắc ký đồ thẩm định phương pháp: độ tuyến tính, tinh khiết pic.

Phụ lục 2. Sắc ký đồ phân tích mẫu thực.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Phụ lục 3. Bài báo.

Data File C:\CHEM32\1\DATA\ACID CHLOROGENIC 2018-01-13 15-04-00\001-0101.D Sample Name: CHUAN CGA 50% ===================================================================== Acq. Operator : MAICH21 Seq. Line : 1 Acq. Instrument : Instrument 1 Location : Vial 1 Injection Date : 1/13/2018 3:05:01 PM Inj : 1 Inj Volume : 10.000 µl Acq. Method : C:\CHEM32\1\DATA\ACID CHLOROGENIC 2018-01-13 15-04-00\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 1/13/2018 3:03:35 PM by MAICH21 Analysis Method : C:\CHEM32\1\METHODS\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 1/23/2018 4:00:06 PM by MAI CH21 (modified after loading) Additional Info : Peak(s) manually integrated 17.285

DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (ACID CHLOROGENIC 2018-01-13 15-04-00\001-0101.D) mAU 15

5

0

-5

-10 0

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

10

5

10

15

20

25

min

===================================================================== Area Percent Report ===================================================================== Sorted By : Signal Multiplier: : 1.0000 Dilution: : 1.0000 Use Multiplier & Dilution Factor with ISTDs

Signal 1: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off Peak RetTime Type Width Area Height Area # [min] [min] [mAU*s] [mAU] % ----|-------|----|-------|----------|----------|--------| 1 17.285 BB 0.5646 533.92267 14.67030 100.0000 Totals :

533.92267

14.67030

===================================================================== *** End of Report *** Instrument 1 1/23/2018 4:05:31 PM MAI CH21

Page

1 of 1

Data File C:\CHEM32\1\DATA\ACID CHLOROGENIC 2018-01-13 15-04-00\002-0201.D Sample Name: CHUAN CGA 80% ===================================================================== Acq. Operator : MAICH21 Seq. Line : 2 Acq. Instrument : Instrument 1 Location : Vial 2 Injection Date : 1/13/2018 3:40:55 PM Inj : 1 Inj Volume : 10.000 µl Acq. Method : C:\CHEM32\1\DATA\ACID CHLOROGENIC 2018-01-13 15-04-00\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 1/13/2018 3:03:35 PM by MAICH21 Analysis Method : C:\CHEM32\1\METHODS\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 1/23/2018 4:00:06 PM by MAI CH21 (modified after loading) Additional Info : Peak(s) manually integrated 17.335

DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (ACID CHLOROGENIC 2018-01-13 15-04-00\002-0201.D) mAU

15

10

5

0

-5

-10 0

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

20

5

10

15

20

25

min

===================================================================== Area Percent Report ===================================================================== Sorted By : Signal Multiplier: : 1.0000 Dilution: : 1.0000 Use Multiplier & Dilution Factor with ISTDs

Signal 1: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off Peak RetTime Type Width Area Height Area # [min] [min] [mAU*s] [mAU] % ----|-------|----|-------|----------|----------|--------| 1 17.335 BB 0.5623 844.18927 23.21288 100.0000 Totals :

844.18927

23.21288

===================================================================== *** End of Report *** Instrument 1 1/23/2018 4:06:18 PM MAI CH21

Page

1 of 1

Data File C:\CHEM32\1\DATA\ACID CHLOROGENIC 2018-01-13 15-04-00\003-0501.D Sample Name: CHUAN CGA 100%.1 ===================================================================== Acq. Operator : MAICH21 Seq. Line : 5 Acq. Instrument : Instrument 1 Location : Vial 3 Injection Date : 1/13/2018 5:13:58 PM Inj : 1 Inj Volume : 10.000 µl Acq. Method : C:\CHEM32\1\DATA\ACID CHLOROGENIC 2018-01-13 15-04-00\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 1/13/2018 3:03:35 PM by MAICH21 Analysis Method : C:\CHEM32\1\METHODS\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 1/23/2018 4:00:06 PM by MAI CH21 (modified after loading) Additional Info : Peak(s) manually integrated 17.301

DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (ACID CHLOROGENIC 2018-01-13 15-04-00\003-0501.D) mAU

20

15

10

5

0

-5

-10 0

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

25

5

10

15

20

25

min

===================================================================== Area Percent Report ===================================================================== Sorted By : Signal Multiplier: : 1.0000 Dilution: : 1.0000 Use Multiplier & Dilution Factor with ISTDs

Signal 1: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off Peak RetTime Type Width Area Height Area # [min] [min] [mAU*s] [mAU] % ----|-------|----|-------|----------|----------|--------| 1 17.301 BB 0.5629 1058.64612 29.20764 100.0000 Totals :

1058.64612

29.20764

===================================================================== *** End of Report *** Instrument 1 1/23/2018 4:07:37 PM MAI CH21

Page

1 of 1

Data File C:\CHEM32\1\DATA\ACID CHLOROGENIC 2018-01-13 15-04-00\004-0301.D Sample Name: CHUAN CGA 120% ===================================================================== Acq. Operator : MAICH21 Seq. Line : 3 Acq. Instrument : Instrument 1 Location : Vial 4 Injection Date : 1/13/2018 4:11:55 PM Inj : 1 Inj Volume : 10.000 µl Acq. Method : C:\CHEM32\1\DATA\ACID CHLOROGENIC 2018-01-13 15-04-00\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 1/13/2018 3:03:35 PM by MAICH21 Analysis Method : C:\CHEM32\1\METHODS\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 1/23/2018 4:00:06 PM by MAI CH21 (modified after loading) Additional Info : Peak(s) manually integrated 17.295

DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (ACID CHLOROGENIC 2018-01-13 15-04-00\004-0301.D) mAU 35

25

20

15

10

5

0

-5

-10 0

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

30

5

10

15

20

25

min

===================================================================== Area Percent Report ===================================================================== Sorted By : Signal Multiplier: : 1.0000 Dilution: : 1.0000 Use Multiplier & Dilution Factor with ISTDs

Signal 1: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off Peak RetTime Type Width Area Height Area # [min] [min] [mAU*s] [mAU] % ----|-------|----|-------|----------|----------|--------| 1 17.295 BB 0.5616 1263.43213 34.96591 100.0000 Totals :

1263.43213

34.96591

===================================================================== *** End of Report *** Instrument 1 1/23/2018 4:06:47 PM MAI CH21

Page

1 of 1

Data File C:\CHEM32\1\DATA\ACID CHLOROGENIC 2018-01-13 15-04-00\005-0401.D Sample Name: CHUAN CGA 150% ===================================================================== Acq. Operator : MAICH21 Seq. Line : 4 Acq. Instrument : Instrument 1 Location : Vial 5 Injection Date : 1/13/2018 4:42:53 PM Inj : 1 Inj Volume : 10.000 µl Acq. Method : C:\CHEM32\1\DATA\ACID CHLOROGENIC 2018-01-13 15-04-00\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 1/13/2018 3:03:35 PM by MAICH21 Analysis Method : C:\CHEM32\1\METHODS\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 1/23/2018 4:00:06 PM by MAI CH21 (modified after loading) Additional Info : Peak(s) manually integrated 17.241

DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (ACID CHLOROGENIC 2018-01-13 15-04-00\005-0401.D) mAU

30

20

10

0

-10 0

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

40

5

10

15

20

25

min

===================================================================== Area Percent Report ===================================================================== Sorted By : Signal Multiplier: : 1.0000 Dilution: : 1.0000 Use Multiplier & Dilution Factor with ISTDs

Signal 1: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off Peak RetTime Type Width Area Height Area # [min] [min] [mAU*s] [mAU] % ----|-------|----|-------|----------|----------|--------| 1 17.241 BB 0.5577 1570.82825 43.45520 100.0000 Totals :

1570.82825

43.45520

===================================================================== *** End of Report *** Instrument 1 1/23/2018 4:07:09 PM MAI CH21

Page

1 of 1

Data File C:\CHEM32\1\DATA\ACID CHLOROGENIC1 2018-01-15 10-39-07\003-0301.D Sample Name: THU THEM CHUAN CGA

Purity results peak 1 at 17.442 min.

Signal DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (ACID CHLOROGENIC1 2018-01-15 10-39-07\003-0301.D) mAU 70 60 50 40 30 20 10 0 5

10

15

20

25

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

0

| |

'

'

'

'

min

| |

'

Calculated

++++-----------------------------------------------------------------

220

240

260

280

300

320

340

360

380

nm

17

18

min

-> The purity factor exceeds the calculated threshold limit. <Purity factor : Threshold : Reference : Spectra : Noise Threshol:

999.753 (7 of 137 spectra exceed the calculated threshold limit.)

999.779 (Calculated with 7 of 137 spectra) Peak start and end spectra (integrated) (16.427 / 18.260) 5 (Selection automatic, 5) 0.027 (12 spectra, St.Dev 0.0127 + 3 * 0.0048) *** End of Report ***

Instrument 1 1/17/2018 11:22:27 AM MAICH21

Page

1 of 1

Data File C:\CHEM32\1\DATA\CAO BIM BIM 2018-02-02 13-16-52\044-2901.D Sample Name: DO DUNG CAO ACTISO 100.1

Purity results peak 1 at 15.932 min.

Signal DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (CAO BIM BIM 2018-02-02 13-16-52\044-2901.D) mAU

30

20

10

0

5

10

15

20

25

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

0

| |

'

'

'

'

min

| |

'

Calculated

+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++

220

240

260

280

300

320

340

360

380

nm

15

16

17

min

-> The purity factor is within the calculated threshold limit. <-

Purity factor : 999.948 (132 of 132 spectra are within the calculated threshold limit.)

Threshold : 999.917 (Calculated with 132 of 132 spectra) Reference : Peak start and end spectra (integrated) (14.796 / 17.296) Spectra : 5 (Selection automatic, 5) Noise Threshol: 0.032 (12 spectra, St.Dev 0.0152 + 3 * 0.0056) *** End of Report ***

Instrument 1 2/4/2018 4:06:59 PM GIAP-TUYEN

Page

1 of 1

Data File C:\CHEM32\1\DATA\ACTISOMAI 2018-02-03 14-29-54\032-3001.D Sample Name: CA07 THU 3 ===================================================================== Acq. Operator : MAICH21 Seq. Line : 30 Acq. Instrument : Instrument 1 Location : Vial 32 Injection Date : 2/4/2018 5:31:01 AM Inj : 1 Inj Volume : 10.000 µl Acq. Method : C:\CHEM32\1\DATA\ACTISOMAI 2018-02-03 14-29-54\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/2/2018 1:16:52 PM by MAICH21 Analysis Method : C:\CHEM32\1\METHODS\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/4/2018 11:04:08 AM by GIAP-TUYEN (modified after loading) Additional Info : Peak(s) manually integrated DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (ACTISOMAI 2018-02-03 14-29-54\032-3001.D) mAU

50

40

30

20

10

0

0

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

60

5

10

15

20

===================================================================== Area Percent Report with Performance ===================================================================== Multiplier: : 1.0000 Dilution: : 1.0000 Use Multiplier & Dilution Factor with ISTDs

Signal 1: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off

RetTime k' Area Height Symm. Width Plates Resol Select [min] [mAU*s] [mAU] [min] ution ivity -------|------|----------|----------|-----|-------|-------|-----|-----15.968 804.77838 22.89622 0.96 0.5400 4843 -

===================================================================== *** End of Report ***

Instrument 1 2/4/2018 3:51:45 PM GIAP-TUYEN Page 1 of 1

25

min

Data File: C:\CHEM32\1\DATA\ACID CHLOROGENIC1 2018-01-16 09-47-22\019-2201.D Sample Name: A.01.0872017 THU 1 ======================================================================== Acq. Operator : MAICH21 Seq. Line : 22 Acq. Instrument : Instrument 1 Location : Vial 19 Inj : 1 Injection Date : 8:42:40 PM Inj. Volume (Method): 10 µl Acq. Method : C:\Chem32\1\DATA\ACID CHLOROGENIC1 2018-01-16 09-47-22\ACID CHLOROGENIC.M Analysis Method :

C:\CHEM32\1\METHODS\ACID CHLOROGENIC.M

Last changed : 1/23/2018 4:38:27 PM ( modified after loading ) ====================================================================================== DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (ACID CHLOROGENIC1 2018-01-16 09-47-22\019-2201.D) mAU

100

80

60

40

20

0 0

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

120

5

10

15

20

25

Customized Report: Performance Report per Signal ======================================================================================= Multiplier : 1.0000 Dilution : 1.00000 Available Signals: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off ======================================================================================= Signal: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off RetTime[min] Area[mAU*s] Height Symm.

USPTail. Plates Resolution -----------|--------------|------------|--------|----------|--------|-----------17.460 1104.124 29.631 0.974 1.102 1608 ========================================================================================

Instrument 1

1/23/2018

4:54:00 PM

Page 1 of 1

min

Data File: C:\CHEM32\1\DATA\ACID CHLOROGENIC1 2018-01-16 09-47-22\020-2301.D Sample Name: A.01.0872017 THU 2 ======================================================================== Acq. Operator : MAICH21 Seq. Line : 23 Acq. Instrument : Instrument 1 Location : Vial 20 Inj : 1 Injection Date : 9:13:48 PM Inj. Volume (Method): 10 µl Acq. Method : C:\Chem32\1\DATA\ACID CHLOROGENIC1 2018-01-16 09-47-22\ACID CHLOROGENIC.M Analysis Method :

C:\CHEM32\1\METHODS\ACID CHLOROGENIC.M

Last changed : 1/23/2018 4:38:27 PM ( modified after loading ) ====================================================================================== DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (ACID CHLOROGENIC1 2018-01-16 09-47-22\020-2301.D) mAU 120

80

60

40

20

0 0

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

100

5

10

15

20

25

Customized Report: Performance Report per Signal ======================================================================================= Multiplier : 1.0000 Dilution : 1.00000 Available Signals: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off ======================================================================================= Signal: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off RetTime[min] Area[mAU*s] Height Symm.

USPTail. Plates Resolution -----------|--------------|------------|--------|----------|--------|-----------17.450 1105.844 29.988 0.979 1.111 1618 ========================================================================================

Instrument 1

1/23/2018

4:54:23 PM

Page 1 of 1

min

Data File: C:\CHEM32\1\DATA\ACID CHLOROGENIC1 2018-01-16 09-47-22\021-2401.D Sample Name: A.01.0872017 THU 3 ======================================================================== Acq. Operator : MAICH21 Seq. Line : 24 Acq. Instrument : Instrument 1 Location : Vial 21 Inj : 1 Injection Date : 9:44:54 PM Inj. Volume (Method): 10 µl Acq. Method : C:\Chem32\1\DATA\ACID CHLOROGENIC1 2018-01-16 09-47-22\ACID CHLOROGENIC.M Analysis Method :

C:\CHEM32\1\METHODS\ACID CHLOROGENIC.M

Last changed : 1/23/2018 4:38:27 PM ( modified after loading ) ====================================================================================== DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (ACID CHLOROGENIC1 2018-01-16 09-47-22\021-2401.D) mAU 120

80

60

40

20

0 0

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

100

5

10

15

20

25

Customized Report: Performance Report per Signal ======================================================================================= Multiplier : 1.0000 Dilution : 1.00000 Available Signals: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off ======================================================================================= Signal: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off RetTime[min] Area[mAU*s] Height Symm.

USPTail. Plates Resolution -----------|--------------|------------|--------|----------|--------|-----------17.478 1060.085 28.847 0.983 1.102 1635 ========================================================================================

Instrument 1

1/23/2018

4:56:54 PM

Page 1 of 1

min

Data File: C:\CHEM32\1\DATA\ACID CHLOROGENIC1 2018-01-16 09-47-22\010-1301.D Sample Name: A.01.2872017 THU 1 ======================================================================== Acq. Operator : MAICH21 Seq. Line : 13 Acq. Instrument : Instrument 1 Location : Vial 10 Inj : 1 Injection Date : 4:01:29 PM Inj. Volume (Method): 10 µl Acq. Method : C:\Chem32\1\DATA\ACID CHLOROGENIC1 2018-01-16 09-47-22\ACID CHLOROGENIC.M Analysis Method :

C:\CHEM32\1\METHODS\ACID CHLOROGENIC.M

Last changed : 1/23/2018 4:38:27 PM ( modified after loading ) ====================================================================================== DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (ACID CHLOROGENIC1 2018-01-16 09-47-22\010-1301.D) mAU

80

60

40

20

0 0

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

100

5

10

15

20

25

Customized Report: Performance Report per Signal ======================================================================================= Multiplier : 1.0000 Dilution : 1.00000 Available Signals: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off ======================================================================================= Signal: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off RetTime[min] Area[mAU*s] Height Symm.

USPTail. Plates Resolution -----------|--------------|------------|--------|----------|--------|-----------17.362 905.496 24.592 0.964 1.109 1594 ========================================================================================

Instrument 1

1/23/2018

4:51:56 PM

Page 1 of 1

min

Data File: C:\CHEM32\1\DATA\ACID CHLOROGENIC1 2018-01-16 09-47-22\011-1401.D Sample Name: A.01.2872017 THU 2 ======================================================================== Acq. Operator : MAICH21 Seq. Line : 14 Acq. Instrument : Instrument 1 Location : Vial 11 Inj : 1 Injection Date : 4:32:35 PM Inj. Volume (Method): 10 µl Acq. Method : C:\Chem32\1\DATA\ACID CHLOROGENIC1 2018-01-16 09-47-22\ACID CHLOROGENIC.M Analysis Method :

C:\CHEM32\1\METHODS\ACID CHLOROGENIC.M

Last changed

1/23/2018 4:38:27 PM

:

( modified after loading )

====================================================================================== DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (ACID CHLOROGENIC1 2018-01-16 09-47-22\011-1401.D) mAU

80

60

40

20

0 0

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

100

5

10

15

20

25

Customized Report: Performance Report per Signal ======================================================================================= Multiplier : 1.0000 Dilution : 1.00000 Available Signals: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off ======================================================================================= Signal: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off RetTime[min] Area[mAU*s] Height Symm.

USPTail. Plates Resolution -----------|--------------|------------|--------|----------|--------|-----------17.339 900.294 24.334 0.984 1.101 1588 ========================================================================================

Instrument 1

1/23/2018

4:52:36 PM

Page 1 of 1

min

Data File: C:\CHEM32\1\DATA\ACID CHLOROGENIC1 2018-01-16 09-47-22\012-1501.D Sample Name: A.01.2872017 THU 3 ======================================================================== Acq. Operator : MAICH21 Seq. Line : 15 Acq. Instrument : Instrument 1 Location : Vial 12 Inj : 1 Injection Date : 5:03:59 PM Inj. Volume (Method): 10 µl Acq. Method : C:\Chem32\1\DATA\ACID CHLOROGENIC1 2018-01-16 09-47-22\ACID CHLOROGENIC.M Analysis Method :

C:\CHEM32\1\METHODS\ACID CHLOROGENIC.M

Last changed : 1/23/2018 4:38:27 PM ( modified after loading ) ====================================================================================== DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (ACID CHLOROGENIC1 2018-01-16 09-47-22\012-1501.D) mAU

80

60

40

20

0 0

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

100

5

10

15

20

25

Customized Report: Performance Report per Signal ======================================================================================= Multiplier : 1.0000 Dilution : 1.00000 Available Signals: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off ======================================================================================= Signal: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off RetTime[min] Area[mAU*s] Height Symm.

USPTail. Plates Resolution -----------|--------------|------------|--------|----------|--------|-----------17.458 899.853 24.346 0.967 1.109 1580 ========================================================================================

Instrument 1

1/23/2018

4:55:32 PM

Page 1 of 1

min

Data File: C:\CHEM32\1\DATA\ACID CHLOROGENIC1 2018-01-15 15-54-35\021-1101.D Sample Name: A.02.1592017 THU1 ======================================================================== Acq. Operator : MAICH21 Seq. Line : 11 Acq. Instrument : Instrument 1 Location : Vial 21 Inj : 1 Injection Date : 11:41:34 PM Inj. Volume (Method): 10 µl Acq. Method : C:\Chem32\1\DATA\ACID CHLOROGENIC1 2018-01-15 15-54-35\ACID CHLOROGENIC.M Analysis Method :

C:\CHEM32\1\METHODS\ACID CHLOROGENIC.M

Last changed : 1/23/2018 4:38:27 PM ( modified after loading ) ====================================================================================== DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (ACID CHLOROGENIC1 2018-01-15 15-54-35\021-1101.D) mAU 120

80

60

40

20

0 0

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

100

5

10

15

20

25

Customized Report: Performance Report per Signal ======================================================================================= Multiplier : 1.0000 Dilution : 1.00000 Available Signals: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off ======================================================================================= Signal: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off RetTime[min] Area[mAU*s] Height Symm.

USPTail.

Plates Resolution -----------|--------------|------------|--------|----------|--------|-----------17.484 1037.896 28.221 0.968 1.123 1559 ========================================================================================

Instrument 1

1/23/2018

4:43:03 PM

Page 1 of 1

min

Data File: C:\CHEM32\1\DATA\ACID CHLOROGENIC1 2018-01-15 15-54-35\022-1201.D Sample Name: A.02.1592017 THU2 ======================================================================== Acq. Operator : MAICH21 Seq. Line : 12 Acq. Instrument : Instrument 1 Location : Vial 22 Inj : 1 Injection Date : 12:12:38 PM Inj. Volume (Method): 10 µl Acq. Method : C:\Chem32\1\DATA\ACID CHLOROGENIC1 2018-01-15 15-54-35\ACID CHLOROGENIC.M Analysis Method :

C:\CHEM32\1\METHODS\ACID CHLOROGENIC.M

Last changed : 1/23/2018 4:38:27 PM ( modified after loading ) ====================================================================================== DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (ACID CHLOROGENIC1 2018-01-15 15-54-35\022-1201.D) mAU 120

80

60

40

20

0 0

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

100

5

10

15

20

25

Customized Report: Performance Report per Signal ======================================================================================= Multiplier : 1.0000 Dilution : 1.00000 Available Signals: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off ======================================================================================= Signal: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off RetTime[min] Area[mAU*s] Height Symm.

USPTail. Plates Resolution -----------|--------------|------------|--------|----------|--------|-----------17.527 1043.398 28.084 0.987 1.114 1551 ========================================================================================

Instrument 1

1/23/2018

4:42:42 PM

Page 1 of 1

min

Data File: C:\CHEM32\1\DATA\ACID CHLOROGENIC1 2018-01-16 09-47-22\023-0101.D Sample Name: A.02.1592017 THU3.1 ======================================================================== Acq. Operator : MAICH21 Seq. Line : 1 Acq. Instrument : Instrument 1 Location : Vial 23 Inj : 1 Injection Date : 9:48:25 AM Inj. Volume (Method): 10 µl Acq. Method : C:\Chem32\1\DATA\ACID CHLOROGENIC1 2018-01-16 09-47-22\ACID CHLOROGENIC.M Analysis Method :

C:\CHEM32\1\METHODS\ACID CHLOROGENIC.M

Last changed : 1/23/2018 4:38:27 PM ( modified after loading ) ====================================================================================== DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (ACID CHLOROGENIC1 2018-01-16 09-47-22\023-0101.D) mAU

120

80

60

40

20

0 0

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

100

5

10

15

20

25

Customized Report: Performance Report per Signal ======================================================================================= Multiplier : 1.0000 Dilution : 1.00000 Available Signals: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off ======================================================================================= Signal: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off RetTime[min] Area[mAU*s] Height Symm.

USPTail. Plates Resolution -----------|--------------|------------|--------|----------|--------|-----------17.454 1020.035 27.811 0.971 1.139 1575 ========================================================================================

Instrument 1

1/23/2018

4:49:33 PM

Page 1 of 1

min

Data File: C:\CHEM32\1\DATA\ACID CHLOROGENIC1 2018-01-16 09-47-22\013-1601.D Sample Name: A.02.1692017 THU 1 ======================================================================== Acq. Operator : MAICH21 Seq. Line : 16 Acq. Instrument : Instrument 1 Location : Vial 13 Inj : 1 Injection Date : 5:35:01 PM Inj. Volume (Method): 10 µl Acq. Method : C:\Chem32\1\DATA\ACID CHLOROGENIC1 2018-01-16 09-47-22\ACID CHLOROGENIC.M Analysis Method :

C:\CHEM32\1\METHODS\ACID CHLOROGENIC.M

Last changed : 1/23/2018 4:38:27 PM ( modified after loading ) ====================================================================================== DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (ACID CHLOROGENIC1 2018-01-16 09-47-22\013-1601.D) mAU

80

60

40

20

0 0

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

100

5

10

15

20

25

min

Customized Report: Performance Report per Signal ======================================================================================= Multiplier : 1.0000 Dilution : 1.00000 Available Signals: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off ======================================================================================= Signal: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off RetTime[min] Area[mAU*s] Height Symm.

USPTail. Plates Resolution -----------|--------------|------------|--------|----------|--------|-----------17.305 999.044 26.971 0.980 1.120 5047 ========================================================================================

Instrument 1

1/23/2018

4:52:58 PM

Page 1 of 1

Data File: C:\CHEM32\1\DATA\ACID CHLOROGENIC1 2018-01-16 09-47-22\014-1701.D Sample Name: A.02.1692017 THU 2 ======================================================================== Acq. Operator : MAICH21 Seq. Line : 17 Acq. Instrument : Instrument 1 Location : Vial 14 Inj : 1 Injection Date : 6:06:24 PM Inj. Volume (Method): 10 µl Acq. Method : C:\Chem32\1\DATA\ACID CHLOROGENIC1 2018-01-16 09-47-22\ACID CHLOROGENIC.M Analysis Method :

C:\CHEM32\1\METHODS\ACID CHLOROGENIC.M

Last changed : 1/23/2018 4:38:27 PM ( modified after loading ) ====================================================================================== DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (ACID CHLOROGENIC1 2018-01-16 09-47-22\014-1701.D) mAU

80

60

40

20

0 0

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

100

5

10

15

20

25

Customized Report: Performance Report per Signal ======================================================================================= Multiplier : 1.0000 Dilution : 1.00000 Available Signals: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off ======================================================================================= Signal: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off RetTime[min] Area[mAU*s] Height Symm.

USPTail. Plates Resolution -----------|--------------|------------|--------|----------|--------|-----------17.509 1006.270 27.360 0.991 1.127 5165 ========================================================================================

Instrument 1

1/23/2018

4:55:58 PM

Page 1 of 1

min

Data File: C:\CHEM32\1\DATA\ACID CHLOROGENIC1 2018-01-16 09-47-22\015-1801.D Sample Name: A.02.1692017 THU 3 ======================================================================== Acq. Operator : MAICH21 Seq. Line : 18 Acq. Instrument : Instrument 1 Location : Vial 15 Inj : 1 Injection Date : 6:37:53 PM Inj. Volume (Method): 10 µl Acq. Method : C:\Chem32\1\DATA\ACID CHLOROGENIC1 2018-01-16 09-47-22\ACID CHLOROGENIC.M Analysis Method :

C:\CHEM32\1\METHODS\ACID CHLOROGENIC.M

Last changed : 1/23/2018 4:38:27 PM ( modified after loading ) ====================================================================================== DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (ACID CHLOROGENIC1 2018-01-16 09-47-22\015-1801.D) mAU

80

60

40

20

0 0

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

100

5

10

15

20

25

Customized Report: Performance Report per Signal ======================================================================================= Multiplier : 1.0000 Dilution : 1.00000 Available Signals: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off ======================================================================================= Signal: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off RetTime[min] Area[mAU*s] Height Symm.

USPTail. Plates Resolution -----------|--------------|------------|--------|----------|--------|-----------17.465 1011.747 27.477 0.977 1.125 5142 ========================================================================================

Instrument 1

1/23/2018

4:56:16 PM

Page 1 of 1

min

Data File: C:\CHEM32\1\DATA\ACID CHLOROGENIC1 2018-01-16 09-47-22\007-1001.D Sample Name: A.03.1992017 THU 1 ======================================================================== Acq. Operator : MAICH21 Seq. Line : 10 Acq. Instrument : Instrument 1 Location : Vial 7 Inj : 1 Injection Date : 2:27:51 PM Inj. Volume (Method): 10 µl Acq. Method : C:\Chem32\1\DATA\ACID CHLOROGENIC1 2018-01-16 09-47-22\ACID CHLOROGENIC.M Analysis Method :

C:\CHEM32\1\METHODS\ACID CHLOROGENIC.M

Last changed : 1/23/2018 4:38:27 PM ( modified after loading ) ====================================================================================== DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (ACID CHLOROGENIC1 2018-01-16 09-47-22\007-1001.D) mAU

80

60

40

20

0 0

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

100

5

10

15

20

25

Customized Report: Performance Report per Signal ======================================================================================= Multiplier : 1.0000 Dilution : 1.00000 Available Signals: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off ======================================================================================= Signal: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off RetTime[min] Area[mAU*s] Height Symm.

USPTail. Plates Resolution -----------|--------------|------------|--------|----------|--------|-----------17.390 1082.331 28.910 0.973 1.112 4870 ========================================================================================

Instrument 1

1/23/2018

4:51:11 PM

Page 1 of 1

min

Data File: C:\CHEM32\1\DATA\ACID CHLOROGENIC1 2018-01-16 09-47-22\008-1101.D Sample Name: A.03.1992017THU 2 ======================================================================== Acq. Operator : MAICH21 Seq. Line : 11 Acq. Instrument : Instrument 1 Location : Vial 8 Inj : 1 Injection Date : 2:58:53 PM Inj. Volume (Method): 10 µl Acq. Method : C:\Chem32\1\DATA\ACID CHLOROGENIC1 2018-01-16 09-47-22\ACID CHLOROGENIC.M Analysis Method :

C:\CHEM32\1\METHODS\ACID CHLOROGENIC.M

Last changed : 1/23/2018 4:38:27 PM ( modified after loading ) ====================================================================================== DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (ACID CHLOROGENIC1 2018-01-16 09-47-22\008-1101.D) mAU 100

60

40

20

0 0

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

80

5

10

15

20

25

Customized Report: Performance Report per Signal ======================================================================================= Multiplier : 1.0000 Dilution : 1.00000 Available Signals: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off ======================================================================================= Signal: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off RetTime[min] Area[mAU*s] Height Symm.

USPTail. Plates Resolution -----------|--------------|------------|--------|----------|--------|-----------17.398 1100.573 29.283 0.960 1.119 4986 ========================================================================================

Instrument 1

1/23/2018

4:51:34 PM

Page 1 of 1

min

Data File: C:\CHEM32\1\DATA\ACID CHLOROGENIC1 2018-01-16 09-47-22\009-1201.D Sample Name: A.03.1992017 THU 3 ======================================================================== Acq. Operator : MAICH21 Seq. Line : 12 Acq. Instrument : Instrument 1 Location : Vial 9 Inj : 1 Injection Date : 3:29:53 PM Inj. Volume (Method): 10 µl Acq. Method : C:\Chem32\1\DATA\ACID CHLOROGENIC1 2018-01-16 09-47-22\ACID CHLOROGENIC.M Analysis Method :

C:\CHEM32\1\METHODS\ACID CHLOROGENIC.M

Last changed

1/23/2018 4:38:27 PM

:

( modified after loading )

====================================================================================== DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (ACID CHLOROGENIC1 2018-01-16 09-47-22\009-1201.D) mAU

80

60

40

20

0 0

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

100

5

10

15

20

25

Customized Report: Performance Report per Signal ======================================================================================= Multiplier : 1.0000 Dilution : 1.00000 Available Signals: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off ======================================================================================= Signal: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off RetTime[min] Area[mAU*s] Height Symm.

USPTail. Plates Resolution -----------|--------------|------------|--------|----------|--------|-----------17.357 1103.334 29.508 0.966 1.130 4959 ========================================================================================

Instrument 1

1/23/2018

4:55:11 PM

Page 1 of 1

min

Data File: C:\CHEM32\1\DATA\ACID CHLOROGENIC1 2018-01-15 15-54-35\019-0901.D Sample Name: B.01.2292017 THU 2 ======================================================================== Acq. Operator : MAICH21 Seq. Line : 9 Acq. Instrument : Instrument 1 Location : Vial 19 Inj : 1 Injection Date : 10:39:22 PM Inj. Volume (Method): 10 µl Acq. Method : C:\Chem32\1\DATA\ACID CHLOROGENIC1 2018-01-15 15-54-35\ACID CHLOROGENIC.M Analysis Method : C:\CHEM32\1\METHODS\ACID CHLOROGENIC.M Last changed

: 1/23/2018 4:38:27 PM

( modified after loading )

====================================================================================== DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (ACID CHLOROGENIC1 2018-01-15 15-54-35\019-0901.D) mAU

100

80

60

40

20

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

120

Acid chlorogenic

0 0

5

10

15

20

25

Customized Report: Performance Report per Signal ======================================================================================= Multiplier : 1.0000 Dilution : 1.00000 Available Signals: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off ======================================================================================= Signal: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off RetTime[min] Area[mAU*s] Height Symm.

USPTail.

Plates Resolution -----------|--------------|------------|--------|----------|--------|-----------17.506 924.786 25.021 0.972 1.195 1612 ======================================================================================

Instrument 1

1/23/2018

4:40:15 PM

Page 1 of 1

min

Data File: C:\CHEM32\1\DATA\ACID CHLOROGENIC1 2018-01-15 15-54-35\020-1001.D Sample Name: B.01.2292017 THU 3 ======================================================================== Acq. Operator : MAICH21 Seq. Line : 10 Acq. Instrument : Instrument 1 Location : Vial 20 Inj : 1 Injection Date : 11:10:29 PM Inj. Volume (Method): 10 µl Acq. Method : C:\Chem32\1\DATA\ACID CHLOROGENIC1 2018-01-15 15-54-35\ACID CHLOROGENIC.M Analysis Method : C:\CHEM32\1\METHODS\ACID CHLOROGENIC.M Last changed

: 1/23/2018 4:38:27 PM

( modified after loading )

====================================================================================== DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (ACID CHLOROGENIC1 2018-01-15 15-54-35\020-1001.D) mAU

100

80

60

40

20

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

120

Acid chlorogenic

0 0

5

10

15

20

25

Customized Report: Performance Report per Signal ======================================================================================= Multiplier : 1.0000 Dilution : 1.00000 Available Signals: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off ======================================================================================= Signal: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off RetTime[min] Area[mAU*s] Height Symm.

USPTail.

Plates Resolution -----------|--------------|------------|--------|----------|--------|-----------17.523 922.402 24.915 0.97 1.199 1625 ======================================================================================

Instrument 1

1/23/2018

4:41:18 PM

Page 1 of 1

min

Data File: C:\CHEM32\1\DATA\ACID CHLOROGENIC1 2018-01-15 15-54-35\030-2001.D Sample Name: B.02.0872017 THU 1 ======================================================================== Acq. Operator : MAICH21 Seq. Line : 20 Acq. Instrument : Instrument 1 Location : Vial 30 Inj : 1 Injection Date : 4:20:54 AM Inj. Volume (Method): 10 µl Acq. Method : C:\Chem32\1\DATA\ACID CHLOROGENIC1 2018-01-15 15-54-35\ACID CHLOROGENIC.M Analysis Method : C:\CHEM32\1\METHODS\ACID CHLOROGENIC.M Last changed

: 1/23/2018 4:38:27 PM

( modified after loading )

===================================================================================== DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (ACID CHLOROGENIC1 2018-01-15 15-54-35\030-2001.D) mAU

80

60

40

20

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

100

Acid chlorogenic

0 0

5

10

15

20

25

Customized Report: Performance Report per Signal ======================================================================================= Multiplier : 1.0000 Dilution : 1.00000 Available Signals: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off ======================================================================================= Signal: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off RetTime[min] Area[mAU*s] Height Symm.

USPTail.

Plates Resolution -----------|--------------|------------|--------|----------|--------|-----------17.458 912.323 24.846 0.969 1.199 1583 ======================================================================================

Instrument 1

1/23/2018

4:47:58 PM

Page 1 of 1

min

Data File: C:\CHEM32\1\DATA\ACID CHLOROGENIC1 2018-01-15 15-54-35\031-2101.D Sample Name: B.02.0872017 THU 2 ======================================================================== Acq. Operator : MAICH21 Seq. Line : 21 Acq. Instrument : Instrument 1 Location : Vial 31 Inj : 1 Injection Date : 4:51:56 AM Inj. Volume (Method): 10 µl Acq. Method : C:\Chem32\1\DATA\ACID CHLOROGENIC1 2018-01-15 15-54-35\ACID CHLOROGENIC.M Analysis Method : C:\CHEM32\1\METHODS\ACID CHLOROGENIC.M Last changed

: 1/23/2018 4:38:27 PM

( modified after loading )

===================================================================================== DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (ACID CHLOROGENIC1 2018-01-15 15-54-35\031-2101.D) mAU

80

60

40

20

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

100

Acid chlorogenic

0 0

5

10

15

20

25

Customized Report: Performance Report per Signal ======================================================================================= Multiplier : 1.0000 Dilution : 1.00000 Available Signals: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off ======================================================================================= Signal: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off RetTime[min] Area[mAU*s] Height Symm.

USPTail.

Plates Resolution -----------|--------------|------------|--------|----------|--------|-----------17.368 899.389 24.146 0.979 1.191 1578 ======================================================================================

Instrument 1

1/23/2018

4:48:23 PM

Page 1 of 1

min

Data File: C:\CHEM32\1\DATA\ACID CHLOROGENIC1 2018-01-15 15-54-35\032-2201.D Sample Name: B.02.0872017 THU 3 ======================================================================== Acq. Operator : MAICH21 Seq. Line : 22 Acq. Instrument : Instrument 1 Location : Vial 32 Inj : 1 Injection Date : 5:22:56 PM Inj. Volume (Method): 10 µl Acq. Method : C:\Chem32\1\DATA\ACID CHLOROGENIC1 2018-01-15 15-54-35\ACID CHLOROGENIC.M Analysis Method : C:\CHEM32\1\METHODS\ACID CHLOROGENIC.M Last changed

: 1/23/2018 4:38:27 PM

( modified after loading )

====================================================================================== DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (ACID CHLOROGENIC1 2018-01-15 15-54-35\032-2201.D) mAU

100

80

60

40

20

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

120

Acid chlorogenic

0 0

5

10

15

20

25

Customized Report: Performance Report per Signal ======================================================================================= Multiplier : 1.0000 Dilution : 1.00000 Available Signals: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off ======================================================================================= Signal: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off RetTime[min] Area[mAU*s] Height Symm.

USPTail.

Plates Resolution -----------|--------------|------------|--------|----------|--------|-----------17.486 893.704 24.647 0.97 1.190 1579 ======================================================================================

Instrument 1

1/23/2018

4:48:50 PM

Page 1 of 1

min

Data File: C:\CHEM32\1\DATA\ACID CHLOROGENIC1 2018-01-16 09-47-22\016-1901.D Sample Name: B.03.0982017 THU 1 ======================================================================== Acq. Operator : MAICH21 Seq. Line : 19 Acq. Instrument : Instrument 1 Location : Vial 16 Inj : 1 Injection Date : 7:09:31 PM Inj. Volume (Method): 10 µl Acq. Method : C:\Chem32\1\DATA\ACID CHLOROGENIC1 2018-01-16 09-47-22\ACID CHLOROGENIC.M Analysis Method : C:\CHEM32\1\METHODS\ACID CHLOROGENIC.M Last changed

: 1/23/2018 4:38:27 PM

( modified after loading )

===================================================================================== DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (ACID CHLOROGENIC1 2018-01-16 09-47-22\016-1901.D) mAU

80

60

40

20

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

100

Acid chlorogenic

0 0

5

10

15

20

25

Customized Report: Performance Report per Signal ======================================================================================= Multiplier : 1.0000 Dilution : 1.00000 Available Signals: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off ======================================================================================= Signal: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off RetTime[min] Area[mAU*s] Height Symm.

USPTail.

Plates Resolution -----------|--------------|------------|--------|----------|--------|-----------17.462 897.969 24.547 0.97 1.199 1584 ======================================================================================

Instrument 1

1/23/2018

4:53:20 PM

Page 1 of 1

min

Data File: C:\CHEM32\1\DATA\ACID CHLOROGENIC1 2018-01-16 09-47-22\017-2001.D Sample Name: B.03.0982017 THU 2 ======================================================================== Acq. Operator : MAICH21 Seq. Line : 20 Acq. Instrument : Instrument 1 Location : Vial 17 Inj : 1 Injection Date : 7:40:34 PM Inj. Volume (Method): 10 µl Acq. Method : C:\Chem32\1\DATA\ACID CHLOROGENIC1 2018-01-16 09-47-22\ACID CHLOROGENIC.M Analysis Method : C:\CHEM32\1\METHODS\ACID CHLOROGENIC.M Last changed

: 1/23/2018 4:38:27 PM

( modified after loading )

===================================================================================== DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (ACID CHLOROGENIC1 2018-01-16 09-47-22\017-2001.D) mAU

80

60

40

20

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

100

Acid chlorogenic

0 0

5

10

15

20

25

Customized Report: Performance Report per Signal ======================================================================================= Multiplier : 1.0000 Dilution : 1.00000 Available Signals: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off ======================================================================================= Signal: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off RetTime[min] Area[mAU*s] Height Symm.

USPTail.

Plates Resolution -----------|--------------|------------|--------|----------|--------|-----------17.366 889.485 24.184 0.973 1.188 1617 ======================================================================================

Instrument 1

1/23/2018

4:53:44 PM

Page 1 of 1

min

Data File: C:\CHEM32\1\DATA\ACID CHLOROGENIC1 2018-01-16 09-47-22\018-2101.D Sample Name: B.03.0982017 THU 3 ======================================================================== Acq. Operator : MAICH21 Seq. Line : 21 Acq. Instrument : Instrument 1 Location : Vial 18 Inj : 1 Injection Date : 8:11:36 PM Inj. Volume (Method): 10 µl Acq. Method : C:\Chem32\1\DATA\ACID CHLOROGENIC1 2018-01-16 09-47-22\ACID CHLOROGENIC.M Analysis Method : C:\CHEM32\1\METHODS\ACID CHLOROGENIC.M Last changed

: 1/23/2018 4:38:27 PM

( modified after loading )

====================================================================================== DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (ACID CHLOROGENIC1 2018-01-16 09-47-22\018-2101.D) mAU

100

80

60

40

20

0 0

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

120

5

10

15

20

25

Customized Report: Performance Report per Signal ======================================================================================= Multiplier : 1.0000 Dilution : 1.00000 Available Signals: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off ======================================================================================= Signal: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off RetTime[min] Area[mAU*s] Height Symm.

USPTail.

Plates Resolution -----------|--------------|------------|--------|----------|--------|-----------17.522 866.721 24.884 0.97 1.129 1640 ======================================================================================

Instrument 1

1/23/2018

4:47:58 PM

Page 1 of 1

min

Data File C:\CHEM32\1\DATA\CAO BIM BIM 2018-02-02 13-16-52\055-4001.D Sample Name: CA05 THU 3 ===================================================================== Acq. Operator : MAICH21 Seq. Line : 40 Acq. Instrument : Instrument 1 Location : Vial 55 Injection Date : 2/3/2018 9:28:35 AM Inj : 1 Inj Volume : 10.000 µl Acq. Method : C:\CHEM32\1\DATA\CAO BIM BIM 2018-02-02 13-16-52\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/2/2018 1:16:52 PM by MAICH21 Analysis Method : C:\CHEM32\1\METHODS\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/3/2018 2:37:04 PM by GIAP-TUYEN (modified after loading) Additional Info : Peak(s) manually integrated DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (CAO BIM BIM 2018-02-02 13-16-52\055-4001.D)

80

60

40

20

0 0

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

mAU 100

5

10

15

20

===================================================================== Area Percent Report with Performance ===================================================================== Multiplier: : 1.0000 Dilution: : 1.0000 Use Multiplier & Dilution Factor with ISTDs

Signal 1: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off

RetTime k' Area Height Symm. Width Plates Resol Select [min] [mAU*s] [mAU] [min] ution ivity -------|------|----------|----------|-----|-------|-------|-----|-----15.983 1018.42755 28.87260 0.98 0.5400 4851 -

===================================================================== *** End of Report ***

Instrument 1 2/3/2018 2:46:48 PM GIAP-TUYEN Page 1 of 1

25

min

Data File C:\CHEM32\1\DATA\ACTISOMAI 2018-02-03 14-29-54\033-3101.D Sample Name: CA01 THU 1 ===================================================================== Acq. Operator : MAICH21 Seq. Line : 31 Acq. Instrument : Instrument 1 Location : Vial 33 Injection Date : 2/4/2018 6:02:03 AM Inj : 1 Inj Volume : 10.000 µl Acq. Method : C:\CHEM32\1\DATA\ACTISOMAI 2018-02-03 14-29-54\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/2/2018 1:16:52 PM by MAICH21 Analysis Method : C:\CHEM32\1\METHODS\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/4/2018 11:04:08 AM by GIAP-TUYEN (modified after loading) Additional Info : Peak(s) manually integrated DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (ACTISOMAI 2018-02-03 14-29-54\033-3101.D) mAU 120

80

60

40

20

0 0

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

100

5

10

15

20

===================================================================== Area Percent Report with Performance ===================================================================== Multiplier: : 1.0000 Dilution: : 1.0000 Use Multiplier & Dilution Factor with ISTDs

Signal 1: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off

RetTime k' Area Height Symm. Width Plates Resol Select [min] [mAU*s] [mAU] [min] ution ivity -------|------|----------|----------|-----|-------|-------|-----|-----15.965 1256.65906 36.16125 0.97 0.5333 4965 -

===================================================================== *** End of Report ***

Instrument 1 2/4/2018 3:52:01 PM GIAP-TUYEN Page 1 of 1

25

min

Data File C:\CHEM32\1\DATA\ACTISOMAI 2018-02-03 14-29-54\034-3201.D Sample Name: CA01 THU 2 ===================================================================== Acq. Operator : MAICH21 Seq. Line : 32 Acq. Instrument : Instrument 1 Location : Vial 34 Injection Date : 2/4/2018 6:33:09 AM Inj : 1 Inj Volume : 10.000 µl Acq. Method : C:\CHEM32\1\DATA\ACTISOMAI 2018-02-03 14-29-54\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/2/2018 1:16:52 PM by MAICH21 Analysis Method : C:\CHEM32\1\METHODS\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/4/2018 11:04:08 AM by GIAP-TUYEN (modified after loading) Additional Info : Peak(s) manually integrated DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (ACTISOMAI 2018-02-03 14-29-54\034-3201.D) mAU 120

80

60

40

20

0 0

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

100

5

10

15

20

===================================================================== Area Percent Report with Performance ===================================================================== Multiplier: : 1.0000 Dilution: : 1.0000 Use Multiplier & Dilution Factor with ISTDs

Signal 1: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off

RetTime k' Area Height Symm. Width Plates Resol Select [min] [mAU*s] [mAU] [min] ution ivity -------|------|----------|----------|-----|-------|-------|-----|-----15.971 1225.53821 35.23966 0.97 0.5400 4847 -

===================================================================== *** End of Report ***

Instrument 1 2/4/2018 3:52:26 PM GIAP-TUYEN Page 1 of 1

25

min

Data File C:\CHEM32\1\DATA\ACTISOMAI 2018-02-03 14-29-54\035-3301.D Sample Name: CA01.3 ===================================================================== Acq. Operator : MAICH21 Seq. Line : 33 Acq. Instrument : Instrument 1 Location : Vial 35 Injection Date : 2/4/2018 7:04:11 AM Inj : 1 Inj Volume : 10.000 µl Acq. Method : C:\CHEM32\1\DATA\ACTISOMAI 2018-02-03 14-29-54\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/2/2018 1:16:52 PM by MAICH21 Analysis Method : C:\CHEM32\1\METHODS\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/4/2018 11:04:08 AM by GIAP-TUYEN (modified after loading) Additional Info : Peak(s) manually integrated DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (ACTISOMAI 2018-02-03 14-29-54\035-3301.D) mAU 120

80

60

40

20

0 0

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

100

5

10

15

20

===================================================================== Area Percent Report with Performance ===================================================================== Multiplier: : 1.0000 Dilution: : 1.0000 Use Multiplier & Dilution Factor with ISTDs

Signal 1: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off

RetTime k' Area Height Symm. Width Plates Resol Select [min] [mAU*s] [mAU] [min] ution ivity -------|------|----------|----------|-----|-------|-------|-----|-----15.973 1226.20422 34.61955 0.97 0.5467 4730 -

===================================================================== *** End of Report ***

Instrument 1 2/4/2018 3:52:46 PM GIAP-TUYEN Page 1 of 1

25

min

Data File C:\CHEM32\1\DATA\ACTISOMAI 2018-02-03 14-29-54\027-2501.D Sample Name: CA02 THU 1 ===================================================================== Acq. Operator : MAICH21 Seq. Line : 25 Acq. Instrument : Instrument 1 Location : Vial 27 Injection Date : 2/4/2018 2:55:57 AM Inj : 1 Inj Volume : 10.000 µl Acq. Method : C:\CHEM32\1\DATA\ACTISOMAI 2018-02-03 14-29-54\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/2/2018 1:16:52 PM by MAICH21 Analysis Method : C:\CHEM32\1\METHODS\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/4/2018 11:04:08 AM by GIAP-TUYEN (modified after loading) Additional Info : Peak(s) manually integrated DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (ACTISOMAI 2018-02-03 14-29-54\027-2501.D) mAU

80

60

40

20

0 0

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

100

5

10

15

20

===================================================================== Area Percent Report with Performance ===================================================================== Multiplier: : 1.0000 Dilution: : 1.0000 Use Multiplier & Dilution Factor with ISTDs

Signal 1: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off

RetTime k' Area Height Symm. Width Plates Resol Select [min] [mAU*s] [mAU] [min] ution ivity -------|------|----------|----------|-----|-------|-------|-----|-----15.938 1194.58423 34.15104 0.97 0.5467 4710 -

===================================================================== *** End of Report ***

Instrument 1 2/4/2018 3:49:55 PM GIAP-TUYEN Page 1 of 1

25

min

Data File C:\CHEM32\1\DATA\ACTISOMAI 2018-02-03 14-29-54\029-2701.D Sample Name: CA02 THU 3 ===================================================================== Acq. Operator : MAICH21 Seq. Line : 27 Acq. Instrument : Instrument 1 Location : Vial 29 Injection Date : 2/4/2018 3:57:57 AM Inj : 1 Inj Volume : 10.000 µl Acq. Method : C:\CHEM32\1\DATA\ACTISOMAI 2018-02-03 14-29-54\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/2/2018 1:16:52 PM by MAICH21 Analysis Method : C:\CHEM32\1\METHODS\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/4/2018 11:04:08 AM by GIAP-TUYEN (modified after loading) Additional Info : Peak(s) manually integrated DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (ACTISOMAI 2018-02-03 14-29-54\029-2701.D) mAU

80

60

40

20

0 0

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

100

5

10

15

20

===================================================================== Area Percent Report with Performance ===================================================================== Multiplier: : 1.0000 Dilution: : 1.0000 Use Multiplier & Dilution Factor with ISTDs

Signal 1: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off

RetTime k' Area Height Symm. Width Plates Resol Select [min] [mAU*s] [mAU] [min] ution ivity -------|------|----------|----------|-----|-------|-------|-----|-----15.940 1168.69678 33.41077 0.96 0.5400 4827 -

===================================================================== *** End of Report ***

Instrument 1 2/4/2018 3:50:41 PM GIAP-TUYEN Page 1 of 1

25

min

Data File C:\CHEM32\1\DATA\ACTISOMAI 2018-02-03 14-29-54\028-2601.D Sample Name: CA02 THU 2 ===================================================================== Acq. Operator : MAICH21 Seq. Line : 26 Acq. Instrument : Instrument 1 Location : Vial 28 Injection Date : 2/4/2018 3:26:57 AM Inj : 1 Inj Volume : 10.000 µl Acq. Method : C:\CHEM32\1\DATA\ACTISOMAI 2018-02-03 14-29-54\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/2/2018 1:16:52 PM by MAICH21 Analysis Method : C:\CHEM32\1\METHODS\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/4/2018 11:04:08 AM by GIAP-TUYEN (modified after loading) Additional Info : Peak(s) manually integrated DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (ACTISOMAI 2018-02-03 14-29-54\028-2601.D) mAU 120

80

60

40

20

0 0

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

100

5

10

15

20

===================================================================== Area Percent Report with Performance ===================================================================== Multiplier: : 1.0000 Dilution: : 1.0000 Use Multiplier & Dilution Factor with ISTDs

Signal 1: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off

RetTime k' Area Height Symm. Width Plates Resol Select [min] [mAU*s] [mAU] [min] ution ivity -------|------|----------|----------|-----|-------|-------|-----|-----15.960 1212.64075 34.72790 0.97 0.5400 4839 -

===================================================================== *** End of Report ***

Instrument 1 2/4/2018 3:50:18 PM GIAP-TUYEN Page 1 of 1

25

min

Data File C:\CHEM32\1\DATA\CAO BIM BIM 2018-02-02 13-16-52\050-3501.D Sample Name: CA03 THU 1 ===================================================================== Acq. Operator : MAICH21 Seq. Line : 35 Acq. Instrument : Instrument 1 Location : Vial 50 Injection Date : 2/3/2018 6:53:23 AM Inj : 1 Inj Volume : 10.000 µl Acq. Method : C:\CHEM32\1\DATA\CAO BIM BIM 2018-02-02 13-16-52\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/2/2018 1:16:52 PM by MAICH21 Analysis Method : C:\CHEM32\1\METHODS\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/3/2018 2:37:04 PM by GIAP-TUYEN (modified after loading) Additional Info : Peak(s) manually integrated DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (CAO BIM BIM 2018-02-02 13-16-52\050-3501.D) mAU

80

60

40

20

0 0

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

100

5

10

15

20

===================================================================== Area Percent Report with Performance ===================================================================== Multiplier: : 1.0000 Dilution: : 1.0000 Use Multiplier & Dilution Factor with ISTDs

Signal 1: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off

RetTime k' Area Height Symm. Width Plates Resol Select [min] [mAU*s] [mAU] [min] ution ivity -------|------|----------|----------|-----|-------|-------|-----|-----15.962 1116.34277 31.84720 0.97 0.5400 4839 -

===================================================================== *** End of Report ***

Instrument 1 2/3/2018 2:45:00 PM GIAP-TUYEN Page 1 of 1

25

min

Data File C:\CHEM32\1\DATA\CAO BIM BIM 2018-02-02 13-16-52\051-3601.D Sample Name: CA03 THU 2 ===================================================================== Acq. Operator : MAICH21 Seq. Line : 36 Acq. Instrument : Instrument 1 Location : Vial 51 Injection Date : 2/3/2018 7:24:24 AM Inj : 1 Inj Volume : 10.000 µl Acq. Method : C:\CHEM32\1\DATA\CAO BIM BIM 2018-02-02 13-16-52\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/2/2018 1:16:52 PM by MAICH21 Analysis Method : C:\CHEM32\1\METHODS\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/3/2018 2:37:04 PM by GIAP-TUYEN (modified after loading) Additional Info : Peak(s) manually integrated DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (CAO BIM BIM 2018-02-02 13-16-52\051-3601.D) mAU

80

60

40

20

0 0

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

100

5

10

15

20

===================================================================== Area Percent Report with Performance ===================================================================== Multiplier: : 1.0000 Dilution: : 1.0000 Use Multiplier & Dilution Factor with ISTDs

Signal 1: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off

RetTime k' Area Height Symm. Width Plates Resol Select [min] [mAU*s] [mAU] [min] ution ivity -------|------|----------|----------|-----|-------|-------|-----|-----15.978 1106.44507 31.43872 0.97 0.5467 4734 -

===================================================================== *** End of Report ***

Instrument 1 2/3/2018 2:45:34 PM GIAP-TUYEN Page 1 of 1

25

min

Data File C:\CHEM32\1\DATA\CAO BIM BIM 2018-02-02 13-16-52\052-3701.D Sample Name: CA03 THU 3 ===================================================================== Acq. Operator : MAICH21 Seq. Line : 37 Acq. Instrument : Instrument 1 Location : Vial 52 Injection Date : 2/3/2018 7:55:25 AM Inj : 1 Inj Volume : 10.000 µl Acq. Method : C:\CHEM32\1\DATA\CAO BIM BIM 2018-02-02 13-16-52\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/2/2018 1:16:52 PM by MAICH21 Analysis Method : C:\CHEM32\1\METHODS\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/3/2018 2:37:04 PM by GIAP-TUYEN (modified after loading) Additional Info : Peak(s) manually integrated DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (CAO BIM BIM 2018-02-02 13-16-52\052-3701.D) mAU

80

60

40

20

0 0

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

100

5

10

15

20

===================================================================== Area Percent Report with Performance ===================================================================== Multiplier: : 1.0000 Dilution: : 1.0000 Use Multiplier & Dilution Factor with ISTDs

Signal 1: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off

RetTime k' Area Height Symm. Width Plates Resol Select [min] [mAU*s] [mAU] [min] ution ivity -------|------|----------|----------|-----|-------|-------|-----|-----15.948 1098.17944 31.33772 0.97 0.5400 4831 -

===================================================================== *** End of Report ***

Instrument 1 2/3/2018 2:45:51 PM GIAP-TUYEN Page 1 of 1

25

min

Data File C:\CHEM32\1\DATA\CAO BIM BIM 2018-02-02 13-16-52\036-2101.D Sample Name: CA04.2 ===================================================================== Acq. Operator : MAICH21 Seq. Line : 21 Acq. Instrument : Instrument 1 Location : Vial 36 Injection Date : 2/2/2018 11:38:39 PM Inj : 1 Inj Volume : 10.000 µl Acq. Method : C:\CHEM32\1\DATA\CAO BIM BIM 2018-02-02 13-16-52\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/2/2018 1:16:52 PM by MAICH21 Analysis Method : C:\CHEM32\1\METHODS\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/3/2018 2:37:04 PM by GIAP-TUYEN (modified after loading) Additional Info : Peak(s) manually integrated DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (CAO BIM BIM 2018-02-02 13-16-52\036-2101.D) mAU 80

60 50 40 30 20 10 0 0

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

70

5

10

15

20

===================================================================== Area Percent Report with Performance ===================================================================== Multiplier: : 1.0000 Dilution: : 1.0000 Use Multiplier & Dilution Factor with ISTDs

Signal 1: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off

RetTime k' Area Height Symm. Width Plates Resol Select [min] [mAU*s] [mAU] [min] ution ivity -------|------|----------|----------|-----|-------|-------|-----|-----15.902 1036.49231 29.56905 0.98 0.5400 4803 -

===================================================================== *** End of Report ***

Instrument 1 2/3/2018 2:40:15 PM GIAP-TUYEN Page 1 of 1

25

min

Data File C:\CHEM32\1\DATA\CAO BIM BIM 2018-02-02 13-16-52\037-2201.D Sample Name: CA04.3 ===================================================================== Acq. Operator : MAICH21 Seq. Line : 22 Acq. Instrument : Instrument 1 Location : Vial 37 Injection Date : 2/3/2018 12:09:42 AM Inj : 1 Inj Volume : 10.000 µl Acq. Method : C:\CHEM32\1\DATA\CAO BIM BIM 2018-02-02 13-16-52\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/2/2018 1:16:52 PM by MAICH21 Analysis Method : C:\CHEM32\1\METHODS\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/3/2018 2:37:04 PM by GIAP-TUYEN (modified after loading) Additional Info : Peak(s) manually integrated DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (CAO BIM BIM 2018-02-02 13-16-52\037-2201.D) mAU

60

50

40 30 20 10 0 0

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

70

5

10

15

20

===================================================================== Area Percent Report with Performance ===================================================================== Multiplier: : 1.0000 Dilution: : 1.0000 Use Multiplier & Dilution Factor with ISTDs

Signal 1: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off

RetTime k' Area Height Symm. Width Plates Resol Select [min] [mAU*s] [mAU] [min] ution ivity -------|------|----------|----------|-----|-------|-------|-----|-----15.905 1050.08398 30.21875 0.98 0.5333 4928 -

===================================================================== *** End of Report ***

Instrument 1 2/3/2018 2:40:36 PM GIAP-TUYEN Page 1 of 1

25

min

Data File C:\CHEM32\1\DATA\CAO BIM BIM 2018-02-02 13-16-52\035-2001.D Sample Name: CA04.1 ===================================================================== Acq. Operator : MAICH21 Seq. Line : 20 Acq. Instrument : Instrument 1 Location : Vial 35 Injection Date : 2/2/2018 11:07:39 PM Inj : 1 Inj Volume : 10.000 µl Acq. Method : C:\CHEM32\1\DATA\CAO BIM BIM 2018-02-02 13-16-52\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/2/2018 1:16:52 PM by MAICH21 Analysis Method : C:\CHEM32\1\METHODS\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/3/2018 2:37:04 PM by GIAP-TUYEN (modified after loading) Additional Info : Peak(s) manually integrated DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (CAO BIM BIM 2018-02-02 13-16-52\035-2001.D) mAU 80

60 50 40 30 20 10 0 0

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

70

5

10

15

20

===================================================================== Area Percent Report with Performance ===================================================================== Multiplier: : 1.0000 Dilution: : 1.0000 Use Multiplier & Dilution Factor with ISTDs

Signal 1: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off

RetTime k' Area Height Symm. Width Plates Resol Select [min] [mAU*s] [mAU] [min] ution ivity -------|------|----------|----------|-----|-------|-------|-----|-----15.862 1067.32935 30.58005 0.97 0.5400 4779 -

===================================================================== *** End of Report ***

Instrument 1 2/3/2018 2:38:36 PM GIAP-TUYEN Page 1 of 1

25

min

Data File C:\CHEM32\1\DATA\CAO BIM BIM 2018-02-02 13-16-52\054-3901.D Sample Name: CA05 THU 2 ===================================================================== Acq. Operator : MAICH21 Seq. Line : 39 Acq. Instrument : Instrument 1 Location : Vial 54 Injection Date : 2/3/2018 8:57:32 AM Inj : 1 Inj Volume : 10.000 µl Acq. Method : C:\CHEM32\1\DATA\CAO BIM BIM 2018-02-02 13-16-52\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/2/2018 1:16:52 PM by MAICH21 Analysis Method : C:\CHEM32\1\METHODS\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/3/2018 2:37:04 PM by GIAP-TUYEN (modified after loading) Additional Info : Peak(s) manually integrated DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (CAO BIM BIM 2018-02-02 13-16-52\054-3901.D) mAU 100

60

40

20

0 0

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

80

5

10

15

20

===================================================================== Area Percent Report with Performance ===================================================================== Multiplier: : 1.0000 Dilution: : 1.0000 Use Multiplier & Dilution Factor with ISTDs

Signal 1: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off

RetTime k' Area Height Symm. Width Plates Resol Select [min] [mAU*s] [mAU] [min] ution ivity -------|------|----------|----------|-----|-------|-------|-----|-----15.946 1019.98389 29.22053 0.96 0.5400 4831 -

===================================================================== *** End of Report ***

Instrument 1 2/3/2018 2:46:27 PM GIAP-TUYEN Page 1 of 1

25

min

Data File C:\CHEM32\1\DATA\CAO BIM BIM 2018-02-02 13-16-52\053-3801.D Sample Name: CA05 THU 1 ===================================================================== Acq. Operator : MAICH21 Seq. Line : 38 Acq. Instrument : Instrument 1 Location : Vial 53 Injection Date : 2/3/2018 8:26:27 AM Inj : 1 Inj Volume : 10.000 µl Acq. Method : C:\CHEM32\1\DATA\CAO BIM BIM 2018-02-02 13-16-52\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/2/2018 1:16:52 PM by MAICH21 Analysis Method : C:\CHEM32\1\METHODS\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/3/2018 2:37:04 PM by GIAP-TUYEN (modified after loading) Additional Info : Peak(s) manually integrated DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (CAO BIM BIM 2018-02-02 13-16-52\053-3801.D) mAU 100

60

40

20

0 0

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

80

5

10

15

20

===================================================================== Area Percent Report with Performance ===================================================================== Multiplier: : 1.0000 Dilution: : 1.0000 Use Multiplier & Dilution Factor with ISTDs

Signal 1: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off

RetTime k' Area Height Symm. Width Plates Resol Select [min] [mAU*s] [mAU] [min] ution ivity -------|------|----------|----------|-----|-------|-------|-----|-----15.951 1042.65088 29.72229 0.97 0.5467 4718 -

===================================================================== *** End of Report ***

Instrument 1 2/3/2018 2:46:05 PM GIAP-TUYEN Page 1 of 1

25

min

Data File C:\CHEM32\1\DATA\CAO BIM BIM 2018-02-02 13-16-52\056-4101.D Sample Name: CA06 THU 1 ===================================================================== Acq. Operator : MAICH21 Seq. Line : 41 Acq. Instrument : Instrument 1 Location : Vial 56 Injection Date : 2/3/2018 9:59:35 AM Inj : 1 Inj Volume : 10.000 µl Acq. Method : C:\CHEM32\1\DATA\CAO BIM BIM 2018-02-02 13-16-52\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/2/2018 1:16:52 PM by MAICH21 Analysis Method : C:\CHEM32\1\METHODS\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/3/2018 2:37:04 PM by GIAP-TUYEN (modified after loading) Additional Info : Peak(s) manually integrated DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (CAO BIM BIM 2018-02-02 13-16-52\056-4101.D) mAU

80

60

40

20

0 0

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

100

5

10

15

20

===================================================================== Area Percent Report with Performance ===================================================================== Multiplier: : 1.0000 Dilution: : 1.0000 Use Multiplier & Dilution Factor with ISTDs

Signal 1: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off

RetTime k' Area Height Symm. Width Plates Resol Select [min] [mAU*s] [mAU] [min] ution ivity -------|------|----------|----------|-----|-------|-------|-----|-----15.996 926.10645 26.43788 0.98 0.5400 4860 -

===================================================================== *** End of Report ***

Instrument 1 2/3/2018 2:47:17 PM GIAP-TUYEN Page 1 of 1

25

min

Data File C:\CHEM32\1\DATA\CAO BIM BIM 2018-02-02 13-16-52\057-4201.D Sample Name: CA06 THU 2 ===================================================================== Acq. Operator : MAICH21 Seq. Line : 42 Acq. Instrument : Instrument 1 Location : Vial 57 Injection Date : 2/3/2018 10:30:39 AM Inj : 1 Inj Volume : 10.000 µl Acq. Method : C:\CHEM32\1\DATA\CAO BIM BIM 2018-02-02 13-16-52\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/2/2018 1:16:52 PM by MAICH21 Analysis Method : C:\CHEM32\1\METHODS\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/3/2018 2:37:04 PM by GIAP-TUYEN (modified after loading) Additional Info : Peak(s) manually integrated DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (CAO BIM BIM 2018-02-02 13-16-52\057-4201.D) mAU

80

60

40

20

0 0

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

100

5

10

15

20

===================================================================== Area Percent Report with Performance ===================================================================== Multiplier: : 1.0000 Dilution: : 1.0000 Use Multiplier & Dilution Factor with ISTDs

Signal 1: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off

RetTime k' Area Height Symm. Width Plates Resol Select [min] [mAU*s] [mAU] [min] ution ivity -------|------|----------|----------|-----|-------|-------|-----|-----15.987 936.39215 26.81475 0.97 0.5400 4856 -

===================================================================== *** End of Report ***

Instrument 1 2/3/2018 2:47:42 PM GIAP-TUYEN Page 1 of 1

25

min

Data File C:\CHEM32\1\DATA\ACTISOMAI 2018-02-03 14-29-54\026-2401.D Sample Name: CA06 THU 3 ===================================================================== Acq. Operator : MAICH21 Seq. Line : 24 Acq. Instrument : Instrument 1 Location : Vial 26 Injection Date : 2/4/2018 2:24:57 AM Inj : 1 Inj Volume : 10.000 µl Acq. Method : C:\CHEM32\1\DATA\ACTISOMAI 2018-02-03 14-29-54\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/2/2018 1:16:52 PM by MAICH21 Analysis Method : C:\CHEM32\1\METHODS\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/4/2018 11:04:08 AM by GIAP-TUYEN (modified after loading) Additional Info : Peak(s) manually integrated DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (ACTISOMAI 2018-02-03 14-29-54\026-2401.D) mAU 100

60

40

20

0 0

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

80

5

10

15

20

===================================================================== Area Percent Report with Performance ===================================================================== Multiplier: : 1.0000 Dilution: : 1.0000 Use Multiplier & Dilution Factor with ISTDs

Signal 1: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off

RetTime k' Area Height Symm. Width Plates Resol Select [min] [mAU*s] [mAU] [min] ution ivity -------|------|----------|----------|-----|-------|-------|-----|-----15.943 907.27588 26.00790 0.96 0.5333 4949 -

===================================================================== *** End of Report ***

Instrument 1 2/4/2018 3:49:28 PM GIAP-TUYEN Page 1 of 1

25

min

Data File C:\CHEM32\1\DATA\ACTISOMAI 2018-02-03 14-29-54\030-2801.D Sample Name: CA07 THU 1 ===================================================================== Acq. Operator : MAICH21 Seq. Line : 28 Acq. Instrument : Instrument 1 Location : Vial 30 Injection Date : 2/4/2018 4:28:59 AM Inj : 1 Inj Volume : 10.000 µl Acq. Method : C:\CHEM32\1\DATA\ACTISOMAI 2018-02-03 14-29-54\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/2/2018 1:16:52 PM by MAICH21 Analysis Method : C:\CHEM32\1\METHODS\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/4/2018 11:04:08 AM by GIAP-TUYEN (modified after loading) Additional Info : Peak(s) manually integrated DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (ACTISOMAI 2018-02-03 14-29-54\030-2801.D) mAU

50

40

30

20

10

0 0

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

60

5

10

15

20

===================================================================== Area Percent Report with Performance ===================================================================== Multiplier: : 1.0000 Dilution: : 1.0000 Use Multiplier & Dilution Factor with ISTDs

Signal 1: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off

RetTime k' Area Height Symm. Width Plates Resol Select [min] [mAU*s] [mAU] [min] ution ivity -------|------|----------|----------|-----|-------|-------|-----|-----15.961 793.60638 22.68109 0.98 0.5400 4839 -

===================================================================== *** End of Report ***

Instrument 1 2/4/2018 3:51:03 PM GIAP-TUYEN Page 1 of 1

25

min

Data File C:\CHEM32\1\DATA\ACTISOMAI 2018-02-03 14-29-54\031-2901.D Sample Name: CA07 THU 2 ===================================================================== Acq. Operator : MAICH21 Seq. Line : 29 Acq. Instrument : Instrument 1 Location : Vial 31 Injection Date : 2/4/2018 5:00:00 AM Inj : 1 Inj Volume : 10.000 µl Acq. Method : C:\CHEM32\1\DATA\ACTISOMAI 2018-02-03 14-29-54\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/2/2018 1:16:52 PM by MAICH21 Analysis Method : C:\CHEM32\1\METHODS\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/4/2018 11:04:08 AM by GIAP-TUYEN (modified after loading) Additional Info : Peak(s) manually integrated DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (ACTISOMAI 2018-02-03 14-29-54\031-2901.D) mAU

50

40

30

20

10

0

0

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

60

5

10

15

20

===================================================================== Area Percent Report with Performance ===================================================================== Multiplier: : 1.0000 Dilution: : 1.0000 Use Multiplier & Dilution Factor with ISTDs

Signal 1: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off

RetTime k' Area Height Symm. Width Plates Resol Select [min] [mAU*s] [mAU] [min] ution ivity -------|------|----------|----------|-----|-------|-------|-----|-----15.953 814.34772 23.21540 0.96 0.5400 4835 -

===================================================================== *** End of Report ***

Instrument 1 2/4/2018 3:51:28 PM GIAP-TUYEN Page 1 of 1

25

min

l Nghiên cứu - Kỹ thuật Các kết quả thẩm định thu được cho thấy phương pháp đáp ứng đầy đủ các yêu cầu của ICH. Ứng dụng phân tích mẫu thực Ứng dụng quy trình đã xây dựng và thẩm định định lượng 5 mẫu lá tam thất được thu hái tại các tỉnh Lào Cai và Hà Giang. Kết quả hàm lượng ginsenosid Rb3 tính theo dược liệu khô được trình bày ở bảng 4.

Bảng 4. Hàm lượng ginsenosid Rb3 có trong các mẫu lá tam thất (TB ± sd; n = 3)

1 2 3 4 5

Mẫu thử M1 M2 M3 M4 M5

Nơi thu hái Bắc Hà, Lào Cai Si Ma Cai, Lào Cai Đồng Văn, Hà Giang Đồng Văn, Hà Giang Quản Bạ, Hà Giang

Kết luận

Năm tuổi 2 3 3 2 2

Hàm lượng ginsenosid Rb3 (%) 1,54 ± 0,03 1,86 ± 0,05 2,11 ± 0,03 1,62 ± 0,02 1,69 ± 0,04

Tài liệu tham khảo

1. CP. (2015), Vol IB, p. 1326, Total sapogium of Notoginseng Folium.

2. Viện Dược liệu (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam. 3. ICH (2005), Validation of analytical procedures: Text and Methodology.

4. Fang Liu, Ni Ma, Chengwei He, Yuanjia Hu, Peng Li, Meiwan Chen, Huanxing Su, Jian-Bo Wan (2017), “Qualitative and quantitative analysis of the saponins in Panax notoginseng leaves using ultra-performance liquid chromatography coupled with time-of-flight tandem mass spectrometry and high perfoemance liquid chromatography coupled with UV detector”, J. of Ginseng Research , pp.1-9.

5. Xu Y. X., Shi J. S., Jiang Z. L. (2005), “Innibitory influence of ginsenoside Rb3 on activation of strychnine-sensitive glycine receptors in hippocampal neurons of rat”, Brain Res. , 1037, pp. 99-106.

6. Xiang H., Liu Y., Zhang B., Huang J, Li Y., et al (2011), “The antidepressant effects and mechanismof action of total saponins from the caudexes and leaves of Panax notoginseng in animal models of depression”, Phytomedicine, 18, pp. 731-8.

7. Wang M. Zhang X. J., Liu F., Hu Y. J., He C. W., Li P., Su H. X., Wan J. B. (2015), “Saponins isolated from the leaves of Panax notoginseng protect against alcoholic liver injury via inhibiting ethanol-induced oxidative stress and gut-derived endotoxin-mediated inflammation”, J. Funct. Foods, 19, pp. 214-224.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

TT

chứng tỏ tính khả thi của phương pháp. Do đó, phương pháp này có thể sử dụng để định lượng ginsenosid Rb3 có trong lá tam thất trồng tại Việt Nam.

Nghiên cứu đã xây dựng được phương pháp định lượng ginsenosid Rb3 trong lá tam thất (Panax notoginseng) trồng tại Việt Nam bằng HPLC. Phương pháp đã được thẩm định theo hướng dẫn của ICH cho kết quả đạt theo qui định. Với khoảng tuyến tính rộng (từ 10 – 500 µg/ml), độ đúng cao (99,58%), độ chính xác đảm bảo với giá trị RSD% nhỏ (1,27%), giới hạn định lượng (LOQ) thấp (0,257 µg/ml), đồng thời phương pháp đã được ứng dụng định lượng ginsenosid Rb3 trong 5 mẫu lá tam thất thu hái tại Lào Cai và Hà Giang cho kết quả khách quan

(Ngày nhận bài: 13/10/2017 - Ngày phản biện: 05/04/2018 - Ngày duyệt đăng: 16/04/2018)

Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng acid chlorogenic trong viên nang mềm Bổ gan bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Nguyễn Thị Mai*, Nguyễn Thị Kiều Anh

Trường Đại học Dược Hà Nội *E-mail: maipharmacist88@gmail.com

Summary

An HPLC was developed for the determination of chlorogenic acid in “Bo gan” soft capsules. For injection, the samples were extracted by ultrasonication with a mixture of methanol and water (60:40, v/v), injection volume - 10 µl. The HPLC separation was performed on an Inertsil ODS column (250 x 4.6 mm; 5 µm) with the mobile phase consisting of phosphoric acid 0.1% in water and acetonitrile (in gradient elution) and UV detector (330nm). The procedure was validated for specificity, linearity, precision (repeatability, intermediate precision), accuracy, LOD and LOQ. These all indicated the method well satisfactory to the ICH requirements. By practical trial, Bo Gan soft capsules from 6 commercial production batches were analyzed. The chlorogenic acid of these all products were found to exceed the claimed formulated content of 1.50 mg per capsule.

Keywords: Chlorogenic acid, Bo gan soft capsules, HPLC, quantification.

TẠP CHÍ DƯỢC HỌC - 4/2018 (SỐ 504 NĂM 58)

35

l Nghiên cứu - Kỹ thuật Đặt vấn đề

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Xã hội ngày càng phát triển, cách ăn uống, sinh hoạt thay đổi dẫn tới một số bệnh lý tăng cao như bệnh về tim mạch, huyết áp, tiểu đường... Trong đó, các bệnh về gan (gan nhiễm mỡ, viêm gan B, ung thư gan…) là một trong những bệnh chiếm tỷ lệ cao nhất.

Bên cạnh sử dụng thuốc tân dược, thì số người tìm hiểu và sử dụng các sản phẩm thuốc từ thảo dược không ngừng tăng lên do người dùng cho rằng các thuốc này có nguồn gốc thiên nhiên, có lợi cho sức khỏe, không hoặc rất ít độc hại.

Hiện nay, có rất nhiều chế phẩm thuốc bổ gan có nguồn gốc thảo dược được sản xuất và lưu hành trên thị trường góp phần quan trọng trong sự nghiệp chăm sóc sức khỏe cộng đồng như viên nang mềm Boganic của Traphaco, viên nang mềm Giadogane của HD Pharma, viên nang cứng Chobil của Công ty CP Dược Hậu Giang, viên nang mềm (cứng) Liverbil của Công ty CP Dược phẩm OPC… Thành phần chính của các chế phẩm này chủ yếu gồm actiso (Cynara scolymus), bìm bìm biếc (Pharbitisnil) và rau đắng đất (Glinus oppositifolius) với lượng actiso chiếm tỷ lệ khoảng 54,6% so với 2 thành phần còn lại. Tiêu chuẩn 3 dược liệu này trong Dược điển IV [1], cũng như tiêu chuẩn chất lượng của chế phẩm chưa đề cập tới định lượng chất định danh nào. Dược điển Trung Quốc 2015 [3], Dược điển châu Âu [4] yêu cầu định tính và định lượng acid chlorogenic trong dược liệu, cao actiso; Dược điển Mỹ 38 [7] yêu cầu định lượng acid chlorogenic trong một số dược liệu. Acid chlorogenic là hoạt chất có tác dụng chống oxy hóa, chống viêm, ức chế sự phát triển của khối u; chống virus... Đây có thể là một trong các thành phần quan trọng tạo nên tác dụng bảo vệ gan, tăng cường chức năng gan, giải độc gan của chế phẩm.

Nhằm góp phần nâng cao chất lượng sản phẩm bổ gan chứa 3 dược liệu actiso, bìm bìm biếc và rau đắng đất, nghiên cứu này được tiến hành với mục tiêu xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng acid chlorogenic trong viên nang mềm Bổ gan bằng HPLC, từ đó ứng dụng định lượng acid chlorogenic trong một số chế phẩm viên nang mềm chứa 3 thành phần này.

Chất chuẩn: Acid chlorogenic (C16H18O9) hàm lượng 99,60% (nguyên trạng); SKS: 71121F của AK Scientific, TnC, Mỹ. Đối tượng nghiên cứu - Mẫu chế phẩm viên nang mềm Bổ gan có thành phần công thức gồm: cao actiso, cao rau đắng đất, cao bìm bìm biếc của 2 công ty, mỗi công ty lấy 3 mẫu được mã hóa công ty (A, B), số thứ tự mẫu (01, 02, 03) và ngày lấy mẫu (ngày/ tháng/ năm); cách nhau bằng dấu chấm.

- Mẫu placebo gồm sáp ong trắng, palm oil, lecithin, colloidan silicon dioxid, dầu đậu nành với tỷ lệ theo công thức công bố.

Phương pháp nghiên cứu Chuẩn bị mẫu chuẩn, mẫu thử - Dung dịch chuẩn gốc: Dung dịch acid chlorogenic có nồng độ chính xác khoảng 0,35 mg/ml trong methanol.

- Dung dịch chuẩn làm việc: Dung dịch acid chlorogenic có nồng độ chính xác khoảng 35 µg/ml trong hỗn hợp methanol - nước (60:40).

- Dung dịch thử: Lấy 20 viên nang mềm, cân và tính khối lượng trung bình thuốc trong viên. Trộn đều. Cân chính xác một lượng dịch thuốc tương ứng 1 viên vào cốc có mỏ, thêm 20 ml nước, siêu âm 15 phút. Chuyển toàn bộ mẫu vào bình gạn 100 ml, tráng cốc bằng 25 ml n-hexan và tập trung vào bình gạn. Lắc 5 phút, để lắng, bỏ lớp n-hexan. Tiếp tục chiết như vậy thêm 1 lần nữa bằng 25 ml n-hexan. Chuyển dịch chiết nước vào bình định mức 50 ml, thêm khoảng 20 ml methanol, siêu âm 15 phút, thêm methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều. Ly tâm dịch chiết 6000 vòng/phút trong 10 phút, thu lấy phần dịch trong. Lọc qua màng lọc PTFE 0,22 μm. Điều kiện sắc ký - Cột Inertsil ODS (250 x 4,6 mm, 5 µm); nhiệt độ cột: 25oC. - Pha động: Acetonitril (A) – dung dịch acid phosphoric 0,1% (B) theo chương trình gradient:

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu Thiết bị, hóa chất, chất chuẩn Thiết bị: Hệ thống HPLC Agilent 1260 series với detector DAD (Mỹ).

Hóa chất: Cloroform, n-hexan loại thuốc thử (Trung Quốc); acid phosphoric 85% loại PA (JTBaker, Mỹ); acetonitril và methanol loại HPLC ( Merck, Đức).

36

Thời gian (phút)

A (%)

B (%)

0 → 14

10

90

Tốc độ dòng (ml/ phút) 1,5

14,0→ 14,5

10

90

1,5 → 1,0

14,5→ 21,0

10

90

1,0

21,0→ 21,5

10

90

1 → 1,5

22,0→ 22,5

10 → 90

90 → 10

1,5

- Detector UV bước sóng 330 nm; Thể tích tiêm: 10 µl. Sau mỗi lần tiêm mẫu, rửa giải với hỗn hợp acetonitril – dung dịch acid phosphoric 0,1% lần lượt TẠP CHÍ DƯỢC HỌC - 4/2018 (SỐ 504 NĂM 58)

l Nghiên cứu - Kỹ thuật theo tỷ lệ 90:10 và 10:90, mỗi tỷ lệ trong 5 phút.

Thẩm định quy trình Tiến hành thẩm định phương pháp phân tích theo hướng dẫn của ICH [5]. Đánh giá tính thích hợp hệ thống, độ chọn lọc, khoảng tuyến tính, độ chính xác, độ đúng, LOD và LOQ của phương pháp.

Kết quả nghiên cứu

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Khảo sát và lựa chọn điều kiện xử lý mẫu Trong thành phần chế phẩm có một lượng lớn dầu béo nên cần loại để giảm thiểu ảnh hưởng tới độ bền cột tách, cũng như cản trở quá trình tách bằng sắc ký. Dung môi loại dầu béo khảo sát gồm cloroform và n-hexan. Kết quả cho thấy cả 2 dung môi đều có khả năng loại chất béo tốt, nhưng cloroform có thể tạo nhũ gây khó khăn trong quá trình chiết nên lựa chọn n-hexan làm dung môi chiết loại dầu béo. Để làm sạch tốt mẫu thử thực hiện chiết bằng n-hexan lặp lại 2 lần trong quá trình xử lý mẫu.

Dựa vào độ tan của acid chlorogenic và các tài liệu công bố như Dược điển châu Âu, Dược điển Mỹ và Dược điển Trung Quốc, khảo sát các dung môi chiết methanol, hỗn hợp methanol - nước với tỷ lệ methanol từ 90 - 50% (DC = 10%), kết quả cho thấy hỗn hợp dung môi methanol - nước (60:40) cho hiệu suất chiết cao nhất. Đồng thời, khảo sát thời gian chiết siêu âm từ 5 - 20 phút (Dt = 5 phút) thấy khi thời gian siêu âm tăng, lượng acid chlorogenic chiết được tăng, nhưng với thời gian chiết 20 phút lượng acid chlorogenic chiết được không khác nhau so với siêu âm 15 phút.

Qui trình xử lý mẫu lựa chọn được trình bày trong mục chuẩn bị mẫu của Phương pháp nghiên cứu.

Khảo sát điều kiện sắc ký Dựa vào tính chất của acid chlorogenic và các tài liệu công bố như Dược điển châu Âu, Dược điển Mỹ và Dược điển Trung Quốc lựa chọn sắc ký lỏng pha đảo với cột C18 để phân tích acid chlorogenic trong chế phẩm. Sử dụng hệ dung môi acetonitril và dung dịch acid phosphoric 0,1% với tỷ lệ acetonitril từ 5 30% (DC = 5%), kết quả cho thấy khi tỷ lệ acetonitril tăng thời gian lưu của acid chlorogenic giảm và không tách rời khỏi các pic lân cận ở tỷ lệ acetonitril là 20% do đó lựa chọn hệ pha động với tỷ lệ acetonitril là 10%.

Mặt khác, nếu duy trì tỷ lệ hệ pha động không đổi trong quá trình rửa giải thì thời gian phân tích kéo dài do đó tỷ lệ thành phần và tốc độ dòng pha động được thay đổi để có thể rửa giải tất cả các thành phần trong mẫu thử trong thời gian 30 phút. Quét phổ UV tại vị trí ứng với đỉnh pic acid chlorogenic trên sắc ký đồ, bước sóng cực đại là 330 nm. Thể tích mẫu thử ảnh hưởng

tới độ phân giải của pic sắc ký, mặt khác đối với mẫu dược liệu thể tích mẫu nhỏ cũng góp phần hạn chế ảnh hưởng của nền mẫu làm bẩn cột sắc ký có thể dẫn đến kém ổn định khi phân tích. Điều kiện sắc ký lựa chọn được trình bày trong mục điều kiện sắc ký của Phương pháp nghiên cứu.

Thẩm định phương pháp Độ chọn lọc Tiến hành tiêm vào hệ thống sắc ký lần lượt các dung dịch sau: mẫu placebo (chuẩn bị tương tự mẫu thử); mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn.

Kết quả được trình bày ở hình 1.

TẠP CHÍ DƯỢC HỌC - 4/2018 (SỐ 504 NĂM 58)

Hình 1. Sắc ký đồ của mẫu thử viên nang mềm Bổ gan A.01.0872017 (a), mẫu chuẩn (b), mẫu placebo (c), mẫu thử thêm chuẩn (d)

Kết quả ở hình 1 cho thấy trên sắc ký đồ của mẫu thử có pic có cùng thời gian lưu với pic acid chlorogenic trong sắc ký đồ của mẫu chuẩn; pic ứng với acid chlorogenic trong sắc ký đồ của mẫu thử thêm chuẩn tăng lên, còn sắc ký đồ của mẫu placebo không xuất hiện pic ứng với thời gian lưu của acid chlorogenic. Tiến hành chồng phổ UV của pic acid chlorogenic trên sắc ký đồ của dung dịch thử và chuẩn, hệ số match thu được là 999,98. Độ tinh khiết của pic acid chlorogenic trên sắc ký đồ mẫu thử là 999,753 cho thấy pic thu được trên sắc ký đồ của mẫu thử là tinh khiết. Như vậy, phương pháp đạt yêu cầu về độ chọn lọc.

Khoảng nồng độ tuyến tính Từ dung dịch chuẩn gốc pha loãng chính xác để thu được dãy các dung dịch chuẩn trong hỗn hợp methanol: nước (60:40) có nồng độ acid chlorogenic là 50%, 80%, 100%, 120%, 150% so với nồng độ định lượng (35 µg/ml). Tiến hành sắc ký. Kết quả được thể hiện ở bảng 1 và hình 2.

Bảng 1. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính Nồng độ acid chlorogenic (µg/ml) 17,9 28,6 35,7 42,8 53,6 Diện tích pic (mAU.s) 530,3 843,7 1058,2 1260,1 1568,3 Phương trình hồi quy:

y = 29109x + 12,335

Hệ số tương quan: 0,99995

% hệ số chắn: 1,17%

37

l Nghiên cứu - Kỹ thuật lặp lại 6 lần song song mẫu thử viên nang mềm Bổ gan A.01.0872017 vào ngày phân tích khác. Kết quả được trình bày trong bảng 2. Độ đúng Tiến hành theo phương pháp thêm chuẩn vào mẫu thử đã biết hàm lượng. Thêm một thể tích chính xác dung dịch chuẩn acid chlorogenic vào mẫu thử (khối lượng chính xác khoảng nửa viên - 50% lượng mẫu thử) để thu được các mẫu tương ứng với lượng acid chlorogenic khi xử lý mẫu ở 3 mức nồng độ 70; 100; 130% so với nồng độ định lượng. Tại mỗi mức nồng độ thực hiện trên 3 mẫu độc lập. Tiến hành phân tích.

Dựa vào hàm lượng hoạt chất đã biết trong mẫu thử, lượng chất chuẩn thêm vào và diện tích pic mẫu thử thêm chuẩn, diện tích pic acid chlorogenic và nồng độ dung dịch chuẩn làm song song tính lượng thu hồi của acid chlorogenic. Kết quả được trình bày ở bảng 2.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Kết quả ở bảng 1 cho thấy trong khoảng nồng độ khảo sát có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa nồng độ acid chlorogenic và diện tích pic tương ứng với hệ số tương quan r ≈ 1.

Tính thích hợp của hệ thống sắc ký Tiêm vào hệ thống sắc ký 6 lần lặp lại dung dịch chuẩn ở mức nồng độ 100%. Kết quả thu được thời gian lưu trung bình là 17,29 phút với RSD = 0,173%; diện tích pic trung bình là 1058,15 mAU.s với RSD = 0,274%. Kết quả đều đạt theo yêu cầu của ICH là RSD < 2,0%. Độ chính xác Độ lặp lại của phương pháp: Tiến hành định lượng lặp lại 6 lần song song mẫu thử viên nang mềm Bổ gan A.01.0872017. Kết quả được trình bày trong bảng 2. Độ chính xác trung gian: Tiến hành định lượng

Bảng 2. Kết quả thẩm định độ chính xác và độ đúng của phương pháp Ngày phân tích 1

Độ lặp lại (yêu cầu RSD < 2%; n = 6)

RSD (%)

TB (mg/viên)

RSD (%)

1,796

1,70

1,787

1,81

Độ chính xác trung gian (yêu cầu RSD < 3,0%; n = 12)

Độ đúng (yêu cầu độ thu hồi 98,0 – 102,0%; RSD < 2,0%; n = 3)

Ngày phân tích 2

TB (mg/viên)

Trung bình (mg/viên): 0,791 RSD: 1,70%

Mức

Min (%)

Max (%)

TB (%)

RSD (%)

70%

98,35

100,46

99,15

1,16

100%

100,86

101,88

101,32

0,51

130%

98,33

100,12

99,26

0,9

Kết quả ở bảng 2 cho thấy, phương pháp đạt yêu cầu về độ đúng và độ chính xác theo ICH.

Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

2 công ty tại các nhà thuốc trên địa bàn Hà Nội. Tiến hành định lượng acid chlorogenic trong các mẫu theo phương pháp đã xây dựng. Kết quả được trình bày ở bảng 3 và hình 2.

Pha loãng dung dịch chuẩn gốc bằng dịch chiết từ mẫu placebo được dung dịch có nồng độ chính xác khoảng 17 µg/ml. Pha loãng lần lượt gấp đôi dung dịch thu được bằng dịch chiết từ mẫu placebo. Tiến hành sắc ký. Nồng độ tại đó có tỷ lệ S/N lần lượt bằng 3 và bằng 10 được coi là LOD và LOQ của phương pháp.

Từ kết quả thu được, xác định được phương pháp có LOD và LOQ lần lượt là 0,196 µg/ml 0,647 µg/ml.

Từ các kết quả thẩm định cho thấy phương pháp đáp ứng các yêu cầu về độ chọn lọc, khoảng tuyến tính, độ đúng, độ chính xác theo qui định của ICH; phương pháp có độ nhạy cao, khoảng làm việc là 70130% nồng độ định lượng 35 µg/ml. Ứng dụng Mua mẫu thuốc viên nang mềm Bổ gan của 38

Hình 2. Sắc ký đồ của mẫu thử viên nang mềm Bổ gan A.01.0872017 (a), B.01.0982017 (b)

TẠP CHÍ DƯỢC HỌC - 4/2018 (SỐ 504 NĂM 58)

l Nghiên cứu - Kỹ thuật Bảng 3. Kết quả định lượng acid chlorogenic trong các mẫu viên nang mềm Bổ gan đang lưu hành trên thị trường (n = 3) Hàm lượng Hình thức (mg/viên) ± RSD% 1 A.02.1592017 1,721 mg ± 1,28% Viên nang mềm màu nâu, dịch 2 A.02.1692017 1,675 mg ± 0,89% thuốc trong nang màu vàng nâu, mùi thơm dược liệu 3 A.03.1992017 1,829 mg ± 0,93%

TT

Mẫu thử

4 B.01.2292017 5 B.02.0872017 6 B.03.0982017

1,604 mg ± 0,89%

Viên nang mềm màu nâu, dịch 1,572 mg ± 1,31% thuốc trong nang màu vàng nâu, mùi thơm dược liệu 1,544 mg ± 1,82%

Bàn luận

Phương pháp đã được ứng dụng định lượng acid chlorogenic trong 6 mẫu thuốc viên nang mềm Bổ gan của 2 công ty đang lưu hành trên thị trường, kết quả cho thấy hàm lượng aicd chlorogenic đều lớn hơn 1,50 mg/ viên do đó có thể đưa chỉ tiêu định lượng acid chlorogenic vào tiêu chuẩn chất lượng cho những chế phẩm này. Mặt khác, trên thị trường còn có nhiều chế phẩm viên nang mềm dùng hỗ trợ điều trị các bệnh về gan dạng thực phẩm chức năng đang lưu hành nên để có thể áp dụng phương pháp này cần tiếp tục khảo sát mở rộng khoảng làm việc trong thẩm định để khẳng định độ đúng và độ chính xác của phương pháp.

D ẠY da K y k ÈM em Q qu UY yn N ho H nb ƠN us O in F es F s@ ICI gm AL ai ST l.c &G om T

Theo Dược điển châu Âu 8.0 [4], acid chlorogenic trong lá được chiết hồi lưu bằng methanol lặp lại 2 lần trong 2 giờ/lần và chiết bằng hỗn hợp methanol – nước (30:70) đối với cao actiso. Tuy nhiên, khi lặp lại điều kiện chiết này đối với mẫu nghiên cứu, hiệu suất thu được thấp hơn khi chiết với hỗn hợp methanol – nước (60:40). Li-Mei Wang và CS. chiết acid chlorogenic trong kim ngân hoa với dung môi ethanol 70o bằng cách siêu âm 30 phút; lọc lấy dịch chiết; dịch được cô đặc và làm khô ở 45ºC trong chân không; sau đó hòa tan cắn trong methanol và định lượng bằng HPLC [6].

Quy trình xử lý mẫu khá phức tạp có thể gây mất mẫu.

Dược điển Trung Quốc [3] và Nguyễn Thị Ánh Nguyệt và CS. định lượng acid chlorogenic trong kim ngân hoa bằng HPLC với với hệ dung môi acetonitril : dung dịch acid phosphoric 0,4% (13:87), chế độ đẳng dòng [2]. Với hệ này khi áp dụng phân tích mẫu viên nang mềm Bổ gan không đảm bảo rửa giải được hết các chất như chương trình gradient mà chúng tôi xây dựng. Nghiên cứu này đã khảo sát và lựa chọn được điều kiện sắc ký và quy trình xử lý mẫu tối ưu để tách acid chlorogenic (tR=17,3 phút, Rs=1,73 và As=0,97) trong các chế phẩm viên nang mềm Bổ gan với thời gian phân tích 30 phút.

Nghiên cứu sử dụng pha tĩnh là cột C18 Inertsil ODS có điều nhiệt cột ở 25oC và pha động là hỗn hợp MeCN dung dịch acid phosphoric 0,1% với chương trình rửa giải gradient, gradient tốc độ dòng, đây là điều kiện phân tích sắc ký lỏng có thể dễ dàng áp dụng. Chế độ gradient pha động và tốc độ dòng, kèm rửa giải sau mỗi lần phân tích nhằm tách được chất cần phân tích, rửa giải được chất ít phân cực đồng thời đưa điều kiện pha động về trạng thái ban đầu để phân tích các mẫu tiếp theo cho kết ổn định.

17,9 - 53,6 µg/ml. Độ chính xác trong ngày và giữa 2 ngày đều có giá trị RSD nhỏ hơn 2%, độ đúng của phương pháp với độ tìm lại đều trong khoảng 98,0 102,0%, giới hạn định lượng 0,647 µg/ml, thời gian phân tích 30 phút. Do đó có thể sử dụng quy trình này cho phân tích thường quy trong kiểm tra chất lượng các chế phẩm viên nang mềm Bổ gan trên thị trường.

Kết quả thẩm định theo tiêu chuẩn ICH [4] cho thấy, quy trình đảm bảo tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính

Kết luận

Nghiên cứu này đã xây dựng được phương pháp định lượng acid chlorogenic trong viên nang mềm Bổ gan bằng HPLC. Quy trình xử lý mẫu khá đơn giản và nhanh chóng, điều kiện sắc ký có thể dễ dàng áp dụng. Phương pháp xây dựng có độ chính xác đạt yêu cầu, độ đúng tốt, phương pháp có khoảng tuyến tính rộng so với nồng độ định lượng đồng thời có giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng thấp nên thích hợp để phân tích thành phần hoạt chất trong mẫu chế phẩm viên nang mềm Bổ gan lưu hành trên thị trường.

Tài liệu tham khảo

1. Hội đồng Dược điển (2009), Dược Điển Việt Nam IV, tr. 681, 695.

2. Nguyễn Thị Ánh Nguyệt, Lê Phan Kim Trang, Phạm Đông Phương (2016), “Phân lập và thiết lập chất chuẩn acid Chlorogenic”, Tạp chí Dược học, 56 (487), tr. 22 - 27.

3. Chinese Pharmacopoeia (2015), pp. 270-271.

4. European Pharmacopoeia, 8.0, pp. 1154-1156.

5. ICH (2005), Validation of analytical procedures: Text and Methodology Q2 (R1) 6. Li-Mei Wang, Mao-Teng Li, You-Yu Yan, Ming-Zhang Ao, GengWu, Long-Jiang Yu (2009), “Influence of flowering stage of Lonicera japonica Thunb. On variation in volatiles and chlorogenic acid”, Research Article, (98), pp. 953-957.

7. USP 38, Bản online.

(Ngày nhận bài: 21/02/2018 - Ngày phản biện: 05/04/2018 - Ngày duyệt đăng: 16/04/2018) TẠP CHÍ DƯỢC HỌC - 4/2018 (SỐ 504 NĂM 58)

39