Issuu on Google+

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN THỊ THANH NGA

NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG CIPROFLOXACIN VÀ ENPROFLOXACIN TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC-MS/MS CHUYÊN NGÀNH: HÓA PHÂN TÍCH. MÃ SỐ: 1.04.03

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC – HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS. NGUYỄN THỊ XUÂN MAI

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2009

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, tôi xin chân thành cảm ơn tới PGS.TS. NGUYỄN THỊ XUÂN MAI – người đã bỏ nhiều công sức, hướng dẫn tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài này. Tôi xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô giáo trong Bộ môn Hóa Phân Tích – Khoa Hóa – trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên – Đại học quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức trong suốt khóa học. Tôi chân thành cảm ơn đến Ban giám đốc Trung tâm Phân tích Phân loại Hàng hóa Xuất Nhập khẩu miền Nam, chú Cao Xuân Quảng, chị Nguyễn Thị Thanh Phượng, anh Nguyễn Ngọc Linh và các đồng nghiệp khác đã giúp đỡ, tạo cơ sở về trang thiết bị, hóa chất, phòng thí nghiệm. Cuối cùng tôi xin cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã luôn động viên trong suốt thời gian học tập và làm việc. Nguyễn Thị Thanh Nga

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1: Phần trăm ion mẹ (ciprofloxacin) còn lại theo sự tăng dần năng lượng đập mảnh........................................................................................................................40 Bảng 3.2: Phần trăm ion mẹ (enrofloxacin) còn lại theo sự tăng dần năng lượng đập mảnh........................................................................................................................43 Bảng 3.3: Kết quả thời gian lưu thay đổi theo thành phần pha động ................47 Bảng 3.4: Dữ liệu đường chuẩn của ciprofloxacin ............................................48 Bảng 3.5: Dữ liệu đường chuẩn của enrofloxacin: ............................................49 Bảng 3.6: Kết quả chiết mẫu với kỹ thuật sohxlet .............................................50 Bảng 3.7: Kết quả chiết mẫu với kỹ thuật khuấy trộn sử dụng thiết bị đánh vortex trên ba hệ dung môi: ......................................................................................................50 Bảng 3.8: Kết quả chiết mẫu với kỹ thuật khuyấy trộn sử dụng trên máy khấy từ với ba hệ dung môi ........................................................................................................51 Bảng 3.9: Hàm lượng và hiệu suất thu hồi trên mẫu thêm chuẩn......................52 Bảng 3.10: Hàm lượng và hiệu suất thu hồi khi cho qua cột SCX ....................54 Bảng 3.11: Kết quả biểu diễn hiệu suất thu hồi theo nồng độ dung dịch rửa giải khi qua cột SCX..................................................................................................55 Bảng 3.12: Kết quả biểu diễn hiệu suất thu hồi theo thể tích dung dịch rửa giải trên mẫu tự tạo khi qua cột SCX ...............................................................................56 Bảng 3.13: Hiệu suất thu hồi trên mẫu cá diêu hồng .........................................57 Bảng 3.14: Hiệu suất thu hồi trên mẫu cá basa..................................................58 Bảng 3.15: Hiệu suất thu hồi trên mẫu thịt gà ...................................................59 Bảng 4.1: Kết quả phân tích trên mẫu cá diêu hồng ..........................................61 Bảng 4.2: Kết quả phân tích trên mẫu cá basa dạng file....................................61 Bảng 4.3: Kết quả phân tích trên mẫu thịt gà ....................................................62

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

DANH MỤC HÌNH H1.1 Cấu trúc cơ bản của nhóm quinolone..........................................................3 H1.2 Cân bằng acid base của nhóm Acidic quinolone.........................................3 H1.3. Cân bằng acid base của nhóm Piperazinyl quinone ...................................4 H1.4. Công thức cấu tạo của Ciprofloxacin.........................................................5 H1.5. Công thức cấu tạo của Enrofloxacin ..........................................................5 H1.6. Danh mục hóa chất kháng sinh bị hạn chế sử dụng theo quyết định 07/2005/QĐ-BTS...................................................................................7 H1.7. Phức tạo thành giữa Fe(III) với Ciprofloxacin (λmax = 430nm)...............7 H1.8.Công thức cột Strata-X-C..........................................................................10 H1.9: Thời gian lưu của cấu tử phân tích...........................................................11 H1.10. Sơ đồ cấu tạo chung của một hệ sắc kí lỏng ..........................................13 H1.11. Cấu tạo của vòng loop ............................................................................15 H1.12. Sơ đồ kỹ thuật APCI của hãng Agilent. .................................................18 H1.13. Sơ đồ kỹ thuật phun ESI của máy Agilent Technologies 6410 Triple Quad LC/MS ...........................................................................................................................20 H1.14. Vị trí của các dòng khí trong hệ .............................................................21 H1.15. Cấu hình của một tứ cực.........................................................................22 H1.16. Sơ đồ cấu tạo của bộ phân tích khối một tứ cực. ...................................23 H1.17. Sơ đồ cấu tạo ba tứ cực của hãng Agilent ..............................................24 H1.18. Sự phân mảnh diễn ra ở Q2....................................................................25 H1.19. Khối phổ của chất phân tích ứng với từng giai đoạn trong bộ ba tứ cực25 H2.1. Kết quả phân tích của reserpin 500fg.......................................................30 H3.1. Kết quả sắc kí đồ của ciprofloxacin và enrofloxacin dạng full................40 H3.2. Kết quả sắc kí đồ của ciprofloxacin và enrofloxacin tại CE=18..............41 H3.3. Sự phân mảnh của ciprofloxacin ..............................................................42 H3.4. Kết quả sắc kí đồ của ciprofloxacin và enrofloxacin tại CE=20..............43

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

H3.5. Sự phân mảnh của enrofloxacin ...............................................................44 H3.6. Kết quả sắc kí đồ của ciprofloxacin và enrofloxacin theo % acid formic.45 H3.7. Ảnh hưởng của tốc độ dòng .....................................................................46 H3.8. Sắc kí đồ thể hiện ảnh hưởng của tỉ lệ ACN: formic acid 1% lên hỗn hợp ciprofloxacin và enprofloxacin......................................................................................47 H3.9. Đồ thị biểu diễn đường chuẩn của ciprofloxacin và enrofloxacin. ..........49 H3.10. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH lên quá trình tách ciprofloxacin và enrofloxacin ...................................................................................................................53 H3.11. Ảnh hưởng của pH lên dạng tồn tại của ciprofloxacin và enrofloxacin 53 H3.12. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của thể tích rửa giải đối với ciprofloxacin, enrofloxacin ..................................................................................................................56 H4.1 Sơ đồ tóm tắt quy trình phân tích mẫu trong đề tài...................................60

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

DANH MỤC VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU amu: đơn vị khối. ESI : ElectroSpray Ionization – kỹ thuật phun ion. APCI: Atmospheric Presure Chemical Ionization – kỹ thuật ion hóa ở áp suất thường EU: Eurobean Union - Cộng đồng Châu Âu. HPLC: High Performance Liquid Chromatography - Sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC-MS: sắc kí lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ LC-MS: sắc kí lỏng ghép khối phổ LC-MS2: sắc kí lỏng ghép khối phổ hai lần DAD: diode array detector LOD: Limit Of Detection - Giới hạn phát hiện LOQ: Limit Of Quantification - Giới hạn định lượng MS: Mass Spectrometry - khối phổ MRLs: Maximum Residue Limits giới hạn dư lượng lớn nhất ppb: một phần tỉ ppm: một phần triệu ppt: một phần ngàn tỉ SIM: Selected Ion Monitor – theo dõi ion được chọn SRM: Selected Reaction Monitoring – theo dõi phản ứng được chọn. SPE: Solid Phase Extraction – chiết pha rắn. TIC: Total Ion Chromatogram – sắc kí đồ tổng hoặc toàn ion. AQ: Acidic quinolone PQ: Piperazinyl quinolone SCX: Strong Cation exchange SAX: Strong Anion exchange SPE: Solid phase extraction

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

MỤC LỤC Trang Đặt vấn đề ......................................................................................................................1 Mục tiêu của đề tài.........................................................................................................2 Chương 1: TỔNG QUAN ...........................................................................................3 1.1 Đôi nét về họ Fluoroquinolone................................................................................3 1.1.1 Công thức cấu tạo ................................................................................................3 1.1.2. Tính chất acid base nhóm quinolone ..................................................................4 1.1.3. Ciprofloxacin ......................................................................................................4 1.1.4. Enrofloxacin .......................................................................................................5 1.1.5. Nguồn gốc của Ciprofloxacin và Enrofloxacin trong thực phẩm ......................6 1.1.6. Ứng dụng và ảnh hưởng của Ciprofloxacin và Enrofloxacin .............................6 1.1.7. Giới hạn cho phép của dư lượng thuốc kháng sinh .............................................6 1.2. Các phương pháp xác định ....................................................................................7 1.2.1. Phương pháp trắc quang .....................................................................................7 1.2.2. Phương pháp HPLC – đầu dò UV và DAD ........................................................8 1.2.3. Phương pháp HPLC – đầu dò huỳnh quang .......................................................8 1.2.4. Phương pháp HPLC – đầu dò MS ......................................................................8 1.2.6. Điều kiện xử lí mẫu và làm sạch mẫu ................................................................9 1.3. Đôi nét về phương pháp sắc kí – sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC ......................10 1.3.1. Định nghĩa: ..........................................................................................................10 1.3.2. Một số đại lượng cơ bản của sắc kí ....................................................................10 1.3.3. Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC ) ...............................................12 1.3.4. Đầu dò khối phổ – Đầu dò MS ba tứ cực ...........................................................17 Chương 2: Phần thực nghiệm – Nội dung nghiên cứu ..........................................25 2.1. Thiết bị – hóa chất .................................................................................................25 2.2. Tối ưu hóa các thông số máy móc .........................................................................26 2.3. Nội dung nghiên cứu .............................................................................................28

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Chương 3: Kết quả và thảo luận ...............................................................................36 3.1. Kết quả khảo sát các thông số cho LC-MS ...........................................................36 3.1.1. Lựa chọn nguồn ion hóa: .....................................................................................36 3.1.2. Khảo sát năng lượng đập mảnh colision energy (CE).........................................36 3.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ acid formic:....................................................41 3.1.4. Khảo sát sự ảnh hưởng của tốc độ dòng - thành phần pha động:........................42 3.1.5. Kết quả xác định LOD và LOQ của máy HPLC-MS/MS:..................................44 3.1.6. Khảo sát khoảng tuyến tính và dựng đường chuẩn của enrofloxacin và ciprofloxacin:.................................................................................................................44 3.2. Kết quả khảo sát trên mẫu thực tế .....................................................................45 3.2.1. Khảo sát các kỹ thuật chiết mẫu thô với một số dung môi hữu cơ .....................45 3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH và khả năng chiết qua cột SPE...............................47 3.2.2.1. Ảnh hưởng của pH qua cột SCX trên mẫu thêm chuẩn: ..................................47 3.2.2.2. Kiểm tra khả năng chiết qua cột SCX ..............................................................49 3.2.2.3. Khảo sát nồng độ dung dịch rửa giải qua cột SCX ..........................................50 3.2.2.4. Khảo sát thể tích dung dịch rửa giải .................................................................50 3.2.3. Xác định MLOD, MLOQ, hiệu suất thu hồi, độ chụm trên nền mẫu cá diêu hồng .51 3.2.4. Xác định MLOD, MLOQ, hiệu suất thu hồi, độ chụm trên nền mẫu cá basa: .........52 3.2.5. Xác định MLOD, MLOQ, hiệu suất thu hồi, độ chụm trên nền mẫu thịt gà ...........53 Chương 4: Kết quả phân tích trên mẫu thực tế: ......................................................54 4.1. Tóm tắt quy trình phân tích thực tế: .......................................................................54 4.2. Kết quả phân tích trên mẫu cá diêu hồng ..............................................................55 4.3. Kết quả phân tích trên mẫu cá basa .......................................................................55 4.4. Kết quả phân tích trên mẫu thịt gà: ........................................................................56 Chương 5: Kết luận .....................................................................................................57 TÀI LIỆU THAM KHẢO Phụ lục

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học

ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, kháng sinh được sử dụng rất phổ biến trong lĩnh vực nông nghiệp đặc biệt là trong chăn nuôi. Tuy nhiên, việc lạm dụng thuốc kháng sinh nói chung và nhóm Fluoroquinolone nói riêng có thể làm nguồn thực phẩm cung cấp cho con người còn chứa một lượng nhỏ chất kháng sinh. Nếu người tiêu dùng sử dụng thực phẩm có dư lượng kháng sinh đáng kể, trong thời gian dài, sẽ làm tăng sức đề kháng của các vi khuẩn, việc kháng cự thuốc tăng dần. Khi người này bị bệnh, việc điều trị trên những loại thuốc tương tự sẽ cho hiệu quả thấp hoặc làm mất tác dụng [1,2,3]. Để bảo vệ quyền lợi của người tiêu dùng, ở châu Âu, tổ chức EU đã thiết lập giới hạn lớn nhất (MRLs) đối với dư lượng thuốc trong nguồn thực phẩm khi cung cấp cho con người vào năm 1990

[4]

. Theo sự kiểm tra và định hướng của các chuyên gia phòng

thí nghiệm, EU đã công bố “Council directive 96/23/EC in 1996”

[5]

, trong đó quy định

rõ hàm lượng kháng sinh theo từng loại thực phẩm và từng loại thuốc, ví dụ như với enrofloxacin trong cơ, gan, thận của bò, lợn, gia cầm (gà, vịt) là 30µg/kg; trong sữa bò là 100 µg/kg; Ở châu Mỹ, Hoa kỳ và các nước Bắc Mỹ đã cấm sử dụng kháng sinh họ Fluoroquinolone. Ở nước ta, nghề nuôi trồng thủy hải sản phát triển mạnh trong những năm gần đây. Theo các chuyên gia thủy sản, nguyên nhân chủ yếu gây bệnh thủy sản là do vi khuẩn. Thông thường, người nuôi sử dụng kháng sinh để khống chế các vi khuẩn gây bệnh, nhưng do chưa biết cách sử dụng, nên đã gây ra hiện tượng vi khuẩn kháng thuốc và tích tụ dư lượng kháng sinh trong sản phẩm. Mặt khác, một số ngư dân chạy theo lợi nhuận, lạm dụng thuốc trong thức ăn với vai trò là chất kích thích tăng trưởng của vật nuôi, dẫn đến việc đến kỳ thu hoạch, sản phẩm thủy sản vẫn còn tồn đọng nhiều dư lượng kháng sinh trong cơ thể. Tại Việt Nam, Bộ trưởng Bộ thủy sản đã ban hành quyết định số 07/2005/QĐ-BTS ngày 24/2/2005 về việc cấm sử dụng một số loại kháng sinh và quy định dư lượng tối đa một số kháng sinh được phép có trong thực phẩm [6]. Theo quy định này dư lượng tối đa của enrofloxacin và ciprofloxacin là 100 ppb NGUYỄN THỊ THANH NGA WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Trang 1


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học

Tóm lại, dư lượng thuốc kháng sinh phải được kiểm soát trong các mẫu thực phẩm. Và việc tìm ra các phương pháp phân tích khá nhạy để phát hiện và định lượng chính xác dư lượng kháng sinh nói chung và nhóm Fluoroquinolone nói riêng là vấn đề cần thiết.

MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI Việt Nam có điều kiện tự nhiên khá thuận lợi để phát triển ngành chăn nuôi gia súc, gia cầm, ngành khai thác và nuôi trồng thủy sản. Hiện nay nước ta đã gia nhập WTO, thị trường ngày càng được mở rộng, hoạt động của các ngành chăn nuôi vì thế mà trở nên sôi động hơn. Ngành chăn nuôi nói chung gần đây phát triển rất nhanh, đặc biệt nuôi tôm và cá. Sản lượng nuôi trồng đáp ứng được nhu cầu trong nước và xuất khẩu. Để bảo đảm quyền lợi người tiêu dùng trong nước và nước ngoài, khẳng định thương hiệu và uy tín của các mặt hàng Việt Nam chất lượng cao trên thương trường quốc tế, vấn đề cấp thiết là phải kiểm soát được dư lượng kháng sinh trong thực phẩm. Mục tiêu của đề tài là xây dựng một phương pháp đủ nhạy, chính xác, để đưa ra một quy trình phân tích một số kháng sinh thuộc họ fluoroquinolone cụ thể như enrofloxacin, ciprofloxacin phù hợp với điều kiện Việt Nam, kiểm soát dư lượng kháng sinh trên nền mẫu thực phẩm thông qua các bài báo đã công bố [1,2,3,4,5,6,7,8,….] Hiện nay, tại Trung tâm Phân tích Phân loại Hàng hóa xuất nhập khẩu Miền Nam đang có máy sắc kí ghép khối phổ ba tứ cực có thể cho phép thực hiện kỹ thuật ESI cũng như kỹ thuật MS/MS, chúng tôi sẽ sử dụng ưu điểm này của thiết bị để xây dựng một phương pháp phân tích phù hợp với điều kiện Việt Nam, đáp ứng yêu cầu về chất lượng phân tích của nhiều nước tiên tiến trên thế giới, đáp ứng quyết định số 07/2005/QĐ-BTS ngày 24/2/2005 của Bộ trưởng Bộ Thủy sản.

NGUYỄN THỊ THANH NGA WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Trang 2


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học

Chương 1: Tổng quan 1.1. Đôi nét về họ fluoroquinolone[ 1,7, 8] - Quinolone là một kháng sinh được sử dụng rộng rãi trong việc điều trị nhiễm trùng ở người và động vật. Mục tiêu chính của chúng là vi khuẩn the bacterial enzyme DNA gyrase hay topoisomerase II. Quinolone có thành phần hóa học là dẫn suất của acid nalidixic. Dựa trên phổ kháng khuẩn của nó, quinolone được chia thành nhiều thế hệ như: Quinolone thế hệ thứ nhất: cinoxacin, flumequine, nalidixic acid, oxilinic, .. Quinolone thế hệ thứ hai: ciprofloxacin., enoxacin, fleroxacin, lomefloxacin… Quinolone thế hệ thứ ba: balofloxacin, gatifloxacin, grepafloxacin… Quinolone thế hệ thứ tư: garenoxacin, clinafloxacin, gemifloxacin… - Fluoroquinolone là một nhóm kháng sinh thuộc họ quinolone trong đó có một nguyên tử F gắn ở vị trí số 6 của hệ thống trung tâm. Cả Quinolones và Fluoroquinolones đều là thuốc kháng sinh có khả năng giết chết vi khuẩn. 1.1.1 Công thức cấu tạo: Công thức cấu tạo chung của nhóm quinolone là hợp chất vòng thơm có chứa N, vị trí thứ 4 có gắn nhóm ketone, vị trí thứ 3 có gắn nhóm carboxylic. Các dẫn suất của quinolone gồm những hợp chất mà: Vị trí 1: có thể gắn thêm nhóm alkyl hoặc aryl; Vị trí 6: có thể gắn thêm F; Vị trí 2, 6, 8 có thể gắn thêm một nguyên tử N

Cấu trúc cơ bản của nhóm quinolone

Acid nalidixic

H1.1 Cấu trúc cơ bản của nhóm quinolone

NGUYỄN THỊ THANH NGA WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Trang 3


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học

1.1.2. Tính chất acid - base nhóm quinolone: Quinolone có một nhóm carboxylic ở vị trí số 3 nên đây là một hợp chất có tính acid. Một số quinolone có chứa thêm nhóm amine khác nên có thêm tính base. Dựa vào pKa có thể chia nhóm quinolone thành hai loại: Acidic quinolone (AQ) và Piperazinyl quinolone (PQ) - Acidic quinolone (AQ): chỉ có một giá trị pKa thuộc khoảng 6.0 đến 6.9. Trong nước chúng tồn tại ở dạng trung hòa hoặc dạng anion. Thường AQ gồm những quinolone thuộc thế hệ thứ nhất.

H1.2 Cân bằng acid base của nhóm Acidic quinolone - Piperazinyl quinolone (PQ): có hai giá trị pKa, pKa1 khoảng 5.5 – 6.6 và pKa2 khoảng 7.2 - 8.9. Trong nước chúng có thể tồn tại ở ba dạng khác nhau: dạng cation, dạng trung hòa và dạng anion; một số PQ là Danofloxacin, Difloxacin, Norfloxacin, Ofloxacin, Benofloxacin, Marbofloxacin, Pipemidic acid

H1.3. Cân bằng acid base của nhóm Piperazinyl quinolone 1.1.3. Ciprofloxacin: Ciprofloxacin là kháng sinh thuộc nhóm fluoroquinolone, loại PQ, có thể chống vi khuẩn gram dương và gram âm.

NGUYỄN THỊ THANH NGA WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Trang 4


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học

Tên gọi: Công thức hóa học: C17H18FN3O3 Trọng lượng phân tử: 331.35 g/mol Nhiệt độ nóng chảy: 318-320oC

H1.4. Công thức cấu tạo của Ciprofloxacin Tính chất: là bột kết tinh màu vàng nhạt, tan một phần trong nước, tan rất ít trong ethanol, methylene chloride. Tan tốt trong dung dịch acid acetic loãng, có hai giá trị pKa là 6.0 và 8.8 1.1.4. Enrofloxacin: Enrofloxacin là kháng sinh thuộc nhóm fluoroquinolone, loại PQ, có thể chống vi khuẩn gram dương và gram âm. Tên gọi: Công thức hóa học: C19H22FN3O3 Trọng lượng phân tử: 359.4 g/mol Nhiệt độ nóng chảy: 219-221oC

H1.5. Công thức cấu tạo của Enrofloxacin NGUYỄN THỊ THANH NGA WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Trang 5


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học

Tính chất: là tinh thể màu vàng nhạt, tan nhẹ một phần trong nước ở pH = 7, có hai giá trị pKa: khoảng 5 và 8-9 1.1.5. Nguồn gốc của Ciprofloxacin và Enrofloxacin trong thực phẩm: Ciprofloxacin và Enrofloxacin được đưa vào thịt gà, cá…dưới dạng nguyên liệu thức ăn chăn nuôi, hoặc do người chăn nuôi trộn vào thức ăn gia súc, gia cầm, hoặc cho vào môi trường sống của các động vật thủy sản. Khi động vật ăn, hoặc sống trong môi trường đấy hoặc tiêm để chữa bệnh thì kháng sinh sẽ xâm nhập vào cơ thể. 1.1.6. Ứng dụng và ảnh hưởng của Ciprofloxacin và Enrofloxacin Ciprofloxacin và Enrofloxacin được dùng làm kháng sinh cho người và động vật. Hai loại kháng sinh này được con người sử dụng khi mắc các chứng bệnh về đường hô hấp, nhiễm trùng huyết xương khớp, viêm nhiễm cơ quan sinh dục… Nhóm fluoroquinolone nói chung (Ciprofloxacin, Enrofloxacin nói riêng) là nhóm kháng sinh có độc tính cao, chỉ sử dụng với liều nhất định, được quy định rất chặt chẽ và đều thuộc nhóm kháng sinh hạn chế sử dụng đối với trẻ em vì ảnh hưởng đến quá trình tăng trưởng. Nhóm fluoroquinolone nếu dùng liều cao và kéo dài sẽ làm ảnh hưởng trên sụn đầu xương và quá trình tăng trưởng của bé chậm lại, bị lùn.(theo bác sĩ Đào Thị Yến PhiTrung tâm đào tạo –bồi dưỡng cán bộ y tế Tp. HCM) Trường hợp tồn dư 5ppb fluoroquinolone, nếu một người ăn trung bình 150-200g thịt/ngày thì lượng fluoroquinolone đưa vào cơ thể khoảng 2µg/ngày. Với lượng này sẽ không gây độc tính ngay, nhưng nếu tích lũy lâu dài hoặc ăn quá nhiều sẽ bị tác hại. Ngoài ra, việc sử dụng tràn lan cho vật nuôi các loại kháng sinh trong danh mục thuốc dùng cho người hoàn toàn có khả năng dẫn tới kháng thuốc ở vi khuẩn. Như vậy sẽ ảnh hưởng đến khả năng điều trị các bệnh lý nhiễm trùng trong cộng đồng loài người. 1.1.7. Giới hạn cho phép của dư lượng thuốc kháng sinh [1]: Ở Việt Nam, dư lượng tối đa của ciprofloxacin và enrofloxacin là 100ppb (quyết định 07/2005/QĐ-BTS ngày 24/2/2005 của Bộ Trưởng Bộ thủy sản). Tổ chức EU có quy định MRLs cho quinolone trong các mô động vật và sữa. Tuy nhiên lại cấm sử dụng trong gà đẻ vì dư lượng kháng sinh có thể chuyển vào trong trứng. Mỹ và các nước Bắc Mỹ: dư lượng tối đa là 0 NGUYỄN THỊ THANH NGA WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Trang 6


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học

H1.6. Danh mục hóa chất kháng sinh bị hạn chế sử dụng theo quyết định 07/2005/QĐ-BTS

1.2. Các phương pháp xác định Dựa vào cấu trúc và tính chất của Ciprofloxacin và Enrofloxacin, có nhiều phương pháp xác định hàm lượng trong nền mẫu thực phẩm như phương pháp so màu, sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC với các đầu dò khác nhau như: đầu dò huỳnh quang, đầu dò photodiode array, đầu dò UV… 1.2.1. Phương pháp trắc quang [9] Nguyên tắc: Dùng một số ion kim loại như Fe(III), Cu(II), Cd(II), Mn(II)…để tạo phức với nhóm quionlone. Đo cường độ bước sóng của phức tạo thành bằng máy trắc quang. Lập đồ thị biểu diễn cường độ hấp thu của chất tại bước sóng đó theo những nồng độ khác nhau.

H1.7. Phức tạo thành giữa Fe(III) với Ciprofloxacin (λmax = 430nm). Ngoài kim loại có thể dùng Chloranillic acid, tetracyanoethylene để tạo hình thành phức chất chuyển điện tích. Phức của Chloranillic acid có bước sóng λmax = 520nm. Phức của tetracyanoethylene hình thành với Ciprofloxacin có λmax = 335nm, với NGUYỄN THỊ THANH NGA WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Trang 7


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học

Enrofloxacin là λmax = 290 nm. Quy trình này được ứng dụng trong việc xác định thuốc với độ chính xác 99.91% đến 100.40% tùy theo từng chất. Ưu điểm: Phương pháp này sử dụng thiết bị đơn giản, dễ vận hành, chi phí thấp nên được dùng để kiểm tra độ tinh khiết của chất hữu cơ. Nhược điểm: Độ chọn lọc không cao, độ nhạy kém, phân tích các chất ở nồng độ cao 1.2.2. Phương pháp HPLC – đầu dò UV và DAD [ 10,11,12,13,14, 15 ] Nguyên tắc: Do cấu trúc của Ciprofloxacin và Enrofloxacin có khả năng hấp thu bước sóng tử ngoại nên có thể dùng phương pháp HPLC - đầu dò UV ở bước sóng 275nm. Đường chuẩn: 10Æ 1000 ng/g LOD: 10 ng/g cho cả hai chất. 1.2.3. Phương pháp HPLC – đầu dò huỳnh quang[ 8,15,16, 17, 18,19,20,21,22,23,24,25,26,27] Nguyên tắc: mẫu sẽ được kích thích với nguồn sáng có bước sóng là 276nm, sau đó sẽ phát xạ ra bước sóng 442nm; đo cường độ chất ở bước sóng này theo nồng độ, từ đó tính nồng độ của mẫu. Đường chuẩn: Ciprofloxacin, Enrofloxacin: 1 - 500 ng/g Giới hạn phát hiện: Ciprofloxacin: 0.56ng/g; Enofloxacin: 0.12 ng/g Bước sóng: λ kích thích: 276nm - 295nm; λ phát xạ: 442nm - 500nm; Ưu điểm: Phương pháp này có độ nhạy và độ chọn lọc cao, phân tích được các chất có nồng độ bé. Do vậy, phương pháp này được nghiên cứu rất nhiều và được lựa chọn làm phương pháp chính trong tiêu chuẩn của Châu Âu 1.2.4. Phương pháp HPLC – đầu dò MS [1,2,10,13,29] Nguyên tắc: Dựa trên ái lực của các cấu tử với pha tĩnh (thường là chất rắn hoặc chất lỏng) và pha động mà mỗi cấu tử sẽ được rửa giải ra khỏi cột theo các thứ tự khác nhau. Cấu tử ra khỏi cột sẽ được đưa vào đầu do MS và ở đây cấu tử ion hóa, phân mảnh, được phát hiện dựa vào cường độ tỉ lệ m/z. Trên cở sở đó, đầu dò MS cho phép nhận danh và định lượng một cách rõ ràng về một hợp chất cụ thể. Với đầu dò MS nhóm fluoroquinolones có khuynh hướng tạo thành mảnh mẹ và những mảnh con: [MH-H2O]+; [MH-CO2]+; [MH-H2O-NR]+; [MH-CO2-NR]+ NGUYỄN THỊ THANH NGA WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Trang 8


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học

Kí hiệu

Ý nghĩa

[MH-H2O]+

M + 1(H) – 18(H2O)

[MH-CO2]+

M + 1(H) – 44(CO2)

[MH-H2O-NR]+

M + 1(H) – 18(H2O) – M(NR)

[MH-CO2-NR]+

M + 1(H) – 44(CO2) – M(NR)

Phương pháp này có độ nhạy và độ chọn lọc rất cao. Giới hạn phát hiện: Ciprofloxacin: 0.1ng/g; Enrofloxacin: 0.2ng/g; Đường tuyến tính:Ciprofloxacin: 3-30ng/g; Enprofloxacin: 3-30ng/g; Năng lượng đập mảnh của : Ciprofloxacin: 18 eV; Enprofloxacin: 20eV; Æ Phương pháp này rất phù hợp cho việc phân tích dư lượng chất kháng sinh trong thực phẩm. 1.2.5 Điều kiện xử lí mẫu và làm sạch mẫu [ 8,14,19,30,31]: Theo các tài liệu tham khảo, ciprofloxacin và enrofloxacin được nghiên cứu trên nhiều loại mẫu trứng, thịt heo, gan heo, nước bề mặt ……Tùy theo từng loại mẫu sẽ có cách xử lí mẫu cụ thể. Xu hướng xử lí mẫu chính là hoạt chất được chiết với các dung môi hữu cơ như ethanol, acetonitril, trichloroacetic acid, dichloromethane hoặc hỗn hợp acetic acid, phosphoric acid, dung dịch NH3 (lưu ý cần thận trọng lựa chọn dung môi chiết khi phân tích với đầu dò MS). Sau đó chất phân tích sẽ được tách trên các cột SPE. Các loại cột SPE thường dùng là cột C18, cột trao đổi cation SCX, cột trao đổi anion SAX.

H1.8.Công thức cột SCX NGUYỄN THỊ THANH NGA WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Trang 9


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học

Hiện nay có xu hướng mới là sử dụng cột imprint polymer: Người ta sẽ tạo màng polymer có cấu trúc lỗ rỗng vừa đủ bằng kích thước của chất phân tích bằng cách trộn hỗn hợp 1.0nmol norfloxacin 8.0 mmol 2-hydroxyethyl methacrylate, ethylen glycol dimethaacrylate, α,α’-azobis isobutyronitrile trong dung môi MeOH-H2O, sau đó polymer hóa, rửa norfloxacin ra khỏi màng. (norfloxacin hiện diện với vai trò là chất tạm thời)[6,14] 1.3. Đôi nét về phương pháp sắc kí – sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC 1.3.1. Định nghĩa: Sắc kí là quá trình tách liên tục từng vi phân hỗn hợp các chất do sự phân bố không đồng đều của chúng giữa pha tĩnh và pha động khi cho pha động đi xuyên qua pha tĩnh. Sắc kí là một trong những phương pháp cho hiệu quả cao trong việc sử dụng để định tính và định lượng hỗn hợp nhiều cấu tử. 1.3.2. Một số đại lượng cơ bản của sắc kí: 1.3.2.1. Hệ số phân bố: Cân bằng của một cấu tử X bất kì trong hệ sắc kí được mô tả theo phương trình sau: Xpha tĩnh

Xpha động

Hằng số cân bằng K của cân bằng này được gọi là hệ số phân bố và được tính:

K=

Cs CM

Với

Cs: nồng độ cấu tử trong pha tĩnh; CM: nồng độ cấu tử trong pha động.

Hệ số K tùy thuộc vào bản chất của pha tĩnh, pha động và chất cần phân tích và nhiệt độ 1.3.2.2. Thời gian lưu: tR thời gian lưu của một cấu tử từ khi vào cột đến khí tách ra ngoài cột tO thời gian để một chất nào đó không có ái lực với pha tĩnh đi qua cột (thời gian lưu chết). t’R thời gian lưu hiệu chỉnh của một cấu tử t’R = tR -tO

NGUYỄN THỊ THANH NGA WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Trang 10


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học

C(nồng độ) tR

tO

t’R

t (thời gian)

H1.9: Thời gian lưu của cấu tử phân tích. 1.3.2.3. Hệ số chứa (the capacity factor):

Trong đó: k’X là hệ số chứa. KX là hệ số phân bố của cấu tử X tR, tO là các giá trị nhận được từ sắc kí đồ. Khi hệ số chứa của một cấu tử < < 1 Æ quá trình rửa giải xảy ra quá nhanh. Khi hệ số chứa nằm trong khoảng từ 20 đến 30 Æ thời gian rửa giải quá dài. Giá trị tối ưu trong quá trình tách các cấu tử trong khoảng 1-5. 1.3.2.4. Hệ số chọn lọc α: là đại lượng đặc trưng cho khả năng phân tách đối với các cấu tử khác nhau trong hỗn hợp chất khảo sát.

α càng lớn, khả năng tách càng cao. Để hai chất tách khỏi nhau, thường α > 1. Khi α = 1 hai chất không thể tách riêng được NGUYỄN THỊ THANH NGA WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Trang 11


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học

1.3.2.5. Độ phân giải của cột: Là đại lượng đặc trưng cho khả năng tách hai cấu tử ra khỏi nhau. Độ phân giải của cột được tính theo công thức:

A và B là hai cấu tử cần tách khỏi nhau. ∆tR là khoảng cách giữa hai peak . Rs ≤ 0.75 : hai peak không tách được. Rs = 1 : hai peak chồng lập nhau khoảng 4%. Rs ≥ 1.5: hai peak tách hoàn toàn ra khỏi nhau. 1.3.2.6. Hiệu năng của cột sắc kí: Là đại lượng đặc trưng cho khả năng tách mũi sắc kí của các cấu tử trên cùng một cột. Số đĩa lí thuyết N càng lớn, hiệu năng tách càng cao. Số đĩa lí thuyết có thể được tính theo công thức:

hay:

W1/2 bề rộng của peak ở giữa chiều cao 1.3.3. Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) Ưu điểm: HPLC có khả năng tách và định lượng đồng thời các chất có độ phân cực gần nhau. Vì vậy có thể tách được các đồng phân và đồng đẳng của nhau. Các đầu dò trong HPLC có độ nhạy cao (detector UV 10-9g; detector huỳnh quanh và điện hóa 10-12g)

NGUYỄN THỊ THANH NGA WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Trang 12


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học

cho phép xác định đến nồng độ cỡ ppb, ppt (đầu dò MS).Phương pháp này cho độ tách tốt (các chất nhồi trong cột có kích thước rất nhỏ), cột tách có thể sử dụng nhiều lần; khả năng thu hồi mẫu cao vì hầu hết các detector không phá hủy mẫu; lượng mẫu cho phép bơm vào cột lớn (lớn hơn so với phương pháp sắc kí khí).Tính đến nay, số lượng các chất được xác định trên HPLC là rất lớn. Nhược điểm:Thiết bị đắt tiền; Thời gian làm sạch và ổn định sau mỗi lần chạy lâu. 1.3.3.1 Sơ đồ cấu tạo chung của hệ thống sắc kí lỏng: Đối với một thiết bị HPLC thông thường phải có các bộ phận chính sau: hệ thống pha động, bơm cao áp, cột tách, detector, bộ ghi.

H1.10. Sơ đồ cấu tạo chung của một hệ sắc kí lỏng 1.3.3.2. Hệ thống pha động : Hệ thống pha động gồm các bình chứa các dung môi, thường có 4 kênh A,B,C, D và có thể có một chai để rửa kim tiêm trong hệ thống bơm tự động (đối với hệ thống sắc kí lỏng của Thermo, còn đối với hệ thống của Agilent thì không có). Pha động thường là các dung môi MeOH, ACN, isopropyanol… đối với cột pha đảo hoặc là dung môi dichlorometan, chloroform, hexane đối với cột pha thường. Pha động sẽ vận chuyển và tương tác với chất cần phân tích, do đó chúng giữ vai trò quan trọng trọng việc tách các chất phân tích. Yêu cầu của pha động: phải có độ tinh khiết cao, phải loại bỏ các khí hòa tan, để tránh hiện tượng tạo bọt khí làm tốc độ dòng không ổn định. Đối với hệ thống HPLCMS/MS chỉ được phép sử dụng pha động là các dung môi dễ bay hơi (tránh các dung môi không bay hơi như đệm phosphate, borate, citrate…)

NGUYỄN THỊ THANH NGA WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Trang 13


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học

1.3.3.3. Cột sắc kí: Cột sắc kí đóng vai trò quan trọng trong việc tách các chất cần phân tích, nguyên liệu chủ yếu làm cột là thép không rỉ, chiều dài cột từ 1-30cm, kích thước hạt cỡ 3-15µm Cột C18: là những hạt silica được phủ lên lớp hydrocarbon có mạch dài 18 C Yêu cầu cột: cột phải trơ, bền hóa học, bền nhiệt, chịu được acid, base ở khoảng pH rộng, ít bị ảnh hưởng của nhóm silanol Si-OH và chịu được áp suất cao. Cột có thể hư hỏng ngay cả khi sử dụng cột nhồi rất tốt từ các nhà sản xuất có tiếng như Water, Agilent, Alltech, HP, Phenomenex… Để kéo dài tuổi thọ của cột, chúng ta nên: + Tránh những thay đổi đột ngột điều kiện thí nghiệm(thay đổi tốc độ dòng, thay đổi pha động rất khác với pha động trước, thay đổi nhiệt độ, không làm rớt…) + Sử dụng cột bảo vệ. + Rửa cột kỹ sau khi sử dụng (nếu dùng đệm phải rửa thật kỹ, tránh hiện tượng lên men trong cột (ví dụ KH2PO4 – môi trường dinh dưỡng tốt). + Lưu giữ pha tĩnh trong acetonitrile, tránh lưu trong các alcohol như methanol (do có thể lên men yếm khí) + Luôn luôn đậy nắp kỹ để tránh dung môi bay hơi làm khô cột 1.3.3.4. Bơm cao áp: - Vai trò: tạo áp lực giúp pha động di chuyển trong hệ thống, tạo dòng ổn định ngay cả khi thành phần pha động thay đổi. - Áp lực bơm sử dụng tùy thuộc vào tốc độ dòng, độ nhớt pha động, kích thước pha tĩnh. - Có hai chế độ bơm: Chế độ đẳng dòng: thành phần pha động không thay đổi có nhược điểm là thời gian phân tích kéo dài, độ phân giải kém. Chế độ gradient dòng: thành phần pha động thay đổi có ưu điểm là thời gian phân tích ngắn, độ phân giải tốt. Tuy nhiên đòi hỏi bơm phải rất tốt.

NGUYỄN THỊ THANH NGA WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Trang 14


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học

1.3.3.5. Bộ phận tiêm mẫu: Phổ biến nhất là bộ tiêm mẫu gồm một van 6 cổng có gắn vòng chứa mẫu:

a)Tiêm mẫu vào

b) Phần dư bị thải ra ngoài H1.11. Cấu tạo của vòng loop

Yêu cầu đối với bộ tiêm mẫu: thể tích cho vào phải đều, độ lặp lại phải cao. 1.3.3.6. Đầu dò (detector): là bộ phận phát hiện của chất cần phân tích khi nó vừa ra khỏi cột. Dựa vào tích chất của các chất cần phân tích, có thể chia đầu dò ra làm nhiều loại như: + Detector UV, UV/VIS, diode array(DAD) + Đầu dò huỳnh quang(detector fluoresence) + Detetor điện hóa. + Dectector khối phổ MS. Nhiệm vụ của đầu dò khối phổ: có hai nhiệm vụ chính + Nhận danh hóa chất: Khi ghép với thiết bị sắc kí lỏng thì hóa chất được xác định bằng một peak trên sắc kí đồ ở thời gian lưu xác định đặc trưng cho hóa chất(giống các đầu dò khác). Đầu dò khối phổ còn nhận danh hóa chất thông qua khối phổ tương ứng của hóa chất hoặc khối phổ biểu diễn cường độ ion sinh ra từ một ion nhất định của hóa chất.

NGUYỄN THỊ THANH NGA WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Trang 15


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học

Theo chỉ thị của cộng đồng Châu Âu 2002/657/EC, bắt buộc phải dùng phương pháp phổ để phân tích khẳng định các chất bị cấm tuyệt đối, nghĩa là áp dụng theo quy tắc 4 điểm nhận danh (identification point kí hiệu là IP) và chỉ được quyền kết hợp tối đa ba kỹ thuật. Mối liên hệ giữa kỹ thuật khối phổ và điểm nhận danh đạt được: Kỹ thuật khối phổ

Điểm nhận danh đạt được cho mỗi ion Độ phân giải thấp

Khối phổ độ phân giải thấp LRMS

1.0

Ion mẹ đem phân mảnh (precursor)

1.0

Ion con(transion)

1.5 Độ phân giải cao

Khối phổ độ phân giải cao HRMS

2.0

Ion mẹ đem phân mảnh (precursor)

2.0

Ion con(transion)

2.5

Một số ví dụ về cách tính điểm nhận danh khi kết hợp các kỹ thuật: Kỹ thuật

Số ion

Các IP

GC-MS (CI hoặc EI)

N

N

GC-MS (CI và EI)

2(CI) và 2(EI)

4

GC-MS (CI hoặc EI) 2 dẫn xuất

2 dẫn xuất A và 2 dẫn xuất B

4

GC-MS2

1 ion mẹ, 2 ion con

4

GC-MS2

2 ion mẹ, 2 ion con (mỗi ion mẹ 1 ion con)

5

GC-MS và LC-MS

2 ion (GC)+2 ion(LC)

4

LC-MS

N

N

LC-MS2

1 ion mẹ, 2 ion con

4

LC-MS2

2 ion mẹ, 2 ion con (mỗi ion mẹ 1 ion con)

5

+ Định lượng nồng độ của hóa chất trong mẫu. NGUYỄN THỊ THANH NGA WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Trang 16


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học

1.3.4. Đầu dò khối phổ – Đầu dò MS ba tứ cực Các bộ phận chính của Detector MS là: bộ tạo ion(ionizer); bộ tách khối(mass analyser); bộ dò ion (detector). 1.3.4.1. Bộ tạo ion: Với hệ thống sắc kí lỏng MS - ba tứ cực của Agilent có 4 nguồn tạo ion đó là: ESI , APCI, APPI, MMI Trong nội dung của bài này, chúng tôi chỉ đề cập đến hai kỹ thuật APCI và ESI. a) Kỹ thuật APCI: Theo hình H1.12, phân tử phân tích và dung môi được đi qua một lò sấy, hóa hơi, các phân tử hơi được khí N2 phun ra và đi vào vùng phóng điện (corona discharge) –vùng này được tạo ra nhờ cây kim mang điện rất lớn (corona discharge needle). Hiện tượng ion hóa xảy ra.

H1.12. Sơ đồ kỹ thuật APCI của hãng Agilent. Cơ chế tạo ion dương: N2 + e- Æ N2+. + 2eH2O + e- Æ H2O .+ +2 eH2O + H2O .+ Æ H3O + + .OH (phản ứng ion phân tử). M + H3O + Æ MH+ + H2O (phản ứng ion phân tử).

NGUYỄN THỊ THANH NGA WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Trang 17


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học

Tạo ion âm: với những phân tử có H di động, trong vùng phóng điện, có sự ion hóa của phân tử bằng cách mất đi H+, phần còn lại là một anion .

OH + M -e- Æ (M-H)- + H2O

b) Kỹ thuật phun ion ESI: Các phân tử hóa chất và dung môi khi ra khỏi cột sắc kí được đưa vào một ống mao quản bằng kim loại cao thế (3-5kV) và sau đó được phun mịn bằng khí N2 thoát ra chung quanh ống mao quản. Dưới tác dụng của điện thế cao, có sự tạo thành những hạt nhuyễn mang điện tích thoát ra từ đầu ống mao quản. Các phân tử dung môi từ từ bốc hơi, các hạt mang điện tích có thể tích nhỏ dần và do sự đẩy nhau giữa các điện tích cùng dấu, sẽ bể dần ra thành các hạt nhỏ mang điện tích. Sau đó, các ion dương hoặc âm tạo thành được đưa vào bộ phận tách ion qua một của rất nhỏ. Dung môi và khí N2 bị bơm chân không hút ra ngoài. Xem hình H1.13 Điện thế dương ở đầu kim được quyết định tùy chất khảo sát, điện thế ở đầu kim dương tạo ion dương, điện thế ở đầu kim âm tạo ion âm . Thông thường, các chất acid tạo ion âm ở pH cao, các chất có tính base tạo ion dương ở pH thấp.

H1.13. Sơ đồ kỹ thuật phun ESI của máy Agilent Technologies 6410 Triple Quad LC/MS

NGUYỄN THỊ THANH NGA WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Trang 18


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học

Với hệ thống máy Agilent Technologies 6410 Triple Quad LC/MS: dòng khí nitrogen được gia nhiệt thổi vào mẫu, làm bay hơi dung môi (những hạt trung hòa ) ra khỏi chất cần phân tích Æ làm tăng độ nhạy. Ngoài ra ống mao quản bằng thủy tinh sẽ tốt hơn ống mao quản bằng thep không gỉ do làm tăng khả năng loại ion và tăng lượng ion đi vào. Đặc điểm của hai kỹ thuật này: ESI

APCI

- Ion tạo trong pha dung dịch.

- Ion tạo trong pha hơi.

- Thích hợp cho chất không bền nhiệt.

- Thích hợp cho chất bền nhiệt.

- Thích hợp cho chất khá phân cực.

- Thích hợp cho chất kém phân cực.

- Thích hợp cho chất có phẩn tử khối lớn

- Thích hợp cho chất có phẩn tử khối nhỏ.

*Hệ thống HPLC cần hai dòng khí mang N2 để dưa mẫu vào đầu dò: một nguồn khí cung cấp cho dòng sheath gas, một nguồn cung cấp cho dòng nebulizing.

. H1.14. Vị trí của các dòng khí trong đầu dò MS Bộ tạo khí Nitơ: Thiết bị LC/MS dùng khí nitơ như là khí purge gas trong giai đoạn tạo sương(nebulizer), do vậy đòi hỏi phải có nguồn cung cấp khí đặc biệt. Bộ tạo khí Parker Balston tạo khí bằng kỹ thuật màng, trong khi bộ tạo khí của Domnick Hunter sử dụng kỹ thuật hấp thụ cân bằng áp suất (PSA-presure swing adsorption). Cả hai loại trên đều có thể cung cấp khí Nitơ đạt yêu cầu của LC/MS. Trong đề tài này hệ thống HPLC sử dụng thiết bị sinh khí của Parker Balston, cho phép cung cấp nitơ với độ tinh khiết lớn hơn 99.5%, tốc độ dòng: 30l/phút; áp suất đầu ra 100psi.

NGUYỄN THỊ THANH NGA WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Trang 19


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học

Đặc điểm của bộ sinh khí Parker Balston: -

Dùng kỹ thuật màng.

-

Máy nén không khí gắn liền (built-in compressor).

-

Có thể điều khiển tốc độ dòng khi cần thiết.

1.3.4.2. Bộ tách khối: Hiện nay có ba kỹ thuật tách có thể thực hiện MS/MS: kỹ thuật bẫy ion và kỹ thuật ba tứ cực, kỹ thuật TOF. Trong đề tài này tôi sử dụng thiết bị có kỹ thuật ba tứ cực, gồm các bước sau: + Các ion được hình thành từ sự ion hóa phân tử hóa chất tạo nên khối phổ MS của hóa chất, tách ra và cô lập thành một loại ion nhất định. + Phân mảnh ion cô lập + Đưa những mảnh ion đó vào bộ dò detector để từ đó tạo ra khối phổ MS của các ion đã cô lập. Æ ta có khối phổ MS/MS. a) Bộ phân tích khối một tứ cực (single quadrupole): Cấu tạo của bộ phân tích khối một tứ cực được thể hiện trong hình H1.18, gồm 4 thanh được đặt song song với nhau, hai thanh đối diện được nối với điện và thế, bao gồm thành phần radiofrequency (RF) và direct-current (DC), Thành phần RF được đặt vào hai cặp lệch nhau 180o . Tại giá trị đặc biệt của các volt thế này, những ion có m/z bền sẽ đi xuyên qua các thanh tứ cực, tiến vào bộ dò ion. Những ion không bền sẽ lọt qua khoảng trống giữa các khe đi ra ngoài

H1.15. Cấu hình của một tứ cực. Đối với bộ phân tích khối một tứ cực của hãng Agilent : ion sau khi bị ion hóa bởi nguồn ion hóa (orthogonal ion source) sẽ đi qua bốn thanh octopole và vào detector.

NGUYỄN THỊ THANH NGA WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Trang 20


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học

H1.16. Sơ đồ cấu tạo của bộ phân tích khối một tứ cực. b) Bộ phân tích khối ba tứ cực (triple quadrupole – triple quad): gồm ba bộ quad nối trực tiếp với nhau hình H1.17, trong đó Q1 và Q3 có cấu trúc giống cấu hình của một tứ cực và chỉ đóng vai trò chọn lọc ion. Chỉ có ở Q2, các ion sẽ bị đập thành những ion nhỏ. Xem hình H1.18 Đường đi của ion cần phân tích được tóm tắt như sau: Sau khi các ion được hình thành và đi vào bộ tách khối, tại Q1: áp một thế cố định để chỉ những ion mẹ cần phân tích, mới đủ bền để đi thẳng tới Q2. Tại Q2: ion mẹ sẽ bị đập ra thành nhiều mảnh ion nhỏ.Tất cả các ion này được đưa vào Q3. Tại Q3: lại áp một thế xác định để chọn các ion con cần phân tích.

a) Dạng đơn giản

NGUYỄN THỊ THANH NGA WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Trang 21


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học

b) Ba tứ cực H1.17. Sơ đồ cấu tạo ba tứ cực của hãng Agilent

H1.18. Sự phân mảnh diễn ra ở Q2

Nhận xét: + Khối phổ kế một tứ cực không thực hiện được kỹ thuật MS/MS chính qui như trường hợp ba tứ cực hay bẫy ion. + Khối phổ kế ba tứ cực thực hiện được rất tốt kỹ thuật MS/MS. Với các tiến triển của công nghệ và khoa học hiện nay, khối phổ kế ba tứ cực rất nhạy, vượt cả bẫy ion.

NGUYỄN THỊ THANH NGA WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Trang 22


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học

1.3.4.3. Một số kỹ thuật scan trên thiết bị MS/MS ba tứ cực: Với cấu trúc của ba tứ cực cho phép ta ghi tín hiệu theo những chế độ khác nhau xem H1.19:

Full scan

SIM

Product ion

MRM

H1.19. Khối phổ của chất phân tích ứng với từng giai đoạn trong bộ ba tứ cực + Full scan: Khi thao tác ở chế độ full scan này, chất phân tích sau khi qua cột, được ion hóa sẽ qua Q1 để loại các ion tạp; rồi đi qua Q2,Q3 (lúc này Q2,Q3 không hoạt động) rồi đi vào ion detetor. Æ đầu dò sẽ nhận tất cả các mảnh ion để cho khối phổ toàn ion của tất cả các chất trong quá trình phân tích. Thiết bị sẽ quét trong một khoảng khối lượng nhất định (ví dụ như 50 đến 300). + SIM (selected ion monitoring): Với kỹ thuật này, các ion sẽ qua Q1 để chọn ion của chất cần phân tích(thường là ion mẹ), rồi đi qua Q2,Q3 (lúc này Q2,Q3 cũng chỉ cho một hoặc một vài ion đặc trưng đi qua) rồi đi vào ion detetor. Æ đầu dò sẽ nhận một số mảnh ion đặc trưng của chất cần phân tích: + Product ion: Với kỹ thuật này, các ion sẽ qua Q1 để chọn ion của chất cần phân tích(thường là ion mẹ), rồi đi qua Q2. Tại Q2 ion mẹ sẽ được đập thành nhiều ion con. Các ion này đi qua Q3 rồi tiến thẳng đến ion detetor. Æ đầu dò sẽ cung cấp toàn bộ mảnh phổ của ion mẹ ban đầu. Thông thường người ta sẽ áp thế đập phá tại ion mẹ sao cho ion mẹ vẫn còn lại khoảng 10%.

NGUYỄN THỊ THANH NGA WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Trang 23


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học

+ MRM( multiple reaction monitoring): Tương tự như product ion, ion mẹ cũng được chọn lọc tại Q1, đập tại Q2, nhưng đến Q3 các ion này sẽ được loại hết chỉ giữ lại một loại ion con đặc trưng sinh ra từ ion mẹ. Nhận xét: + Kỹ thuật lấy sắc kí đồ toàn ion: - Kỹ thuật này thường được dùng để phát hiện, nhận danh các thành phần hóa chất trong một hỗn hợp hay xác định cấu trúc của một hợp chất chưa biết. - Chỉ dùng sắc kí đồ toàn ion để định lượng khi chất phân tích có thành phần tương đối lớn. - Không dùng sắc kí đồ toàn ion để định lượng vết như dư lượng kháng sinh trong thực phẩm, thủy hải sản. + SIM (selected ion monitoring): Với kỹ thuật này, tất cả ion đều bị loại, chỉ còn ion muốn định lượng tồn tại và đi vào ion detector để ghi nhận, những ion khác kể cả ion tạp đều bị loại nên dùng để định lượng trong phân tích dư lượng thuốc kháng sinh trong thực phẩm, thủy hải sản được. + MRM( multiple reaction monitoring): chọn một ion để định lượng và loại bỏ hết các ion còn lại, như vậy đã loại bỏ được hai lần nhiễu nền: S giảm, N giảm nhiều hơn nên tỉ lệ S/N tăng. việc định lượng bằng kỹ thuật này có độ chọn lọc tốt cho hợp chất. 1.3.4.4. Bộ dò ion (detector): Sau khi ion đã được tách sẽ đi vào detector. Hai “dynodes” là “orthogonal “ sẽ định hướng dòng gồm ion và phân tử trung hòa. Sự định hướng này sẽ làm giảm các phân tử trung hòa và tập trung các ion với các thế cao khác nhau.Những dynode này sẽ chuyển các ion thành những electron trước khi chúng va chạm với bộ phận multiplier. “off-axis” được thiết kế sao cho các phân tử trung hòa xuyên qua mà không đâm vào detetor. Bộ phận multipliercó tuổi thọ dài vì chỉ có các electron mới được phép và chạm với nó. Các ion không bao giờ va chạm đến bề mặt của nó.

NGUYỄN THỊ THANH NGA WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Trang 24


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học

Chương 2: Phần thực nghiệm – Nội dung nghiên cứu 2.1. Thiết bị – hóa chất: 2.1.1 Thiết bị: - Máy: Agilent Technologies 6410 Triple Quad HPLC-MS/MS. - Cột XDB-C18 3.5µm; 4.6*50mm của Agilent. - Cột chiết SCX: Strata - X - C 33u Polymeric Strong Cation 500mg/3ml. 500mg là Khối lượng chất rắn nhồi trong cột - Máy cất nước hai lần; Máy lọc ion. - Tủ sấy Memmert; Máy đo pH - Bồn siêu âm. - Máy vortex; - Cân phân tích độ chính xác 0.01mg - Máy xay mẫu. - Hệ thống làm lạnh - Hệ thống đun cách thủy. - Hệ thống chiết SPE có bơm chân không. - Giấy lọc băng xanh; Đầu lọc 0.2µm 2.1.2. Dụng cụ thủy tinh: - Ống ly tâm - Phễu thủy tinh. - Bộ chiết soxhlet. - Bình định mức, pipet, bercher các loại: Merck. 2.1.3. Hóa chất: - Chuẩn ciprofloxacin, enprofloxacin 99.99% Merck - NH3: 25%, Merck.; MeOH: Merck.; dichloromethane 99%: merck - Các acid của Merck như: acid acetic 99.9%; acid formic: >99%; Trichloroacetic acid 99.9% - Khí N2; Nước cất hai lần có trao đổi ion.

NGUYỄN THỊ THANH NGA WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Trang 25


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học

2.1.3. Dung dịch: - Dung dịch chuẩn gốc Enrofloxacin 99µg/ml: Cân 9.90mg chuẩn gốc Enrofloxacin trên cân phân tích, hòa tan trong MeOH. Sau đó chuyển vào bình định mức 100ml và định mức tới vạch với MeOH, ta được dung dịch Enrofloxacin 99µg/ml. Bảo quản dung dịch này trong tủ lạnh tại 2-8oC tối thiểu được hai tháng. - Dung dịch chuẩn gốc Ciprofloxacin 105 µg/ml: Cân 10.50mg chuẩn gốc Ciprofloxacin trên cân phân tích, hòa tan trong MeOH. Sau đó chuyển vào bình định mức 100ml và định mức tới vạch với MeOH, ta được dung dịch Enrofloxacin 105 µg/ml. Bảo quản dung dịch này trong tủ lạnh tại 2-8oC. - Dung dịch chuẩn làm việc được pha loãng từ các dung dịch chuẩn gốc với nước trước khi phân tích. - Dung dịch formic acid 1M: Rút 7.6ml formic acid (>99%) cho vào bình định mức 200ml, định mức đến vạch bằng nước cất hai lần đã loại ion.(A) - Dung dịch ammoniac 1M: Rút 13.7ml dung dịch amoniac 25% cho vào bình định mức 200ml, định mức đến vạch bằng nước cất hai lần đã loại ion.(B) - Dung dịch đệm formic: Trộn (A) và (B) có sử dụng máy đo pH, ta được các dung dịch đệm pH = 2.0, 2.5; 3.0; 3.5; 4.0; 5.0 2.2. Tối ưu hóa các thông số máy móc 2.2.1. Hiệu chỉnh (Tuning): Trước khi phân tích mẫu thử chúng ta nên hiệu chỉnh các tham số đầu dò khối phổ để bảo đảm hệ thống được tối ưu và hoạt động ổn định bằng cách tuning hệ thống. Thời gian autotune thường kéo dài khoảng 18-25 phút Trong hệ thống máy sắc kí lỏng của hãng Agilent, chúng ta có thể hiệu chỉnh tự động với dung dịch chuẩn (mixed tune EI) do hãng cung cấp. Mọi thứ sẽ tự động vì quá trình này được điều khiển bởi calibrant delivery system (CDS), trong suốt thời gian tune. Kết quả hiệu chỉnh xem trong phụ lục. 2.2.2. Kiểm tra độ nhạy của thiết bị: Theo hướng dẫn của nhà sản xuất, hệ thống được kiểm tra độ nhạy bằng cách tiêm dịch Reserpine ở nồng độ 500fg. Tiêu chuẩn chấp nhận cho hệ thống là S/N > 20. Kết quả phân tích chuẩn Reserpine 500fg được biểu diễn trong hình: NGUYỄN THỊ THANH NGA WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Trang 26


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học

H2.1. Kết quả phân tích của reserpin 500fg Nhận xét: Phổ của Reserpin 500fg trong hình cho ta thấy S/N = 58.3 lớn hơn tiêu chuẩn chấp nhận. (xem phụ lục 1). Æ Điều kiện thiết bị HPLC-MS/MS đáp ứng được nhu cầu phân tích ở hàm lượng thấp. c) Các thông số cài đặt khi phân tích bằng LC-MS: Tốc độ dòng: 0.5 ml/phút. Nhiệt độ cột: 300C. Áp suất chân không cao (High Vac): 4.26 *10-5 Torr. Áp suất chân không (Rough Vac): 1.92 Torr. Nhiệt độ MS1 (MS1 Heater): 100oC. Nhiệt độ MS2 (MS2 Heater): 100oC Nhiệt độ dòng khí (Gas temp): 350oC

NGUYỄN THỊ THANH NGA WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Trang 27


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học

Tốc độ dòng khí (Gas flow): 8.0 l/min. Thế áp vào ống mao quản (Capillary): 3840V. Cường độ dòng điện của buồng(Chamber Current): 1.66µA Cường độ dòng điện tại ống mao quản (Capillary Current): 74nA. Tốc độ bơm turbo (Turbo speed): 100%. Áp suất dòng khí N2 cho hệ phun sương (Nebulizer): 40.0psi 2.3. Nội dung nghiên cứu: 2.3.1. Khảo sát các thông số cho LC/MS/MS 2.3.1.1.Lựa chọn nguồn ion hóa: Đối với thiết bị HPLC/MS/MS của hãng Agilent, có hai cách để ion hóa mẫu là ESI và APCI. Enrofloxacin và ciprofloxacin là hai kháng sinh có tính phân cực cao, khối lượng phân tử khá lớn. Do đó, nguồn ion hóa phù hợp cho hai chất này là ESI. Với nguồn ion hóa ESI, ciprofloxacin và enrofloxacin được cung cấp proton bởi acid trong pha động để tạo thành ion mẹ có mảnh phổ lần lượt là m/z = 332 và m/z = 360. Tiêm trực tiếp lần lượt từng chuẩn vào hệ thống (không qua cột sắc kí) để định danh xác định các mảnh phổ 2.3.1.2. Khảo sát năng lượng đập mảnh colision energy (CE) Đối với một chất phân tích, năng lượng đập mảnh đóng vai trò quan trọng trong việc tạo ra số lượng các ion con đủ lớn để định lượng chính xác nồng độ của chất phân tích. Để khảo sát năng lượng đập mảnh, chúng tôi tiến hành tiêm trực tiếp từng chuẩn ở nồng độ khoảng 0.250µg/ml để xác định vị trí của ciprofloxacin và enprofloxacin. Sau đó tăng dần thế CE từ 0 V lên đến khi ion mẹ còn dưới 10%. 2.3.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ acid formic: Enrofloxacin và ciprofloxacin là hai kháng sinh có tính lưỡng tính, có khả năng phân li nhận ion H+ để tạo ra dạng ion dương, cũng có thể cho ion H+ tạo ra dạng ion âm hoặc ở dạng trung hòa, nên chúng chịu ảnh hưởng lớn của nồng độ acid. Trong đề tài này, pha động được sử dụng có chứa formic acid để tạo ra ion mẹ mang điện tích dương cho nên việc khảo sát nồng độ formic acid là hết sức cần thiết. NGUYỄN THỊ THANH NGA WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Trang 28


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học

2.3.1.4. Khảo sát sự ảnh hưởng của tốc độ dòng - thành phần pha động: Ở đây tôi tiến hành khảo sát trên cột C18 của hãng Agilent (có cột bảo vệ). Một trong những thông số ảnh hưởng đến thời gian lưu là tốc độ dòng của pha động. Nếu tốc độ dòng quá cao, pha động đi qua cột nhanh chất phân tích chưa kịp tương tác với pha tĩnh, gây sự trùng lặp các peak sắc kí và sai lệch kết quả, peak có thể ra ngay đầu cột hoặc áp lực lớn hơn khả năng chịu đựng của cột, gây hỏng cột. Nếu tốc độ dòng quá chậm, chất phân tích ở trong cột lâu dẫn đến thời gian phân tích kéo dài, peak bị tù, lãng phí thời gian. Đối với đầu dò MS tốc độ dòng thường không cao vì nó gây ảnh hưởng đến quá trình ion hóa trong nguồn ESI, dung môi pha động không kịp bay hơi hết trước khi vào bộ phận phân tích khối phổ sẽ làm đầu dò mất ổn định gây nhiễu nền. Do vậy chúng tôi khảo sát tốc độ dòng ở giá trị 0.3 và 0.5 ml/phút. Yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến thời gian lưu của chất phân tích là pha động và thành phần pha động. Vì enrofloxacin và ciprofloxacin là những kháng sinh phân cực nên pha động được chọn là những dung môi phân cực như: nước, methanol, ACN. Ngoài ra pha động còn được thêm một lượng nhỏ formic acid nhằm mục đích cung cấp proton H+ cho quá trình proton hóa. Để khảo sát thành phần pha động, chúng tôi sử dụng hệ pha động gồm kênh AAcetonitril và kênh B- nước formic acid 0.1% với tỉ lệ các kênh A:B là 10:90; 15:85; 20:80. 2.3.1.5. Xác định LOD và LOQ của máy HPLC-MS/MS: Giới hạn phát hiện (LOD) của một thiết bị là hàm lượng nhỏ nhất của một chất phân tích có thể phát hiện bởi thiết bị này. Giới hạn định lượng (LOQ) của một thiết bị là hàm lượng nhỏ nhất của một chất phân tích có thể định lượng bởi thiết bị này. Cách thực hiện: Pha dung dịch chuẩn có nồng độ nhỏ khoảng 0.5 ng/ml. Tiêm dung dịch chuẩn này vào máy LC/MS/MS. Tìm ra dung dịch chuẩn có tín hiệu sao cho: 3< S/N < 10 LOD, LOQ của thiết bị được xác định theo công thức sau: NGUYỄN THỊ THANH NGA WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Trang 29


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học

LOQ = 3 * LOD Cmin: là nồng độ nhỏ nhất cho vào pha động LOD: giới hạn phát hiện của thiết bị LOQ: giới hạn định lượng của thiết bị. S: tín hiệu; N: nhiễu nền Tương tự , MLOD- MLOQ Xác định trên mẫu thực tế theo công thức sau:

hoặc

MLOQ = 3 * MLOD Trong đó: V (ml) là thể tích định mức cuối cùng; m (g) là khối lượng mẫu. Cmin: là nồng độ nhỏ nhất của chất chuẩn cho vào mẫu trắng. MLOD: giới hạn phát hiện của phương pháp. MLOQ: giới hạn định lượng của phương pháp. S: tín hiệu; N: nhiễu nền NGUYỄN THỊ THANH NGA WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Trang 30


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học

- Giới hạn phát hiện (MLOD) của một qui trình là hàm lượng nhỏ nhất của một chất phân tích có thể phát hiện bởi qui trình này. - Giới hạn định lượng (MLOQ) của một qui trình là hàm lượng nhỏ nhất của một chất phân tích có thể định lượng bởi qui trình này. Cách thực hiện: - Mẫu blank là mẫu không chứa ciprofloxacin và enrofloxacin, đã được kiểm tra bằng cách chạy trên thiết bị. - Thêm các chuẩn ciprofloxacin và enrofloxacin vào mẫu blank sao cho hàm lượng các chất này có trong mẫu là khá nhỏ(cỡ 100ppb). - Xử lí mẫu và thực hiện phân tích trên các thiết bị theo các điều kiện đã khảo sát - Tìm ra dung dịch mẫu có nồng độ chuẩn tối thiểu biết trước Cmin với tín hiệu sao cho: 3< S/N< 10. 2.3.1.6. Khảo sát khoảng tuyến tính và dựng đường chuẩn của enrofloxacin và ciprofloxacin: Pha dung dịch chuẩn trong khoảng từ 2 đến 500mg/ml, tiêm dung dịch chuẩn vào thiết bị theo thứ tự nồng độ từ thấp lên cao. 2.3.2. Khảo sát trên mẫu thực tế: Do dư lượng kháng sinh ciprofloxacin và enrofloxacin trong thực phẩm rất ít nên đòi hỏi cần có một quy trình xử lí mẫu hợp lí để tách các kháng sinh này. Một trong những phương pháp xử lí mẫu hiệu quả đối với sắc kí lỏng là phương pháp chiết pha rắn. Quá trình xứ lí mẫu chia làm hai giai đoạn: + giai đoạn chiết mẫu. + giai đoạn làm sạch mẫu với cột SPE. Quá trình chiết mẫu: Trong giai đoạn này, chất cần phân tích sẽ được chiết vào một dung môi hữu cơ ở pH phù hợp. Dung dịch thu được sẽ chứa chất cần phân tích vẫn còn các tạp chất khác; do vậy phải tiến hành bước tiếp theo.

NGUYỄN THỊ THANH NGA WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Trang 31


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học

Quá trình làm sạch mẫu: Cả hai kháng sinh này đều là những hóa chất có pHa1 khoảng 5.5-6.0 do đó để làm sạch chúng trên cột SPE - Cationit acid mạnh (cột được sử dụng là cột SCX), chúng tôi cần chuyển chúng về hết dạng cation bằng cách khảo sát pH nhỏ hơn giá trị pKa1 - Hoạt hóa cột: Hoạt hóa cột đóng vai trò quan trọng để đảm bảo rằng chất hấp phụ đã được thấm ướt để có thể tương tác tốt với chất phân tích. Cách thực hiện: Nối cột SCX vào bộ chiết SPE, gắn hệ thống hút chân không, cho 2ml MeOH; cho tiếp 3ml hỗn hợp dung dịch MeOH : H2O: acid formic theo tỉ lệ 98:1:1 (v/v) - Đưa dịch chiết lên cột: Cho toàn bộ dịch chiết lên cột đã được hoạt hóa (tốc độ dòng khoảng 5 giọt /phút). Tráng ống ly tâm bằng 2ml dịch chiết khảo sát. - Làm sạch cột: Cho lần lượt 5ml MeOH, 5ml H2O; 5ml MeOH, sau đó tiến hành rút khô cột. Lưu ý: Từ giai đoạn này trở về trước, không được làm cột khô, nứt cột - Rửa giải: Chuyển chất phân tích về dạng anion với dung dịch rửa giải bằng cách thêm V(ml) dung dịch NH4OH 10% trong MeOH - Chuẩn bị mẫu tiêm vào HPLC-MS/MS: Thu dịch sau rửa giải vào ống li tâm, cô cạn, hòa tan cặn còn lại với 2ml pha động. Lọc dịch thu được qua màng lọc 0.2µm, cho vào vial. Tiến hành xác định bằng HPLC. 2.3.2.1. Khảo sát các kỹ thuật chiết mẫu (chiết thô): Giai đoạn xử lí mẫu là một giai đoạn quan trọng của qui trình phân tích. Nếu xử lí mẫu không tốt, hiệu quả chiết không cao thì cho dù các bước tiếp theo có tốt cũng làm hiệu suất thu hồi của quá trình kém. Do vậy, cần tiến hành nghiên cứu, lựa chọn kỹ thuật chiết, cũng như dung môi phù hợp để có quy trình tối ưu: a) Chiết mẫu với kỹ thuật chiết soxhlet: Cân khoảng 10g mẫu thực phẩm (cá, gà…) đã được đồng nhất vào giấy lọc. Chiết soxhlet với 250ml MeOH (chứa formic acid 1%) trong 3giờ. Lấy dung dịch thu được đun cách thủy trong tủ hút (hoặc cô quay) để đuổi hết dung môi. Hòa cặn với 5ml đệm formic(pH=3.5). Lọc dung dịch thu được qua giấy lọc băng xanh (nếu có cặn). NGUYỄN THỊ THANH NGA WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Trang 32


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học

b) Chiết mẫu với kỹ thuật khuấy trộn với một số dung môi hữu cơ: Cân chính xác khoảng 10g mẫu trắng (không chứa ciprofloxacin và enrofloxacin) . Thêm vào mẫu 50µl dung dịch chuẩn gốc, trộn đều, để trong tủ lạnh 1 ngày ở nhiệt độ 5oC. Sau đó tiến hành chiết thô trên các dung môi hữu cơ như sau: DM1, DM11: dung dịch acid formic 1% trong MeOH. DM2, DM21: dung dịch acid formic 1% trong dichloromethane MD3, DM31: dung dịch acid trichloroacetic 1% trong MeOH Các mẫu DM1, DM2, DM3 được xử lí như sau: mẫu được để trong các ống li tâm 80ml, thêm khoảng 30ml dung môi chiết, đánh vortex 30 giây một lần, làm khoảng khoảng 30 lần, li tâm lấy dung dịch(làm ba lần), sấy khô dung dịch thu được, thêm 5ml dung dịch đệm formic (pH=3.5) và cho qua cột tách SPE, sau khi rửa giải, sấy khô mẫu ở 100oC, thêm 3ml pha động và tiêm vào LCMS Các mẫu DM11, DM21, DM31 được xử lí như sau: mẫu được để trong các bình erlene 250ml, thêm khoảng 30ml dung môi chiết, một cá từ (khoảng 5 phút lắc đều một lần) , chuyển dung dịch vào ống li tâm, lấy phần dung dịch (làm ba lần). Dung dịch thu được sấy khô, thêm 5ml dung dịch đệm formic (pH=3.5) và cho qua cột tách SPE, sau khi rửa giải, sấy khô mẫu ở 100oC, thêm 3ml pha động và tiêm vào LC-MS 2.3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của pH và khả năng chiết qua cột SCX: 2.3.2.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của pH đối với quá trình chiết mẫu Mẫu sau khi chiết thô sẽ được chiết tinh với cột SCX nên cần phải chuyển hết enrofloxacin và ciprofloxacin về dạng cation. Mà enrofloxacin và ciprofloxacin là hai kháng sinh có tính lưỡng tính, có khả năng nhận ion H+ để tạo ra dạng ion dương, cũng có thể cho ion H+ tạo ra dạng ion âm hoặc ở dạng trung hòa. Do vậy việc khảo sát ảnh hưởng của pH lên hai kháng sinh này là cần thiết. Cách tiến hành: Mẫu trắng có thêm chuẩn sau khi đã được chiết tách thô, đun cách thủy loại bỏ dung môi chiết, sẽ được pha loãng với MeOH trong bình định mức 25ml và định mức đến vạch. Rút 2ml dung dịch cho vào ống nhiệm, đun cách thủy đến cạn. Hòa tan cặn vói các dung dịch đệm formic ở pH = 2.0; 2.5; 3.0; 3.5; 4.0; 5.0

NGUYỄN THỊ THANH NGA WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Trang 33


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học

2.3.2.1.2 Kiểm tra khả năng chiết qua cột SCX: Sai số của một qui trình xử lí mẫu có thể nằm trong giai đoạn cho mẫu qua cột SPE. Do vậy cần kiểm tra hiệu suất thu hồi chất cần phân tích trên cột SCX khi không có ảnh hưởng của nền mẫu. Tiến hành kiểm tra như sau: Rút 2ml chất chuẩn ở nồng độ khoảng 20ng/ml, cô khô, hòa tan với dung dịch đệm formic (pH=3.0; 3.5; 4.0); sau đó qua cột và được rửa giải với dung dịch NH4OH trong MeOH ở nồng độ 10%. 2.3.2.1.3 Khảo sát nồng độ dung dịch rửa giải qua cột SCX: Mẫu được chiết trên cột SCX, đây là cột trao đổi cation mạnh. Do vậy phải có dung dịch rửa giải đủ mạnh (kiềm mạnh) để chuyển chất cần phân tích sang dạng anion để không tương tác với pha tĩnh của cột SCX, theo dung dịch rửa giải ra ngoài. Nồng độ dung dịch rửa giải được tiến hành khảo sát như sau: Rút 2ml chất chuẩn ở nồng độ khoảng 20ng/ml, cô khô, hòa tan với dung dịch đệm formic (pH=3.5); sau đó qua cột và được rửa giải với dung dịch NH4OH trong MeOH ở nồng độ 1%; 5%; 10%. 2.3.2.1.4. Khảo sát thể tích dung dịch rửa giải: Khi tiến hành chiết mẫu trên cột SCX, giai đoạn rửa giải đóng vai trò quan trọng đặc biệt là thể tích dung dịch rửa giải: nếu thể tích rửa giải quá ít, chất phân tích bị giữ lại trên cột SCX hiệu suất quá trình sẽ thấp. Do vậy cần phải khảo sát thể tích dung dịch rửa giải. Cách tiến hành: Mẫu sau khi chiết thô sẽ được định mức với dung dịch đệm formic; sau đó qua cột và được rửa giải với dung dịch NH4OH 10% trong MeOH. 2.3.2.3 Xác định hiệu suất thu hồi và độ chụm của phương pháp trên mẫu thực tế như cá diêu hồng, cá basa, thịt gà: - Mẫu blank là mẫu không chứa ciprofloxacin và enrofloxacin, đã được kiểm tra bằng cách chạy trên thiết bị. - Mẫu thêm chuẩn: Cân m(mg) mẫu thực phẩm như cá, gà…), thêm khoảng 100µg/ml chất chuẩn; trộn đều bằng máy xay sinh tố. Sau đó để trong tủ lạnh ở nhiệt độ khoảng 5oC, thời gian: 24h.

NGUYỄN THỊ THANH NGA WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Trang 34


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học

- Xử lí mẫu và thực hiện phân tích trên các thiết bị theo các điều kiện đã khảo sát Khi đó hiệu xuất thu hồi được xác định theo công thức:

H: Hiệu suất thu hồi. C mẫu: Nồng độ chất phân tích có trên mẫu thực tế. Ctn: Nồng độ chất phân tích tìm được. Clt: Nồng độ chất phân tích thêm mẫu ban đầu. Trong đề tài này, mẫu được sử dụng là mẫu blank không chứa chất phân tích nên Cmẫu = 0 Khoảng tin cậy SD được tính theo công thức sau:

Sx SD = tP=0.95,f * √n SD: khoảng tin cậy của trị trung bình, ước lượng theo chuẩn Student (P = 0.95) Sx: Độ lệch chuẩn Độ chụm RSD(%) được tính theo công thức sau:

SD RSD(%) =

* 100 Mtb

RSD: Độ chụm SD: khoảng tin cậy của trị trung bình, ước lượng theo chuẩn Student ( P = 0.95 Mtb: hàm lượng trung bình.

NGUYỄN THỊ THANH NGA WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Trang 35


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học

Chương 3: Kết quả và thảo luận 3.1. Kết quả khảo sát các thông số cho LC-MS: 3.1.1. Lựa chọn nguồn ion hóa:

H3.1. Kết quả sắc kí đồ của ciprofloxacin và enrofloxacin dạng full. Dựa trên sắc kí đồ thu được, ta thấy ciprofloxacin cho một mảnh ion là 332 và enrofloxacin là 360. Mảnh này được hình thành do ion phân tử kết hợp với proton H+ (M+1) 3.1.2. Khảo sát năng lượng đập mảnh colision energy (CE) a) Đối với ciprofloxacin (M= 331.35): Bảng 3.1: Phần trăm ion mẹ (ciprofloxacin) còn lại theo sự tăng dần năng lượng đập mảnh CE(V)

0

10

11

12

13

14

% ion mẹ còn lại

100

53

46

40

32

25

CE(V)

15

16

17

18

19

20

% ion mẹ còn lại

15

9

10

4

0

0

NGUYỄN THỊ THANH NGA WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Trang 36


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học

H3.2. Kết quả sắc kí đồ của ciprofloxacin và enrofloxacin tại CE=18. Từ kết quả thực nghiệm cho thấy: Năng lượng đập mảnh colision energy càng lớn ion mẹ càng bị đập ra thành nhiều mảnh nhỏ hay % ion mẹ(332) còn lại càng ít. Các mảnh ion con là 314; 288; 245. Trong đó, mảnh 314 được hình thành do ion mẹ mất một nước (H2O); mảnh 288 do ion mẹ mất một gốc acid (-CO2); mảnh 245 do mảnh 288 bị mất ethylamine. Các mảnh ion con được hình thành có thể giải thích dựa theo sơ đồ H3.3. Năng lượng đập mảnh colision energy được lựa chọn sao cho ion con là lớn nhất trong khi ion m��� vẫn còn (thông thường < 10%). Mảnh 314 mặc dù có cường độ cao nhưng không đặc trưng cho ciprofloxacin khi phân tích LC/MS/MS nên không chọn để phân tích. Æ chọn CE cipro là 18V và ion 332/ 288 để phân tích định lượng LC/MS/MS

NGUYỄN THỊ THANH NGA WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Trang 37


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học

(m/z = 332) - CO2

- H2O

(m/z = 288)

(m/z = 314)

(m/z = 245) H3.3. Sự phân mảnh của ciprofloxacin Lưu ý: Trên sắc kí đồ của ciprofloxacin có mảnh 314, mảnh này được hình thành do phân tử ciprofloxacin mất một nước.

NGUYỄN THỊ THANH NGA WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Trang 38


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học

b) Đối với enrofloxacin : Bảng 3.2: Phần trăm ion mẹ (enrofloxacin) còn lại theo sự tăng dần năng lượng đập mảnh CE(V)

0

10

11

12

13

14

% ion mẹ

100

62

50

49

38

28

CE(V)

15

16

17

18

20

21

% ion mẹ

23

14

12

11

8 2 (xem sắc kí đồ trong phụ lục 2)

H3.4. Kết quả sắc kí đồ của ciprofloxacin và enrofloxacin tại CE=20. Ion mẹ: 360 Các mảnh ion con của enrofloxacin là: 342; 316; 245. Tương tự, chọn CE enpro là 20V và ion 360/316 để định lượng. Các mảnh ion con được hình thành có thể giải thích dựa theo sơ đồ sau:

NGUYỄN THỊ THANH NGA WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Trang 39


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học

(m/z = 360) - CO2

(m/z = 316)

(m/z = 342)

có thể loại nhóm C2H4Æ m/z = 288

- C2H5

(m/z = 245) H3.5. Sự phân mảnh của enrofloxacin

NGUYỄN THỊ THANH NGA WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Trang 40


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học

3.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ acid formic: Khảo sát nồng độ acid trong khoảng từ 0.1 đến 10%(của dung dịch formic acid 5% trong nước). Kết quả H3.6 cho thấy nồng độ acid gần như không ảnh hưởng nhiều đến ciprofloxacin và enrofloxacin. Tuy nhiên, nồng độ acid lớn hơn 0.1%, peak thu được thấp, thời gian bị kéo dài. Nồng độ acid thấp, có sự tương tác giữa nhóm amin của chất phân tích với gốc C18 làm chân peak bị kéo đuôi.

acid formic 5* 10-5 (v/v)

acid formic 5* 10-4 (v/v)

acid formic 1* 10-3 (v/v)

acid formic 2* 10-3 (v/v)

acid formic 2.5* 10-3 (v/v)

acid formic 4* 10-3 (v/v)

acid formic 4.5* 10-3 (v/v)

acid formic 5* 10-4 (v/v)

H3.6. Kết quả sắc kí đồ của ciprofloxacin và enrofloxacin theo % acid formic. (ciprofloxacin: 100ng/ml; enrofloxacin: 100ng/ml; tốc độ dòng: 0.5ml/phút; pha động: ACN: acid formic: 15: 85; MS: lấy phổ sắc kí đồ toàn ion ciprofloxacin: 332/288; enrofloxacin: 360/316)

NGUYỄN THỊ THANH NGA WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Trang 41


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học

Æ Chọn nồng độ acid formic là 0.1% để phân tích hỗn hợp ciprofloxacin và enprofloxacin. 3.1.4. Khảo sát sự ảnh hưởng của tốc độ dòng - thành phần pha động: - Ảnh hưởng của tốc độ dòng: Ở tốc độ dòng 0.3ml/phút phải mất khoảng 10 phút hai chất mới ra hết khỏi cột, trong khi ở tốc độ dòng 0.5 ml/phút chỉ cần 5 phút đã có thể tách hoàn toàn hai chất này ra khỏi nhau và peak thu được cũng hẹp hơn. Do tốc độ dòng càng lớn, lượng pha động qua cột nhiều, làm ciprofloxacin và enprofloxacin phân bố trong pha động nhiều hơn trong pha tĩnh, dẫn đến thời gian phân tích ngắn hơn.

H3.7. Ảnh hưởng của tốc độ dòng: a) tốc độ 0.3ml/phút; b) tốc độ 0.5ml/phút (ciprofloxacin: 100ng/ml; enrofloxacin: 100ng/ml; pha động: ACN: acid formic: 15: 85; MS: lấy phổ sắc kí đồ toàn ion ciprofloxacin: 332/288; enrofloxacin: 360/316)

Æ Để tiết kiệm thời gian phân tích đồng thời vẫn đảm bảo tách được hai chất tốt nên chọn tốc độ dòng là 0.5ml/phút Kết quả thực nghiệm cũng chỉ ra rằng ciprofloxacin ra trước enrofloxacin. Điều này được giải thích như sau: Khi tiến hành phân tích trên cột C18, đây là cột không phân NGUYỄN THỊ THANH NGA WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Trang 42


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học

cực nên chất phân tích càng ít phân cực càng bị giữ trên cột lâu, và ra càng trễ. Ciprofloxacin và enrofloxacin có công thức cấu tạo giống nhau, tuy nhiên ciprofloxacin ít hơn enrofloxacin một nhóm C2H5. nên nó phân cực hơn enrofloxacin vì vậy ciprofloxacin. sẽ ra trước enrofloxacin. - Ảnh hưởng của thành phần pha động:

H3.8. Sắc kí đồ thể hiện ảnh hưởng của tỉ lệ của tỉ lệ pha động - Tỉ lệ ACN: formic acid 0.1%, a):10:90(v/v); b) :15:85(v/v); c):20:80(v/v) (ciprofloxacin: 100ng/ml; enrofloxacin: 100ng/ml; tốc độ dòng: 0.5ml/phút; MS: lấy phổ sắc kí đồ toàn ion ciprofloxacin: 332/288; enrofloxacin: 360/316)

Dựa trên sắc kí đồ H3.8, kết quả thu được thể hiện ở bảng 3.3: Bảng 3.3: Kết quả thời gian lưu thay đổi theo thành phần pha động Thời gian của ciprofloxacin

Thời gian của enrofloxacin

ACN

Formic 0.1% trong nước

12.7 phút

21.0 phút

10

90

3.8 phút

5.5 phút

15

85

1.89 phút

2.36 phút

20

80

NGUYỄN THỊ THANH NGA WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Trang 43


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học

Tỉ lệ dung môi hữu cơ (ACN)càng cao thì các chất được rửa giải càng nhanh vì lượng pha động qua cột càng nhiều, ciprofloxacin và enrofloxacin trong pha động nhiều hơn trong pha tĩnh nên ra càng sớm. Với tỉ lệ ACN: formic acid 0.1, :10:90(v/v) thời gian ciprofloxacin và enprofloxacin ra khỏi cột quá lâu nên tốn thời gian khi phân tích nhiều mẫu. Với tỉ lệ pha động ACN: formic acid 0.1%, : 20:80(v/v) khả năng tách peak kém và các peak ra ngay gần đầu cột, điều này không phù hợp khi phân tích trên nền mẫu phức tạp (tạp chất trong mẫu có thể ra ngay đầu cột sẽ ảnh hưởng đến chất phân tích. Do vậy tỉ lệ ACN: formic acid 0.1% , :15:85 là phù hợp và được chọn để phân tích ciprofloxacin và enprofloxacin. 3.1.5. Kết quả xác định LOD và LOQ của máy HPLC-MS/MS: Kết quả xác định được như sau: (xem phụ lục 2) Ciprofloxacin: LOD= 0.426ng/ml; LOQ= 1.278ng/ml Enrofloxacin: LOD= 0.391ng/ml; LOQ= 1.173ng/ml 3.1.6. Khảo sát khoảng tuyến tính và dựng đường chuẩn của ciprofloxacin và enrofloxacin: Pha dung dịch chuẩn theo bảng , tiêm dung dịch chuẩn vào thiết bị. Từ dữ liệu của sắc kí đồ thu được chúng ta có kết quả như bảng 3.4 và bảng 3.5 Bảng 3.4: Dữ liệu đường chuẩn của ciprofloxacin Nồng độ (ng/ml) Diện tích trung bình

2.1

5.25

10.5

21

52.5

105

315

630

260

993

2640

6329

15479

26561

143242

275518

Bảng 3.5: Dữ liệu đường chuẩn của enrofloxacin: Nồng độ (ng/ml) Diện tích trung bình

1.98

4.95

9.9

19.8

49.5

99

297

594

433

1987

4932

11898

31833

65005

249844

480332

NGUYỄN THỊ THANH NGA WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Trang 44


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học

Đường chuẩn 600000 y = 774.86x - 4765.8

500000

2

R = 0.9986

Diện tích

400000 Ciprofloxacin

300000

Enrofloxacin Linear (Enrofloxacin)

200000

Linear (Ciprofloxacin)

y = 446.61x - 4839.3

100000

2

R = 0.995

0 0

100

200

300

400

500

600

700

-100000

C(ng/ml)

H3.9. Đồ thị biểu diễn đường chuẩn của ciprofloxacin và enrofloxacin. Kết quả phương trình đường chuẩn như sau: * Ciprofloxacin trong khoảng nồng độ từ 2 – 630 ng/ml, với phương trình hồi quy là: y = 446.61x – 4839.3 và R2=0.9950. * Enrofloxacin trong khoảng nồng độ từ 2 – 594 ng/ml, với phương trình hồi quy là: y = 774.86x – 4765.8 với R2=0.9986. (trong đó y là diện tích chuẩn, x là nồng độ chuẩn) Khoảng nồng độ khá rộng thuận tiện để phân tích ciprofloxacin và enrofloxacin bằng HPLC/MS/MS

3.2. Kết quả khảo sát trên mẫu thực tế: 3.2.1. Khảo sát các kỹ thuật chiết mẫu thô: a) Chiết mẫu với kỹ thuật chiết sohxlet: Kết quả thu được khi tiến hành chiết mẫu với kỹ thuật chiết sohxlet, làm sạch trên cột SCX, hiệu suất thu hồi sohxlet tại pH=3.5 là 64.09 % đối với ciprofloxacin và 74.40% đối với enrofloxacin. NGUYỄN THỊ THANH NGA WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Trang 45


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học

Bảng 3.6: Kết quả chiết mẫu với kỹ thuật sohxlet pH= 3.5 Hàm lượng thêm vào (ng/g) Hàm lượng tìm thấy(ng/g) Hiệu suất %

Ciprofloxacin 50.50 32.36 64.09 ± 0.81

Enrofloxacin

49.50 36.83 74.4±1.6

b) Chiết mẫu với kỹ thuật khuấy trộn với một số dung môi hữu cơ: Kết quả được thu được như sau: Bảng 3.7: Kết quả chiết mẫu với kỹ thuật khuấy trộn sử dụng thiết bị đánh vortex trên ba hệ dung môi: ( DM1: dung dịch acid formic 1% trong MeOH; DM2: dung dịch acid formic

Enrofloxacin

Ciprofloxacin

1% trong dichloromethane; MD3: dung dịch acid trichloroacetic 1% trong MeOH)

DM1

DM2

Hàm lượng thêm vào (ng/g) 49.21 Hàm lượng tìm thấy(ng/g) 5.41 Hiệu suất( %) 10.99±0.16 Hàm lượng thêm vào (ng/g) 46.40 Hàm lượng tìm thấy(ng/g) 29.56 Hiệu suất (%) 63.71±0.46

DM3 36.17

39.70

0.23

23.88

0.65±0,92 60.15±0.56 34.11

37.43

0.14

22.60

0.43±0.01 60.37±0.66

Bảng 3.8: Kết quả chiết mẫu với kỹ thuật khuấy trộn sử dụng trên máy khuấy từ với ba hệ dung môi:(DM11: dung dịch acid formic 1% trong MeOH; DM21: dung dịch acid formic

Enrofloxacin

Ciprofloxacin

1% trong dichloromethane; DM31: dung dịch acid trichloroacetic 1% trong MeOH)

DM11

Hàm lượng thêm vào (ng/g) 33.31 Hàm lượng tìm thấy(ng/g) 29.45 Hiệu suất( %) 88.41±1.30 Hàm lượng thêm vào (ng/g) Hàm lượng tìm thấy(ng/g) Hiệu suất (%)

DM21

DM31

47.80

47.93

3.80

40.03

7.96±1.29 83.51±1.24

46.40

34.11

37.43

29.56

0.14

22.60

89.39±0.89

8.97±1.40 84.77±1.54

NGUYỄN THỊ THANH NGA WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Trang 46


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học

Nhận xét: Khi tiến hành chiết với mẫu với kỹ thuật khuyấy trộn sử dụng thiết bị đánh vortex, có hiện tượng mẫu bị vón cục lại tạo thành tảng lớn. Tuy nhiên kỹ thuật khuyấy trộn sử dụng cá từ mẫu được phân tán đều hơn .Từ kết quả thực nghiệm cho thấy: kỹ thuật chiết sohxlet và kỹ thuật khuấy trộn sử dụng thiết bị đánh vortex cho hiệu suất thấp. Kỹ thuật khuấy trộn mẫu trong erlen có sử dụng máy khuấy từ cho hiệu suất cao nhất. Nguyên nhân là do: kỹ thuật chiết sohxlet và kỹ thuật khuấy trộn sử dụng thiết bị đánh vortex đều có diện tích tiếp xúc giữa kháng sinh và dung môi hữu cơ nhỏ làm khả năng chiết kém hơn. Với kỹ thuật khuấy trộn mẫu trong erlen có sử dụng máy khuấy từ có diện tích tiếp xúc giữa kháng sinh và dung môi hữu cơ lớn, nên khả năng chiết ciprofloxacin và enrofloxacin tốt hơn. Trong ba hệ dung môi khảo sát, cả hai hệ formic 1% trong MeOH và trichloroacetic 1% trong MeOH đều cho kết quả chiết lớn hơn 80%. Vậy, kỹ thuật khuấy trộn mẫu trong erlen có sử dụng máy khuấy từ và hệ dung môi chiết là acid formic 1% trong MeOH được chọn khi tiến hành phân tích trên mẫu thực tế. 3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH và khả năng chiết qua cột SCX 3.2.2.1. Ảnh hưởng của pH qua cột SCX trên mẫu thêm chuẩn Chúng tôi tiến hành khảo sát như sau: Mẫu trắng có thêm chuẩn sau khi đã được chiết tách thô, đun cách thủy loại bỏ dung môi chiết, sẽ được pha loãng với MeOH trong bình định mức 25ml và định mức đến vạch. Rút 2ml dung dịch cho vào ống nhiệm, đun cách thủy đến cạn. Hòa tan cặn với các dung dịch đệm formic ở pH = 2.0; 2.5; 3.0; 3.5; 4.0; 5.0, Kết quả được chỉ trong bảng 3.9: Bảng 3.9: Hàm lượng và hiệu suất thu hồi trên mẫu thêm chuẩn pH 2 2.5 3 Diện tích trung bình ciprofloxacin 7790 11022 13877 Hiệu suất % 40.4±0.8 51.7±0.3 59.8±0.6 Diện tích trung bình 28534 29780 32052 enrofloxacin Hiệu suất % 65.1±2.2 67.5±1.3 72.0±2.4

3.5

4

5

15197

11188

7978

64.1±0.8

51.3±1.2

41.0±0.2

33303

28475

25260

74.4±1.6

65.0±1.5

58.7±1.4

NGUYỄN THỊ THANH NGA WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Trang 47


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học

Ảnh hưởng của pH đối với ciprofloxacin và enrofloxacin 35000 30000

S

25000 20000

TB(cipro)

15000

TB(enro)

10000 5000 0 0

1

2

3

4

5

6

pH H3.10. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH lên quá trình tách ciprofloxacin và enrofloxacin

H3.11. Ảnh hưởng của pH lên dạng tồn tại của ciprofloxacin và enrofloxacin NGUYỄN THỊ THANH NGA WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Trang 48


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học

Nhận xét: Khi pH tăng, cường độ tín giảm điều này giải thích như sau: Từ hình H3.12 cho thấy ciprofloxacin và enrofloxacin có ba dạng tồn tại là anion, cation, trung hòa. pH càng tăng gần điểm đẳng điện, phân tử càng có xu hướng trở thành dạng trung hòa, làm hàm lượng ion dương giảm dẫn đến tín hiệu giảm. Trong đề tài này, chọn pH=3.5 để phân tích đồng thời hai chất kháng sinh trong cùng một nền mẫu.

3.2.2.2. Kiểm tra khả năng chiết qua cột SCX: Kết quả thực hiện trên dung dịch ciprofloxacin và enrofloxacin chuẩn được biểu diễn ở bảng 3.10 Bảng 3.10: Hàm lượng và hiệu suất thu hồi khi cho qua cột SCX 3.5 7410

ciprofloxacin 26.25ng/ml

3 7301

Diện tích trung bình Hàm lượng tìm thấy (ng/ml) 27.18 27.43 Hiệu suất % 103.5±1.6 104.5±2.2

enrofloxacin 24.75ng/ml

pH

Diện tích trung bình Hàm lượng tìm thấy (ng/ml) Hệu suất %

15173

15511

4 6137 24.58 93.6±1.4 14485

25.73 26.16 24.84 94.0 ±1.0 105.7±3.9 100.4±0.4

Nhận xét: Từ kết quả thực nghiệm cho thấy, trong khoảng pH từ 3.0 đến 4.0 hiệu suất thu hồi trên cột SCX quanh giá trị 100%. Do vậy có thể chiết hoàn toàn hai kháng sinh ciprofloxacin và enrofloxacin trong khoảng pH này trên cột SCX

NGUYỄN THỊ THANH NGA WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Trang 49


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học

3.2.2.3. Khảo sát nồng độ dung dịch rửa giải qua cột SCX: Kết quả thực nghiệm thể hiện trong Bảng 3.11 Bảng 3.11: Kết quả biểu diễn hiệu suất thu hồi theo nồng độ dung dịch rửa giải khi qua cột SCX

ciprofloxacin 26.25ng/ml

Diện tích trung bình Hàm lượng tìm thấy (ng/ml)

enrofloxacin 24.75ng/ml

%NH4OH/MeOH

Diện tích trung bình Hàm lượng tìm thấy (ng/ml)

Hệu suất %

1%

5%

10%

3903

6564

7410

19.57

25.53

27.43

74.6±0.8 97.2±2.0 104.5±2.2

Hệu suất %

12288

13869

15511

22.0084

24.0488

26.1679

88.9±2.2 97.2±2.4 105.7±3.9

Nhận xét: Kết quả thực nghiệm chỉ ra rằng: ở nồng độ dung dịch rửa giải 5% đến 10%, hiệu suất chiết đạt trên 97%. Do vậy chọn dung dịch rửa giải là NH4OH 10% trong MeOH 3.2.2.4. Khảo sát thể tích dung dịch rửa giải: Kết quả thực nghiệm xem bảng 3.12: Bảng 3.12: Diện tích peak theo thể tích dung dịch rửa giải trên mẫu tự tạo Thể tích dung dịch rửa giải (ml)

1

2

3

4

5

7

S (Ciprofloxacin)

6282

6827

8456

9966

10274

10322

S (Enrofloxacin)

18170

19479

22648

21910

22036

22182

Kết quả thực nghiệm cho thấy ở thể tích rửa giải từ 4ml trở lên, chất phân tích sẽ được rửa giải tốt nhất trên cột SCX 500mg/3ml xem hình H3.12 Vậy, chọn thể tích rửa giải là 5ml để đảm bảo chất phân tích được rửa giải tối đa.

NGUYỄN THỊ THANH NGA WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Trang 50


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học

Thể tích dung dịch rửa giải 25000.0 20000.0 15000.0

Ciprofloxacin Enrofloxacin

10000.0 5000.0 0.0 0

1

2

3

4

5

6

7

8

V(ml)

H3.12. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của thể tích rửa giải đối với ciprofloxacin, enrofloxacin * Tóm lại: Qua quá trình chiết xuất mẫu và làm sạch mẫu cho thấy rằng, giai đoạn làm sạch mẫu rất hoàn toàn, hiệu suất thu hồi này phụ thuộc chủ yếu vào giai đoạn chiết xuất mẫu và li trích mẫu. Việc chiết xuất mẫu bằng kỹ thuật khuấy trộn trên máy khuấy từ với dung môi chiết acid formic 1%/MeOH sẽ được sử dụng trong quá trình phân tích mẫu thực tế. 3.2.3. Xác định MLOD, MLOQ, hiệu suất thu hồi, độ chụm trên nền mẫu cá diêu hồng a) Xác định MLOD, MLOQ: (xem phụ lục 2) - Với ciprofloxacin: Giới hạn phát hiện của phương pháp là: 1.26 ± 0.24 (ppb) Giới hạn định lượng của phương pháp là: MLOQ = 3* MLOD = 3.78 ppb - Với enrofloxacin Giới hạn phát hiện của phương pháp là: 1.20 ± 0.26 (ppb) Giới hạn định lượng của phương pháp là: MLOQ = 3* MLOD = 3.60 ppb

NGUYỄN THỊ THANH NGA WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Trang 51


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học

b) Hiệu suất thu hồi và độ chụm của phương pháp: Nồng độ của ciprofloxacin và enrofloxacin cho vào mẫu cá diêu hồng lần lượt là: 1.73 và 1.46(µg/kg) Bảng 3.13: Hiệu suất thu hồi trên mẫu cá diêu hồng Hiệu suất thu hồi

ciprofloxacin

enrofloxacin

Lần 1

75.47

81.58

Lần 2

73.04

82.24

Lần 3

76.47

80.52

Trung bình (%)

74.99

81.45

% RSD

5.84

2.64

3.2.4. Xác định MLOD, MLOQ, hiệu suất thu hồi, độ chụm trên nền mẫu cá basa: a) Xác định MLOD, MLOQ: (xem phụ lục 2) - Với ciprofloxacin: Giới hạn phát hiện của phương pháp là: 0.889 ± 0.081 (ppb) Giới hạn định lượng của phương pháp là: MLOQ = 3* MLOD = 2.667 ppb - Với enrofloxacin Giới hạn phát hiện của phương pháp là: 1.12 ± 0.22 (ppb) Giới hạn định lượng của phương pháp là: MLOQ = 3* MLOD = 3.66 ppb b) Hiệu suất thu hồi và độ chụm của phương pháp: Nồng độ của ciprofloxacin và enrofloxacin cho vào mẫu cá basa lần lượt là: 0.15 và 0.14(µg/kg) Bảng 3.14: Hiệu suất thu hồi trên mẫu cá basa Hiệu suất thu hồi trên cá basa

ciprofloxacin

enrofloxacin

Lần 1

83.28

83.57

Lần 2

81.75

85.74

Lần 3

84.24

84.81

Trung bình (%)

83.09

84.71

% RSD

3.75

3.19

NGUYỄN THỊ THANH NGA WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Trang 52


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học

3.2.5. Xác định MLOD, MLOQ, hiệu suất thu hồi, độ chụm trên nền mẫu thịt gà a) Xác định MLOD, MLOQ: (xem phụ lục 2) - Với ciprofloxacin: Giới hạn phát hiện của phương pháp là: 0.872 ± 0.097(ppb) Giới hạn định lượng của phương pháp là: MLOQ = 3* MLOD = 2.616 ppb - Với enrofloxacin: Giới hạn phát hiện của phương pháp là: 0.87 ± 0.14 (ppb) Giới hạn định lượng của phương pháp là: MLOQ = 3* MLOD = 2.61 ppb b) Hiệu suất thu hồi và độ chụm của phương pháp: Nồng độ của ciprofloxacin và enrofloxacin cho vào mẫu thịt gà lần lượt là: 0.14 và 0.13(µg/kg) Bảng 3.15: Hiệu suất thu hồi trên mẫu thịt gà Hiệu suất thu hồi trên thịt gà

ciprofloxacin

enrofloxacin

1

88.61

90.07

2

87.79

91.38

3

87.04

92.72

Trung bình (%)

87.81

91.39

% RSD

2.22

3.60

NGUYỄN THỊ THANH NGA WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Trang 53


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học

Chương 4: Kết quả phân tích trên mẫu thực tế: 4.1. Tóm tắt quy trình phân tích thực tế: Sau khi tiến hành khảo sát các thông số, chúng tôi đưa ra quy trình phân tích trên mẫu thực tế như sau:

Cân m(g) mẫu

Chiết với 30ml dd acid formic 1% trong MeOH sau 2h(*3)

Đun cách thủy đến khô Thêm 5ml đệm formic pH =3.5 Lọc qua giấy lọc(nếu có cặn) Chiết pha rắn cột SCA Rửa giải với NH310% trongMeOH Thể tích rửa giải: 5ml Dịch chiết đun cách thủy Thêm 2ml pha động. Lọc với màng 0.2µm HPLC MS/MS

H4.1 Sơ đồ tóm tắt quy trình phân tích mẫu trong đề tài

NGUYỄN THỊ THANH NGA WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Trang 54


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học

4.2 Kết quả phân tích trên mẫu cá diêu hồng (xem phụ lục 3) Các mẫu được lấy tại chợ Hòa Hưng-quận 10, và chợ Nguyễn Đình Chiểu quận Gò Vấp, Tp Hồ Chí Minh. Các mẫu được làm sạch, xay nhuyễn bằng máy xay sinh tố để làm đồng đều mẫu. Sau đó thực hiện các bước như quy trình phân tích. Điều kiện chạy máy: Pha động ACN:acid formic 0.1%: 15: 85; Tốc độ dòng: 0.5ml/phút; Cột C18 Bảng 4.1: Kết quả phân tích trên mẫu cá diêu hồng STT

Tên mẫu

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 M11 M12 M13 M16 M51DH

Kết quả hàm lượng ciprofloxacin KPH KPH KPH KPH 28.52 ± 2.30 20.80 ± 0.72 KPH KPH 187.76 ± 1.21 150.60 ± 6.22 23.11 ± 0.30 24.70 ± 1.36

Kết quả hàm lượng enrofloxacin 16.04 ± 4.68 KPH 41.27 ± 8.40 2.93 ± 0.13 65.79 ± 6.52 52.92 ± 5.80 10.97± 1.04 9.59 ± 0.28 336.76 ± 7.10 305.76 ± 2.93 14.02 ± 0.97 132.00 ± 3.97

4.3 Kết quả phân tích trên mẫu cá basa(dạng file): Các mẫu được lấy tại siêu thị CoMark. Các mẫu được xử lí như trong 4.2 Bảng 4.2: Kết quả phân tích trên mẫu cá basa dạng file STT

Tên mẫu

1 2 3 4 5

M70 M73 M74 M75 M76

Kết quả hàm lượng ciprofloxacin KPH KPH KPH KPH KPH

NGUYỄN THỊ THANH NGA WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Kết quả hàm lượng enrofloxacin KPH KPH KPH KPH KPH Trang 55


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học

6 7 8 9 10

M77 M80 M90 M100 M110

KPH KPH KPH KPH KPH

KPH KPH KPH KPH KPH

11 12

M120 M130

KPH KPH

KPH KPH

4.4 Kết quả phân tích trên mẫu thịt gà: Các mẫu được lấy tại chợ Hòa Hưng-quận 10, và chợ Nguyễn Đình Chiểu quận Gò Vấp, Tp Hồ Chí Minh. Các mẫu được xử lí như trong 4.2 Bảng 4.3: Kết quả phân tích trên mẫu thịt gà

M41 M42 M43

Kết quả hàm lượng ciprofloxacin 66.78 ± 3.74 117.82 ± 1.49 KPH

Kết quả hàm lượng enrofloxacin 384.36 ± 9.10 424.00 ± 5.81 KPH

4 5 6 7 8 9 10

M44 M45 M46 M61 M62 M63 M64

20.75 ± 0.18 51.61± 2.08 16.38 ± 0.13 71.89 ± 2.76 35.17 ± 8.68 30.34 ± 0.31 KPH

30.87 ± 1.69 91.86 ± 3.92 9.70 ± 0.21 255.85 ± 5.41 61.31 ± 8.06 63.10 ± 5.01 9.56 ± 0.19

11

M65

315.30 ± 2.11

378.17 ± 8.55

12

M66

151.54 ± 3.55

131.19 ± 2.99

STT

Tên mẫu

1 2 3

NGUYỄN THỊ THANH NGA WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Trang 56


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học

Chương 5: Kết luận Tóm lại, với các điều kiện tối ưu hóa của máy HPLC-MS/MS sử dụng nguồn ion hóa ESI, thành phần pha động là ACN: H2O:15:85, quy trình xử lí mẫu thích hợp, tôi đã thiết lập một quy trình phân tích dư lượng kháng sinh, có các ưu điểm sau: - Khoảng tuyến tính rộng, định lượng tốt. - Độ nhạy với LODciprofloxacin trên cá diêu hồng là 1.26; cá basa là 0.889; thịt gà là 0.872(ppb); LODenrofloxacin trên cá diêu hồng là 1.20; cá basa là 1.12; thịt gà là (0.87ppb) - Độ chọn lọc cao - Hiệu suất thu hồi trung bình của ciprofloxacin khoảng 88% và enrofloxacin khoảng 89% - Đơn giản, dễ thực hiện. Đặc biệt với quy trình trên, chúng tôi có thể phân tích định lượng trên mẫu thực tế. Kết quả kiểm tra cho thấy: trong 36 mẫu thực phẩm có 8 mẫu có nồng độ enrofloxacin và 5 mẫu có nồng độ ciprofloxacin vượt quá giới hạn cho phép của Bộ Thủy sản; Ba mẫu có nồng độ ciprofloxacin vượt quá giới hạn cho phép của Bộ Thủy sản, các mẫu này chủ yếu rơi vào các mẫu thịt gà. Như vậy, người tiêu dùng nên cẩn trọng khi sử dụng các thực phẩm không rõ nguồn gốc. Theo nội dung của Council Regulation (EEC) số 2377/90: khi sử dụng kháng sinh enrofloxacin trên động vật, có sự chuyển hóa enrofloxacin thành ciprofloxacin. Do vậy khi xác định MRLs, người ta sẽ đánh giá trên tổng hàm lượng ciprofloxacin và enrofloxacin. Tuy nhiên do thời gian có hạn, đề tài chưa tìm hiểu sâu về khía cạnh này. Vì vậy việc đánh giá mẫu dựa trên hàm lượng của từng kháng sinh so với tiêu chuẩn quy định.

NGUYỄN THỊ THANH NGA WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Trang 57


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. S.Bogialli, G.D’Ascenzo, A.D.Corcia, A.Lagana, G.Tramontana Journal of Chromatography A, 1216, 794-800 ,2009 2. B.Toussaint, M.Chedin, G.Bordin, A.R.Rodriguez, Journal of Chromatography A, 1088, 32-39, 2005 3. L.Johnton, L.Mackay, M.Croft, Journal of Chromatography A, 982,97-109, 2002 4. Y.Xiao, H.Chang, A.Jia, J.Hu Journal of Chromatography A, 1214, 100-108, 2008 5. Commission of the Eurobean Communities, Off. J.Eur.Commun.L125 (1996) 10. 6. Danh mục hóa chất, kháng sinh hạn chế sử dụng trong sản xuất kinh doanh thủy sản, ban hành kèm theo quyết định số 07/2005/QĐ-BTS ngày 24/2/2005 7. J.A.H-Arteseros, J.Barbosa , R.Compano, M.D.Prat Journal of Chromatography A, 945,1-24, 2002 8. M.D>Prat, J.Benito, R.Compano, J.A.H-Arteseros, M.Granados; Journal of Chromatography A, 1041, 27-33, 2004 9. S.Mostafa, M.EI- Sadek and E.A.Alla, Journal of pharmaceutical and Biomedical Analysis volume 27, 133-142, 2001 10. W.Xu, X.Zhu, X.Wang, L.Deng, G.Zhang, Aquaculture 254, 1-8; 2006 11. F.Salehzadeh, A.Salehzadeh, N.Rokini, R.Madani, and F.Golchinefar, Pakistan Journal of Nutrition 6, 409-413, 2007. 12. E.Turiel, G.Bordin, A.R.Rodriguez, Journal of Chromatography A, 1008, 145-155, 2003 13. A.Garces, A.Zerzanova, R.Kucera, D.Barron, J.Barbosa Journal of Chromatography A, 1137, 22 – 29, 2006 14. H. Sun , F-X.Qiao Journal of Chromatography A, 1212, 1-9, 2008 15. M.D.Marazuela, M.C.M–Bondi, Journal of Chromatography A, 1034, 25-32, 2004 16. M.A.Garcia, C. Solans, A.Calvo, E.Hernandez, R. Rey, M.A.Bregante, M.Puig; Biomedical Chromatography volume 19,27-31;2004 17. H.Ovando, N. Gorla, Dr. Cs. Biol.; A weyers, M. Sc., L.ugnia, m.v.,a. Magnoli M.V. Arch. Med. Vet. XXXVI, N0 1, 2004 18. P-S Chu, R-C Wang, and H.V. Chu; J.Agric.Food Chem, 50, 4425-4455, 2002

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

19. H.Yan and K.H.Row; Bull. Korean Chem. Soc, Volume 29, 1173-1178, 2008 20. Z.Zeng, A.Dong, G.Yang, Z. Chen and X. Huang; Journal of Chromatography B Volume 821,202-209,2005 21. Olutosin R. Idowu and James O. Peggins; Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis Volume 27, 133-142; 2004 22. E.Rodriguez , M.C Moreno-Bondi , M .D.Marazuela Journal of Chromatography A, 1209, 136-144, 2008 23. S.Herranz ,M.C.M-Bondi , M.D. Marazuela Journal of Chromatography A, 1140, 63-70, 2007 24. R.D .Yeole ,A.S .Jadhav , K.R.Patil ,M.L. Kubal , S.Singh,M.V.Patel, H.F .Khorakiwala Journal of Chromatography A , 1108, 38-42, 2006 25. H.Salem ,L Fada and W.K. American Journal of Pharmacology and Toxicology 1825 , 2007 26. C.Ho, D.W.M.Sin, H.P.O.Tang, L.P.K Chung, S.M.P.Siu, Journal of Chromatography A, 1061,123-131, 2004 27. Y.Xiao , H.Chang , A. Jia, Jianing Hu Journal of Chromatography A 1214, 100108, 2008 28. V.Samanidou , E.Evaggelopoulou , M.Trotzmuller, X.Guo, E.Lankmayr Journal of Chromatography A 1203, 115-123,2008 29. M.P.Hermo, D.Barron, J.Barbosa Journal of Chromatography A, 1061,123-131, 2004 30. Z.S-Jun, L.Cun, J.H-Yang, L. B-Yu, S.J-Zhong, Chinese Journal of Analytical Chemitry Volume 35,786-790, 2007 31. M.D.Rose, J.Bygrave and G. W.F.Stubbings Analyst 123,2789-2796, 1998 32. A. Kaufmann, P.Butcher, K.Maden, M.Widmer Journal of Chromatography A, 1194, 66-79,2008 33. R.C-Martinez ,E.R-Gonzalo, P.R-Ruiz, J.H-Mendez Journal of Chromatography A , 1089, 1-17,2005 34. M.Lolo ,S.Pedreira , C.Fente , B.I.Vazquez ,C.M.Franco, A.Cepeda Analytica Chimica Acta 480,123-130, 2003 35. Tài liệu hãng Agilent.

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

PHỤ LỤC 1: KIỂM TRA THIẾT BỊ: Kết quả của quá trình autotune thiết bị HPLC:

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

PHỤ LỤC 2:

N

Cmin (ng/ml)

S/N

LOD

1

0.52

3.70

0.42

2

0.52

3.60

0.43

3

0.52

3.70

0.42

1

0.5

3.8

0.39

2

0.5

3.9

0.38

3

0.5

3.8

0.39

Enrofloxacin

Ciprofloxacin

- Giá trị LOD và LOQ của thiết bị LODTB (ng/ml)

SD

RSD%

LOQTB (ng/ml)

0.426

0.017

3.94

1.278

0.391

0.015

3.71

1.173

enrofloxacin ciprofloxacin

- Giá trị MLOD trên mẫu cá diêu hồng

1 2 3

Cmin (ng/ml) 5.4 5.4 5.4

1 2 3

5 5 5

N

S/N

V(ml)

m(g)

MLOD

MLODTB (ppb)

SD

RSD%

3.5 3.2 3

2 2 2

7.96 7.96 7.96

1.16 1.27 1.36

1.26

0.24

19.09

3.5 3 3

2 2 2

7.96 7.96 7.96

1.08 1.26 1.26

1.20

0.26

21.50

enrofloxacin ciprofloxacin

- Giá trị MLOD trên mẫu cá basa

1 2 3

Cmin (ng/ml) 5.4 5.4 5.4

1 2 3

5 5 5

N

S/N

V(ml)

m(g)

MLOD

MLODTB (ppb)

SD

RSD%

4.1 4 4.3

2 2 2

8.83 8.83 8.83

0.89 0.92 0.85

0.889

0.081

9.07

6.5 6.2 6.2

4 4 4

8.83 8.83 7.96

1.05 1.10 1.22

1.12

0.22

19.41

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

enrofloxacin ciprofloxacin

- Giá trị MLOD trên mẫu thịt gà

1 2 3

Cmin (ng/ml) 5.4 5.4 5.4

1 2 3

5 5 5

N

S/N

V(ml)

m(g)

MLOD

MLODTB (ppb)

SD

RSD%

3.5 3.6 3.3

2 2 2

10.73 10.73 10.73

0.86 0.84 0.92

0.872

0.097

11.10

3.4 3.0 3.3

2 2 2

10.73 10.73 10.73

0.82 0.93 0.85

0.87

0.14

16.45

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

PHỤ LỤC 3: Kết quả xác định mẫu cá thực tế trên thị trường: 1) Kết quả phân tích trên mẫu cá diêu hồng (không có mỡ): Ciprofloxacin (Cipro): MLOD =1.26 ± 0.24 (ppb); MLOQ = 3.78 ppb Enrofloxacin(Enro): MLOD =1.20 ± 0.26 (ppb); MLOQ = 3.60 ppb KHP: không phát hiện. Khối lượng cân(mg)

Mẫu 1

M4 Cipro

M4 Enro

M5 Cipro

M5 Enro

M6 Cipro

M6 Enro

2

V định mức(ml)

F (pha loãng)

2

10

KPH

11621.4

KPH

Hàm lượng (ppb)

0

1

3111

17.49

11621.4

2761

3

1497

1

KPH

2

9335.4

KPH

2

10

2

10

1

KPH

0 2

10

KPH

0

1

KPH

0

10026.1

KPH

2

10

KPH

0

1

10836

40.16

10026.1

3

2

10

10217

1 2

12738

KPH KPH

4.68

16.04 ± 4.68

0

0

KPH

0

0

KPH

0

0

45.06

KPH

41.27

8.40

41.27 ± 8.40

0

0

KPH

38.57 0

KPH

70501.8

16.04

0

3 2

KPH

0

3 2

0

0

KPH KPH

0

13.91 0

3

9335.4

Kết quả

16.71

0

2

Sai số

0

KPH

2

Hàm lượng trung bình (ppb)

0

3

3 M7 Cipro

Diện tích mẫu

2

10

0 0

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

1

M7 Enro

M8 Cipro

2

3412

70501.8

3183

M9 Cipro

M9 Enro

1

1614

29.49

2

9797.2

1377

2

9797.2

10

21015

28.41

2

10

67.92

19092

62.85

1

1338

20.56

2

13448.5

1504

2

10

21.12

3

1377

20.69

1

21619

50.63

2

13448.5

22752

2

3

10

13574.8

1176

2

10

2.29

28.52 ± 2.30

65.79

6.52

65.79 ± 6.52

20.79

0.72

20.80 ± 0.72

52.81

52.92

5.80

52.92 ± 5.80

0

0

0

KPH

2

KPH

10.96

11.29

1.03916

10.97± 1.04

0

KPH

10.49 0

KPH 10

0

0

0

KPH 557

14254.6

28.52

11.10

754

14254.6

2.93 ± 0.13

0 1075

1 2

2

KPH

0.13

55.31 0

KPH

1 2

10

KPH

13574.8

1 2

2

24052

1

2.93

27.65 66.59

3

3 M111 Enro

2

1211 20511

3 M11 Cipro

2.91 2.89

3 M10 Enro

10

3143

3 M10 Cipro

2

3

3 1 M8 Enro

2.99

572 459

9.64 2

10

9.66 9.46

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

9.59

0.28

9.59 ± 0.28


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

M12 Cipro

M12 Enro

M13 Cipro

M13 Enro

M16 Cipro

1 2

19399

5770.5

M51DH Cipro

10

187.20

19382

187.96

1

70281

335.68

2

5770.5

71246

2

10

339.99

3

70038

334.59

1

18094

149.90

2

6851

18624

2

10

153.36

3

17879

148.49

1

76660

306.77

2

6851

76471

2

10

306.05

3

76048

304.46

1

178

23.23

2

9669.2

1 2

125

414 390

1

74511 72612 71081 719182 704132 719286

70310.9

1 2 3

10

70310.9

22.99

187.76

1.21

187.76 ± 1.21

336.76

7.10

336.76 ± 7.10

150.60

6.22

150.60 ± 6.22

305.76

2.93

305.76 ± 2.93

23.11

0.30

23.11 ± 0.30

14.02

0.97

14.02 ± 0.97

24.70

1.36

24.70 ± 1.36

132.00

3.97

132.00 ± 3.97

23.09

654

9669.2

3 2

2

148

3 M51DH Enro

2

3

3 M16 Enro

19283

188.10

14.47 2

10

13.83 13.76 25.27

2

5

24.66 24.18 132.88

2

5

130.12 132.89

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

2. Kết quả phân tích trên mẫu cá basa: Ciprofloxacin: MLOD = 0.889 ± 0.081 (ppb); MLOQ = 2.667 ppb

Enrofloxacin: MLOD = 1.12 ± 0.22 (ppb); MLOQ = 3.66 ppb Khối lượng cân(mg)

Mẫu

M70 Cipro

M70 Enro

1 2 3 1 2

7958.5

7958.5

3 M73 Cipro

M73 Enro

1 2 3 1 2

M7 Enro

1 2 3 1 2

6912.3

6912.3

M75 Enro

1 2 3 1 2 3

KPH

F(pha loãng)

2

1

2

1

KPH KPH KPH KPH KPH

10730.7

10730.7

KPH KPH KPH KPH KPH

2

1

2

1

8829.5

KPH KPH KPH KPH KPH KPH

Hàm lượng trung bình (ppb)

Sai số

Kết quả

0 0 0 0

0

0

KPH

0

0

0

KPH

0 0 0 0

0

0

KPH

0

0

0

KPH

0

0

KPH

0

0

KPH

0

0

KPH

0

0

KPH

0 2

1

2

1

0 0 0 0 0 0

KPH

8829.5

Hàm lượng (ppb)

0

KPH

3 M75 Cipro

KPH KPH KPH KPH

V định mức(ml)

KPH

3 M7 Cipro

S mẫu

2

1

2

1

0 0 0 0 0 0

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

M76 Cipro

M76 Enro

M77 Cipro

M77 Enro

1 2 3 1 2

6739.6

6739.6

M80 Enro

M90 Enro

M100 Enro

1

1 2 3 1

KPH KPH KPH KPH

0 0 0 0

2

9297.2

9297.2

1 2 3 1 2 1 2 3 1 2 1 2 3 1 2 3

KPH

2

2

1

1

9797.2

KPH KPH KPH KPH KPH

2

2

10

10

11462

KPH KPH KPH KPH KPH

2

2

10

10

13574.8

KPH KPH KPH KPH KPH KPH

0

0 KPH

0

0 KPH

0

0

0

KPH

0 0 0 0

0

0 KPH

0

0

0

KPH

0 0 0 0

0

0 KPH

0

0

0

KPH

0

KPH

13574.8

KPH

0

KPH

11462

0

0

KPH

9797.2

0

0 0

3 M100Cipro

2

1

KPH

3 M90 Cipro

KPH

2

0 0 0 0

3

3 M80 Cipro

KPH KPH KPH KPH

2

2

10

10

0 0 0 0

0

0 KPH

0

0 0

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

0 KPH


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

M110 Cipro

M110 Enro

M120 Cipro

M120 Enro

1 2 3 1 2

14254.6

14254.6

2

10

10

KPH

1 2 3 1

KPH KPH KPH KPH

0 0 0 0

2

5770.5

5770.5

2

11632

KPH

2

2

10

10

0

KPH

0 2

10

KPH

0

1

KPH

0

3

11632

KPH KPH

2

10

KPH 0

0 KPH

0

0 KPH

0

0 KPH

0

0

0

3 2

0

0

KPH KPH

0

0

3

1

M130 Enro

KPH

2

0 0 0 0 0

3 M130 Cipro

KPH KPH KPH KPH

KPH 0

0 0

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

0 KPH


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

3. Kết quả phân tích trên mẫu thịt gà: Ciprofloxacin: MLOD = 0.872 ± 0.097 (ppb); MLOQ = 2.616 ppb

Enrofloxacin: MLOD = 0.87 ± 0.14 (ppb); MLOQ = 2.61 ppb Khối lượng cân(mg)

Mẫu M41 Cipro M41 Enro M42 Cipro M42 Enro M43 Cipro M43 Enro M44 Cipro

1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3

Diện tích mẫu

V định mức(ml)

F(pha loãng)

102452

70310.9

99841

2

10

2

10

2

2

2

2

2

10

2

10

2

10

97736 1039495

70310.9

1033950 1053330

6310.9

6310.9

9669.2

9669.2

78623 77781 78133 510869 513288 516573 KPH KPH KPH KPH KPH KPH 1383

13448.5

1377 1417

Hàm lượng (ppb) 68.33 66.67 65.33 383.35 381.31 388.43 118.45 117.25 117.75 421.78 423.76 426.44 0 0 0 0 0 0 20.72 20.70 20.83

Hàm lượng trung bình (ppb)

Sai số

Kết quả

66.78

3.74

66.78 ± 3.74

384.36

9.10

384.36 ± 9.10

117.82

1.49

117.82 ± 1.49

423.99

5.81

424.00 ± 5.81

0

0

KPH

0

0

KPH

20.75

0.18

20.75 ± 0.18

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

M44 Enro M45 Cipro M45 Enro M46 Cipro M46 Enro M61 Cipro M61 Enro M62 Cipro M62 Enro

1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3

11728

13448.5

11118

2

10

2

10

2

10

2

10

2

10

11112 6647

9797.2

6425 6284 29530

9797.2

30048 30727

13448.5

13448.5

6639.6

6639.6

9797.2

9797.2

97 80 65 318 239 315 5653 5983 5821 61586 60468 61091 1987 3154 3427 19925 17684 17913

2

10

2

10

2

10

2

10

31.66 30.48 30.47 52.50 51.49 50.84 90.35 91.72 93.51 16.44 16.38 16.33 9.76 9.60 9.75 70.77 72.99 71.90 257.94 253.59 256.01 31.20 36.54 37.78 65.05 59.14

30.87

1.69

30.87 ± 1.69

51.61

2.08

51.61± 2.08

91.86

3.92

91.86 ± 3.92

16.38

0.13

16.38 ± 0.13

9.70

0.21

9.70 ± 0.21

71.89

2.76

71.89 ± 2.76

255.85

5.41

255.85 ± 5.41

35.17

8.68

35.17 ± 8.68

61.31

8.06

61.31 ± 8.06

59.75

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

M63 Cipro M63 Enro M64 Cipro M64 Enro M65 Cipro M65 Enro M66 Cipro M66 Enro

1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3

13448.5

13448.5

13574.8

13574.8

5770.5

5770.5

7543.3

7543.3

4316 4248 4255 28765 28669 26899 KPH KPH KPH

239 236 308 35830 35874 35666 79344 79327 80670 20695 20441 20923 33675 33867 33185

2

10

2

10

30.48 30.26 30.28 64.35 64.17

30.34

0.31

30.34 ± 0.31

63.10

5.01

63.10 ± 5.01

0

0

60.77 0

2

10

0

KPH

0

2

10

2

10

2

10

2

10

2

10

9.52 9.51 9.65 315.61 315.95 314.34 376.22 376.14 382.15 151.59 150.08 152.94 131.53 132.19

9.56

0.19

9.56 ± 0.19

315.30

2.11

315.30 ± 2.11

378.17

8.55

378.17 ± 8.55

151.54

3.55

151.54 ± 3.55

131.19

2.99

131.19 ± 2.99

129.86

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON


Xác định dư lượng ciprofloxacin và enprofloxacin trong thực phẩm bằng phương pháp HPLC-MS/MS