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2013, Vol.34, No.13   247

食品科学

※营养卫生

L-半胱氨酸对乙醛消除及A549细胞内环境抗氧化作用 张晓红,罗

成*

(天津科技大学食品科学与生物技术学院,天津

300457)

摘  要:为了研究L-半胱氨酸对乙醛的消除作用及对A549细胞内环境抗氧化的影响,在分析乙醛对非小细胞肺癌 A549细胞损伤影响的基础上,重点研究了L-半胱氨酸对乙醛损伤非小细胞肺癌A549细胞增殖、乳酸脱氢酶(LDH) 释放、超氧化物歧化酶(SOD)活性和一氧化氮(NO)含量的影响。结果显示:乙醛对A549细胞具有明显的损伤作 用,且呈剂量依赖性;L-半胱氨酸对乙醛损伤的A549细胞具有保护作用并增强其抗氧化性。在L-半胱氨酸浓度为 0~160µmol/L范围内,L-半胱氨酸处理对乙醛损伤的A549细胞的LDH活力和NO含量与L-半胱氨酸实验剂量呈负相 关,SOD活性与L-半胱氨酸实验剂量呈正相关。 关键词:乙醛;L-半胱氨酸;抗氧化;A549细胞

Effect of L-Cysteine on Elimination of Acetaldehyde and Intracellular Redox Status in Lung Cancer Line A549 ZHANG Xiao-hong, LUO Cheng* (College of Food Science and Biological Technology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin

300457, China)

Abstract:Local acetaldehyde exposure from alcohol drinking and smoking is a major factor behind different diseases including cancers. Thus, decreasing the production or eliminating acetaldehyde locally might offer a preventive strategy against acetaldehydeinduced cancers. In this study, the influence of acetaldehyde on the cell proliferation and intracellular antioxidants of non small cell lung cancer A549 cells including the leakage of lactate dehydrogenase (LDH), superoxide dismutases (SOD) activity and nitric oxide (NO) content was investigated. The protection effect of L-cysteine on A549 cells was also studied. Our results showed that the cytotoxicity of acetaldehyde on A549 cell growth was dose-dependent. This acetaldehyde-induced cytotoxicity was inhibited by L-cysteine within the concentration range of 0—160 μmol/L. In addition, the antioxidant status was enhanced. Increasing L-cysteine concentration led to a reduction in LDH activity and NO content but an increase in SOD activity. Key words:acetaldehyde;L-cysteine;antioxidant;A549 cell 中图分类号:TS201.2 文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2013)13-0247-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201313052

酒中的主要成分是乙醇,生理条件下乙醇经乙醇

较低剂量的乙醛(蒸汽)能产生皮肤、眼睛和上呼吸道黏

脱氢酶(ADH)代谢为乙醛;短时间内大量摄入乙醇会激

膜的直接刺激作用,使痰增多,眼充血红肿,引起过敏、头

活微粒体乙醇氧化酶系统(microsomal ethanol oxidizing

痛等[7],吸入高浓度的乙醛则会引起窒息,甚至呼吸麻痹而

system,MEOS)促进乙醇的代谢。乙醇经上述两种代谢

死亡。机理研究表明,乙醛可引起线粒体的功能障碍,使线

途径均氧化生成乙醛,乙醛在乙醛脱氢酶(ALDH)的催

粒体的呼吸功能、脂肪酸氧化能力受到损伤;乙醛还影响胚

化下转化成乙酸[1],乙酸进一步转化成乙酰辅酶A,乙酰

胎的发育[8-9];此外,乙醛还能够与DNA共价结合形成加合

辅酶A可进入三羧酸循环进一步产生二氧化碳、水和能 量 。香烟也是乙醛的一大来源 ,酗酒和长期吸烟会改

物,引起DNA链交联或DNA断裂,从而导致细胞癌变[10]。 L-半胱氨酸(L-Cys)对乙醛具有较强的“亲和力”,

变口腔菌群,这些微生物产生乙醛,但转化乙醛能力很

生成亚胺类(2-甲基四氢噻唑-4-羧酸)较为稳定的物质,直

[2]

[3]

[4]

低,使摄入的酒精产生更多的乙醛 。人唾液中的ALDH

接排除体外,从而降低乙醛的毒性[11-12],因此L-半胱氨酸

含量极低,因此吸烟者的口腔细胞就经常处于乙醛包围

也能有效地解除乙醇的毒性 [12]。L-半胱氨酸可以与自由

之下,甚至吸收进入体内,弥散到鼻,肺等器官,从而

基发生反应,进而清除乙醇氧化过程中产生的自由基,

诱发口腔和呼吸道肿瘤以及其他肿瘤,因此乙醛也被认

降低脂质过氧化等反应速率。另外,L-半胱氨酸还可转

为是烟草中的主要致癌物质之一[5-6]。

化为胱氨酸,参与受损组织的修复[13]。

收稿日期:2012-04-07 基金项目:天津市2010年千人计划启动经费项目(91111114) 作者简介:张晓红(1988—),女,硕士研究生,研究方向为食品科学。E-mail:zhangxiaohong222@126.com *通信作者:罗成(1958—),男,教授,博士,研究方向为食品科学。E-mail:Luo58@yahoo.com


248  2013, Vol.34, No.13

食品科学

※营养卫生

目前,采用L-半胱氨酸与乙醛的反应的机理来消除

CO2培养箱,37℃培养24h,待细胞贴壁长满培养板后,

乙醛的毒性在国外备受重视。美国、德国、澳大利亚、

换用含无血清的培养液培养24h使细胞同步化。随后加入

日本和芬兰学者都相继发现乙醛对人体的危害性,并

不同处理因素继续培养24h,每组培养3孔细胞。培养终

提出可采用L-半胱氨酸来清除乙醛。其中,日本科学家

止后,3000r/min离心3min,小心吸取上清液,按试剂盒

Yamashita等

[14]

发现L-半胱氨酸对空气中的乙醛有较强的

亲和力,可用于清除空气中的乙醛。在芬兰,Salaspuro 等

[15-16]

说明书测定LDH活力,实验重复3次。 1.5

将细胞制成密度为6×104个/mL的细胞悬液,接种在

甚至发现L-半胱氨酸清除体内乙醛效果也很显著, ®

细胞上清液中NO活性测定

同时利用此原理制成了Acetium ,作为Biohit公司的专利

24孔培养板中进行培养,待细胞长满80%时,按上面分

产品上市。中国是吸烟大国,也是饮酒大国,本实验试

组处理,每组设3个复孔。每孔取上清液100µL,按照南

图利用细胞模型研究乙醛的毒性,并考察L-半胱氨酸对

京建成生物工程研究所试剂盒要求测定NO含量,实验重

乙醛的消除作用,为在降低烟酒毒性方面开发具有自主

复3次。

知识产权的功能食品提供实验依据。

1.6

细胞内SOD活力测定 将细胞制成密度为6×104个/mL的细胞悬液,接种在

1

材料与方法

24孔培养板中进行培养,待细胞长满80%时,按上面分 组处理,每组设3个复孔。终止培养后,加入细胞裂解

1.1

材料、试剂与仪器

液,4℃裂解30min,12000r/min离心15min,取上清BCA

非小细胞肺癌A549细胞由天津市肺癌研究所提供。

法测定蛋白浓度,同时按照南京建成生物工程研究所试

乙醛(含量40%)、L-半胱氨酸(AR)、RPMI-1640培养

剂盒要求测定SOD活力。实验重复3次。

基、胎牛血清、青链霉素混合液(100×)、胰蛋白酶、噻

1.7

氢酶测定试剂盒、一氧化氮测定试剂盒、BCA法测定超 微量蛋白含量试剂盒、超氧化物歧化酶测定试剂盒

进行统计分析。以P<0.05表示有统计学意义。

南 2

京建成生物工程研究所。 HERAcell150二氧化碳培养箱 BDS200-PH倒置生物显微镜

统计学分析 本实验的数据用 x ±s表示,采用t检验对各组变异性

唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、PBS缓冲液、乳酸脱

结果与分析

德国贺利氏公司;

重庆奥特光学仪器公

司;Multiskan Spectrum全波长酶标仪

2.1

乙醛及L-半胱氨酸对A549细胞生长活性的影响

上海雷勃生物

有限公司。 细胞培养

OD570nm

1.2

将A549细胞培养在含10%胎牛血清、青链霉素混合 液(1×)的1640培养基中,于37℃、饱和湿度、5% CO2条 件下培养,根据细胞生长状态每隔2~3d换液1次。待细胞 长满80%后,对细胞进行消化用于传代培养或用于实验。 1.3

0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0

A

0

MTT法检测细胞生长活性

并接种至96孔培养板,每孔加入100µL细胞悬液(空白 孔不加细胞,只加培养基)培养24h,待细胞长满80%左 右,换成无血清培养基继续培养24h,使细胞同步化; OD570nm

然后分别加入L-半胱氨酸、乙醛等处理因素,每个剂量 重复6孔,置培养箱中孵育24h后进行检测。吸弃上清液 20µL,每孔加入20µL质量浓度为5mg/mL MTT(终质量浓 度为0.5mg/mL),继续孵育4h后弃培养基,每孔加入150µL DMSO终止反应,避光低速振摇10min使深紫色沉淀溶解,

用10%胎牛血清的1640培养基稀释细胞至6×104个/mL, 将细胞接种至24孔板中,每孔加入细胞悬液1mL,置5%

100

150

200

300

900

0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0

L-Cys+0μmol/LЭ䝯

L-Cys+150μmol/LЭ䝯

L-Cys+10μmol/LЭ䝯

L-Cys+200μmol/LЭ䝯

L-Cys+50μmol/LЭ䝯

L-Cys+300μmol/LЭ䝯

L-Cys+100μmol/LЭ䝯

L-Cys+900μmol/LЭ䝯

B

0

10

20

40

80

160

320

640

L-半胱氨酸浓度/(μmol/L)

于酶标仪波长570nm处测定OD值,实验重复3次。 细胞上清液LDH活性测定

50

Э䝯⌧ᑺ/(μmol/L)

用含10%胎牛血清的1640培养基稀释细胞至6×104个/mL,

1.4

10

图1

乙醛对A549细胞生长活性的影响(A)和L-半胱氨酸对乙醛损伤

Fig.1

Effect of acetaldehyde (A) and acetaldehyde + L-cysteine (B) on

A549细胞生长活性的影响(B) the cell proliferation of A549


氨酸浓度增大,不同浓度乙醛作用后的A549细胞释放的NO 含量呈下降趋势,且当L-半胱氨酸浓度为160µmol/L时,不 同浓度乙醛作用后的A549细胞释放的NO含量与空白对 照组比较,其差异具有统计学意义(P<0.05)。 60 NO৿䞣/(μmol/L)

图1A显示,随着乙醛浓度增大,A549细胞的生长活 性明显下降,其中200、300、900µmol/L的乙醛组与空 白对照组比较,其差异具有统计学意义(P<0.05)。如图 1B显示,L-半胱氨酸浓度为0~160µmol/L范围内,其浓 度与A549细胞生长活性呈正相关,表明在该浓度范围内 L-半胱氨酸浓度对受损A549细胞的保护作用呈浓度依赖

10

50

100

150

200

300

900

L-Cys+0μmol/LЭ䝯

L-Cys+150μmol/LЭ䝯

L-Cys+10μmol/LЭ䝯

L-Cys+200μmol/LЭ䝯

L-Cys+50μmol/LЭ䝯

L-Cys+300μmol/LЭ䝯

L-Cys+100μmol/LЭ䝯

L-Cys+900μmol/LЭ䝯

图3

0

10

50

100

150

200

300

900

L-Cys+150μmol/LЭ䝯 L-Cys+200μmol/LЭ䝯 L-Cys+300μmol/LЭ䝯 L-Cys+900μmol/LЭ䝯

L-Cys+0μmol/LЭ䝯 L-Cys+10μmol/LЭ䝯 L-Cys+50μmol/LЭ䝯 L-Cys+100μmol/LЭ䝯

B

50 40 30 20 10 0

10

20

40

80

160

320

640

乙醛对A549细胞上清液中NO含量的影响(A)及L-半胱氨酸对乙醛 损伤A549细胞上清液中NO含量的影响(B)

Fig.3

Effect of acetaldehyde (A) and acetaldehyde + L-cysteine (B) on NO amount in the supernatant of A549 cells

2.4

乙醛对A549细胞及L-半胱氨酸对乙醛损伤A549细

胞内SOD活性的影响 0

10

20

40

80

160

320

640

乙醛对A549细胞上清液中LDH活力的影响(A)及L-半胱氨酸对乙 醛损伤A549细胞上清液中LDH活力的影响(B)

Fig.2

10

L-ञ㛅⇼䝌⌧ᑺ/(μmol/L)

L-ञ㛅⇼䝌⌧ᑺ/(μmol/L) 图2

20

0

SOD⌏࡯/(U/mg pro)

LDH⌏࡯/(U/L)

B

30

60

Э䝯⌧ᑺ/(μmol/L)

700 600 500 400 300 200 100 0

40

Э䝯⌧ᑺ/(μmol/L)

A

0

A

50

0

NO৿䞣/(μmol/L)

LDH⌏࡯/(U/L)

性,并且160µmol/L时与空白对照组比较,其差异具有统 计学意义(P<0.05);但当L-半胱氨酸浓度大于160µmol/L 时,细胞活力有所下降,表明过高的L-半胱氨酸浓度不 利于其对A549细胞的保护作用。 2.2 乙醛对A549细胞及L-半胱氨酸对乙醛损伤A549细 胞上清液中LDH活性的影响 700 600 500 400 300 200 100 0

2013, Vol.34, No.13   249

食品科学

※营养卫生

Effect of acetaldehyde (A) and acetaldehyde + L-cysteine (B) on LDH activity in the supernatant of A549 cells

A

0

10

50

100

150

200

300

900

Э䝯⌧ᑺ/(μmol/L)

SOD⌏࡯/(U/mg pro)

图2A显示,随着乙醛浓度增大,A549细胞上清液中 LDH活力增强,其中200、300、900µmol/L的乙醛组与空 白对照组比较,其差异具有统计学意义(P<0.05)。如图2B 显示,在0~160µmol/L范围内,伴随着L-半胱氨酸浓度的 增大,不同浓度乙醛作用后的A549细胞上清液中LDH活力 明显下降,且当L-半胱氨酸浓度为160µmol/L时,不同浓度 乙醛作用后的A549细胞上清液中LDH活力与空白对照组比 较,其差异具有统计学意义(P<0.05)。 2.3 乙醛对A549细胞及L-半胱氨酸对乙醛损伤A549细 胞上清液中NO含量的影响 图3A显示,随着乙醛浓度增大,A549细胞释放的NO 含量呈上升趋势,其中200、300、900µmol/L的乙醛组与空 白对照组比较,其差异具有统计学意义(P<0.05)。如图3B显 示,在L-半胱氨酸浓度为0~160µmol/L范围内,随着L-半胱

70 60 50 40 30 20 10 0

80 70 60 50 40 30 20 10 0

B

0

L-Cys+150μmol/LЭ䝯 L-Cys+200μmol/LЭ䝯 L-Cys+300μmol/LЭ䝯 L-Cys+900μmol/LЭ䝯

L-Cys+0μmol/LЭ䝯 L-Cys+10μmol/LЭ䝯 L-Cys+50μmol/LЭ䝯 L-Cys+100μmol/LЭ䝯

10

20

40

80

160

320

640

L-ञ㛅⇼䝌⌧ᑺ/(μmol/L) 图4

乙醛对A549细胞内SOD活力的影响(A)及L-半胱氨酸对乙醛损伤

Fig.4

Effect of acetaldehyde (A) and acetaldehyde + L-cysteine (B) on

A549细胞内SOD活力的影响(B) SOD activity of A549 cells


250  2013, Vol.34, No.13

食品科学

图4A显示,随着乙醛浓度增大,SOD活力呈下降

※营养卫生

的SOD活性。伴随L-半胱氨酸浓度增大,不同浓度乙醛

趋势,其中200、300µmol/L和900µmol/L的乙醛组与空

同时作用后的A549细胞LDH漏出量和NO释放量明显下

白对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。如图4B

降,SOD活力逐渐上升,说明L-半胱氨酸对乙醛诱导的

显示,在L-半胱氨酸浓度为0~160µmol/L范围内,随着 L-半胱氨酸浓度增大,不同浓度乙醛作用后的A549细胞

A549细胞损伤具有明显的保护作用,且在10~160µmol/L

SOD活力逐渐上升,且当L-半胱氨酸浓度为160µmol/L

浓度范围内其保护效应呈剂量-效应关系。更为重要的是 160µmol/L L-半胱氨酸在所有测试中都表现为对A549细

时,不同浓度乙醛作用后的A549细胞SOD活力与空白对

胞的最佳保护浓度。

照组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。 3

细胞存在助氧化或活性氧族(reactive oxygen species, ROS)系统,如氧自由基等,同时细胞也存在抗氧化系 统,如超氧化物歧化酶等。在正常情况下,无论在极性 氧化或还原条件下,体内自身助氧化系统和抗氧化系统 可保持机体动态平衡[12]。 乙醛是一种氧化剂,对生物大分子有直接的氧化作 用,打破动态平衡,使其抗氧化能力降低,体内自由基 不能及时清除,对组织细胞间接的造成氧化损伤。本实 验用不同浓度乙醛与A549细胞共培养24h后发现,SOD 活力呈下降趋势,而上清液中的LDH活力和NO含量呈 上升趋势,说明乙醛可以使A549细胞产生氧化损伤遗漏 LDH,诱导NO产生。而L-半胱氨酸与乙醛,同时处理 A549细胞24h后发现,SOD活力呈上升趋势,而上清液中 的LDH活力和NO含量呈下降趋势,说明L-半胱氨酸对乙 醛损伤A549细胞具有保护作用。但除抗氧化,降低脂质 过氧化等机制外,可能有更多保护作用机理尚需进一步 研究。 4

实验通过乙醛对细胞生长活性,对LDH漏出量、NO 释放量及SOD活力的检测来探讨乙醛对A549细胞的氧化 损伤效应以及L-半胱氨酸对其的保护作用。研究结果表 明,乙醛对A549细胞具有明显的损伤作用,且呈现浓度 依赖性;伴随乙醛浓度增大,LDH漏出量和NO释放量 逐渐增大,原因可能是乙醛损伤细胞膜,导致LDH遗漏 量和诱导NO释放量增大,伴随乙醛浓度增大,总SOD 活力呈下降趋势,说明较高浓度乙醛可以抑制A549细胞

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Zhang xh 2013 l 半胱氨酸对乙醛消除及a549细胞内环境抗氧化作用