Producción biopolimero

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PROYECTO DE INNOVACIÓN: PRODUCCIÓN DE GOMA XANTANA EN BIORREACTOR IES A SARDIÑEIRA

Departamento de ciclos forma1vos de Química Curso 2011-­‐2012


OBJETIVO Obtención del biopolímero de interés comercial e industrial goma xantana mediante la fermentación aeróbica de la bacteria Xanthomonas campestris. OBJETIVO EDUCATIVOS • Aplicación de técnicas microbiológicas y analíBcas. • Puesta en marcha y manejo de un biorreactor. • Recolección de datos, tratamiento matemáBco y construcción y compresión de gráficas. • Recuperación de la goma xantana del medio de fermentación.


INTRODUCCIÓN La goma xantana es un heteropolisacárido extracelular producido por la fermentación aeróbica de la bacteria Xanthomonas campestris, es un patógeno de las coles.

Hoja de col dañada por Xanthomonas campestris


PROPIEDADES •  Alta viscosidad y solubilidad en agua: la viscosidad de una disolución acuosa de goma xantana del 1% es 100 veces mayor que la viscosidad de una disolución de gelaBna en agua de la misma densidad. •  Tiene una reología pseudoplásLca especial: bajo la temperatura no cambia, forma los cambios reversibles de sol y gel de acuerdo al cambio de fuerzas de máquinas, por lo que es un estabilizador de emulsión. •  Su viscosidad y sus propiedades pueden mantenerse bajo temperaturas de -­‐18 a 120ºC, pH =2 -­‐ 12 y concentraciones salinas variables. •  Buena compaLbilidad: puede formar un sistema de espesamiento estable combinando con ácidos, bases, sales, enzimas, agentes acBvos superficiales, anBsépBcos, agentes oxidantes (entre otros materiales químicos), y al mismo Bempo mantener la reología.


APLICACIONES INDUSTRIA ALIMENTARIA:   Adhesivo: Glaseados y recubrimientos.   AgluLnante: Alimentos para mascotas.   Recubrimiento: Confitería.   Emulsificante: Aderezos para ensaladas.   Encapsulante: Saborizantes en polvo.   Formación de película: Recubrimientos protectores, envoltura de salchichas.   Estabilizante de espuma: Cerveza.   Homogeneizador, SusLtuto de gluten y procesamiento de masa: Panadería, pastas…


APLICACIONES OTRAS INDUSTRIAS: También es uBlizado en otras industrias como la cosméBca o la farmacéuBca (para mantener en suspensión a los anBbióBcos u otros fármacos), la industria agrícola (mejora la presencia de fungicidas, herbicidas e insecBcidas) y también es uBlizado en la industria petrolífera química, papelera y texBl.


OBTENCIÓN DE GOMA XANTANA EN EL IES A SARDIÑEIRA


PREPARACIÓN DEL INÓCULO El microrganismo X. campestris (ATCC ) se cultiva en un medio que contiene triptona (1 % m/v), extracto de levadura (0,5 % m/v), NaCl (0,5 % m/v) y glucosa (1 % m/v) (medio Luria-Bertani más glucosa, LBG). https://vimeo.com/41502560


PREPARACIÓN DEL INÓCULO: Las colonias aisladas de X. campestris se transfieren a matraces Erlenmeyer de 250 mL que contienen 100 mL de medio LBG.


PREPARACIÓN DEL INÓCULO: Los frascos se tapan con tapones de algodón para permitir la aireación pasiva y se incuban en un agitador orbital a 25°C y 200 rpm durante 72h.


MONTAJE DEL BIORREACTOR Antes de la esterilización en autoclave:   Se calibra el electrodo de pH: Antes de montarlo en el recipiente de culBvo, se debe calibrar el punto cero y la pendiente del sensor de pH.   Se conecta sonda de oxígeno: Antes de la calibración es necesario polarizar el electrodo de pO2 durante un mínimo de 2 horas.   Se colocan los filtros de aire.   Se conectan las disoluciones ácida, base y anBespumante a las entradas correspondientes del biorreactor.   Se monta el tubo de guiado de la sonda de temperatura en el recipiente de culBvo.   Se colocan en el biorreactor los elementos restantes: electrodos, extractor manual de muestras, refrigerador de aire de escape y dedo frío.


PREPARACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO Y ESTERILIZACIÓN MEDIO DE CULTIVO LBG (Luria Bertani Glucosa):   Medio de culLvo Luria Bertani (LB), concentración 20g/L   Glucosa, 10 g/L

Se introduce en el vaso del biorreactor (Biostat Aplus) (volumen de trabajo 2 L) y se lleva a autoclave.



MONTAJE DEL BIORREACTOR Después de esterilización:   Se introduce la sonda de temperatura Pt-­‐100 en el tubo guiado.   Se colocan las mangueras de las botellas con los medios de corrección adicionales en las bombas peristálBcas correspondientes.   Se calibra la sonda de O2: •  0% O2 : en caliente y sin agitación (inmediatamente después de finalizar la esterilización) Se conecta el agua de refrigeración y el suministro de aire. Se fija el caudal de aporte de aire en el rotámetro en 3,2 L/min. •  100% O2: con una agitación de 650 rpm y una temperatura de 30°C.


  E l p H d e l m e d i o d e fermentación se ajusta a 7,0 tras la esterilización con las disoluciones:   Disolución ácida (HCl, 1 M)   Disolución básica (NaOH, 1 M)


Se lanza con la aplicación informáBca Operators panel un nuevo batch y se inicia la adquisición y registro de datos.

Las condiciones de trabajo serán:  pH: 7  Agitación: 150 rpm  Temperatura: 30°C  Caudal de aire: 3,2 L/min


Se hace la primera toma de muestra del medio de culBvo para determinar las condiciones iniciales de azúcares reductores y biomasa.


Se inoculan 100 mL de X. campestris en el biorreactor. Se hace la segunda toma de muestra.

Para el seguimiento de la fermentación se toman cuatro muestras diarias realizando los ensayos de azúcares reductores y determinación de biomasa.


Durante el ensayo se registran los valores de las siguientes variables: • Temperatura de operación • Oxígeno disuelto • Agitación • Volumen de ácido añadido • Volumen de base añadida


SEGUIMIENTO DE LA EXPERIENCIA 1)  Azúcares reductores 2)  Determinación de la biomasa


1.DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES 1.1. OBJETO El objeBvo de este análisis consiste en uBlizar la técnica de espectrofotometría para elaborar una recta patrón de glucosa a parBr de concentraciones conocidas de este monosacárido. Mediante interpolación, esta recta permite determinar la concentración de glucosa en una muestra desconocida. Se uBlizará un método colorimétrico que uBliza el ácido 3,5-­‐ dinitrosalicílico (DNS) para que reaccione con la glucosa. 1.2. ALCANCE Este método colorimétrico es aplicable a muestras de glucosa dentro de un rango de linealidad de 0-­‐ 1 g /L siguiendo la Ley de Lambert-­‐Beer.


1.3. FUNDAMENTO TEÓRICO: En el azúcar reductor se presenta la oxidación del grupo funcional aldehído de la glucosa y del grupo carbonilo en la fructosa. Simultáneamente el ácido 3,5-­‐ dinitrosalicílico (DNS) es reducido a un compuesto nitroaminado de color pardo oscuro a marrón según la concentración de los azúcares cuya intensidad de color se mide en espectrofotómetro a 540 nm.

DNS


PREPARACIÓN DE DISOLUCIONES: Ácido 3,5-­‐dinitrosalicílico, DNS  1416 mL Agua desBlada  10,6 g Ácido dinitrosalicílico, C7H4N2O7  19,8 g Hidróxido de sodio, NaOH  306 g KNa tartrato, C4H4KNaO6·∙4 H2O (Sal de Rochelle)  7,6 mL Fenol (funde a 50ºC)  8,3 g Na Metabisulfito, Na2S2O5 Conservar en bote oscuro (color topacio), estable durante varias semanas. Disolución patrón de 1 g/L glucosa Pesar 1 gramo de glucosa en balanza analíBca, enrasar a 1000 mL con agua desBlada en matraz aforado, limpio y seco. Conservar en bote oscuro (color topacio), conservar en frío mientras no se uBliza.


1.4. PREPARACIÓN DEL EQUIPO Y CURVA DE CALIBRADO -­‐ PREPARACIÓN DE PATRONES A parBr de una solución patrón de 1 g/L de glucosa, se prepara una serie de soluciones de glucosa de disBnta concentración, tal y como se indica en la tabla siguiente. Una vez preparadas las diluciones se homogeneizan. Concentración final (g/L)

Volumen patrón glucosa 1 g/L (mL)

Agua desLlada (mL)

ReacLvo DNS (mL)

0

0

1

3

1

0,2

0,8

3

2

0,4

0,6

3

3

0,6

0,4

3

4

0,8

0,2

3

5

1

0

3

A conBnuación se colocan los tubos en el baño termostáBco a 100°C, se llevan a ebullición durante 5 minutos y se enfrían. De cada tubo, se toma 1 mL que se transfiere a un nuevo tubo de ensayo debidamente eBquetado, añadiendo 10 mL de agua desBlada.


-­‐ PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS: Siguiendo el procedimiento conocido para la preparación de patrones, preparamos las muestras de acuerdo al siguiente esquema: 0,1 mL muestra + 0,9 mL agua desLlada + 3 mL DNS Mezclar y hervir 5 minutos. Enfriar y realizar la dilución correspondiente para ajustarla a nuestra recta de calibrado. -­‐ MEDIDAS ESPECTROFOTOMÉTRICAS: Se mide la absorbancia de los patrones y muestras a 540 nm. Se hace la recta de calibrado con los patrones y a parBr de la ecuación de la misma se calcula la concentración de las muestras, teniendo en cuenta el factor de dilución.


1.5. RECTA DE CALIBRADO •  A conBnuación se muestran los valores de absorbancia obtenidos para los patrones preparados.

[Glucosa] (g/L) 0,02

A 0,111

0,04

0,267

0,06

0,429

0,08

0,579

0,1

0,714


1.6. RESULTADOS OBTENIDOS DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES 14

ABSORBANCIA

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

0,497 0,465 0,332 0,326 0,336 0,324 0,272 0,167 0,195 0,182 0,180 0,024

CONCENTRACIÓN (g/L)

11,5 10,8 7,9 7,8 7,4 7,7 6,6 4,3 4,9 4,2 4,6 1,2

12

10 CONCENTRACIÓN (g/L)

Nº MUESTRA

8

6

4

2

0 0

5

10

15

20

25

30

35

40

TIEMPO (horas)

45

50

55

60

65

70


2. DETERMINACIÓN DE LA BIOMASA Se lleva a cabo mediante la esBmación del peso de células secas: Procedimiento: Volumen de muestra: 5 mL   Se centrifugan las muestras (2500 g, 10 min)   Se descarta el sobrenadante   Las células se lavan con NaCl (0,9 % m/V) y se vuelven a centrifugar (Esta operación se repite dos veces).   Las células se secan en una estufa a 110°C durante 24 h hasta peso constante.   Se determina la masa en balanza analíBca.


La biomasa se representa en función del tiempo de fermentación (h) DETERMINACIÓN DE BIOMASA 0.016

Nº MUESTRA TIEMPO (h) BIOMASA (g) 0,1

0,0043

2

12,0

0,0076

3

15,0

0,0100

5

23,0

0,0111

6

36,0

0,0121

8

45,0

0,0146

10

49,0

0,0149

11

62,0

0,0149

0.012

0.010 Masa (g)

1

0.014

0.008

0.006

0.004

0.002

0.000 0

10

20

30

40

TIEMPO (h)

50

60

70


ENSAYO DE TOXICIDAD


ENSAYO DE TOXICIDAD 1.  Se preparan 10 tubos de medio de culBvo LBG con disBntas concentraciones de anBespumante (PolieBlenglicol meBléter PM 2000) 2.  Se inocula X. campestris. 3.  Los tubos se incuban en estufa a 25°C con agitación V medio V anLespumante (µl) (ml) orbital (250 rpm) durante 24 horas.

5 µl

75 µl 50 µl

250 µl 100 µl

750 µl 500 µl

1500 µl 1000 µl

2000 µl

5

5

5

50

5

75

5

100

5

250

5

500

5

750

5

1000

5

1500

5

2000


ENSAYO DE TOXICIDAD RESULTADO: • E n todos ellos se observa turbidez, por lo tanto el a n B e s p u m a nte n o e s tóx i co e n n i n g u n a d e e sta s concentraciones.


AISLAMIENTO DE GOMA XANTANA


AISLAMIENTO DEL BIOPOLÍMERO GOMA XANTANA 1.  Se extrae el culBvo de X. campestris del biorreactor. 2.  Se separan las células del medio de culBvo mediante centrifugación: Condiciones de centrifugación: v = 4200 rpm t acel. = 105 s

FCR = 3.609 t decel. = 85 s

t cent. = 5 min

3.  Se adiciona alcohol isopropílico al sobrenadante para precipitar la goma xantana (1 vol de muestra : 3 vol de alcohol isopropílico). 4.  El producto se filtra a vacío o se centrifuga. 5.  El precipitado se lava de nuevo con 2 vol de alcohol isopropílico y se centrifuga para separar la goma xantana del disolvente. 6.  Se seca el producto a temperatura ambiente (Se puede secar en estufa a 40 ºC si fuese necesario). 7.  El producto obtenido se muele hasta obtener un polvo fino.


CENTRIFUGACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO


PRECIPITACIÓN DEL BIOPOLÍMERO

nol Adición de Alcohol isopropílico (1:3)

72 h

EN LOS PRIMEROS EXPERIMENTOS EL POLIMERO SE DEPOSITÓ EN EL FONDO, EN EL ÚLTIMO APARECIÓ EN LA SUPERFICIE


FILTRACIÓN

1er EXPERIMENTO


SECADO Y MOLIENDA DEL BIOPOLÍMERO

SECADO


RESULTADOS MASA DE BIOPOLÍMERO OBTENIDO EXPERIMENTO 1

EXPERIMENTO 2

EXPERIMENTO CULTIVO EN ESTUFA

V culBvo: 2 L

V culBvo: 1,2 L

V culBvo: 0,2 L

V culBvo: 1,2 L

0,24 g

1,87 g

ND

1,61 g

Rendimiento experimento 3: 0,130 g xantano/g sustrato consumido

EXPERIMENTO 3


RECUPERACIÓN DE ALCOHOL ISOPROPÍLICO DESTILACIÓN A VACÍO EN ROTAVAPOR


RECUPERACIÓN DE ALCOHOL ISOPROPÍLICO Para la precipitación de xantano se necesita 3 volúmenes de alcohol isopropílico por cada 2 volúmenes de muestra, lo que equivale a unos 3L de alcohol. También se vuelve a uBlizar alcohol en el lavado de la goma xantana. Para recuperar este alcohol, desBlamos a vacío en el rotavapor las aguas de filtrado y/o centrifugación. Las condiciones de desBlación son las siguientes: T = 72 °C P = 0,8 bar

Punto de ebullición: 82-83 ºC Densidad: 0,785

En esta desBlación, no se recupera la totalidad de alcohol isopropílico, sino una mezcla de este alcohol y agua. Para garanBzar que recuperamos el alcohol en la misma proporción en este proceso, mantenemos las mismas condiciones de presión y temperatura durante las diferentes desBlaciones.


RECUPERACIÓN DE ALCOHOL ISOPROPÍLICO

Condensador

Bomba de vacío

Balón de muestra

Balón recolección Baño de agua Unidad de control


RECUPERACIÓN DE ALCOHOL ISOPROPÍLICO En este proceso se han encontrado algunos problemas: -­‐  Formación de espuma, en cuyo caso se rompe el vacío y se intenta seguir la desBlación hasta que la formación de la espuma es conBnua y por lo tanto se desecha el contenido del matraz de desBlación (Para evitar este problema se podría uBlizar un adaptador anBespuma). -­‐  Formación de azeótropos: No se sabe en que proporción. Habría que hacer un ensayo de densidad y averiguar la proporción de alcohol y agua en el desBlado mediante la determinación del grado alcohólico. El alcohol recuperado se eBqueta con nombre y fecha en la que se desBló y se almacena en botellas de color topacio para reuBlizarlo en los siguientes experimentos.


PROBLEMAS DE OPERACIÓN


1-­‐ Calibración de la sonda de Oxígeno Calibración del 0 % de oxígeno: Después de la esterilización, a una temperatura todavía alta (±80°C) y sin haber comenzado la agitación, se realiza la calibración del sensor y salta la alarma de la figura: “Calib out of range”.

Solución 1: Cero eléctrico Tras conversación telefónica con el técnico de Sartorius se nos insta a desenchufar la sonda pO 2 para que el aparato realice un cero eléctrico, lo que no da resultado y de nuevo salta la alarma en panel.


Solución 2: Ajuste por pendiente Otra alternaBva fue fijar una pendiente de 60,0 nA (ver figura), y esperar a que el valor de la corriente eléctrica (ELEC, ver figura) fuese inferior a 10 nA. Observamos que la medida del electrodo desciende a 0,0.


2-­‐ Problema con la calibración de la sonda de pH

Se realiza la calibración con dos disoluciones tampón: pH 4 y pH 7. En el tercer experimento, la calibración fallaba y aparecía la pantalla “fuera de rango”. En la pantalla la temperatura que figuraba era de 450 ºC, no se había conectado la sonda de temperatura a la unidad de control antes de realizar la calibración de pH. Una vez subsanado el error no hubo problemas.


3-­‐ Formación de espuma

A lo largo de las 3 experiencias se formó una gran canBdad de espuma. Ésta rebosaba por la parte superior (a pesar del cierre de la junta tórica) y causaba un pequeño goteo. Problemas originados por la espuma: 1. Goteo en el desarrollo de la prácBca. Para reducirlo hemos tomado las siguientes medidas: • Limitación del volumen inicial del caldo de culBvo a 1,2 L. • Añadir anLespumante en canBdades y concentraciones cada vez mayores. Lo que ha supuesto la realización de ensayos de toxicidad del agente anBespumante. El problema no se ha solucionado. 2. Oxidación de las partes metálicas del biorreactor en contacto con la espuma. 3. Colmatación de los filtros de aire.


4-­‐ Esterilización en autoclave En una de la experiencias la no colocación de pinzas Hoffman para estrangular las tuberías de látex (ver figura), que conectan los frascos de ácido y de base con el biorreactor, ha provocado la aspiración de ácido y base al comparBmento del reactor donde se encontraba el caldo de culBvo durante la esterilización. El color pasó de amarillo a marrón.


5-­‐ Control de O2 en el desarrollo de la prácLca. El control de O2 se realiza variando únicamente el número de revoluciones del agitador. En experiencias previas -­‐siguiendo el guión-­‐ se fija un caudal de 1,5 L/min y se permite un intervalo 175-­‐300 rpm. Se observa (ver fig. línea gruesa roja) que en esas condiciones la aireación no es suficiente y el O2 disuelto cae a cero.

En la úlBma experiencia se fija el caudal a 3,2 L/min y se controla la agitación en un intervalo de 150-­‐650 rpm. Con las nuevas condiciones (ver fig. línea fina naranja) el n i v e l d e o x í g e n o n o desciende del 60% durante el desarrollo de la prácBca.


6-­‐ Imposibilidad de realizar un batch. Al iniciar el tercer experimento e intentar lanzar un nuevo batch se encontró que el anterior no había finalizado. Cuando se intentó detenerlo salta una pantalla de error donde el Bempo sigue contando (ver figura) e imposibilita el inicio de otro nuevo. Preguntando la solución a Sartorius comentó: El MFCS/DA no permite eliminar batches que se han quedado colgados, así que solo cabe reinstalar el sozware.


BIBLIOGRAFÍA Produc1on of a Biopolymer at Reactor Scale: A Laboratory Experience J. Chem. Educ., 2011, 88 (8), pp 1175–1177. DOI: 10.1021/ed100681b

PÁGINAS WEB CONSULTADAS • h~p://milksci.unizar.es/bioquimica/temas/azucares/xantana.html • h~p://cvnaturplas.dnsalias.com/materials-­‐naturales/polimeros-­‐ biodegradables/principales-­‐aplicaciones-­‐de-­‐polimeros/polimeros-­‐ biodegradables-­‐de-­‐origen-­‐natural/polisacaridos?set_language=es • h~p://laciudadatomica.blogspot.com.es/2011/12/325-­‐xantano.html


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