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PROYECTO DE  INNOVACIÓN:   PRODUCCIÓN  DE  GOMA   XANTANA  EN  BIORREACTOR   IES  A  SARDIÑEIRA  

Departamento de  ciclos  forma1vos  de  Química   Curso  2011-­‐2012  


OBJETIVO Obtención   del   biopolímero   de   interés   comercial   e   industrial   goma  xantana  mediante  la  fermentación  aeróbica  de  la  bacteria   Xanthomonas  campestris.   OBJETIVO  EDUCATIVOS   • Aplicación  de  técnicas  microbiológicas  y  analíBcas.   • Puesta  en  marcha  y  manejo  de  un  biorreactor.   • Recolección   de   datos,   tratamiento   matemáBco   y   construcción   y   compresión  de  gráficas.   • Recuperación  de  la  goma  xantana  del  medio  de  fermentación.  


INTRODUCCIÓN La   goma   xantana   es   un   heteropolisacárido   extracelular   producido   por   la   fermentación   aeróbica   de   la   bacteria   Xanthomonas   campestris,  es  un  patógeno  de  las  coles.    

Hoja de  col  dañada  por  Xanthomonas  campestris


PROPIEDADES •  Alta   viscosidad   y   solubilidad   en   agua:   la   viscosidad   de   una   disolución   acuosa  de  goma  xantana  del  1%    es  100  veces  mayor  que  la  viscosidad  de   una  disolución  de  gelaBna  en  agua  de  la  misma  densidad.   •  Tiene   una   reología   pseudoplásLca   especial:   bajo   la   temperatura   no   cambia,  forma  los  cambios  reversibles  de  sol  y  gel  de  acuerdo  al  cambio  de   fuerzas  de  máquinas,  por  lo  que  es  un  estabilizador  de  emulsión.   •  Su   viscosidad   y   sus   propiedades   pueden   mantenerse   bajo   temperaturas   de    -­‐18  a  120ºC,  pH  =2  -­‐  12  y  concentraciones  salinas  variables.   •  Buena   compaLbilidad:   puede   formar   un   sistema   de   espesamiento   estable   combinando   con   ácidos,   bases,   sales,   enzimas,   agentes   acBvos   superficiales,   anBsépBcos,   agentes   oxidantes   (entre   otros   materiales   químicos),  y  al  mismo  Bempo  mantener  la  reología.  


APLICACIONES INDUSTRIA    ALIMENTARIA:      Adhesivo:  Glaseados  y  recubrimientos.        AgluLnante:  Alimentos  para  mascotas.        Recubrimiento:  Confitería.        Emulsificante:  Aderezos  para  ensaladas.      Encapsulante:  Saborizantes  en  polvo.         Formación   de   película:   Recubrimientos   protectores,   envoltura   de   salchichas.        Estabilizante  de  espuma:  Cerveza.         Homogeneizador,   SusLtuto   de   gluten   y   procesamiento   de   masa:  Panadería,  pastas…  


APLICACIONES OTRAS  INDUSTRIAS:   También  es  uBlizado  en  otras  industrias  como  la  cosméBca    o  la  farmacéuBca   (para   mantener   en   suspensión   a   los   anBbióBcos   u   otros   fármacos),   la   industria   agrícola   (mejora   la   presencia   de   fungicidas,   herbicidas   e   insecBcidas)   y   también   es   uBlizado   en   la   industria   petrolífera   química,   papelera  y  texBl.  


OBTENCIÓN DE  GOMA  XANTANA   EN  EL  IES  A  SARDIÑEIRA  


PREPARACIÓN DEL  INÓCULO   El microrganismo X. campestris (ATCC ) se cultiva en un medio que contiene triptona (1 % m/v), extracto de levadura (0,5 % m/v), NaCl (0,5 % m/v) y glucosa (1 % m/v) (medio Luria-Bertani más glucosa, LBG). https://vimeo.com/41502560


PREPARACIÓN DEL INÓCULO: Las colonias aisladas de X. campestris se transfieren a matraces Erlenmeyer de 250 mL que contienen 100 mL de medio LBG.


PREPARACIÓN DEL INÓCULO: Los frascos se tapan con tapones de algodón para permitir la aireación pasiva y se incuban en un agitador orbital a 25°C y 200 rpm durante 72h.


MONTAJE DEL BIORREACTOR Antes  de  la  esterilización  en  autoclave:       Se   calibra   el   electrodo   de   pH:   Antes   de   montarlo   en   el   recipiente   de   culBvo,  se  debe  calibrar  el  punto  cero  y  la  pendiente  del  sensor  de  pH.         Se   conecta   sonda   de   oxígeno:   Antes   de   la   calibración   es   necesario   polarizar  el  electrodo  de  pO2  durante  un  mínimo  de  2  horas.      Se  colocan  los  filtros  de  aire.       Se  conectan  las  disoluciones  ácida,  base  y  anBespumante  a  las  entradas   correspondientes  del  biorreactor.       Se  monta  el  tubo  de  guiado  de  la  sonda  de  temperatura  en  el  recipiente   de  culBvo.       Se   colocan   en   el   biorreactor   los   elementos   restantes:   electrodos,   extractor  manual  de  muestras,  refrigerador  de  aire  de  escape  y  dedo  frío.    


PREPARACIÓN DEL   MEDIO  DE  CULTIVO  Y   ESTERILIZACIÓN   MEDIO    DE  CULTIVO  LBG   (Luria  Bertani  Glucosa):       Medio   de   culLvo   Luria   Bertani   (LB),  concentración  20g/L      Glucosa,  10  g/L  

Se introduce   en   el   vaso   del   biorreactor   (Biostat   Aplus)   (volumen   de   trabajo   2   L)   y   se  lleva  a  autoclave.    


MONTAJE DEL BIORREACTOR Después  de  esterilización:      Se  introduce  la  sonda  de  temperatura  Pt-­‐100  en  el  tubo  guiado.       Se  colocan  las  mangueras  de  las  botellas  con  los  medios  de  corrección   adicionales  en  las  bombas  peristálBcas  correspondientes.      Se  calibra  la  sonda  de  O2:   •    0%  O2   :  en  caliente  y  sin  agitación  (inmediatamente  después  de  finalizar   la  esterilización)   Se   conecta   el   agua   de   refrigeración   y   el   suministro   de   aire.   Se   fija   el   caudal   de  aporte  de  aire  en  el  rotámetro  en  3,2  L/min.   •   100%  O2:  con  una  agitación  de  650  rpm  y  una  temperatura  de  30°C.  


  E l   p H   d e l   m e d i o   d e   fermentación  se  ajusta  a  7,0  tras  la   esterilización  con  las  disoluciones:      Disolución  ácida  (HCl,  1  M)      Disolución  básica  (NaOH,  1  M)  


Se lanza  con  la  aplicación  informáBca  Operators  panel  un  nuevo  batch  y  se     inicia  la  adquisición  y  registro  de  datos.  

Las condiciones   de   trabajo   serán:    pH:  7    Agitación:  150  rpm    Temperatura:  30°C    Caudal  de    aire:  3,2  L/min  


Se hace  la  primera  toma  de  muestra    del   medio   de   culBvo   para   determinar   las   condiciones   iniciales   de   azúcares   reductores  y  biomasa.      


Se inoculan   100   mL   de   X.   campestris     en   el   biorreactor.     Se  hace  la  segunda  toma   de  muestra.  

Para el   seguimiento   de   la   fermentación   se   toman   cuatro   muestras   diarias   realizando  los  ensayos  de  azúcares  reductores  y  determinación  de  biomasa.  


Durante el  ensayo  se  registran  los  valores  de  las  siguientes  variables:   • Temperatura  de  operación   • Oxígeno  disuelto   • Agitación     • Volumen  de  ácido  añadido   • Volumen  de  base  añadida  


SEGUIMIENTO DE  LA   EXPERIENCIA   1)  Azúcares  reductores   2)  Determinación  de  la  biomasa  


1.DETERMINACIÓN DE  AZÚCARES   REDUCTORES   1.1.  OBJETO       El   objeBvo   de   este   análisis   consiste   en   uBlizar   la   técnica   de   espectrofotometría  para  elaborar  una  recta  patrón  de  glucosa  a  parBr  de   concentraciones  conocidas  de  este  monosacárido.  Mediante  interpolación,   esta  recta  permite  determinar  la  concentración  de  glucosa  en  una  muestra   desconocida.  Se  uBlizará  un  método  colorimétrico  que  uBliza  el  ácido  3,5-­‐ dinitrosalicílico  (DNS)  para  que  reaccione  con  la  glucosa.       1.2.  ALCANCE       Este  método  colorimétrico  es  aplicable  a  muestras  de  glucosa  dentro  de  un   rango  de  linealidad  de  0-­‐  1  g /L  siguiendo  la  Ley  de  Lambert-­‐Beer.    


1.3. FUNDAMENTO  TEÓRICO:   En   el   azúcar   reductor   se   presenta   la   oxidación   del   grupo   funcional   aldehído   de   la   glucosa   y   del   grupo   carbonilo   en   la   fructosa.   Simultáneamente   el   ácido   3,5-­‐ dinitrosalicílico  (DNS)  es  reducido  a  un  compuesto  nitroaminado  de  color  pardo  oscuro   a  marrón  según  la  concentración  de  los  azúcares  cuya  intensidad  de  color  se  mide  en   espectrofotómetro  a  540  nm.    

DNS


PREPARACIÓN DE  DISOLUCIONES:   Ácido  3,5-­‐dinitrosalicílico,  DNS        1416  mL  Agua  desBlada    10,6  g  Ácido  dinitrosalicílico,  C7H4N2O7    19,8  g  Hidróxido  de  sodio,  NaOH    306  g  KNa  tartrato,  C4H4KNaO6·∙4  H2O  (Sal  de  Rochelle)    7,6  mL  Fenol  (funde  a  50ºC)    8,3  g  Na  Metabisulfito,  Na2S2O5   Conservar  en  bote  oscuro  (color  topacio),  estable  durante  varias  semanas.       Disolución  patrón  de  1  g/L  glucosa       Pesar  1  gramo  de  glucosa  en  balanza  analíBca,  enrasar  a  1000  mL  con  agua   desBlada  en  matraz  aforado,  limpio  y  seco.    Conservar  en  bote  oscuro  (color  topacio),  conservar  en  frío  mientras  no  se   uBliza.  


1.4. PREPARACIÓN  DEL  EQUIPO  Y  CURVA  DE  CALIBRADO   -­‐ PREPARACIÓN  DE  PATRONES   A  parBr  de  una  solución  patrón  de  1  g/L  de  glucosa,  se  prepara  una  serie  de   soluciones   de   glucosa   de   disBnta   concentración,   tal   y   como   se   indica   en   la   tabla  siguiente.  Una  vez  preparadas  las  diluciones  se  homogeneizan.   Concentración   final  (g/L)  

Volumen patrón   glucosa  1  g/L  (mL)  

Agua desLlada  (mL)  

ReacLvo DNS  (mL)  

0

0

1

3

1

0,2

0,8

3

2

0,4

0,6

3

3

0,6

0,4

3

4

0,8

0,2

3

5

1

0

3

A conBnuación   se   colocan   los   tubos   en   el   baño   termostáBco   a   100°C,   se   llevan  a  ebullición  durante  5  minutos  y  se  enfrían.   De   cada   tubo,   se   toma   1   mL   que   se   transfiere   a   un   nuevo   tubo   de   ensayo   debidamente  eBquetado,  añadiendo  10  mL  de  agua  desBlada.    


-­‐ PREPARACIÓN  DE  LAS  MUESTRAS:   Siguiendo  el  procedimiento  conocido  para  la  preparación  de  patrones,  preparamos   las  muestras  de  acuerdo  al  siguiente  esquema:   0,1  mL  muestra  +  0,9  mL  agua  desLlada  +  3  mL  DNS   Mezclar   y   hervir   5   minutos.   Enfriar   y   realizar   la   dilución   correspondiente   para   ajustarla  a  nuestra  recta  de  calibrado.   -­‐ MEDIDAS  ESPECTROFOTOMÉTRICAS:   Se  mide  la  absorbancia  de  los  patrones  y  muestras  a  540  nm.   Se   hace   la   recta   de   calibrado   con   los   patrones   y   a   parBr   de   la   ecuación   de   la   misma   se   calcula   la   concentración   de   las   muestras,   teniendo   en   cuenta   el   factor   de   dilución.  


1.5. RECTA  DE  CALIBRADO   •    A   conBnuación   se   muestran   los   valores   de   absorbancia   obtenidos   para   los   patrones  preparados.  

[Glucosa] (g/L)   0,02  

A 0,111  

0,04

0,267

0,06

0,429

0,08

0,579

0,1

0,714


1.6. RESULTADOS OBTENIDOS DETERMINACIÓN DE  AZÚCARES   REDUCTORES   14  

ABSORBANCIA

1 2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12  

0,497 0,465   0,332   0,326   0,336   0,324   0,272   0,167   0,195   0,182   0,180   0,024  

CONCENTRACIÓN (g/L)  

11,5 10,8   7,9   7,8   7,4   7,7   6,6   4,3   4,9   4,2   4,6   1,2  

12

10 CONCENTRACIÓN  (g/L)  

Nº MUESTRA  

8

6

4

2

0 0  

5

10

15

20

25

30

35

40

TIEMPO (horas)  

45

50

55

60

65

70


2. DETERMINACIÓN  DE  LA  BIOMASA   Se  lleva  a  cabo  mediante  la  esBmación  del  peso  de  células  secas:     Procedimiento:    Volumen  de  muestra:  5  mL      Se  centrifugan    las  muestras  (2500  g,  10  min)      Se  descarta  el  sobrenadante         Las   células   se   lavan   con   NaCl   (0,9   %   m/V)   y   se   vuelven   a   centrifugar   (Esta   operación  se  repite  dos  veces).       Las   células   se   secan   en   una   estufa   a   110°C   durante   24   h   hasta   peso   constante.      Se  determina  la  masa  en  balanza  analíBca.  


La biomasa se representa en función del tiempo de fermentación (h) DETERMINACIÓN DE  BIOMASA   0.016  

Nº MUESTRA   TIEMPO  (h)   BIOMASA  (g)   0,1  

0,0043

2

12,0

0,0076

3

15,0

0,0100

5

23,0

0,0111

6

36,0

0,0121

8

45,0

0,0146

10

49,0

0,0149

11

62,0

0,0149

0.012

0.010 Masa  (g)  

1

0.014

0.008

0.006

0.004

0.002

0.000 0  

10

20

30

40

TIEMPO (h)  

50

60

70


ENSAYO DE  TOXICIDAD  


ENSAYO DE  TOXICIDAD   1.    Se   preparan   10   tubos   de   medio   de   culBvo   LBG   con   disBntas     concentraciones  de  anBespumante  (PolieBlenglicol  meBléter    PM  2000)   2.   Se  inocula    X.  campestris.   3.   Los  tubos  se  incuban  en  estufa  a  25°C    con  agitación   V  medio   V  anLespumante   (µl)   (ml)          orbital  (250  rpm)  durante  24  horas.  

5 µl

75 µl 50 µl

250 µl 100 µl

750 µl 500 µl

1500 µl 1000 µl

2000 µl

5

5

5

50

5

75

5

100

5

250

5

500

5

750

5

1000

5

1500

5

2000


ENSAYO DE  TOXICIDAD   RESULTADO:     • E n   todos   ellos   se   observa   turbidez,   por   lo   tanto   el   a n B e s p u m a nte   n o   e s   tóx i co   e n   n i n g u n a   d e   e sta s   concentraciones.  


AISLAMIENTO DE  GOMA   XANTANA  


AISLAMIENTO DEL  BIOPOLÍMERO   GOMA  XANTANA   1.  Se  extrae  el  culBvo  de  X.  campestris  del  biorreactor.   2.  Se  separan  las  células  del  medio  de  culBvo  mediante  centrifugación:   Condiciones de centrifugación: v = 4200 rpm t acel. = 105 s

FCR = 3.609 t decel. = 85 s

t cent. = 5 min

3.  Se adiciona  alcohol  isopropílico  al  sobrenadante  para  precipitar  la  goma   xantana  (1  vol  de  muestra  :  3  vol  de  alcohol  isopropílico).     4.  El  producto  se  filtra  a  vacío  o  se  centrifuga.   5.  El   precipitado   se   lava   de   nuevo   con   2   vol   de   alcohol   isopropílico   y   se   centrifuga  para  separar  la  goma  xantana  del  disolvente.   6.  Se  seca  el  producto  a  temperatura  ambiente  (Se  puede  secar  en  estufa  a   40  ºC  si  fuese  necesario).   7.  El  producto  obtenido  se  muele  hasta  obtener  un  polvo  fino.  


CENTRIFUGACIÓN DEL  MEDIO  DE  CULTIVO  


PRECIPITACIÓN DEL  BIOPOLÍMERO  

nol Adición de Alcohol isopropílico (1:3)

72 h

EN LOS PRIMEROS EXPERIMENTOS EL POLIMERO SE DEPOSITÓ EN EL FONDO, EN EL ÚLTIMO APARECIÓ EN LA SUPERFICIE


FILTRACIÓN

1er EXPERIMENTO


SECADO Y  MOLIENDA  DEL  BIOPOLÍMERO  

SECADO


RESULTADOS MASA  DE  BIOPOLÍMERO  OBTENIDO   EXPERIMENTO  1  

EXPERIMENTO 2  

EXPERIMENTO CULTIVO  EN   ESTUFA  

V culBvo:  2  L  

V culBvo:  1,2  L  

V culBvo:  0,2  L  

V culBvo:  1,2  L  

0,24 g  

1,87 g  

ND

1,61 g  

Rendimiento experimento 3: 0,130 g xantano/g sustrato consumido

EXPERIMENTO 3  


RECUPERACIÓN DE  ALCOHOL   ISOPROPÍLICO   DESTILACIÓN  A  VACÍO     EN  ROTAVAPOR  


RECUPERACIÓN DE  ALCOHOL  ISOPROPÍLICO   Para   la   precipitación   de   xantano   se   necesita   3   volúmenes   de   alcohol   isopropílico   por   cada   2   volúmenes  de  muestra,  lo  que  equivale  a  unos  3L   de   alcohol.   También   se   vuelve   a   uBlizar   alcohol   en  el  lavado  de  la  goma  xantana.   Para   recuperar   este   alcohol,   desBlamos   a   vacío   en   el   rotavapor   las   aguas   de   filtrado   y/o   centrifugación.     Las  condiciones  de  desBlación  son  las  siguientes:   T  =  72  °C   P  =  0,8  bar  

Punto de ebullición: 82-83 ºC Densidad: 0,785

En esta  desBlación,  no  se  recupera  la  totalidad  de  alcohol  isopropílico,  sino   una  mezcla  de  este  alcohol  y  agua.   Para  garanBzar  que  recuperamos  el  alcohol  en  la  misma  proporción  en  este   proceso,   mantenemos   las   mismas   condiciones   de   presión   y   temperatura   durante  las  diferentes  desBlaciones.  


RECUPERACIÓN DE  ALCOHOL  ISOPROPÍLICO  

Condensador

Bomba de vacío

Balón de muestra

Balón recolección Baño de agua Unidad de control


RECUPERACIÓN DE  ALCOHOL  ISOPROPÍLICO   En  este  proceso  se  han  encontrado  algunos  problemas:   -­‐  Formación  de  espuma,  en  cuyo  caso  se  rompe  el  vacío  y  se  intenta  seguir   la   desBlación   hasta   que   la   formación   de   la   espuma   es   conBnua   y   por   lo   tanto  se  desecha  el  contenido  del  matraz  de  desBlación  (Para  evitar  este   problema  se  podría  uBlizar  un  adaptador  anBespuma).   -­‐  Formación   de   azeótropos:   No   se   sabe   en   que   proporción.   Habría   que   hacer  un  ensayo  de  densidad  y  averiguar  la  proporción  de  alcohol  y  agua   en  el  desBlado  mediante  la  determinación  del  grado  alcohólico.   El  alcohol  recuperado  se  eBqueta  con  nombre  y  fecha  en  la  que  se  desBló  y  se   almacena   en   botellas   de   color   topacio   para   reuBlizarlo   en   los   siguientes   experimentos.  


PROBLEMAS DE  OPERACIÓN  


1-­‐ Calibración  de  la  sonda  de  Oxígeno   Calibración   del   0   %   de   oxígeno:   Después   de   la   esterilización,   a   una   temperatura   todavía   alta   (±80°C)   y   sin   haber   comenzado   la   agitación,   se   realiza   la   calibración   del   sensor  y  salta  la  alarma  de  la  figura:  “Calib  out  of  range”.  

Solución 1:  Cero  eléctrico   Tras   conversación   telefónica   con  el  técnico  de  Sartorius  se   nos   insta   a   desenchufar   la   sonda   pO 2   para   que   el   aparato   realice   un   cero   eléctrico,   lo   que   no   da   resultado   y   de   nuevo   salta   la   alarma  en  panel.      


Solución 2:  Ajuste  por  pendiente   Otra  alternaBva  fue  fijar  una  pendiente  de  60,0  nA  (ver  figura),  y  esperar  a  que  el  valor   de  la  corriente  eléctrica  (ELEC,  ver  figura)  fuese  inferior  a  10  nA.     Observamos  que  la  medida  del  electrodo  desciende  a  0,0.  


2-­‐ Problema  con  la  calibración  de  la  sonda  de  pH  

Se realiza la calibración con dos disoluciones tampón: pH 4 y pH 7. En el tercer experimento, la calibración fallaba y aparecía la pantalla “fuera de rango”. En la pantalla la temperatura que figuraba era de 450 ºC, no se había conectado la sonda de temperatura a la unidad de control antes de realizar la calibración de pH. Una vez subsanado el error no hubo problemas.


3-­‐ Formación  de  espuma  

A lo   largo   de   las   3   experiencias   se   formó   una   gran   canBdad   de   espuma.   Ésta   rebosaba   por   la   parte   superior   (a   pesar   del   cierre   de   la   junta   tórica)  y  causaba  un  pequeño  goteo.   Problemas  originados  por  la  espuma:   1.   Goteo   en   el   desarrollo   de   la   prácBca.   Para   reducirlo  hemos  tomado  las  siguientes  medidas:            • Limitación  del  volumen   inicial  del  caldo  de   culBvo  a  1,2  L.             • Añadir   anLespumante   en   canBdades   y   concentraciones   cada   vez   mayores.   Lo   que   ha   supuesto   la   realización   de   ensayos   de   toxicidad   del  agente  anBespumante.                  El  problema  no  se  ha  solucionado.   2.   Oxidación   de   las   partes   metálicas   del   biorreactor  en  contacto  con  la  espuma.   3.  Colmatación  de  los  filtros  de  aire.  


4-­‐ Esterilización  en  autoclave   En   una   de   la   experiencias   la   no   colocación   de   pinzas   Hoffman  para  estrangular  las  tuberías  de  látex    (ver   figura),   que   conectan   los   frascos   de   ácido   y     de   base   con   el   biorreactor,   ha   provocado   la   aspiración   de   ácido   y   base   al   comparBmento   del   reactor   donde   se   encontraba   el   caldo   de   culBvo   durante   la   esterilización.  El  color  pasó  de  amarillo  a  marrón.  


5-­‐ Control  de  O2  en  el  desarrollo  de  la  prácLca.   El   control   de   O2   se   realiza   variando   únicamente   el   número   de   revoluciones   del   agitador.   En   experiencias   previas   -­‐siguiendo   el   guión-­‐   se   fija   un   caudal   de   1,5   L/min   y   se   permite  un  intervalo  175-­‐300  rpm.    Se  observa  (ver  fig.  línea  gruesa  roja)  que  en  esas   condiciones  la  aireación  no  es  suficiente  y  el  O2  disuelto  cae  a  cero.    

En la   úlBma   experiencia   se   fija  el  caudal  a  3,2  L/min  y  se   controla   la   agitación   en   un   intervalo   de   150-­‐650   rpm.   Con   las   nuevas   condiciones   (ver  fig.  línea  fina  naranja)  el   n i v e l   d e   o x í g e n o   n o   desciende   del   60%   durante   el  desarrollo  de  la  prácBca.  


6-­‐ Imposibilidad  de  realizar  un  batch.   Al   iniciar   el   tercer   experimento   e   intentar   lanzar   un   nuevo   batch   se   encontró   que   el   anterior   no   había   finalizado.   Cuando   se   intentó   detenerlo   salta   una   pantalla   de   error   donde  el  Bempo  sigue  contando  (ver  figura)  e  imposibilita  el  inicio  de  otro  nuevo.   Preguntando  la  solución  a  Sartorius  comentó:  El  MFCS/DA  no  permite  eliminar  batches   que  se  han  quedado  colgados,  así  que  solo  cabe  reinstalar  el  sozware.  


BIBLIOGRAFÍA Produc1on  of  a  Biopolymer  at  Reactor  Scale:  A  Laboratory  Experience     J.  Chem.  Educ.,  2011,  88  (8),  pp  1175–1177.  DOI:  10.1021/ed100681b  

PÁGINAS WEB  CONSULTADAS   • h~p://milksci.unizar.es/bioquimica/temas/azucares/xantana.html     • h~p://cvnaturplas.dnsalias.com/materials-­‐naturales/polimeros-­‐ biodegradables/principales-­‐aplicaciones-­‐de-­‐polimeros/polimeros-­‐ biodegradables-­‐de-­‐origen-­‐natural/polisacaridos?set_language=es     • h~p://laciudadatomica.blogspot.com.es/2011/12/325-­‐xantano.html    

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