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A GENÉTICA AO SERVIÇO DA PRODUÇÃO ANIMAL Comunicações da jornada de transferência do conhecimento científico e tecnológico


FICHA TÉCNICA: Título: A genética ao serviço da produção animal – Comunicações da jornada de transferência de conhecimento científico e tecnológico Autores: Nuno Carolino, María José Sánchez Guerrero, António Vicente, Rosa Lino Neto Pereira, Maria Inês Carolino, Fátima Santos Silva Editor (coordenação e montagem): Rute Guedes dos Santos Edição: Instituto Politécnico de Portalegre C3i – Coordenação Institucional para a Investigação e a Inovação Coleção C3i, nº 9 ISBN: 978-989-8806-20-8 Data de edição: 2017


ÍNDICE: INTRODUÇÃO .......................................................................................................................................................... 1 NOTAS BIOGRÁFICAS DOS AUTORES ....................................................................................................................... 2 CAPÍTULO 1 – PROJETO ALT-BIOTECH REPGEN: RECURSOS GENÉTICOS ANIMAIS E BIOTECNOLOGIAS: PROJEÇÃO PARA O FUTURO ...................................................................................................................................................... 4 CAPÍTULO 2 - ESTRATÉGIAS DE SELEÇÃO NAS ESPÉCIES PECUÁRIAS ...................................................................... 7 CAPÍTULO 3 - APLICACIÓN DE LA CALIFICACIÓN LINEAL A LA MEJORA GENÉTICA: EVALUACIÓN MORFOLÓGICA ............................................................................................................................................................................... 21 CAPÍTULO 4 - METODOLOGIAS DE SELEÇÃO EM EQUINOS: O CASO DO CAVALO LUSITANO ............................... 41 CAPÍTULO 5 - BANCO PORTUGUÊS DE GERMOPLASMA ANIMAL: COMO RECUPERAR UMA RAÇA A PARTIR DE MATERIAL CRIOPRESERVADO ................................................................................................................................ 59 CAPÍTULO 6 - “CSI” ANIMAL .................................................................................................................................. 70 CAPÍTULO 7 - PATERNIDADE: SER OU NÃO SER .................................................................................................... 80 HIPERLIGAÇÕES DE INTERESSE .............................................................................................................................. 91


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INTRODUÇÃO Rute Guedes dos Santos (Escola Superior Agrária de Elvas, Instituto Politécnico de Portalegre) rutesantos@esaelvas.pt A presente publicação reúne as comunicações apresentadas na jornada de transferência do conhecimento científico e tecnológico “ A genética ao serviço da produção animal”, que teve lugar na Escola Superior Agrária de Elvas a 25 de maio de 2017, inserida nas atividades do projeto ALT Biotech RepGen: RECURSOS GENÉTICOS ANIMAIS E BIOTECNOLOGIAS: PROJEÇÃO PARA O FUTURO. Os oradores que participaram nesta jornada acederam generosa e entusiasticamente ao desafio proposto pela organização da mesma: o de transformar o conteúdo das suas comunicações num texto técnico, que permitisse estender a partilha dos conhecimentos transmitidos a todos os potenciais interessados, como forma adicional de contribuir para a divulgação das ferramentas atualmente utilizadas na genética e melhoramento animal. Nesta área do conhecimento, as últimas décadas proporcionaram o desenvolvimento sem precedentes de tecnologias que permitem que esteja hoje disponível um manancial de informação e um conjunto alargado de serviços, visando a conservação dos recursos genéticos e o melhoramento dos rendimentos produtivos dos efetivos, numa ótica de desenvolvimento sustentável da produção pecuária. A sua aplicação assume também particular relevo no campo da segurança alimentar e defesa do consumidor, temas para os quais a sociedade revela cada vez mais sensibilidade e interesse. Espera-se, assim, que a leitura desta publicação possa contribuir para dar a conhecer um pouco melhor alguns destes temas, e sensibilizar toda a fileira (dos produtores aos consumidores) para a sua importância.

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Autores (da esq. para a dta.): ANCORME; António Vicente; AMIBA; ACBM; Fonte: http://autoctones.ruralbit.com

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NOTAS BIOGRÁFICAS DOS AUTORES Nuno Carolino tem o Doutoramento em Ciência e Tecnologia Animal (2006), Mestrado em Produção Animal (1999) pela Fac. Medicina Veterinária – Univ. Técnica de Lisboa e Licenciatura em Engenharia Zootécnica pela Univ. de Évora (1992). Investigador do INIAV I.P. com atividades na área da conservação e melhoramento genético animal. Ponto Focal Nacional Português para os Recursos Genéticos para a Alimentação e Agricultura na FAO. Representante de Portugal no European Regional Focal Point for Animal Genetic Resources. Presidente da Sociedade Portuguesa de Recursos Genéticos Animais (SPREGA) e Vice-Presidente da Sociedade Portuguesa de Ovinotecnia e Caprinotecnia (SPOC). Membro da Comissão de Gestão e Acompanhamento do Banco Português de Germoplasma Animal. Membro do Centro de Investigação Interdisciplinar em Sanidade Animal (CIISA) da Faculdade de Medicina Veterinária Universidade de Lisboa. Membro da Rede Conbiand - Asociación Sobre la Conservación de la Biodiversidad de los Animales Domésticos Locales para el Desarrollo Rural Sostenible. Editor Coordenador da Revista Actas Iberoamericanas de Conservación Animal (AICA). María José Sánchez Guerrero é licenciada e doutorada em Veterinária pela Universidade de Córdova, e é atualmente investigadora contratada na Universidade de Sevilha e membro do Grupo de Investigação MERAGEM (Mejora de Razas y Genética Molecular) da Universidade de Córdova (Espanha). É autora de 12 artigos publicados em revistas internacionais revistas por pares, 7 comunicações em congressos internacionais e 2 capítulos de livros. É também coautora dos Catálogos de Reprodutores de diversas raças equinas espanholas e participou em 10 projetos de investigação financiados. O seu trabalho de investigação desenvolve-se sobretudo na área da avaliação genética quantitativa, com ênfase na avaliação morfológica e de rendimento em raças equinas e na aplicação das metodologias de classificação linear na morfologia e comportamento de equinos e bovinos. António Vicente concluiu Doutoramento em Ciências Veterinárias - Especialidade em Produção Animal pela Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade de Lisboa em 2015. Mestre em Produção Animal pela Universidade Técnica de Lisboa (2005). Licenciado em Engenharia Agronómica – ramo Produção Animal pelo Instituto Superior de Agronomia da Universidade Técnica de Lisboa (2001). Bacharel em Produção Animal pela Escola Superior Agrária do Instituto Politécnico de Santarém (1997). É Professor Adjunto com grau de Doutor na Escola Superior Agrária do Instituto Politécnico de Santarém. Publicou 13 artigos em revistas especializadas e 8 trabalhos em atas de eventos. Possui 58 itens de produção técnica. Participou em 5 eventos no estrangeiro e 43 em Portugal. Recebeu 2 prémios e/ou homenagens. Atua nas áreas de Ciências Agrárias com especial ênfase em Genética, Recursos Genéticos Animais, Equinicultura e Suinicultura. Membro fundador e Secretário da direção da Sociedade Portuguesa de Recursos Genéticos Animais (SPREGA). Rosa Lino Neto Pereira é licenciada em Medicina Veterinária e Mestre em Produção Animal pela Fac. Medicina Veterinária da Univ. Técnica de Lisboa, e Doutora em Ciências Veterinárias pela Univ. de Trás os Montes e Alto Douro. Atualmente é Investigadora do INIAV, IP. É a responsável pelo Laboratório de Embriologia do INIAV e pela Equipa de

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Colheita e Produção de Embriões, licenciada pela Direção Geral de Alimentação e Veterinária (código PT0305TEPIV). Membro da Direção da Sociedade Portuguesa de Reprodução Animal. Dedica-se às áreas de investigação das técnicas de reprodução assistida, nomeadamente de produção de embriões de diferentes espécies, criopreservação de tecido ovárico, gâmetas e embriões e na identificação/resolução de fatores determinantes para a fertilidade/infertilidade, tanto em projetos de investigação como na conservação dos recursos genéticos animais. Maria Inês Carolino detém o PhD em Ciências Veterinárias, na especialidade de Produção Animal pela Fac. Medicina Veterinária, Univ. de Lisboa (2015). É Mestre em Produção Animal pelo Instituto Superior de Agronomia – Univ. Técnica de Lisboa (2004) e Licenciada em Engenharia Zootécnica pela Univ. de Évora (1991). Responsável Técnica pelos Laboratórios de Genética Molecular de Santarém e de Alter do Chão (desde 2013). Responsável pelo Departamento de Biologia Molecular do Laboratório de medicina Veterinária – Atalaia – Santarém (2007-2012). Responsável pelo Laboratório de Genética Molecular do Departamento de Genética e Melhoramento Animal da Estação Zootécnica Nacional (2003- 2006). Participação nos Consórcios de Biodiversidade da Red Conbiand - BiOvis, BioGoat e BioPig (desde 2011). Técnica Superior dos Quadros do estado onde exerce atividade desde 1991, atualmente no INIAV, I.P., com experiência na área da genética quantitativa na realização de trabalhos no âmbito do melhoramento genético da raça Frísia e na Biologia Molecular no apoio às associações de criadores, agrupamentos de produtores, serviços oficiais e criadores na área da caracterização genética das espécies pecuárias. Implementação/estudo de marcadores genéticos com interesse para as espécies pecuárias, designadamente características produtivas, qualitativas e resistência/ suscetibilidade a doenças e exames de paternidade por análise de ADN de diversas raças de bovinos, ovinos, suínos e caprinos. Fátima Santos Silva licenciou-se em Engenharia Agronómica na Univ. Técnica de Lisboa em 1984, pós graduou-se em Genética, Nutrição Animal e Reprodução no Centro Internacional de Altos Estudios Agronomicos Mediterraneos de Zaragoza (CIHEAM), em 1984 e fez o Mestrado em Produção Animal no mesmo centro em 1994. De 1984 a 1988 lecionou diversas disciplinas do ensino Preparatório, Secundário e Profissional. Ingressou em 1988 como técnico Superior na Estação Zootécnica Nacional (Santarém) do Instituto Nacional de Investigação Agrária, no Departamento de Bovinicultura exercendo funções técnicas e de Investigação na área dos bovinos de carne e leite. Desde 2001 a exercer funções no Departamento de Genética e Melhoramento Animal, atual Unidade de Recursos Genéticos, Reprodução e Melhoramento do INIAV. A partir de 2003 a sua atividade centrou-se na área da Genética Molecular essencialmente na prestação de serviços e investigação nas áreas de caracterização genética e pesquisa/genotipagem de genes de interesse, como por ex. Scrapie, e caseínas em pequenos ruminantes. É também responsável pela orientação de estágios, revisão de artigos científicos e organização de encontros para a divulgação do conhecimento.

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CAPÍTULO 1 – PROJETO ALT-BIOTECH REPGEN: RECURSOS GENÉTICOS ANIMAIS E BIOTECNOLOGIAS: PROJEÇÃO PARA O FUTURO O projeto ALT-Biotech RepGen pretende transmitir conhecimentos científicos e tecnológicos nas áreas das biotecnologias, reprodução e genética animal aos diversos agentes do setor agropecuário, de forma a melhorar a produtividade e a competitividade das empresas agrícolas e, indiretamente, a economia da região Alentejo e a sustentabilidade do meio rural. Mais especificamente, pretende-se contribuir para a melhoria da eficiência dos programas de conservação das raças domésticas autóctones e dos programas de melhoramento genético das raças, tanto autóctones como exóticas, das espécies pecuárias e, de forma mais alargada, para o desenvolvimento e competitividade das empresas pecuárias, mediante formas alternativas de transferência de conhecimento entre a investigação e o setor agrícola Alentejano. O projeto tem os seguintes objetivos:    

Transferir conhecimento acumulado nas áreas da conservação, do melhoramento e utilização dos recursos genéticos animais (RGAn) e das biotecnologias genómicas e reprodutivas Disseminar novas ferramentas e oportunidades para o tecido produtivo Fazer ações demonstrativas para as soluções mais inovadoras e promissoras Criar uma rede de informação e troca de conhecimentos, estabelecendo sinergias entre a investigação, o ensino superior, o tecido produtivo e os cidadãos.

Mais especificamente: 

  

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Sensibilizar a comunidade e os agentes envolvidos para a necessidade fundamental da preservação da biodiversidade e do maneio sustentável dos recursos genéticos animais RGAn para a agricultura, desenvolvimento rural e segurança alimentar. Divulgar o Banco Português de Germoplama Animal (BPGA), reforçando o seu papel primordial nestes aspetos; Incrementar a utilização de novos procedimentos na preservação e gestão do germoplasma animal, através de metodologias genómicas e reprodutivas mais eficientes, integrando avanços da biologia de conservação; Explicar e demonstrar a utilidade da avaliação genética enquanto metodologia de seleção no âmbito dos programas de melhoramento genético e na gestão de explorações das espécies pecuárias; Equacionar e rever estratégias de conservação e de melhoramento genético por seleção; Aumentar a eficiência reprodutiva e produtiva das diferentes espécies pecuárias e o respetivo rendimento dos agricultores;


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      

Promover, divulgar e chamar a atenção para as raças autóctones portuguesas mais ameaçadas de extinção; Demonstrar a utilidade das técnicas de genética molecular para a produção animal e no apoio à identificação, valorização, rastreabilidade e comercialização de produtos; Criar oportunidades de negócio no setor agroalimentar, na área das biotecnologias e da genética animal; Proporcionar a internacionalização das raças e dos produtos portugueses apoiados em tecnologias recentes; Contribuir para a segurança e rastreabilidade dos alimentos de origem animal; Contribuir a favorecer a criação de produtos alimentares de elevado valor; Potenciar iniciativas empresariais inovadoras de jovens agricultores e empresários;

O projeto assenta numa parceria liderada pelo Instituto Nacional de Investigação Agrária e Veterinária, I.P., e que envolve as Escolas Superiores Agrárias de Santarém e Elvas, e a Associação de Agricultores do Sul (ACOS).

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A equipa técnica do projeto ALT Biotech Rep Gen tem a seguinte constituição:

INIAV, IP – Polo de Santarém/Banco Português de Germoplasma Animal

IP de Santarém – ESA de Santarém

IP de Portalegre – ESA de Elvas ACOS – Associação de Agricultores do Sul

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Rosa Lino Neto Pereira (Investigadora Responsável) Carla Cruz Marques Nuno Carolino Maria da Conceição Batista António E. M. Horta Maria Inês Carolino Fátima Santos Silva Patrícia Bidarra Mesquita João Pedro Barbas Maria da Conceição Sousa Sandra Cavaco Gonçalves Teresa Pinto da Cunha António Andrade Vicente Paula Azevedo Carolina Balão da Silva Miguel da Gama Minas Rute Guedes dos Santos Claudino Pereira Matos


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CAPÍTULO 2 - ESTRATÉGIAS DE SELEÇÃO NAS ESPÉCIES PECUÁRIAS Nuno Carolino (Instituto Nacional de Investigação Agrária e Veterinária – Polo de Investigação da Fonte Boa 2005-048 Vale de Santarém) nuno.carolino@iniav.pt A seleção consiste na escolha de futuros reprodutores, tanto machos como fêmeas. Ou seja, é o processo através do qual alguns animais irão produzir mais descendentes do que outros. De um modo geral, através da seleção artificial, a partir do conjunto de animais anualmente disponíveis para futuros reprodutores, interessa-nos selecionar os indivíduos que melhor servem os objetivos dos criadores, transmitindo aos descendentes as características pretendidas, sendo os restantes rejeitados. Pretende-se desta forma aumentar ou diminuir a frequência dos genes favoráveis à expressão das características de interesse ou indesejáveis, respetivamente, de forma a obter-se novos indivíduos que possam expressar características desejáveis. A grande dificuldade deste processo de seleção é que normalmente apenas dispomos de informação fenotípica (pesos, produção leite, morfologia, etc.) sobre o próprio indivíduo ou sobre os seus familiares, mas desconhecemos especificamente todos os genes que os candidatos a reprodutores possuem e a forma como determinam as características que interessam aos criadores. As metodologias de seleção dos animais têm evoluído consideravelmente nos últimos anos em todo mundo e em várias espécies, embora, na prática, possam ser diferentes e envolver particularidades, consoante a espécie, vocação (e.g., carne ou leite), raça ou o modo de produção, entre outros fatores, que determinam realidades muito distintas. De um modo geral, um programa de melhoramento genético tem como objetivo proporcionar o aumento do rendimento dos criadores que nele participam, sendo necessário avaliar previamente qual a melhor forma de obter o progresso genético dos caracteres que, direta ou indiretamente, contribuem para o benefício económico das explorações, de acordo com as características demográficas, produtivas e genéticas da população, considerando os meios disponíveis e a estratégias para o sector. O progresso genético anual de uma característica é função de vários parâmetros (precisão e intensidade de seleção, variabilidade genética, intervalo de gerações) que, por sua vez dependem, para além dos parâmetros genéticos desse caracter e dos caracteres com ele correlacionados, da quantidade e tipo de informação disponível (individual ou familiar), da forma como esta é utilizada ou combinada, e do método de seleção dos animais (Van der Werf, 2000). Segundo Falconer e Mackay (1996), Gama (2002) e Carolino (2006) os principais métodos de seleção são os seguintes:

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Seleção individual

Seleção Familiar o Seleção pela ascendência

o

Seleção fraternal

o

Teste de descendência (TD)

o

Seleção intrafamiliar

Seleção combinada o Índices de Seleção  

o

Índices de seleção simples Índices de seleção especiais (respostas desejadas, com restrições, em retrospetiva, para caracteres definidos como produtos ou rácios, etc.) BLUP – Modelo Animal

o

MAS (Seleção assistida por marcadores genéticos)

o

GS (Seleção genómica)

Na seleção individual os animais são selecionados apenas com base nas suas próprias performances, sendo, por isso mesmo, a metodologia mais simples. Apesar de em alguns casos poder apresentar resultados satisfatórios, designadamente carateres com transmissibilidade (heritabilidade) elevada, esta metodologia é bastante limitada quando se pretendem selecionar carateres apenas avaliados num dos sexos (e.g., produção de leite), avaliados demasiado tarde (e.g., longevidade produtiva) ou após a morte do animal (e.g., características das carcaças). Nestas situações, há claramente vantagem em utilizar-se a seleção familiar, praticada com base na informação fenotípica de indivíduos com distintas relações de parentesco com os indivíduos que se pretendem selecionar (filhos, meios-irmãos, progenitores, etc.). Falconer e Mackay (1996) sugerem a utilização desta metodologia alternativa (seleção familiar) para a seleção de carateres com heritabilidade reduzida ou quando estes não podem ser mensurados nos indivíduos que se pretendem selecionar. No entanto, a possibilidade de se aumentar a precisão de seleção depende, evidentemente, da quantidade de informação familiar disponível e da relação de parentesco entre os indivíduos mensurados e os indivíduos a selecionar. Na seleção intrafamiliar utiliza-se como critério de seleção o desvio do valor fenotípico do indivíduo relativamente à média da família.

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O teste de descendência (TD) é uma metodologia de seleção amplamente utilizada em melhoramento genético animal, especialmente na produção de leite (bovinos, ovinos e caprinos de leite), em que o critério de seleção, tal como o nome indica, é a performance da descendência. É particularmente útil quando o carater é limitado dos sexos e, para Falconer e Mackay (1996), intuitivamente, parece ser um método de seleção ideal, uma vez que, teoricamente, o valor médio da descendência de um indivíduo se aproxima do seu valor genético real.

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No entanto, apesar de poder proporcionar um aumento da precisão de seleção e poder considerar quatro vias de seleção (Pais de Macho, Mães de Macho, Pais de Fêmeas e Mães de Fêmeas), esta metodologia pode apresentar inconvenientes (Rendel e Robertson, 1950; Van der Werf, 2000), pelo facto de poder alargar demasiadamente o intervalo de gerações e diminuir a intensidade de seleção, devido ao número limitado de animais que é possível colocar em teste e à enorme exigência em termos de eficiência e organização de todo o processo de testagem. São várias as raças de diferentes espécies, desde bovinos de carne a equinos, que incluem nos seus programas de melhoramento, numa primeira fase, a testagem individual (seleção individual) e mais tarde o teste de descendência (Ménissier, 1988; Kinghorn e Simm, 1999, Carolino, 2006). Os índices de seleção são particularmente úteis quando se pretende selecionar um ou diversos carateres em simultâneo (índice multi-carater), a partir de várias fontes de informação produtiva (um ou vários registos do indivíduo ou de parentes). A metodologia de seleção com recursos a índices foi, inicialmente, utilizada por Fisher (1936) e Smith (1936), para melhorar, simultaneamente, vários carateres em plantas, sendo posteriormente desenvolvida por Hazel (1943) em animais. Desde então, os índices de seleção têm sido largamente trabalhados e utilizados para estimar os valores genéticos em diversas áreas da produção animal (Cartwright, 1970; Campo, 1978; Akbar et al., 1986; Ponzoni e Newman, 1989; Gibson e Kennedy, 1990; Hazel et al., 1994; Philipsson et al., 1994; Cameron, 1997; Simm, 1998; entre outros).

ˆ ) é obtido a partir do valor do próprio índice ( Com os índices de seleção, o valor genético de um indivíduo ( A i

I i  Aˆi ), que maximiza a probabilidade de ordenação correta dos indivíduos pelo seu valor genético real (Ai). Os índices de seleção podem também ser utilizados na seleção para vários carateres, introduzindo o conceito de mérito global ou genótipo agregado (H), definido como uma função linear dos valores genéticos para carateres utilizados como objetivos de melhoramento, ponderados pelos respetivos pesos económicos. Assim, um índice de seleção pode combinar diversos tipos de informação fenotípica sobre vários carateres, I 

n

∑bi (x i - i ) , i

n

de forma a predizer o mérito global H =

∑(a i A i ) de cada indivíduo, em que, b , x ,  e a correspondem, i

i

i

i

i

respetivamente, aos coeficientes de ponderação do índice, ao valor fenotípico de um indivíduo, à média e ao peso económico do carater i.

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Os carateres em I são os critérios de seleção e os carateres em H são os objetivos de melhoramento. Em notação matricial, pretende-se construir um índice I = b’X que permita maximizar a resposta em H = a’A. Os coeficientes de um índice sem restrições podem ser obtidos através da resolução do sistema Pb=Ga que, segundo Hazel (1943), maximiza a correlação (rIH) entre o índice de seleção (I) e o mérito global (H). Para Amer (1994) e Bourdon (1997), nos índices de seleção, como fatores de ponderação (b’s) devem constar características de medição fácil e barata e que estejam correlacionadas com H, enquanto nos objetivos de seleção devem constar características com impacto económico no sistema de produção. À teoria geral dos índices de seleção, desenvolvida por Hazel (1943), podem ser introduzidas algumas alterações (Kempthorne e Nordskog, 1959; Tallis, 1962; Cunningham et al., 1970; Gibson e Kennedy, 1990; Akbar et al., 1986) com o objetivo de proporcionarem várias particularidades (Gama, 2002), nomeadamente, respostas desejadas, restrições totais ou parciais de um ou vários caracteres, utilizar caracteres definidos como produtos ou rácios ou funcionar em retrospetiva. Atualmente, a nível internacional e em diversas espécies pecuárias (equinos, bovinos, ovinos, suínos, aves, caprinos, etc.), o recurso ao “BLUP - Modelo Animal” para a estimativa de parâmetros genéticos e para a avaliação genética (estimativa dos valores genéticos) está generalizado, para um ou vários caracteres, considerando-se diversos tipos de modelos e de efeitos fixos e aleatórios. O BLUP - Modelo Animal é uma extensão da metodologia dos índices de seleção, com algumas diferenças substanciais (Simm, 1998), pelo que, quando comparado com a seleção fenotípica, apresenta diversas vantagens

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(Henderson, 1994; Ronningen e Van Vleck, 1985; Mrode, 1996; Van der Werf, 2000; Gianola, 2001), nomeadamente:  é melhor (best), no sentido em que maximiza a correlação entre o valor genético real (A) e o valor genético estimado (Â) ou, por outras palavras, minimiza a variância do erro de predição, isto é var(A-Â); consequentemente, é mais elevada a probabilidade de ordenação correta dos indivíduos pelo seu valor genético real.  as soluções são obtidas por uma função linear das observações.  as soluções não são enviesadas (unbiased), no sentido em que a expectativa do valor real, dado o valor estimado, é o próprio valor real (isto é, E(A|Â)=A).  envolve a predição (prediction) dos valores genéticos reais dos indivíduos considerados. O valor genético real dos animais nunca chega a ser conhecido, mas a sua estimativa indica-nos o que o animal poderá valer quando utilizado como reprodutor, podendo ser obtida com diferentes precisões em função da quantidade de informação disponível, parâmetros genéticos entre outros fatores (Arnason e Van Vleck, 2000). O valor genético representa o valor do indivíduo num programa de seleção para determinada característica ou a soma dos efeitos de cada um dos alelos que afetam essa característica, podendo ser quantificado com o dobro do desvio de um grande número de descendentes (teoricamente ) desse indivíduo relativamente à média da população. O BLUP - Modelo Animal baseado no conceito do modelo infinitesimal, que assume que as características são determinadas por um número infinito de loci, cada qual com efeitos infinitesimalmente pequenos, independentes e aditivos, tem demonstrado um enorme sucesso no melhoramento genético das mais variadas espécies, raças e características, evidenciando uma enorme robustez mesmo em características controladas por um número reduzido de loci. Estas características ou particularidades do BLUP - Modelo Animal, em termos práticos, apresentam algumas vantagens e significam que o valor genético de um indivíduo predito por esta metodologia considera:  O mérito genético de todos os seus parentes (devido à inclusão da matriz de parentescos).  O valor genético dos participantes nos diferentes acasalamentos (isto é, um macho não será prejudicado por ser acasalado com fêmeas de mérito inferior, ou o contrário, não será beneficiado por ser acasalado com fêmeas de mérito superior).  Todos os registos produtivos disponíveis (registos repetidos no mesmo indivíduo ou familiares, etc.).  Os efeitos fixos a que um registo é sujeito (e.g., diferentes ambientes).

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Este último aspeto é particularmente importante, já que os efeitos fixos são estimados no BLUP por quadrados mínimos generalizados, tendo em conta os efeitos aleatórios (valores genéticos, efeitos permanentes, etc.) envolvidos, o que é uma diferença importante relativamente aos índices de seleção. Estas características do BLUP requerem contudo algum cuidado na interpretação dos resultados, já que a fiabilidade das soluções depende da fiabilidade dos dados, da adequação do modelo e dos parâmetros utilizados. Uma outra particularidade do aspeto BLUP - Modelo Animal, inultrapassável e que deverá estar sempre presente, é que o mérito genético de um animal para determinada característica só poderá ser predito se houver registos produtivos do próprio animal ou dos seus parentes disponíveis sobre essa característica. Algumas situações podem resultar em erros na estimativa de valores genéticos e podem passar despercebidas, são as seguintes:  Erros cometidos, voluntária ou involuntariamente, nas genealogias dos animais, conduzirão a estimativas incorretas dos valores genéticos, o mesmo acontecendo se os dados foram artificialmente censurados (por exemplo, excluindo os piores registos).  No caso de a heritabilidade ser baixa, o peso dado pelo BLUP à informação dos parentes é mais elevado, comparativamente à informação do próprio indivíduo; se a heritabilidade real for elevada, e for incorretamente usada uma estimativa da heritabilidade mais baixa, dá-se menos peso à informação do indivíduo, do que ela deveria ter, obtendo-se predições incorretas dos valores genéticos.  A comparação entre o valor genético estimado de indivíduos pertencentes a diferentes explorações só é exequível se estas explorações estiverem geneticamente ligadas pois, caso não estejam, o valor genético médio é suposto ser igual nas duas, o que pode não ser verdade. Como é evidente, o BLUP não pode ultrapassar problemas de desconexão ou de fraca ligação genética entre explorações e, se for este o caso, as comparações entre animais de diferentes explorações podem conduzir a conclusões erradas na comparação dos animais com distintas origens.  Se a estrutura dos efeitos aleatórios for considerada incorretamente, por exemplo, ignorando efeitos maternos, as estimativas obtidas para os valores genéticos diretos ficarão distorcidas. Um inconveniente possível do BLUP, estudado por vários autores (e.g., Quinton et al., 1992; Verrier et al., 1993 e 1994; Muir, 2000), é que poderá não ser ótimo a médio e longo prazo, se não forem tomadas as devidas precauções. Isto deve-se a que, pelo facto de se usar a informação de todos os parentes, há tendência a selecionar sucessivamente e em diferentes gerações indivíduos aparentados e daí resultarem taxas de consanguinidade mais elevadas do que com a seleção individual, e portanto maiores perdas de variabilidade genética. Se o caracter selecionado for afetado pela depressão consanguínea (redução da capacidade de sobrevivência ou de adaptação, da performance produtiva e reprodutiva devido ao efeito da consanguinidade), a prazo a resposta com o BLUP poderá ser inferior à da seleção individual.

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Diversos trabalhos têm sido desenvolvidos, com o objetivo de se utilizarem metodologias de seleção, que permitam maximizar o progresso genético, minimizando o aumento da taxa de consanguinidade (Meuwissen, 1997; Grundy et al., 1998; Meuwissen e Sonesson, 1998; Grundy et al., 2000; Weigel, 2001; Avendaño et al., 2003; Sorensen et al., 2005, entre outros). A seleção assistida por marcadores (MAS) tem apresentado avanços substanciais ao longo dos últimos anos, particularmente em algumas características, tais como a resistência a doenças ou a qualidade dos produtos. Apesar do sucesso inquestionável do modelo infinitesimal, que assume que as características são determinadas por um número infinito de loci, tem aumentado o número de trabalhos que sugerem que poderá haver um número finito de loci responsáveis pela variabilidade de características quantitativas, como sejam a produção de leite ou de carne. Têm sido vários os estudos que demonstraram a distribuição dos efeitos destes loci em características quantitativas, evidenciando que poucos genes podem ter um grande efeito e muitos têm pequenos efeitos. Um locus com um efeito específico conhecido numa característica quantitativa denomina-se de QTL (Quantitative Trait Locus). Segundo Lopes et al. (2017), inicialmente, o recurso à seleção assistida por marcadores no melhoramento genético animal foi mais complicada pelo facto de ser difícil a identificação de marcadores ligados a QTL’s, mediante painéis com marcadores de baixa densidade (microssatélites). Mesmo assim, alguns marcadores genéticos passaram a ser utilizados correntemente com sucesso nos programas de seleção comerciais de diversas espécies e raças, nomeadamente, a seleção para o alelo dominante do gene do halotano (RYR1) na raça Piétrain (Hanset et al., 1995), a seleção para o gene Booroola (FecB) em ovinos de leite (Gootwine et al., 1998) e na seleção para a resistência a doenças (Gibson e Bishop, 2005) ou para a qualidade da carne em bovinos de carne (Quaas, 2003; Dekkers, 2004; Van Eenennaam, 2005). O financiamento de diversos projetos de investigação em todo o mundo no final do século XX e no início do seculo XXI, nomeadamente os estudos do genoma das várias espécies de interesse pecuário, envolvendo montantes consideráveis, viria a impulsionar a identificação de loci que afetam características de importância económica na maioria das espécies, mediante o desenvolvimento de plataformas de genotipagem de SNPs em

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alta densidade (milhares de SNPs) ao longo de todo genoma (Matukumalli et al., 2009). Assim, mais recentemente, com o recurso a estas plataformas ou painéis de alta densidade para deteção em simultâneo de milhares de SNPs, os estudos de associação genómica ampla (GWAS) vieram a potenciaram o poder e a precisão dos resultados de marcadores ligados a QTL’s, proporcionando novas possibilidades à MAS. A seleção genómica ampla (GWAS), embora com recurso a diferentes metodologias e estratégias de análise, permitirá a predição simultânea dos efeitos dos vários marcadores que influenciam uma determinada característica de interesse e poderão vir a ser utilizados na seleção dos indivíduos geneticamente superiores.

Esta nova abordagem apresenta, contudo, alguns requisitos para que possa ser desenvolvida com sucesso (Meuwissen et al., 2001; Cantor et al., 2010). Para além da necessidade de investimento avultado na aquisição\genotipagem de chips comerciais atualmente disponíveis (e.g., BovineHD BeadChip com 777962 SNPs, BovineSNP50 BeadChip com 54609 SNPs, BovineLD BeadChip com 6909 SNPs, OvineSNP50 BeadChip com 54241 SNPs, PorcineSNP60 BeadChip com 62.163 SNPs e CanineHD BeadChip com 172155 SNPs), que apesar do custo por indivíduo/SPN ter vindo a baixar, os preços praticados ainda são relativamente elevados ou, como alternativa, desenvolverem-se estudos de re-sequenciação do genoma que também exigem investimentos avultados, continua a ser imprescindível a informação de um elevado número de indivíduos com informação genealógica e fenotípica precisa, nomeadamente registos produtivos sobre as características que se pretendem selecionar.

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Com estas novas metodologias e com o recurso à GWAS pretende-se determinar as equações de predição que quantifiquem a variação genética específica de cada locus que influencia uma determinada característica de interesse para os criadores e que, por sua vez, permita a estimativa do valor genómico de cada animal a partir do conhecimento do seu genótipo. Segundo Ramos et al. (2009) e Perez-Enciso et al. (2015), o desenvolvimento de tecnologias de sequenciação de próxima geração (NGS – next generation sequencing technologies) veio tonar possível a utilização de informação sobre amplas regiões do genoma na rotina normal das avaliações genéticas, o que desencadeou um interesse considerável tanto na área animal como das plantas de forma a aumentar a resposta à seleção ou progresso genético. Como atualmente estão disponíveis diversas metodologias de seleção, para o delineamento de um programa de melhoramento genético, é importante avaliar qual a melhor em termos de resposta esperada à seleção e como esta poderá ser otimizada, envolvendo obviamente considerações produtivas, genéticas e económicas, de maneira a se atingir, de modo eficiente, os objetivos pretendidos. Em Portugal, nas raças autóctones, a avaliação genética dos animais tem-se tornado um método seleção comum e, anualmente, são cada vez mais as raças que têm disponível informação sobre o mérito genético dos animais para diversas características. Desta forma, os criadores podem consultar catálogos ou as bases de dados das raças que disponibilizam a informação sobre o valor genético dos animais. Conjugando esta informação, com a avaliação morfológica dos animais, os criadores dispõem de informação objetiva para a seleção dos animais que vão utilizar como futuros reprodutores.

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CAPÍTULO 3 - APLICACIÓN DE LA CALIFICACIÓN LINEAL A LA MEJORA GENÉTICA: EVALUACIÓN MORFOLÓGICA María José Sánchez Guerrero (Departamento de Ciencias Agroforestales, Escuela Técnica Superior de Ingeniería Agronómica, Universidad de Sevilla) v32sagum@gmail.com A pesar de los avances en las técnicas de medidas de la conformación animal, es preciso buscar y poner a punto métodos de evaluación rápidos, baratos y objetivos. En este sentido la Calificación Morfológica Lineal (CML) está siendo el método de elección para evaluar la conformación en distintas razas de animales domésticos. La CML se basa en la traducción del grado con que se manifiesta un determinado carácter morfológico en una escala de valores numéricos según el patrón fijado previamente. El sistema de CML se diseña para evaluar los rasgos individuales en una escala lineal, incluyendo toda la variabilidad existente en la población (Samoré et al., 1997). Este sistema de calificación con traducción directa entre medidas y clases suele ser complementado con otros datos morfológicos de carácter secundario (que no disponen de correspondencia directa con una medida zoométrica) que aportan información complementaria en cuanto al "carácter racial, funcional o de conformación" de los animales. Entre las ventajas que presenta el sistema de CML cabría destacar que es:    

 

Descriptivo. La escala y el número de clases disponibles para cada rasgo permiten una máxima discriminación, informando del sentido de la desviación. Objetivo. Describe objetivamente al animal a través de una escala de clases, sin valorar subjetivamente sus características raciales. Reconvertible. Permite la reconversión a un sistema tradicional de valoración por puntos, asignando a cada clase una puntuación en función del ideal (patrón racial). Apto para la valoración de la aptitud funcional. La asignación de coeficientes de peso a cada rasgo, según su correlación con parámetros funcionales, y su combinación en índices puede permitir la valoración morfológica para una aptitud funcional. Flexible en el tiempo y el espacio. Permite la recalificación automática de los animales de una determinada época o lugar con una reordenación de los puntos asignados a cada clase. Positivo. Se centra en qué puede aportar cada animal a la mejora de la población, sin eliminar animales porque tengan un nivel de un carácter bajo y buenísimo para otros. Por lo que permite un mayor progreso genético.

Además la evaluación de los rasgos morfológicos individualmente, en lugar de en combinación (metodología clásica de evaluación regional por puntos), facilita la identificación de las diferencias existentes entre los

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individuos (Koenen et al., 1995) y puede ser una herramienta para estimar el carácter corrector de cada animal para los distintos rasgos evaluados genéticamente. Sistema de calificación morfológica lineal en equidos En el sector equino, los sistemas de CML se comenzaron a diseñar y a aplicar a finales de los años 80. En la Tabla 1 se describen las características básicas para las razas disponibles en la bibliografía consultada. Tabla 1. Características básicas de los sistemas de Calificación Morfológica Lineal en équidos

País y raza

Holanda: Caballo Holandés de Sangre Caliente

Suiza: Caballo Sueco de Sangre Caliente

Bélgica: Caballo Belga de Sangre Caliente

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Esquema lineal 40 clases EN 1 a 40 (incrementos de 1 clase) Nconf = 20 Nfun = 6 (P,T) 40 clases EN 1 a 40 (incrementos de 1 clase) Nfun= 10 (P,T,G) NfunJ = 8 (SL) 9 clases EN 1 a 9 (incrementos de 1 clase) Nconf = 10 Nfun = 2 (P,T) 9 clases EN 1 a 9 (incrementos de 1 clase) Nconf = 19 Nfun = 5 (P,T) 9 clases EN -20 a 20 (incrementos de 5 clases) Nconf = 27 Nfun = 6 (P,T)

Resultados 10.665 hembras (nacidas entre 19891993; de 3 a 7 años) h2conf = 0,09-0,28 h2fun = 0,12-0,22 36.110 caballos (nacidos entre 19922002; de 3 a 7 años; >80% hembras) h2fun = 0,15-0,32 h2funJ = 0,22-0,37 3.755 potros (concentración de potros 1991-1993) h2conf = 0,14-0,34 h2fun = 0,09-0,32 2.026 caballos (pruebas de campo 1993-1995; 3 a 4 años) h2conf = 0,12-0,50 h2fun = 0,16-0,39 987 hembras (nacidas entre 20032007; de 3 a 4 años) h2conf = 0,15-0,55 h2fun = 0,33-0,52

Referencia (Koenen et al., 1995)

(Ducro et al., 2007)

(Hascher, 1998)

(Rustin et al., 2009)


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Irlanda: Caballo Irlandés de Deporte, Caballo de Tiro Irlandés

5 clases ED Nconf = 19 Nfun= 5 (P,T) 9 clases EA (a hasta i) Nconf = 25

Alemania: Hannoveriano

Alemania: Caballos de Sangre Caliente Alemana (Brandenburgo, Mecklenburg, Saxony, SaxonyAnhalt, Thuringia)

Holanda: Poni de shetland

Alemania: Holsteiner

República Checa: Old Kladrub

9 clases EN 1 a 9 (incrementos de 1 clase) Nconf = 24 Nfun = 4 (P,T) 9 clases EN 1 a 9 (incrementos de 1 clase) Nconf = 53 Nfun= 18 (P,T) 41 clases EN 0 a 40 (incrementos de 1 clase) Nconf = 22 Nfun= 6 7 clases EN 1 a 7 (incrementos de 1 clase) Nconf = 9 Nfun= 1 9 clases EN 1 a 9 (incrementos de 1 clase) Nconf = 32

413 caballos (PSCJ y en venta 2007-2008; de 4 a 5 años) 22 hembras (Pruebas de campo 2009) 207 (fotografías) 521 hembras (nacidas entre 1987-1988) h2conf = 0,02-0,74 h2fun = 0,20-0,48 1.753 caballos (nacidos entre 1989-1990; 3 y 4 años) h2conf = 0,12-0,50 h2fun= 0,11-0,39 358 machos y 2337 hembras de 2 años nacidas en 1989 y 1990 h2conf = 0,07-0,39 h2fun = 0,08-0,41 407 potros (concentración de potros en 2010; de 0,5 a 6 meses)

494 caballos en 2003, nacidos entre 1990 y 1995

(Breen, 2009)

(Weymann, 1989)

(Hartmann, 1993)

(van Bergen and van Arendonk, 1993)

(Drückes, 2010)

(Jakubec et al., 2009)

h2conf = 0,20-0,68

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Italia: Haflinger

España: Pura Raza Español

España: Pura Raza Árabe

Alemania: Oldenburgués (Doma y Salto)

Suecia: Caballo Sueco de Sangre Caliente

11 clases EN 0 a 10 (incrementos de 1 clase) Nconf = 23 Nfun = 3 9 clases EN 1 a 9 (incrementos de 1 clase) Nconf = 31 7 clases EN 1 a 7 (incrementos de 1 clase) Nconf = 48 Nfun= 10 7 clases EN 3 a 3 (incrementos de 1 clase) Nconf = 50 Nfun= 51 (P, T, G, B) NfunJ = 7 (SL) 9 clases EA a a i Nconf = 19 Nfun= 9 (P,T,G) NfunJ = 9 (SL)

510 machos and 3392 hembras a los 30 meses h2conf = 0,09-0,53 h2fun = 0,02-0,19 2.512 caballos mayores de 3 años h2conf = 0,06-0,35

(Samoré et al., 1997)

(Sánchez et al., 2013)

(Cervantes et al., 2009b)

83 machos de 3 a 4 años

(Kramer, 2012)

86 caballos ( PSCJ 2010; 3 años)

(Cadier, 2011)

N= número de variables; EA=escala alfabética de a hasta i; conf= conformación; ED= escala descriptiva; EN= escala numérica; func= funcionalidad relativa a los aires (P, paso; T, trote; G, galope) y comportamiento y manejabilidad (B); funJ= funcionalidad al salto (SL, salto libre); PSCJ= prueba de selección de caballos jóvenes.

La metodología lineal resulta mejor que un sistema subjetivo de valoración, ya que se da un mejor uso de la escala que los sistemas de evaluación tradicionales (Breen, 2009), poniendo de relieve las diferencias entre los animales (Vostrý et al., 2009). Como se observa en la Tabla 1, en lo referente al tipo de escala lineal utilizada, la más usado es el de 9 clases, a pesar de que la similitud entre esta escala lineal y la escala de puntuación referente a la belleza tradicional (de 1 a 10) puede causar problemas de aplicación e interpretación (Duensing et al., 2014). En el caso del caballo PRE se escogió esta escala, aunque se insistió mucho en las clases de preparación a las calificadores para la disociación del concepto de belleza con la evaluación de los rasgos CML. De hecho, se puede observar que en el caso del caballo PRE se usan casi todas las clases (de la 1 a la 9) cuando los calificadores están midiendo rasgos lineales (Sánchez et al., 2013) y que, sin embargo, cuando se juzgan los animales por su patrón racial se usa una escala inferior de clases (Sánchez et al., 2014b). Aún así, y debido fundamentalmente al miedo a esta asociación con la escala tradicional asociada a la belleza, algunos autores usan una escala alfabética (de la

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A a la I), y otros han optado por escalas numéricas claramente distintas (de 20 o 40 clases), para minimizar el riesgo de interpretación errónea (Koenen et al., 1995). Valoración genética La valoración genética relaciona la genealogía de todos los caballos con los valores numéricos de las expresiones fenotípicas de cada rasgo de conformación lineal, eliminando las variaciones que pudieran ser causadas por el medio ambiente, obteniendo finalmente un valor absoluto para cada caballo y carácter evaluado. A pesar de que el sistema de CML es más objetivo que los sistemas clásicos de evaluación de la conformación (puntos otorgados por los jueces), la calidad de las evaluaciones genéticas depende de la veracidad de los datos recogidos y de la fiabilidad de los calificadores (Janssens et al., 2004). En la Tabla 2 se muestran, para distintas razas equinas, las heredabilidades de los caracteres morfológicos calificados con metodología CML, en función de la raza y la región corporal. Las heredabilidades estimadas en esta raza oscilaron para los rasgos generales entre 0,18 para la fidelidad racial y 0,21 para la armonía. En el caso de la región de la cabeza y el cuello, las heredabilidades estimadas oscilaron entre 0,10 (anchura de la cabeza) y 0,35 (longitud de la cabeza). En la región del tronco, las heredabilidades variaron de 0,15 (longitud de lomo) a 0,24 (longitud de la espalda). Por último, para las variables analizadas en la región de la extremidad anterior el rango de variación fue de 0,07 (ángulo del hombro) a 0,31 (perímetro del hueso de la caña). En el conjunto de las poblaciones equinas estudiadas en la bibliografía consultada (Tabla 2), las heredabilidades estimadas para los rasgos generales oscilaron entre 0,12 (Caballo Suizo de Sangre Caliente) y 0,54 (Haflinger). Para las variables de la región de la cabeza y el cuello, las heredabilidades oscilaron entre 0,04 (Haflinger) y 0,68 (Old Kladrub); para la región de la espalda y la cruz, el rango de heredabilidades obtenidas osciló entre 0,05 (Haflinger) y 0,54 (Caballos Alemanes de Sangre Caliente); en la región del tronco, las heredabilidades variaron de <0,01 (Old Kladrub) a 0,55 (Caballo Belga de Sangre Caliente) y para las extremidades y la grupa, las heredabilidades oscilaron entre 0,01 (Old Kladrub) y 0,74 (Caballos Alemanes de Sangre Caliente). Como se puede observar, los niveles de heredabilidad obtenidos para el caballo PRE se encuentran dentro del rango de las otras razas, no destacando en ninguna región en el límite superior ni inferior.

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Tabla 2. Heredabilidades (valores comprendidos entre paréntesis) de caracteres de conformación obtenidos en base a la información recopilada mediante la aplicación de la Calificación Morfológica Lineal, en función de la región corporal y la raza

Raza

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Región corporal Rasgos Cabeza Generales Cuello N=4 (0,12-0,21) N=2 N=1: 0,25 (0,31-0,34) N=1 N=5 (0,12) (0,08-0,28) N=5 (0,10-0,39) N=3 N=6 (0,29-0,53) (0,04-0,26) N=1 N=4 (0,43) (0,11-0,68) N=2 N=8 (0,17-0,20) (0,09-0,35) N=2 N=5 (0,15-0,34) (0,24-0,45) N=5 N=5 (0,26-0,37) (0,08-0,53)

Espalda Cuello N=4 (0,16-0,20) N=2 (0,14-0,19) N=4 (0,09-0,15) N=3 (0,26-0,27) N=3 (0,05-0,15) N=5 (0,05-0,17) N=3 (0,14-0,23) N=4 (0,20-0,34) N=4 (0,19-0,54)

Tronco

Extremidades

N=5 (0,15-0,28) N=3 (0,18-0,25) N=5 (0,14-0,25) N=5 (0,18-0,35) N=4 (0,09-0,27) N=8 (0,00-0,43) N=4 (0,06-0,22) N=6 (0,20-0,55) N=3 (0,07-0,18)

N=7 (0,09-0,23) N=2 (0,16-0,18) N=4 (0,13-0,25) N=10 0,07-0,31 N=7 (0,09-0,31) N=13 (0,01-0,47) N=14 (0,08-0,30) N=10 (0,22-0,46) N=6 (0,06-0,74)

Referencias (Koenen et al., 1995)

(Hascher, 1998)

(van Bergen and van Arendonk, 1993) (Samoré et al., 1997) (Jakubec et al., 2009) (Sánchez et al., 2013) (Rustin et al., 2009) (Hartmann, 1993)

Donde: N= número de variables incluidas en cada grupo; 1= Caballo Holandés de Sangre Caliente; 2= Potros Suizos de Sangre Caliente; 3=Caballos de Silla de Sangre Caliente Suiza, 4=Poni de Shetland, 5= Haflinger, 6=Old Kladrub, 7= Pura Raza Español; 8= Caballo Belga de Sangre Caliente y 9= Caballos Alemanes de Sangre Caliente.

Relación entre morfología y funcionalidad Debido a que la forma del cuerpo define los límites del rango de movimientos, la funcionalidad del caballo y, en última instancia, su rendimiento (Mawdsley et al., 1996), la conformación es un factor de amplia importancia en la cría equina. La conformación, definida en el diccionario de la lengua española como “distribución de las partes que forman un conjunto”, ha sido utilizada como un importante indicador de la salud y del rendimiento del caballo, considerándose un factor muy importante en la cría y selección equina (Preisinger et al., 1991). El hombre ha criado caballos con diferentes fines, como la fuerza, la velocidad o simplemente la belleza, en función

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de sus necesidades (Edwars, 1992), produciendo una considerable divergencia entre la conformación de las distintas razas equinas (Cano et al., 2001), diferenciándose desde la morfología masiva y compacta de los animales traccionadores hasta la ligera y refinada de los velocistas. Aunque los trabajos relevantes, desde el punto de vista científico, que analizan la relación entre conformación y funcionalidad en équidos son escasos y relativamente recientes, nos encontramos a finales del siglo XIX autores como Muybridge (1899) y Marey (1882) que introdujeron el uso de la fotografía para el análisis de los aires en el movimiento equino. Este campo de estudio se convirtió en un tema popular en la investigación realizada en Alemania antes de la Segunda Guerra Mundial. Ejemplos de ello son los trabajos de Stratul (1922) y Radescu (1923), quienes estudiaron la relación entre la conformación y la funcionalidad de los caballos Pura Sangre Inglés, Bantoiu (1922) en caballos trotones o Nicolescu (1923) en caballos Hannoverianos. A finales del siglo XX, Holmström and Philipsson (1993) estudiaron la relación entre caracteres de conformación y resultados deportivos en caballos suecos de 4 años, concluyendo que existían correlaciones que iban desde moderadas a altas. Un sector pionero en el estudio de la relación morfología-funcionalidad es el de los caballos de Salto. Langlois et al. (1978) encontraron que, analizando la relación entre morfología y resultados deportivos en pruebas de Salto, los caballos dedicados al Salto debían ser altos, compactos y con buena amplitud al nivel de las espaldas y de las caderas para conseguir buenos resultados en las competiciones. Años después, Holmström (2001) señala que los caballos seleccionados para Salto tienen el cuello significativamente más largo que los caballos de Doma Clásica o los caballos sin una aptitud funcional conocida. En el mismo año, Clayton (2001) volvía a incidir en la importancia de la alzada a la cruz, pero esta vez como la característica morfológica más importante en la relación con la capacidad de Salto de los caballos. La alzada a la cruz es quizás una de las variables más estudiada a través de los años, y aunque hay autores que señalan una correlación entre ésta y problemas locomotores (Magnusson and Thafvelin, 1985, Baban et al., 2009), la mayoría de autores revelan una relación positiva con el rendimiento deportivo (Magnusson and Thafvelin, 1985) o las puntuaciones obtenidas en concursos morfológicos (Holmström and Philipsson, 1993). Para caballos trotadores, también se ha encontrado una relación positiva entre la alzada a la cruz y las ganancias en carrera (Dolvik and Klemetsdal, 1999). En el estudio de la relación de esta variable morfológica con los resultados en Doma Clásica existen conclusiones contradictorias. Mientras que Dusek et al. (1970) afirmaron que la alzada a la cruz no se correlacionaba con la longitud del tranco, Galisteo et al. (1998) estimaron correlaciones significativas y altas con las longitudes de tranco y de sobrehuella y una influencia moderada sobre los parámetros angulares al trote, pero no encontraron relación con las variables temporales analizadas. Según nuestros resultados, la alzada a la cruz tuvo una relación significativa con la mayoría de las variables biocinemáticas (14 variables: 6 temporales, 4 lineales y 4 angulares), siendo de 0,55 la relación con la longitud del tranco del miembro torácico, coincidiendo la importancia que tiene la alzada de la cruz en la longitud del tranco con los resultados previos de Galisteo et al. (1998).

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En el miembro torácico, los estudios han demostrado que una escápula más horizontal induce a este miembro a desarrollar un movimiento pendular hasta una posición más adelantada en relación al cuerpo, lo que se torna ventajoso tanto para caballos de Doma Clásica como de Salto (Back et al., 1996; Holmström et al., 1990). Según Back et al. (1996), los caballos con mayor inclinación de la escápula y menor ángulo del hombro, en relación a un ángulo más abierto del codo, tardan más en alcanzar la máxima extensión del codo, lo que contribuye para prolongar la fase de apoyo y favorece la reunión de los miembros torácicos. Sin embargo, Holmström (2001) indica que, más que la inclinación de la escápula en sí misma, la conjugación de esta característica con una cruz larga y bien destacada coloca al jinete más atrás, lo que favorece el equilibrio y permite que el caballo mueva los miembros torácicos más libremente, influyendo en la calidad del aire. Otro de los aspectos importantes en el miembro torácico parece ser la longitud del húmero, que presenta una de las correlaciones más elevadas con la calidad de los aires, en caballos jóvenes (Holmström and Philipsson, 1993). Holmström (2001) refiere incluso que los caballos de elite de Doma Clásica tienen el húmero significativamente más largo que los caballos de Salto o los caballos que no se usan con fines deportivos. El mismo autor afirma que, comparando objetivamente el movimiento de los miembros torácicos de distintos caballos, los dos factores que más varían son el ángulo del codo y el ángulo del carpo, flexionándose significativamente ambas articulaciones más en aquellos caballos con mejores calificaciones de los aires (en particular el codo, que se flexiona alrededor de 30º más en los caballos calificados como superiores). La importancia de la longitud del húmero podría entonces explicarse por su relación con un músculo tríceps más largo, lo que amplifica el rango de movimientos de la articulación del codo. Según Clayton (2005), la mayor flexión de la articulación del codo implica una elevación mayor del miembro en la posición de protracción máxima y una mayor altura del arco de vuelo del casco en los caballos con más calidad de movimientos. La misma autora defiende que en estos caballos también se observa una ligera flexión del carpo y de las articulaciones más distales en el momento de la máxima protracción del miembro, en contraste con el carpo extendido y las lumbres apuntando hacia arriba, que a veces se observa en caballos con menos calidad de movimientos. Las razas ibéricas tienden a exhibir más flexión del codo y del carpo durante la fase de vuelo que las razas de sangre caliente (Galisteo et al., 1997) y esta característica tiende a evolucionar positivamente con la edad (Cano et al., 2001). Respecto al miembro pelviano, Clayton (2001) considera que la pelvis debe ser más inclinada en los caballos de Doma Clásica y más vertical en los caballos para Salto de Obstáculos. Un fémur largo e inclinado hacia delante es considerado deseable por Knopfhart (1966), Langlois et al. (1978) y Holmström (1996, 2001). La incapacidad de los cuádriceps de soportar el máximo peso obliga al caballo a cambiar la carga para los miembros torácicos, alterándose el equilibrio. Magnusson and Thafvelin, (1985) encontraron una correlación positiva entre el ángulo de la babilla y los resultados deportivos. Estas mismas características fueron también asociadas a una mejor calidad de movimientos (Back et al., 1996), al presentar una menor retracción máxima y un menor rango de

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retracción-protracción en caballos con la pelvis más vertical y menores ángulos de la articulación de la rodilla. En general, existe una diferencia significativa entre los caballos con problemas recurrentes de cojeras y los demás, verificándose ángulos del corvejón menores en los primeros (Back et al., 1996; Holmström, 2001; Magnsson, 1985; Stashak, 1987). Según Back et al. (1996), la mayor abertura del ángulo del tarso está relacionada con amplitudes de tranco más largas, fases de vuelo más duraderas y un mayor ángulo de retracción-protracción, lo que contribuye a la mejor calidad de los aires. En cuanto a la articulación del menudillo y a la cuartilla, se consideran deseables ángulos de menudillo amplios y cuartillas largas (Holmström et al., 1990). Se ha demostrado que las cuartillas de los miembros pelvianos de caballos participantes en Doma Clásica o en concursos de Salto son más largas que las de los demás caballos, aunque no haya diferencias significativas en su inclinación (Holmström, 2001; Holmström et al., 1990). Viendo todas estas relaciones entre variables morfológicas y funcionales, resulta evidente que un conocimiento insuficiente de la influencia de la conformación en el rendimiento deportivo y en la propia salud y bienestar del animal puede provocar una inadecuada selección de los reproductores para la cría (Holmström and Philipsson, 1993). Por lo tanto, cada vez son más los técnicos y los ganaderos que otorgan importancia a la correlación entre la morfología y la funcionalidad, frente a otros caracteres externos de los caballos, como pueden ser el color de la capa o el patrón de belleza. A este respecto, Cárdenas (2005), criador de caballos PRE, manifiesta fundamental la unión indisoluble de raza y funcionalidad: “Un ejemplar muy bello y dentro de la raza, pero que sin embargo resulte inútil o inepto en movimientos, no sirve para nada. Si los jueces de morfología no son capaces de poner en práctica este criterio, la raza está perdida”. Aunque tradicionalmente los criadores de caballos PRE han seleccionado a sus animales desde el punto de vista de la conformación estética (ideal de belleza de la raza), en las últimas décadas se ha comenzado a valorar la conformación funcional y consecuentemente la creciente participación de la raza en pruebas deportivas de nivel nacional e internacional, ya que la eficiencia deportiva de los équidos es la principal demanda en todas las razas con cualquier propósito de uso (Halo et al., 2008). Para que el caballo PRE obtenga un reconocimiento internacional por sus cualidades deportivas, y al mismo tiempo el interés por su cría como caballo de deporte continúe en aumento, es necesario que sus participaciones en las pruebas de Doma Clásica vayan en aumento y que los resultados de participación continúen con una trayectoria ascendente. No hay que olvidar que la Doma Clásica es una modalidad que requiere, para que un caballo pueda competir al más alto nivel, un prolongado período de aprendizaje y entrenamiento, lo que conlleva al ganadero una inversión económica importante. La búsqueda de caracteres morfológicos que se encuentren indirectamente relacionados con el rendimiento deportivo para esta disciplina ecuestre y que permitan una selección precoz de los animales, puede ahorrar recursos al ganadero al permitir preseleccionar a los animales que realmente tengan capacidades deportivas. En general, en el sector ganadero equino se espera que la conformación de un caballo sea una indicación del

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rendimiento deportivo posterior. La selección indirecta para los rasgos funcionales (en el caso del caballo PRE especialmente para la Doma Clásica) en base a los datos de conformación podría ser útil como indicador precoz del rendimiento deportivo. La eficiencia de la selección indirecta para el rendimiento depende de la variación genética de los rasgos de conformación y de las correlaciones genéticas entre los rasgos de conformación y las características de rendimiento deportivo. Dada la importancia del caballo PRE en la cabaña equina española ya se han realizado numerosos estudios genéticos sobre su morfología (Molina et al., 1999; Gómez et al., 2009a, 2009b ; Sánchez et al., 2013, 2014b, 2015) y sobre sus características funcionales (Molina et al., 2008, Valera et al., 2008, Sánchez et al., 2014a, 2014b). No obstante, el estudio genético de la relación entre los rasgos morfológicos lineales y los resultados en la prueba de rendimiento de Doma Clásica no había sido abordado en esta raza. Solo los trabajos de Molina et al. (2008), Valera et al. (2008) y Sánchez et al. (2014b) realizan un análisis de la correlación genética entre caracteres morfológicos con variables biocinemáticas, aunque con un número reducido de animales. Como ya se ha comentado anteriormente, el inconveniente de estos trabajos es que en la actualidad las pruebas biocinemáticas son caras y no son accesibles a la mayoría de los caballos de la raza. Solé et al. (2013) afirmó que el PRE muestra la mejor conformación para la Doma Clásica de tres razas ibéricas estudiadas (PRE, Lusitano y Pura Raza Menorquín). En general, las tres razas ibéricas mostraron buenas características en el movimiento y la flexión de las extremidades anteriores. Sin embargo, estos autores afirmaron que para lograr un nivel de rendimiento superior y ser más competitivo en el mercado de la Doma Clásica, probablemente el caballo PRE necesite mejorar genéticamente la capacidad funcional de sus miembros posteriores y los parámetros lineales de los aires (distancia del tranco y sobrehuella). En el mismo trabajo, se advertía que con el fin de desarrollar el proceso selectivo, resulta necesario verificar la relación entre las variables y el rendimiento de Doma Clásica con el fin de seleccionar los criterios de cría. Caracteres morfológicos y doma clásica En caballos seleccionados para un rendimiento deportivo, la evaluación objetiva de la conformación y su relación con el rendimiento funcional es de gran importancia (Moore, 2010), y el conocimiento insuficiente de la influencia de la conformación en el rendimiento puede dar como resultado una selección inexacta o tardía. La importancia del patrón locomotor está relacionada con el hecho de que para cada tipo de ejercicio, el caballo utiliza un tipo específico de locomoción, donde sus características individuales determinan el nivel de rendimiento que puede alcanzar (Leleu et al., 2005). Por ello, es más conveniente analizar la relación entre los rasgos morfológicos y el rendimiento de Doma Clásica en caballos jóvenes ya que éstos son juzgados, principalmente, en base a las propias características de sus aires básicos (Biau and Barrey, 2004). A pesar de que son muchos los trabajos que han puesto de manifiesto, desde el punto de vista fenotípico, la relación entre conformación y funcionalidad en los ejercicios de Doma Clásica (Barrey et al., 2002, Kattelans et al., 2013, Lashley

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et al., 2014, Greve and Dyson, 2015), son muy pocos los trabajos que han elaborado índices genéticos morfológicos para la preselección de caracteres funcionales, dado el reducido número de estudios morfológicos realizados en animales de competición y la complejidad en la elaboración de un índice genético basado en criterios morfológicos, que proporcione una respuesta indirecta positiva sobre el rendimiento funcional. Recientemente, razas como el Pura Sangre Lusitano o el Trotador Finlandés han presentado un Índice de selección con los rasgos morfológicos más importantes para variables funcionales, como el tiempo de carrera o las ganancias en carreras de trote o Doma Clásica (Suontama et al., 2013; Vicente et al., 2014b). Hasta ahora, la información es escasa sobre las relaciones genéticas existentes entre la morfología y el rendimiento en las pruebas Doma Clásica. Las pocas estimaciones que se han publicado hasta la fecha apuntan a una correlación genética entre los rasgos morfológicos y el rendimiento en los eventos de Doma Clásica que oscila entre baja y media (0,07-0,40) (Koenen et al., 1995, Wallin et al., 2003, Vicente et al., 2014b). Sin embargo, como los rasgos funcionales de los caballos se miden generalmente a una edad avanzada, se considera aceptado que, a pesar de que existan correlaciones genéticas medias-bajas, los rasgos morfológicos se pueden utilizar como criterio de selección temprano, cuando la selección está destinada a mejorar el rendimiento deportivo (Saastamoinen and Barrey, 2000). No obstante, un mismo rasgo de conformación puede ser ventajoso para mejorar una determinada característica de locomoción y perjudicial para otra (Back et al., 1996), ya que la conformación por sí misma no puede explicar la capacidad funcional de los caballos durante una prueba de Doma Clásica, en donde la inteligencia del animal, la capacidad de aprendizaje y la compenetración con el jinete juegan un papel fundamental. En nuestro trabajo las correlaciones genéticas oscilaron entre 0 (paso - anchura de la cabeza) y 0,46 (galope - ángulo del hombro). Como ya hemos indicado, uno de los principales objetivos de la cría de razas equinas debe centrarse en los rasgos de conformación (Jakubec et al., 2009), ya que el objetivo final es la consecución de un caballo con ciertas características morfológicas que destaque por su rendimiento en el deporte (Belloy and Bathe, 1996). En el caso del PRE, cabe destacar que los ganaderos escogen intuitivamente los caballos para la Doma Clásica, que se diferencian de los demás en las variables morfológicas: anchura del pecho, ángulo de la espalda, perímetro de la caña, longitud de la grupa y distancia isquion-babilla (Sánchez et al., 2015b). Para poder darle al ganadero una respuesta sobre qué variables debe escoger (más allá de su propia intuición) si quieren alcanzar una buena morfología para la Doma Clásica, se han elaborado por primera vez distintos Índices de Selección Morfológicos para la Doma Clásica (ISMDC). Estos ISMDC podrían permitir una selección temprana de los animales que no acuden a las pruebas de Doma Clásica, ya que son muchos los PRE que pasan un control morfológico en comparación con los participan en controles funcionales como las PSCJ para la Doma Clásica. Por lo tanto, el objetivo principal de este estudio (Sánchez-Guerrero et al., 2016) fue la selección de los rasgos de conformación más importantes a partir de los 26 rasgos incluidos en la ficha de CML. Las variables seleccionadas fueron:

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De la región de la cabeza: anchura de la cabeza, unión cabeza-cuello, forma de la línea superior del cuello y unión cuello-tronco. En este sentido, Holmström (2001) y Lawrence (2001) sugirieron que las buenas inserciones cabeza-cuello y cuello-tronco eran más importantes que la longitud del cuello para la Doma Clásica, para lograr una buena conexión y flexión de la región del cuello y la cabeza con el tronco.

Del tercio anterior: anchura del pecho y ángulo de la espalda. Los resultados de Holmström and Philipsson (1993) indican que los caballos de Doma Clásica de élite tienen la espalda más horizontal que los demás, y en las valoraciones de caballos de 4 años de edad se ha demostrado una correlación elevada entre la inclinación de la espalda y la puntuación atribuida a los aires. La inclinación de la espalda en caballos de élite para la Doma Clásica juega un papel importante en los procesos de retracción y protracción de la extremidad anterior (Morales et al., 1998). Además, es sabido que la reunión en caballos de Doma Clásica está asociada a un alargamiento de la fase de apoyo del miembro torácico (Back et al., 1994; Holmström et al., 1995).

Del tercio posterior: longitud de la grupa, ángulo de la grupa y distancia isquion-babilla. En nuestro trabajo (Sánchez et al., 2014c), la longitud de la grupa también resultó la medida más correlacionada con variables biocinemáticas del trote en cinta rodante (16 correlaciones genéticas significativas), siendo el rasgo que más estrechamente se correlacionaba con todas las variables analizadas. Trabajos previos demostraron la importancia de la grupa en el rendimiento deportivo. Así, en el caballo Pura Raza Árabe de España, se observaron las diferencias más significativas entre la morfología y la aptitud funcional para el Raid en el triángulo posterior (Cervantes et al., 2009a). Según Koenen et al. (1995), una grupa larga y angulada muestra una correlación muy estrecha con características de trote. Güedes (2008) también apuntó que la longitud de la grupa es un rasgo morfológico que se correlaciona estrechamente con las variables biocinemáticas al trote de caballos Pura Sangre Lusitano, con una importante correlación negativa con el máximo ángulo de protracción-retracción de las extremidades posteriores.

Extremidades: ángulo lateral de la rodilla, ángulo frontal de la rodilla, perímetro de la caña, y ángulo del corvejón lateral. De acuerdo con Holmström (1996), en lo que respecta a las desviaciones de las líneas de aplomos, los defectos ligeros no son demasiado importantes para el caballo. Eso se confirma verificando que la frecuencia de los defectos de aplomos es igual tanto en caballos de 4 años de edad, como los que participan en nivel intermedio de competiciones de Doma Clásica y los que participan en Gran Premio. El mismo autor refiere que alrededor del 90% de los caballos de élite para la Doma Clásica presentan en los miembros pelvianos una ligera


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rotación hacia fuera, al nivel de la articulación de la cadera, aunque el miembro y el casco estén bien alineados. De acuerdo con el autor, esta rotación es normal y necesaria para que el caballo de Doma Clásica pueda ejecutar correctamente determinados ejercicios, ya que se produce un espacio más amplio entre la babilla y el tronco. Sin embargo, la longitud de los miembros es un factor determinante para la amplitud del tranco: miembros más largos están asociados a trancos más amplios. Esto ocurre porque la masa corporal se desplaza más hacia delante durante la fase de apoyo y también porque los miembros más largos representan brazos de palanca más largos. Otros factores que influyen en la longitud del tranco son los rangos de movimiento articular en las regiones proximales de los miembros, que permiten que los miembros basculen sobre un arco más amplio (Clayton, 2005). Con respeto al corvejón, previamente no se observaron diferencias significativas entre el rango de variación del ángulo articular en caballos élite y caballos comunes, aunque los caballos de Doma Clásica tienden a tener ángulos ligeramente más amplios (Holmström, 2001). Solé et al. (2013) afirmaron que el PRE presenta una conformación no deseable para la Doma Clásica en el ángulo del tarso (<155,50), ya que aparentemente es indeseable para el desarrollo de alta calidad de los aires, por una pérdida de elasticidad y amplitud en relación con el rendimiento para la Doma Clásica (Podhajsky, 1976). Sin lugar a duda, la mejor opción es incluir como criterios de selección, en un índice genético para la Doma Clásica, variables funcionales para obtener una mejor respuesta. No obstante, es posible una preselección de los caballos solo con variables morfológicas combinadas en un índice de selección. Así, la respuesta genética de rendimiento para los puntos por reprise (0,76), para las cinco variables parciales de Doma Clásica (0,04) y para los tres aires (0,03) fueron positivas, pero inferiores, utilizando solo rasgos morfológicos lineales como criterios de selección, que cuando se utilizaron como criterios solo rasgos de rendimiento (1,80, 0,16 y 0,14, respectivamente) o la combinación de criterios de rasgos de rendimiento y morfológicos (2,97, 0,16 y 0,15, respectivamente). Por lo tanto, estos resultados sugieren que es posible preseleccionar los individuos precozmente por su morfología, aunque carezca de una estima del valor genético de rendimiento para la Doma Clásica, usando un ISMDC, aunque con una respuesta menor que los caballos en los que se usa como criterio de selección su valor genético para la funcionalidad. Para realizar los índices de selección, en estudios anteriores se utilizaron rasgos morfológicos más generales como aplomos o conformación general (Suontama et al., 2013; Vicente et al., 2014a). Es interesante observar que, en muchos de los estudios sobre la relación de conformación y rendimiento en las razas de carreras, los rasgos de conformación relacionados con la capacidad respiratoria (anchura de tórax y anchura mandibular) se destacaron como los principales factores determinantes para alcanzar el máximo rendimiento, en lugar de

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parámetros ortopédicos (Afanasieff, 1930, von Lengerken and Werner, 1969, Weller et al., 2006). Quizás la conformación perfecta para la Doma, de existir, es una combinación de rasgos simples donde un pequeño cambio en uno afecte al resto y sea imposible obtener una alta respuesta. Además, en los resultados de competición de Doma existen una multitud de factores relacionados con el rendimiento deportivo que alcanzará el caballo, siendo seguramente uno de los más importantes la interacción humano-animal en todas sus facetas. Por lo tanto, no se puede esperar que determinados rasgos de conformación individuales se puedan identificar siempre con un buen valor predictivo para el rendimiento del animal. Por todo ello, debemos ser conscientes de que, debido a la complejidad de la actuación, nunca seremos capaces de identificar los caballos deportistas de primer nivel basándonos solo en el análisis de la conformación (Weeren and Crevier-Denoix, 2006), pero sí que podemos predecir de una forma bastante exacta una buena capacidad funcional para el rendimiento en el deporte. Por ello, es importante que estos índices morfológicos para la selección de la funcionalidad se instauren de forma rutinaria en el Programa de Mejora de la raza para lograr un mayor progreso genético en aquellas variables relacionadas con la consecución de un mejor rendimiento deportivo.

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CAPÍTULO 4 - METODOLOGIAS DE SELEÇÃO EM EQUINOS: O CASO DO CAVALO LUSITANO António Pedro Andrade Vicente (Escola Superior Agrária de Santarém, Instituto Politécnico de Santarém) antonio.vicente@esa.ipsantarem.pt O cavalo de Puro-sangue Lusitano (PSL) é a mais importante raça autóctone portuguesa de equinos. Este nobre animal tem uma longa história evolutiva, sendo considerado uma das mais antigas raças de cavalo de sela do mundo (APSL, 2011). O Lusitano é o resultado da seleção de milhares de anos como animal de caça e de combate (nas guerras, condução de gado e combate à gineta entre outros). Este Ginete Ibérico ou Hispânico, como também pode ser designado, representa o arquétipo do cavalo barroco, apresentando um modelo muito típico e harmonioso, dotado de extrema coragem mas, ao mesmo tempo, docilidade e sociabilidade, sendo reconhecido há muito tempo como um dos melhores cavalos de sela do mundo, aliando ao bom temperamento andamentos fáceis e cómodos (Cordeiro, 1989). Todos os anos, os criadores da raça Lusitana, tal como criadores de outras raças, deparam-se com a complexa tarefa de selecionar os animais (machos e/ou fêmeas) para utilizarem como reprodutores que possam transmitir características desejáveis aos seus descendentes (Figura 1).

Figura 1 – Existe sempre o dilema de qual reprodutor escolher?

No caso dos equinos essa escolha ainda se pode tornar mais complexa, dado que os cavalos apresentam vários condicionalismos relativamente a outras espécies pecuárias. Claro que os princípios da seleção de reprodutores são semelhantes para todas as espécies, mas no caso do cavalo deverá existir uma clara definição dos principais

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objetivos de melhoramento e critérios de seleção, tentado ser mais objetivos num meio com tanta subjetividade. Outro aspeto importante é que, regra geral, os equinos apresentam um amplo leque de funções e utilizações (e.g. animal de trabalho, desporto, lazer, carne, etc.) o que poderá dificultar mais ainda a seleção destes animais. Quando pretendemos falar sobre metodologias de seleção em equinos devemos, em primeiro lugar, referir algumas particularidades desta espécie, relativamente a outros animais domésticos, tais como:

42

i.

Grande importância da morfologia e tipo dos animais, adicionalmente a outras características de interesse (Preisinger et al., 1991);

ii.

Os criadores muitas vezes pretendem selecionar para vários objetivos em simultâneo (dressage, tauromaquia, atrelagem, equitação de trabalho, arte equestre, lazer, etc.), nem sempre bem definidos e muitas vezes com grande subjetividade inerente;

iii.

Baixa intensidade de seleção, dada a escolha de uma ampla proporção de fêmeas e machos para futuros reprodutores;

iv.

Efetivos pequenos e muito dispersos, com grande disseminação de pequenos criadores (e.g. do número médio de produtos Lusitanos por coudelaria de 2.2±3.0 poldros);

v.

Conhecimento muito aprofundado de pedigrees, muitas vezes abrangendo várias gerações (e.g. mais de 11 gerações conhecidas no caso do Lusitano – Vicente, 2015)

vi.

Muitas características de interesse observáveis para machos e fêmeas, embora muitas vezes com valores muito desequilibrados, com mais dados para machos;

vii.

Baixa taxa de reprodução, onde muito animais aprovados como reprodutores não deixam quaisquer descendentes (e.g. 52% dos garanhões Lusitanos com menos de 5 filhos e média global de 13.13±22.53 produtos/garanhão);

viii.

Extenso intervalo temporal de utilização dos reprodutores, muitas vezes com uso de garanhões e éguas com mais de 20 anos de idade, com todas as complicações inerentes;

ix.

Só os “bons” são registados ou se apresentam como candidatos a reprodutores;

x.

Prática frequente de acasalamentos preferenciais, em nada aleatórios;


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xi.

Condicionamento ao uso de tecnologias reprodutivas, como é o caso da inseminação artificial ou transferência de embriões, como se passa na raça Puro-sangue Inglês;

xii.

Longo intervalo de gerações em equinos (e.g. cerca de 10 anos no caso do Lusitano);

xiii.

Ampla sobreposição de grupos etários contemporâneos entre os candidatos a reprodutores;

xiv.

Diferenças muito acentuadas no valor económico dos animais, dependendo do mérito genético assumido (Arnason e Van Vleck, 2000), com ou sem justificação para tal?

Assim sendo, e tendo em consideração todas estas particularidades, os criadores deverão tentar identificar animais geneticamente superiores para as características que mais lhe interessam, para serem utilizados como reprodutores e, desta forma, transmitirem-nas aos seus descendentes. O cavalo Lusitano sempre foi empiricamente selecionado, do passado até ao presente, pelos seus atributos de morfologia, conformação e beleza, a par do seu desempenho funcional em atividades ligadas ao trabalho de campo, tauromaquia e arte equestre. Mas poderá uma raça ser selecionada para tudo em simultâneo? Serão a beleza e funcionalidade compatíveis? Em analogia poderemos pensar: poderá um futebolista jogar bem em qualquer posição? Para conseguirmos responder a estas questões teremos que estudar devidamente as correlações genéticas entre as diferentes características e pensar num adequado programa de melhoramento genético da raça, moderno e atual, com recurso a ferramentas estatísticas e de avaliação genética, a par de todas as outras fontes de informação importantes. Em qualquer programa de seleção e melhoramento genético temos sempre de considerar a resposta esperada à seleção (∆G/ano ou ∆G/geração) que pode ser obtida por intermédio da fórmula apresentada na Figura 2. Para maximizarmos esta resposta à seleção temos sempre de pensar em aumentar os parâmetros do numerador e minimizar os do denominador da equação.

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Figura 2 – Resposta esperada à seleção por ano (Adaptado de Gama, 2002).

No caso do cavalo Lusitano, e quando falamos de ∆G, a intensidade de seleção muitas vezes é baixa visto existirem poucos candidatos à seleção e uma grande proporção de machos e fêmeas selecionados para reprodutores. Existe um rácio de 5 éguas ativas por garanhão, manifestamente baixo para aumentar a intensidade de seleção, bem como um uso limitado da inseminação artificial. No que diz respeito à variabilidade genética, e se considerarmos a consanguinidade média na raça, esta atinge um valor global de cerca de 11%, mas com algumas coudelarias com valores superiores a 30%, podendo reduzir, em parte, a diversidade genética existente. Mais importante ainda de monitorar, para além da consanguinidade, é a reduzida contribuição de fundadores e ascendentes para a população atual, com somente 2 ascendentes a explicarem mais de 30% da variabilidade genética atual e com grande relevância para o garanhão Agareno MV, com quase 25% de contribuição. Por outro lado o intervalo de gerações estimado na raça é muito longo (11.3 anos para machos e 9.7 anos para fêmeas – Vicente, 2015), o que poderá ter alguma vantagem em termos de consanguinidade mas que reduz o progresso genético anual (parâmetro no denominador da equação).

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Interessa então saber, no que diz respeito à resposta à seleção no cavalo Lusitano, se existe envolvimento de todos os players implicados na fileira do cavalo, entre criadores, associação de criadores, treinadores, médicosveterinários, cavaleiros, proprietários, juízes, etc., representando uma atividade conjunta ou um conjunto de iniciativas individuais? Será que todos os envolvidos trabalham para um mesmo fim/objetivo ou em sentidos opostos (Figura 3)?

VS

Figura 3 – Trabalho conjunto e na mesma direção ou em sentidos opostos na seleção do cavalo Lusitano?

Esta será sempre uma pergunta de difícil resposta e se não nos consciencializarmos de que a “união faz a força” então o progresso genético será sempre mais demorado e reduzido. Fruto das mais recentes técnicas e metodologias de seleção de animais existentes globalmente, propusemo-nos desenvolver, de forma sistemática, um sistema de avaliação genética para a morfologia e funcionalidade na raça Lusitana. Interessa então ao criador conhecer o valor genético dos seus animais, ou seja, qual o valor de um animal num programa de seleção, i.e. o que esse animal poderá efetivamente transmitir à descendência, indicador do seu mérito genético. Desde modo, implementou-se uma avaliação genética para a morfologia, considerando todos os dados de pontuação de reprodutores ao Livro de Adultos disponíveis no Studbook da raça Lusitana, para além da medição da altura ao garrote, com a predição de valores genéticos para esta população, com base na metodologia BLUP – Modelo Animal (Gama et al., 2004; Henderson, 1994). O modelo empregue para este estudo apresenta-se na Figura 4. Compilou-se informação genealógica de mais de 53 mil indivíduos presentes no Studbook da raça ou seus ascendentes e um ficheiro com mais de 18 mil animais pontuados ao livro de adultos segundo a grelha definida pela associação de criadores, com a altura ao garrote entre os anos de 1967 e 2009.

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Figura 4 – Modelo de análise segundo o BLUP – Modelo animal, para a morfologia na raça Lusitana, considerando os diferentes efeitos fixos e o efeito genético.

No caso da avaliação genética para a morfologia efetuaram-se estimativas de parâmetros genéticos, nomeadamente de heritabilidade, correlações e valores genéticos para 7 regiões corporais, andamentos, pontuação total e altura ao garrote, num total de 10 características analisadas. De modo análogo desenvolveu-se uma avaliação genética, com a estimativa de parâmetros genéticos para a funcionalidade no cavalo Lusitano, mais especificamente para as disciplinas equestres de Dressage e Equitação de Trabalho, áreas onde esta raça tem vindo a ganhar algum protagonismo e distinção. O modelo de análise apresenta-se na Figura 5. No caso da funcionalidade utilizou-se o mesmo ficheiro de genealogias com mais de 53 mil indivíduos e compilou-se informação de competição desportiva de Dressage com mais 12 mil resultados de provas de 759 cavalos Lusitanos diferentes (entre os anos de 2000 e 2012) e ainda cerca de 1500 resultados de provas de ensino e maneabilidade de Equitação de trabalho de cerca de 200 animais (entre os anos de 1998 e 2011). Finalmente pretendeu-se estimar as correlações genéticas entre a morfologia e função para vermos se existem características que são antagónicas ou complementares, fundamentais para o sucesso da implementação do programa de melhoramento genético da raça.

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Figura 5 – Modelo de análise segundo o BLUP – Modelo animal, para a funcionalidade na raça Lusitana (Dressage e Equitação de Trabalho), considerando os diferentes efeitos fixos.

As estatísticas descritivas e os parâmetros genéticos (heritabilidade – h2) obtidos para a classificação morfológica a quando da apreciação dos candidatos a reprodutores Lusitanos para o Livro de Adultos (LA) apresentam-se no Quadro 1. Podemos observar que existem animais pontuados ao LA com altura ao garrote que varia entre 1.40m e 1.78m e pontuação total entre 44.5 pts e 97 pts. As notas atribuídas aos parciais de morfologia e andamentos variaram entre os 4 e 10 pontos, com valores médios mínimos de 6.68 pts (membros) a máximos de 7.48 pts (peitoral e costado). De referir ainda que a Cabeça e Pescoço foi o parcial com maior variação (CV = 11.12%) seguida da nota para os andamentos. A heritabilidade (h2), parâmetro genético fundamental que mede essencialmente a transmissibilidade à descendência de uma dada característica, foi elevada para a altura ao garrote (0.61) e média/baixa para os diferentes itens de classificação morfológica, variando entre 0.18 (Cabeça e Pescoço) e 0.07 (Membros).

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Quadro 1 – Estatísticas descritivas e parâmetros genéticos (h2 – heritabilidade) para a pontuação de Lusitanos ao LA (DP – desvio padrão e CV – coeficiente de variação)

N

Média

DP

CV (%)

Min

Max

h2

16955

157.80

4.05

2.56

140.0

178.0

0.61

Coef.

18076

71.39

4.94

6.92

44.5

97

0.18

Cabeça e pescoço

1

17139

7.24

0.81

11.12

4

10

0.18

Espádua e garrote

1

17139

7.47

0.62

8.28

5

10

0.13

Peitoral e costado

1

17139

7.48

0.67

8.97

4

10

0.12

1.5

17139

6.93

0.73

10.46

4

10

0.15

1

17139

7.29

0.71

9.70

4

10

0.14

Membros

1.5

17139

6.68

0.69

10.28

4

10

0.07

Conjunto de formas

1.5

17139

7.17

0.71

9.94

4

10

0.14

Andamentos

1.5

17139

7.27

0.78

10.72

4

10

0.16

Característica Altura ao Garrote (cm) Pontuação Total (pts)

Dorso e rim Garupa

Após as estimativas dos vários parâmetros genéticos para a morfologia pode-se de seguida realizar a desejada avaliação genética, com o intuito de se obterem valores genéticos para os diferentes animais que compõem esta população. Com isto podemos elaborar rankings de animais consoante o seu valor genético estimado para diferentes características estudadas (pontuação total, altura ao garrote, andamentos, etc.). De realçar que as estimativas dos valores genéticos são dinâmicas, querendo dizer que podem e devem ser atualizadas

48


A GENÉTICA AO SERVIÇO DA PRODUÇÃO ANIMAL

frequentemente (numa base semestral ou anual) e, à medida que vamos dispondo de mais informação morfológica de pontuação de animais ao LA, poder-se-ão alterar (só apresentamos aqui dados até 2009). Quadro 2 - Ranking de mérito genético da morfologia de garanhões Lusitanos, para a Pontuação Total (em pontos), Altura ao Garrote (em cm) e Andamentos (em pontos), ordenados pelo Valor Genético (VG) da Pontuação Total e respetivas precisões da estimativa em % (Prec).

Pont. Total NOME

Altura Garrote

Andamentos

ANONASC VG

Prec (%)

VG

Prec (%)

VG

Prec (%)

XAQUIRO

1980

6.75

92

2.48

97

1.73

91

RIOPELE

1998

6.70

75

3.94

89

1.38

73

HOSTIL

1989

6.34

82

3.11

93

1.22

80

SARILHO

1999

6.13

69

4.31

86

0.84

66

ZICO

1981

6.12

89

2.42

95

0.78

87

TOLEIRAO

2000

6.03

64

2.66

84

1.17

63

SPARTACUS

1999

5.98

73

2.83

88

1.42

71

COXIXO

2007

5.97

70

1.25

76

1.42

69

ARAGAO

2005

5.95

62

2.08

71

1.38

61

CAMPARI II

2007

5.85

63

1.78

71

1.14

62

XIQUE

2003

5.79

58

3.01

69

1.18

57

MARIALVA

1993

5.69

69

-0.20

84

1.02

68

TIXAQUIR

2000

5.68

73

2.59

86

1.35

71

SOBERANO

1999

5.60

69

6.49

87

1.09

66

EQUADOR

2009

5.58

58

1.97

68

1.06

57

49


A GENÉTICA AO SERVIÇO DA PRODUÇÃO ANIMAL

No Quadro 2 apresenta-se o ranking do mérito genético estimado dos melhores 15 garanhões Lusitanos para a morfologia, ordenados a partir do mais alto valor genético (VG) para a Pontuação Total (PT expresso em pontos). Para além do valor genético para a PT, podemos ainda observar o valor genético estimado para a altura ao garrote (expresso em cm), que evidencia o potencial genético de um determinado reprodutor na dimensão/tamanho que pode transmitir à descendência e ainda para os andamentos. Para estas três características, apresenta-se ainda a precisão das estimativas do valor genético (Prec), que traduz a maior ou menor quantidade de informação existente sobre o animal e seus familiares. Desde modo, o criador de cavalos Lusitanos poderá ter à sua disposição um conjunto de informações, dados relevantes e mais objetivos, que o auxiliem nas opções de seleção e emparelhamentos de reprodutores, no que diz respeito à apreciação morfológica. Esta informação está ao dispor dos associados da APSL, para os seus animais e para o ranking dos melhores na sua área reservada (https://genpro.ruralbit.com/). A título de exemplo, e para que saibamos como interpretar e usar os resultados da avaliação genética para a morfologia, apresentamos os valores da avaliação genética para dois garanhões distintos, aqui identificados como Garanhão A (Figura 6) e Garanhão B (Figura 7) (adaptados de: https://genpro.ruralbit.com/).

Figura 6 – Garanhão A, animal melhorador para todas as características morfológicas estudadas (adaptado de: https://genpro.ruralbit.com/)

50


A GENÉTICA AO SERVIÇO DA PRODUÇÃO ANIMAL

Figura 7 – Garanhão B, animal que não sendo melhorador para os andamentos, é melhorador para a Altura ao Garrote (adaptado de: https://genpro.ruralbit.com/)

De modo análogo podemos obter os resultados para o estudo da funcionalidade na raça Lusitana em Dressage e Equitação de Trabalho e no Quadro 3 apresentam-se as estatísticas descritivas e parâmetros genéticos respetivos.

51


A GENÉTICA AO SERVIÇO DA PRODUÇÃO ANIMAL

Quadro 3 – Estatísticas descritivas e parâmetros genéticos do cavalo Lusitano em Equitação de Trabalho para as provas de ensino e maneabilidade e em Dressage.

Equitação Trabalho - Ensino

Equitação Trabalho Maneabilidade

Dressage

Nº Registos

1454

1524

12131

Nº Cavalos

186

211

759

60.9±7.56

61.25±10.42

62.74±4.47

Mínimo (%)

24.02

25.63

37.00

Máximo (%)

79.26

85.83

89.60

CV (%)

12.41

17.01

7.13

h2±EP

0.32±0.171

0.18±0.121

0.32±0.075

re±EP

0.67±0.235

0.46±0.166

0.60±0.101

Característica

Média±DP (%)

Legenda: DP – Desvio Padrão; CV – Coeficiente de Variação; h2 – heritabilidade; EP – Erro Padrão; re - Repetibilidade.

Observa-se que a percentagem média obtida em provas de ensino e de maneabilidade de Equitação de Trabalho rondou os 61%, com uma ampla dispersão de valores mínimos e máximos (aproximadamente entre os 25 e 85%), ainda mais evidente para a maneabilidade com um coeficiente de variação de aproximadamente 17%. A heritabilidade (h2) foi média/alta para a prova de ensino (0.32) e média/baixa para a maneabilidade (0.18), possivelmente fruto da maior influência ambiental e de diversos fatores que variam numa prova de maneabilidade, comparativamente com a prova de ensino (tipo de obstáculos, piso, percursos, condições climatéricas, etc).

52


A GENÉTICA AO SERVIÇO DA PRODUÇÃO ANIMAL

De realçar que se conseguiu compilar um manancial relevante de resultados desportivos de cavalos Lusitanos em Dressage, com cerca de 12 mil resultados de mais de sete centenas de cavalos diferentes, com uma classificação média global de aproximadamente 63%, com uma heritabilidade estimada média/alta de 0.32 e boa repetibilidade de 0.60. Não podemos deixar de manter este esforço de compilar todos os resultados desportivos de cavalos Lusitanos pois revela-se fundamental para o sucesso a médio/longo prazo do programa de melhoramento genético da raça. No Quadro 4, e após realização da avaliação genética, apresenta-se o ranking do mérito genético estimado dos melhores 20 animais Lusitanos em Dressage, ordenados a partir do mais alto valor genético para a Dressage (expresso em %). Para além do valor genético para a Dressage (expresso em %), podemos ainda observar o valor genético estimado para a altura ao garrote (expresso em cm), que evidencia o potencial genético de um determinado reprodutor na dimensão/tamanho que pode transmitir à descendência. Para as duas características, apresenta-se ainda a precisão das estimativas do valor genético, que traduzem a maior ou menor quantidade de informação existente. Podemos confirmar que no topo do ranking de mérito genético para a Dressage estão cavalos que concursaram ou concursam ao mais alto nível, e que obtiveram bons resultados nesta disciplina equestre, bem como alguns dos seus descendentes. De igual forma, no Quadro 5 apresenta-se o ranking do mérito genético estimado para os melhores 20 animais Lusitanos para a Equitação de Trabalho, ordenados a partir da média do valor genético (VG) para a prova de ensino e para a maneabilidade. No topo do ranking genético para a Equitação de Trabalho estão cavalos com créditos firmados nesta disciplina equestre, com várias provas ganhas e vários títulos nacionais e internacionais, como foram os casos do Oxidado, Navarro e Pintor.

53


A GENÉTICA AO SERVIÇO DA PRODUÇÃO ANIMAL

Quadro 4 – Top 20 do ranking de mérito genético para a Dressage de raça Lusitana

NOME

SEXO CRIADOR

PT AG ANONASC VG_DRES Prec_DRES VG_AG Prec_AG

RUBI

M COUDELARIA DE ALTER

72.0 1.65

1998

6.03

0.79

2.77

0.83

BARILOCHE

M JOAO P. RODRIGUES

78.5 1.66

2006

6.01

0.73

2.61

0.66

ZAIRE

M PEDRO PASSANHA, D.

76.0 1.70

2004

5.66

0.74

2.61

0.66

OXALIS MEIA LUA

F

COUDELARIA MEIA LUA

74.5 1.71

1995

5.40

0.75

4.06

0.79

BEIRAO

M COUDELARIA DE ALTER

69.5 1.71

2006

5.19

0.73

2.90

0.64

ZIRCON

M CASA CADAVAL

73.5 1.62

2004

5.14

0.70

1.28

0.67

CORONEL

M COUDELARIA DE ALTER

74.5 1.61

2007

5.09

0.74

3.36

0.64

QUIXOTE

M COUD. MONTE VELHO

73.5 1.66

1997

5.04

0.76

0.88

0.87

TALISCO

M PEDRO FERRAZ COSTA

72.5 1.67

2000

4.95

0.77

1.81

0.86

SPARTACUS

M COUD. STA.MARGARIDA 81.0 1.64

1999

4.94

0.80

3.12

0.88

ROUXINOL

M JOAO P. RODRIGUES

76.0 1.62

1998

4.90

0.65

3.34

0.87

COROADO

M COUDELARIA DE ALTER

-- 1.68

2007

4.90

0.71

1.00

0.65

HE-XILA

F

COUDELARIA DE ALTER

77.0 1.60

1989

4.89

0.62

0.93

0.87

ALTIVA

F

SOC. QUINTA TERRAS

72.5 1.69

2005

4.83

0.71

5.80

0.80

XAQUIRO

M CIPARQUE

80.0 1.63

1980

4.73

0.87

2.68

0.97

BARLAVENTO

M COUD. OLIVEIRA SANTOS 73.0 1.60

2006

4.62

0.75

1.99

0.68

PAJEU

M COUDELARIA DE ALTER

72.5 1.62

1996

4.62

0.72

0.04

0.82

UTIL

M PAULO CAETANO

70.5 1.62

2001

4.56

0.75

1.05

0.85

BERINJELA

F

76.5 1.61

2006

4.55

0.56

3.27

0.66

DRAGAO FIGUEI.

M SOC. QUINTA TERRAS

80.0 1.66

2008

4.41

0.71

5.88

0.66

COUDELARIA DE ALTER

Legenda: PT – Pontuação Total; AG – Altura ao garrote; ANONASC – Ano de nascimento; VG_Dress – Valor genético para a Dressage (em %); Prec_Dress – Precisão da estimativa para a Dressage; VG_AG – Valor genético para a Altura ao Garrote (em cm); Prec_AG – Precisão da estimativa para a Altura ao Garrote.

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A GENÉTICA AO SERVIÇO DA PRODUÇÃO ANIMAL

Quadro 5 - Ranking de mérito genético para a Equitação de Trabalho de cavalos Lusitanos, para as provas de Ensino (VG ENS em %) e de Maneabilidade (VGMAN em %), respetiva média (Média VG em %), altura ao garrote (AltG, cm) e ano de nascimento (ANOn).

ANOn

VGENS

VGMAN

Média VG

158

1995

8.09

7.80

7.94

M

159

1994

7.51

7.56

7.53

PAULO CAETANO

M

160

1996

8.92

5.44

7.18

ZAGALO

RESINA ANTUNES

M

--

2004

7.02

7.23

7.12

ROUXINOL

JOAO PEDRO RODRIGUES

M

162

1998

6.96

7.13

7.04

PINTOR

MANUEL A. COIMBRA

M

159

1996

7.98

5.80

6.89

XAQUIRO

CIPARQUE

M

163

1980

7.01

6.70

6.85

LATINO

COUDELARIA FREIRE

M

168

1992

6.94

6.69

6.82

NIQUEL

COUDELARIA FREIRE

M

--

1994

7.16

6.01

6.59

ZURIQUE

JOAO PEDRO RODRIGUES

M

--

2004

6.58

6.58

6.58

IDOLO

MANUEL A. COIMBRA

M

162

1990

6.90

6.12

6.51

ZAQUERA

JOSE M. CORREIA LOPES

F

153

1981

7.37

5.63

6.50

UNICO

RESINA ANTUNES

M

152

2001

6.72

6.17

6.45

VIVACA

RESINA ANTUNES

F

157

2002

6.72

6.17

6.45

MARAVILHA

MANUEL TAVARES VEIGA

M

162

1970

6.64

6.21

6.43

NOSTRADAMUS TOP

ANTONIO T. PEREIRA

M

162

1993

7.10

5.76

6.43

ZIDANE DO LIS

COUD. FLOR DO LIS

M

163

2004

6.50

6.32

6.41

QUARESMA

RESINA ANTUNES

F

157

1997

6.54

6.23

6.39

ATILA

COUD. QUINTA RIO

M

169

2005

6.39

6.33

6.36

TRIBUTO

RESINA ANTUNES

M

--

2000

6.65

6.02

6.34

NOME

CRIADOR

SEXO AltG

OXIDADO

JOAO PEDRO RODRIGUES

M

NAVARRO

RESINA ANTUNES

PLUTAO

55


A GENÉTICA AO SERVIÇO DA PRODUÇÃO ANIMAL

Para terminar, e como referimos anteriormente, revela-se especialmente importante o estudo das correlações genéticas em diferentes grupos de características, nomeadamente morfológicas com características funcionais para assim podermos perceber se, ao tentarmos selecionar para um grupo de características, estamos ou não a piorar o desempenho do outro grupo. No Quadro 6 apresentam-se as correlações genéticas entre as diferentes características morfológicas estudadas e as características de funcionalidade em Dressage e Equitação de Trabalho. De um modo global, e pela análise do quadro 6, podemos constatar que existe uma correlação positiva entre a grande maioria de características de morfologia e funcionalidade, ou seja, ao selecionarmos para a morfologia pela pontuação de reprodutores ao livro de adultos da raça estamos também a selecionar, positivamente, para várias características de funcionalidade (e vice-versa), com destaque fundamentalmente para os andamentos (maiores correlações genéticas observadas). Quadro 6 - Correlações genéticas entre características morfológicas e características funcionais na raça Lusitana.

Características Funcionais Características Morfológicas Prova de Ensino ET

Prova de Maneabilidade ET

Dressage

Cabeça e Pescoço

0.56

0.61

0.07

Espádua e Garrote

0.50

0.25

0.57

Peitoral e Costado

0.54

0.23

0.42

Dorso e Rim

0.44

0.24

0.20

Garupa

0.49

0.04

0.19

Membros

0.36

-0.17

0.23

Conjunto de Formas

0.80

0.40

0.27

Andamentos

0.72

0.60

0.60

Pontuação Total

0.67

0.33

0.52

Altura ao Garrote

0.06

-0.10

0.40

Erros-Padrão variaram entre 0.045-0.134 (Dressage) e 0.059-0.233 (ET)

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A GENÉTICA AO SERVIÇO DA PRODUÇÃO ANIMAL

O programa de seleção da raça Lusitana tem, até ao presente, assentado essencialmente na escolha de animais com base na informação fenotípica (morfologia e andamentos) e pedigrees (genealogias), mas seria importante a inclusão de outros objetivos de melhoramento que traduzam a funcionalidade do animal. Com estes resultados obtidos pensamos que o criador de cavalos Lusitanos poderá ter à sua disposição um conjunto de informações e dados relevantes, que o auxiliem nas opções de seleção e emparelhamentos de reprodutores, no que diz respeito ao desempenho em Equitação de Trabalho e Dressage, para além da importância dos resultados morfológicos. Mais recentemente têm vindo a ser implementadas “novas tecnologias” de apoio à seleção de equinos, nomeadamente pelo uso da genética molecular, mais precisamente com recurso a marcadores genéticos em equinos, para estudos populacionais, testes de paternidade ou seleção genómica. Estas novas ferramentas poderão representar uma mais-valia e um incremento nos resultados do progresso genético e estão cada vez mais disponíveis e deverão ser consideradas para o presente/futuro dos programas de melhoramento. Para uma correta análise morfo-funcional de uma raça é importante conhecer a sua história, a seleção efetuada no passado e no presente, e como ela foi moldada até chegar ao momento atual. Somente conhecendo bem a história da população, estudando influências e estratégias de seleção seguidas, podemos tomar medidas e ajudar a definir corretas estratégias de seleção para o futuro, tendo sempre em mente o melhoramento genético do maravilhoso cavalo de raça Lusitana. Em jeito de conclusão, a seleção e melhoramento em populações equinas, com especial ênfase para o cavalo Lusitano, é mais complexa, sendo necessário objetivar mas é possível e fazível! A realização da avaliação genética, com a predição de valores de mérito genético para todos os indivíduos, em diferentes áreas equestres (morfologia, desporto, etc.) é possível e desejável, devendo ser implementada como rotina. Deverá ainda existir um trabalho conjunto e próximo entre todas as partes envolvidas, enfim um longo e desafiante percurso a realizar por todos!

Agradecimentos: Ao RNE/AR e APSL pela cedência dos dados de Studbook e Equitação de Trabalho para este estudo e por todo o apoio na sua elaboração, e ainda à FEP e Jump-Off pela disponibilização dos resultados desportivos de Dressage, bem como aos Orientadores da tese de doutoramento que deu origem a estes resultados.

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A GENÉTICA AO SERVIÇO DA PRODUÇÃO ANIMAL

Referências APSL, 2011. Catálogo 2009|2011. Ed. Associação Portuguesa de Criadores do Cavalo Puro Sangue Lusitano, 183 pp. Arnason T. and Van Vleck, L.D., 2000. Genetic improvement of the horse. In: A.T. Bowling and A. Ruvinsky (eds.). The Genetics of the Horse. p 473-497. CABI Publishing, Oxon, UK. Cordeiro, A., 1989. Cavalo Lusitano: O filho do vento. Edições Inapa, Lisboa, 231 pp. Gama L.T. 2002. Melhoramento genético animal. Escolar Editora. 306 pp. Gama, L.T, Matos, C.P. e Carolino, N. 2004. Modelos Mistos em Melhoramento Animal. Arquivos Veterinários, Nº7, Direcção Geral de Veterinária - Ministério da Agricultura, do Desenvolvimento Rural e Pescas, Portugal. Henderson, C. R., 1994. Applications of Linear Models in Animal Breeding. Third printing. University of Guelph, Canada. Preisinger R., Wilkens J. and Kalm E. 1991. Estimation of genetic parameters and breeding values for conformation traits for foals and mares in the Trakehner population and their practical implications. Livest. Prod. Sci. 29: 77-86. Vicente, A. 2015. Characterization and selection of the Lusitano horse breed. Doctoral Thesis in Veterinary Science. Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade de Lisboa.

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A GENÉTICA AO SERVIÇO DA PRODUÇÃO ANIMAL

CAPÍTULO 5 - BANCO PORTUGUÊS DE GERMOPLASMA ANIMAL: COMO RECUPERAR UMA RAÇA A PARTIR DE MATERIAL CRIOPRESERVADO Rosa Lino Neto Pereira (Unidade Investigação e Serviços de Biotecnologias e Recursos Genéticos do Instituto Nacional de Investigação Agrária e Veterinária – Polo de Investigação da Fonte Boa 2005-048 Vale de Santarém) rosalinoneto@iniav.pt Resumo A preservação e o maneio sustentável dos recursos genéticos animais são desígnios nacionais em cooperação com os organismos internacionais especializados. Portugal é detentor de um património genético animal com grande diversidade genética, incluindo 61 raças de animais domésticos reconhecidas, muitas das quais em perigo de extinção. Face a esta preocupante realidade têm sido implementados diferentes estratégias de conservação das raças que incluem a fundação do Banco Português de Germoplasma Animal. Nesta revisão serão equacionados e discutidos os benefícios e os pontos fracos de diferentes estratégias de conservação, assim como planos para aumentar ou manter a diversidade genética e reduzir os custos da recuperação de uma raça a partir de material criopreservado, referindo algumas particularidades relacionadas com cada espécie ou população. Abstract The preservation and management of animal genetic resources are national priorities in compliance with different international organizations. Portugal owns an animal inheritance with a huge genetic diversity, which includes 61 recognized domestic breeds, most of them in danger of extinction. Facing this distressing reality, different breed conservation strategies have been implemented, including the establishment of the Portuguese Bank of Animal Germplasm. In this review, the benefits and weaknesses of different conservation strategies, as well as plans to increase or maintain the genetic diversity and reduce the costs of the reconstruction of a breed from cryopreserved material will be considered and discussed. Some particularities related to each species or population will also be mention. Introdução A preservação dos recursos genéticos animais (RGAn) e da sua diversidade é uma prioridade internacional. Estes recursos são imprescindíveis para a segurança alimentar, a agricultura e o desenvolvimento rural, tendo um papel importante na fixação de populações e na sua sustentabilidade (Hoffmann 2010; FAO 2015). Como reservatório de variabilidade genética, os RGAn permitem ainda dar resposta a novas necessidades da sociedade, fazer face a situações imprevistas e às alterações climáticas e, assim, favorecer o desenvolvimento da

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A GENÉTICA AO SERVIÇO DA PRODUÇÃO ANIMAL

Humanidade. No entanto, a perda de biodiversidade relatada por muitas organizações e cientistas é hoje uma realidade preocupante e que, apesar de múltiplos esforços e programas de conservação em curso, se tem acentuado nas últimas décadas (Butchart et al., 2010, Marchese, 2015). Globalmente, a biodiversidade não está distribuída equitativamente. De fato estão identificadas várias áreas no mundo particularmente ricas nessa biodiversidade (figura 1), denominadas vulgarmente por biodiversity hotspots, que poderão ser importantes ferramentas para estabelecer prioridades e estratégias de conservação dos RGAn e, de uma forma mais alargada, de todo o ecossistema (Marchese, 2015).

Figura 1. em cima: Regiões repositórias de biodiversidade ou hotspot regions no mundo (Conservation International citado por Marchese, 2015) Figura 1. à esquerda: indicadores do estado de biodiversidade (WBI, Wild Bird Index; WPSI, Waterbird Population Status Index; LPI, Living Planet Index; RLI, Red List Index; Butchart et al., 2010)

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A GENÉTICA AO SERVIÇO DA PRODUÇÃO ANIMAL

Portugal integra uma destas regiões (figura 1) e é considerado um reservatório de biodiversidade, incluindo 61 raças de animais domésticos, muito bem adaptadas localmente e com sistemas de produção “amigos do ambiente”, conquanto muitas destas raças estejam ameaçadas de extinção. É assim prioritário sensibilizar a comunidade e os agentes envolvidos para a necessidade fundamental da preservação desta biodiversidade e do maneio sustentável dos RGAn. As raças de animais domésticos e a sua conservação A biodiversidade animal resulta de milhares de anos de evolução, mas nas últimas décadas, a produção animal mundial restringiu-se a um número muito limitado de raças altamente selecionadas e, por isso, mais produtivas, pelo que se tornou imperativo implementar medidas, englobando diferentes países e regiões do mundo, direcionadas com a utilização dos RGAn, para contrariar a extinção de populações, a erosão genética e o declínio da diversidade genética inter-racial (FAO, 2015). Presentemente, muitas raças locais ou autóctones estão em risco de desaparecer devido à sua substituição generalizada por raças comerciais, ao pequeno número de animais existentes e/ou a uma distribuição regional muito localizada, sendo que algumas já estão mesmo extintas (Woelders et al., 2012). A Europa e o Cáucaso reportaram de longe o maior número de raças extintas no mundo - 7%. Outras regiões não têm dados muito fiáveis (FAO, 2015). Portugal tem um património genético animal muito rico e diversificado, com 61 raças autóctones de animais domésticos (tabela 1). Muitas destas raças estão em sério risco de extinção. A conservação deste património é um desígnio nacional (Gama, 2006, Pereira e Marques, 2011). A Conferência Internacional sobre RGAn da FAO, em 2007, aprovou o Plano Global de Ação para os RGAn e o desenvolvimento de estratégias concertadas e políticas nacionais de conservação. Estas políticas estão vertidas no Plano Nacional para os Recursos Genéticos Animais que tem por objetivo estabelecer as normas básicas e os critérios para a uniformização de procedimentos relacionados com a caracterização, conservação, melhoramento, promoção e utilização sustentável dos RGAn em Portugal.

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A GENÉTICA AO SERVIÇO DA PRODUÇÃO ANIMAL

Tabela 1. Raças de animais domésticos portuguesas

Bovinos

Caprinos

1

Alentejana

Algarvia

2

Algarvia

Bravia

3

Arouquesa

Charnequeira

Garrana

4

Barrosã

Preta Montesinho

Lusitana

Serrana

Sorraia

Serpentina

Pónei da Terceira

5 6

Galinhas Amarela Branca Pedrês Portuguesa Preta Lusitânica

Ovinos Bord. Entre Douro e Minho

Suínos

Campaniça

Bisara

Churra Algarvia

Malhado de Alcobaça

Churra Badana Churra da Terra Quente Churra do Campo

7

Cachena

8

Garvonesa

9

Jarmelista

10

Marinhoa

11

Maronesa

12

Mertolenga

Merina Branca

13

Minhota

Merina Preta

14

Mirandesa

Merino da Beira Baixa

15

Preta

Saloia

16

62

Brava de Lide Ramo Grande

Equídeos Burro de Miranda Burro da Graciosa

Churra do Minho Churra Galega Bragançana Branca Churra Galega Bragançana Preta Churra Galega Mirandesa Churra Mondegueira

Serra da Estrela

Alentejana

Cães Cão de Castro Laboreiro Cão da Serra da Estrela Rafeiro do Alentejo Cão de Fila de S. Miguel Cão da Serra da Aires Podengo Português Perdigueiro Português Cão de Água Português Cão de Gado Transmontano Barbado da Terceira Cão do Barrocal Algarvio


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Para a conservação do RGAn são preconizadas estratégias de conservação in situ, com a manutenção das raças nos seus solares de origem, devendo aliar a caracterização genética à ecológica. Esta conservação pode ser mais passiva, com a manutenção da raça tal como existe, apenas minimizando a consanguinidade ou tentar uma conservação mais pró-ativa, com aumento da competitividade, visando a sustentabilidade da raça, mas compatibilizando a conservação e a seleção. O recurso às biotecnologias reprodutivas ou técnicas de reprodução assistida, como a inseminação artificial (IA), a produção e transferência/sexagem de embriões, a sexagem de sémen e a clonagem, permite aumentar o número de nascimentos a partir de progenitores selecionados, escolher o sexo dos neonatos e a redução do intervalo entre gerações, constituindo ferramentas essenciais para a conservação e seleção das raças. No entanto, as estratégias de conservação in situ, demonstraram ser, em alguns casos, insuficientes, nomeadamente após desastres ambientais, agentes patogénicos ou desequilíbrios extremos/totais entre sexos. A conservação ex situ, com a constituição de núcleos de conservação e bancos de germoplasma, estes últimos através da crioconservação de gâmetas (oócitos e sémen), embriões e outras amostras de tecido biológico ou ADN das diferentes espécies e raças ou variedades, tornou-se essencial e obrigatória em todos os países. De fato, as biotecnologias reprodutivas atualmente ao nosso dispor possibilitam a reposição, se existir material biológico criopreservado, do nível original de diversidade genética de uma população, mesmo em caso de extinção (Andrabi e Maxwell, 2007; Pereira e Marques, 2008; FAO, 2015). A conservação ex situ exige capacidade técnica em genética, fisiologia reprodutiva, criobiologia, sanidade e gestão de dados e, ainda, recursos económicos consideráveis. Os programas de conservação in situ e ex situ são complementares (tabela 2), devendo ser implementados em simultâneo e de forma coordenada (FAO, 2012).

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Tabela 2. Programas de conservação ex situ e in situ.

Dada a premência da maioria das raças de animais domésticos portuguesas estar ameaçada de extinção (relatório de recursos genéticos em Portugal, 2004), o INIAV liderou um projeto Agro para constituir o Banco Português de Germoplasma Animal (BPGA), na Estação Zootécnica Nacional, sendo que há várias décadas já investigava e aperfeiçoava métodos de criopreservação de gâmetas e embriões, por congelação lenta ou vitrificação, com resultados promissores (Marques et al., 1995; Pereira et al., 2007, 2008; Matos et al., 2015; Romão et al., 2015 e 2016). De acordo com as recomendações da FAO, por cada raça deveriam ser crioconservados 200 doses de sémen, de 25 a 50 machos não aparentados, e 5 a 10 embriões, de 30 a 50 fêmeas também não aparentadas. Estes números serão muito difíceis ou mesmo impossíveis de atingir nas raças com menor número de animais. Presentemente, o BPGA têm a tutela conjunta do INIAV e da DGAV, tendo por objetivo assegurar a recolha e a manutenção de germoplasma e ADN de todas as raças nacionais de animais domésticos, para garantir a sua conservação a longo prazo, de acordo com as recomendações das organizações internacionais competentes. Assegura ainda a sua disponibilidade para utilização nos programas de seleção e conservação das raças envolvidas, segundo normas estabelecidas no regulamento do BPGA e promove o intercâmbio de informação e, se oportuno, de material genético, com bancos congéneres estrangeiros. O BPGA tem diferentes polos (figura 2),

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de forma a existirem duplicados do material genético crioconservado. O BPGA tem atualmente armazenado sémen de 14 raças de bovino (235 animais, 189343 doses), de 16 raças de ovinos (75 animais, 13180 doses) e de 6 raças de caprinos (59 animais, 12743 doses). Tem igualmente embriões de 6 raças de pequenos ruminantes e tecido ovárico de 3 animais. Todos estes animais têm amostras de ADN armazenadas e ainda são mantidos os ADN de 56898 equinos.

Figura 2. Banco Português de Germoplasma Animal: Polo Central na Quinta da Fonte Boa, no Vale de Santarém (INIAV); Polo no Norte localizado em Braga (INIAV) e o Polo no Sul na Herdade da Abóboda (DRAP Alentejo).

A crioconservação e a gestão dinâmica dos recursos armazenados é uma tarefa contínua. Estão em curso esforços para aumentar o número de espécies abrangidas, assim como de embriões. Este valioso repositório poderá ser utilizado na recuperação de raças ou variedades extintas ou em risco, na salvaguarda, para uso futuro, de informação genética referente às características de adaptabilidade local e resiliência, resistência a doenças ou outras e, ainda, para suportar estratégias de conservação in vivo, nomeadamente para diminuir a consanguinidade ou para adoção de novas estratégias de melhoramento (Pereira, 2016). Estratégias para a recuperação das raças a partir de material criopreservado Diferentes estratégias podem ser utilizadas para a recuperação ou mesmo reconstrução de raças autóctones bastante ameaçadas de extinção ou mesmo extintas. Estas estratégias deverão ser equacionadas com base na realidade de cada raça, nomeadamente na existência ou não de animais vivos (número de fêmeas e machos)

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e/ou material genético criopreservado (só embriões, só sémen ou ambos) e das particularidades relacionadas com cada espécie ou população. As espécies variam quanto à dimensão da descendência, idade à maturidade sexual, intervalos entre partos e duração da gestação, entre outros, que terão que ser considerados quando se implementam planos para esta recuperação (Gandini et al., 2007). Na figura 3 estão representadas diferentes estratégias para a recuperação das raças a partir de material criopreservado: só sémen, só embriões, sémen e embriões ou sémen, oócitos, embriões e outros tipos de tecido. A estratégia de recuperação mais rápida consiste na transferência de embriões após descongelação (por exemplo 5 meses no coelho a 2,4 anos nos equinos), mas é também a mais dispendiosa. A utilização de apenas sémen é a menos dispendiosa, mas a mais longa e, em exclusivo, não permite a recuperação de todas as características originais da raça. Esta recuperação pode levar entre 2 a 21 anos, dependendo da espécie, das doses congeladas e da existência ou não de fêmeas de outra(s) raça(s) geneticamente próxima(s). Uma estratégia intermédia será a recuperação da raça a partir de sémen e embriões criopreservados, que permite diminuir o intervalo de tempo necessário e aumentar a diversidade genética, com custos menos elevados (Boettcher et al., 2005; Gandini et al., 2007). Idealmente, quanto maior a diversidade e quantidade de material crioconservado de uma raça, maior o sucesso na sua recuperação (figura 3).

Figura 3. Estratégias para a recuperação de raças de animais a partir de material criopreservado.

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A criopreservação de gâmetas e embriões é um processo complexo que origina lesões celulares, sobretudo devido à formação de cristais de gelo e a choques osmóticos decorrentes do processo de congelação e descongelação (Pereira e Marques, 2008 e 2011). A resistência ao processo de criopreservação e, como tal, a possibilidade de obter um neonato a partir de material criopreservado nos animais domésticos, varia significativamente com a espécie e dentro desta com a raça e mesmo o individuo, com o estádio de desenvolvimento, a origem e a técnica utilizada (Pereira e Marques, 2008, Pereira et al., 2007 e 2008, Arav 2014, Prates et al., 2014, Romão et al., 2016). Estes fatores terão que ser ponderados quando se está a planear qual o material que deverá ser armazenado para garantir o futuro de uma raça. Assim a qualidade e a diversidade do material criopreservado nos Bancos de germoplasma são primordiais para o êxito posterior, que se irá traduzir em gestações e neonatos viáveis. O estatuto sanitário do material criopreservado é igualmente importante, não podendo ser descurado o estatuto sanitário de animais dadores e das recetoras, assim como os cuidados a ter durante a sua manipulação e o ambiente a que estão expostos. Conclusões e perspetivas futuras A conservação dos RGAn deverá concertar estratégias de conservação in situ e ex situ. Face aos conhecimentos atuais, a melhor estratégia para recuperar uma raça a partir de material criopreservado deverá utilizar sémen e embriões. Embora esta estratégia seja mais demorada do que a opção de apenas transferir embriões criopreservados, diminui a consanguinidade e os custos, permitindo a conservação de mais raças. O recente desenvolvimento das biotecnologias reprodutivas permite perspetivar grandes alterações nesta área tecnológica com a introdução de técnicas para manipular gâmetas e embriões aumentando a sua resistência à criopreservação e, por outro lado, a conservação do germoplasma à temperatura ambiente após liofilização.

Referências Andrabi SMH, Maxwell WMC. 2007. A review on reproductive biotechnologies for conservation of endangered mammalian species. Anim Reprod Sci 99: 223-243. Arav A. 2014. Cryopreservation of oocytes and embryos. Theriogenology 81:96-102. Boettcher PJ, Stella A, Pizzi F, Gandini G. 2005. The combined use of embryos and semen for cryogenic conservation of mammalian livestock genetic resources. Genet Select Evol 37: 657-675.

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Butchart SHM, Walpole M, Collen B, van Strien A, Scharlemann J, Almond RE, Baillie J, Bomhard B, Brown C, Bruno J, Carpenter KE, Carr GM, Chanson J, Chenery AM, Csirke J, Davidson NC, Dentener F, Foster M, Galli A, Galloway JN, Genovesi P, Gregory RD, Hockings M, Kapos V, Lamarque JF, Leverington F, Loh J, McGeoch MA, McRae L, Minasyan A, Hernández MM, Oldfield TEE, Pauly D, Quader S, Revenga C, Sauer JR, Skolnik B, Spear D, Smith DS, Stuart SN, Symes A, Tierney M, Tyrrell TD, Vié JC, Watson R. 2010. Global biodiversity: indicators of recent declines. Science 328: 1164-1168. FAO. 2012. Cryoconservation of animal genetic resources. FAO Animal Production and Health Guidelines No. 12. Rome. FAO. 2015. The Second Report on the State of the World’s Animal Genetic Resources for Food and Agriculture, edited by B.D. Scherf & D. Pilling. FAO Commission on Genetic Resources for Food and Agriculture Assessments. Rome. Gama LT. 2006. Animal genetic resources and sustainable development in the Mediterranean region. In: Ribeiro J.M.R; Horta A.E.M.; Moscon, C.; Rosati, A. (Eds.), Animal products from the Mediterranean area. EAAP pub, 119, Academic Publishers, Wageningen, pp. 127-135. Gandini G, Pizzi F, Stella A, Boettcher PJ. 2007. The cost of breed reconstruction from cryopreserved material in mammalian livestock species. Genet. Select. Evol. 39: 465-479. Hoffmann, 2010. Climate change and the characterization, breeding and conservation of animal genetic resources. Anim Genet. 2010 May;41 Suppl 1:32-46. Marchese C. 2015. Biodiversity hotspots: A shortcut for a more complicated concept. Global Ecology and Conservation 3: 297–309 Marques CC, Baptista MC, Pereira RM, Vasques MI, Costa LF, Horta AEM. 1995. Influência do sémen de diferentes touros sobre as taxas de fertilização in vitro e desenvolvimento de embriões em co-cultura./ Influence of semen from different bulls on in vitro fertilizaction rates and embryo development in coculture. Revista Portuguesa de Zootecnia, ano II (2): 103-110. Matos JE, Marques CC, Moura TF, Baptista MC, Horta AEM, Soveral G, Pereira RM.2015. Conjugated linoleic acid improves oocyte cryosurvival through modulation of the cryoprotectants influx rate. Reprod Biol Endocrinol. 13:60. Pereira RMLN. 2016. Beyond the cryobanking: purposes for the preservation of Portuguese animal genetic resources. Proc. X Congresso Ibérico sobre Recursos Genéticos Animais (SPREGA-SERGA 2016), Castelo Branco 15 a 17 de Setembro, pp.6-7. Pereira RM, Marques CC. 2008. Animal oocyte and embryo cryopreservation. Cell Tissue Bank, 9: 267-277. Pereira RMLN, Marques CC. 2011. Cryopreservation of gamete and embryos: contribution to the conservation of genetic resources and to the Portuguese Animal Germplasm Bank/ Criopreservação de gâmetas e embriões - contributo para a conservação dos recursos genéticos e Banco Português de Germoplasma Animal. “Agro-rural: contributos científicos”. P. Reis, P. Coelho (Ed). Lisboa, Publicações Casa da Moeda. pp. 1037-1048.

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Pereira RM, Baptista MC, Vasques MI, Horta AEM, Portugal PV, Bessa RJB, Chagas e Silva J; Silva Pereira M, Marques CC. 2007. Cryo-survival of bovine blastocysts is enhanced by culture with trans-10 cis-12 conjugated linoleic acid (10t,12c CLA). Anim Reprod Sci, 98: 293-301. Pereira RM, Carvalhais I, Pimenta J, Baptista MC, Vasques MI, Horta AEM, Santos IC, Marques MR, Reis A, Silva Pereira M, Marques CC. 2008. Biopsied and vitrified bovine embryos viability is improved by trans10, cis12 conjugated linoleic acid supplementation during in vitro embryo culture. Anim Reprod Sci, 106: 322-332. Prates EG, Nunes JT, Pereira RMLN. 2014. A role of lipid metabolism during cumulus-oocyte complex maturation: impact of lipid modulators to improve embryo production. Mediators of Inflammation, volume 2014, Article ID 692067, 11 pages. Romão R, Marques CC, Baptista MC, Barbas JP, Horta AEM, Carolino N, Bettencourt E, Pereira RM. 2015. Cryopreservation of in vitro-produced sheep embryos: Effects of different protocols of lipid reduction. Theriogenology. 84:118-26. Romão R, Bettencourt E, Pereira RM, Marques CC, Baptista MC, Barbas JP, Oliveira E, Bettencourt C, Sousa M. 2016. Ultrastructural characterization of fresh and vitrified In vitro- and in vivo-produced sheep embryos. Anat Histol Embryol. 45:231-239. Woelders H, Windig J, Hiemstra SJ. 2012. How developments in cryobiology, reproductive technologies and conservation genomics could shape gene banking strategies for (farm) animals. Reprod Dom Anim 47 (Suppl. 4), 264–273.

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CAPÍTULO 6 - “CSI” ANIMAL Maria Inês Alves de Carvalho Martins Carolino (Unidade Investigação e Serviços de Biotecnologias e Recursos Genéticos do Instituto Nacional de Investigação Agrária e Veterinária – Polo de Investigação da Fonte Boa 2005-048 Vale de Santarém) ines.carolino@iniav.pt Introdução Constituído em 2002, o Laboratório de Genética Molecular - Fonte Boa (LGM) tem desenvolvido um amplo trabalho de investigação e prestação de serviços de apoio à pecuária nacional, nomeadamente, a associação de criadores, agrupamentos de produtores, serviços oficiais e criadores. Mantem colaboração com diversas organismos nacionais e internacionais, e colabora em vários consórcios (Consórcios da Rede CONBIAND) na área da caracterização genética das espécies pecuárias. Hoje, conta com mais de 78.000 amostras de animais de 7 Espécies (Bovinos, Ovinos, Caprinos, Suínos, Asininos, Equinos e Aves), que incluem todas as raças nacionais e algumas estrageiras, conservando-as de forma a constituírem um banco de ADN para estudos genéticos. O LGM é também membro da ISAG (International Society for Animal Genetics), realizando anualmente os testes interlaboratoriais que esta entidade internacional preconiza para as diferentes espécies. Técnicas de Genética Molecular Com os avanços das técnicas da genética molecular aceder ao genoma de um animal é fácil. De forma muito simplificada, podemos dizer que genoma é o código genético de um ser vivo, ou seja, o conjunto de informação genética de informação genética de um indivíduo codificada no ADN ou no conjunto de cromossomas característicos de cada espécie (Tabela 1). Dois dos cromossomas típicos de cada espécie são cromossomas sexuais e os restantes denominam-se autossomas. O referido código genético é constituído pela sequência de ADN (ácido desoxirribonucleico), que está presente em todas as células do ser vivo e é determinante para o seu desenvolvimento e funcionamento. Tabela 1 – Número de cromossomas por espécie

Espécie Homem Macaco Gato Cão Gato Cavalo Burro Rato

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Nº cromossomas 46 48 38 78 38 64 62 40

Espécie Vaca Ovelha Cabra Porco Galinha Pato Coelho

Nº cromossomas 60 54 60 38 78 82 44


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As técnicas de biologia molecular estão em constante evolução, de tal forma que, quem trabalha nesta área, desempenha uma tarefa com entusiasmo mas também com dificuldade. Entusiasmo, pelo avanço no conhecimento que esta tecnologia nos traz, pelas mudanças e benefícios que pode trazer à humanidade e pelos desafios que permanentemente surgem. Dificuldade, pela exigência de atualização permanente dos novos procedimentos técnicos e a adaptação a uma nova ética científica e tecnológica. Com o desenvolvimento das técnicas de genética molecular, e, consequente, o conhecimento do genoma das várias espécies, tornou-se possível o estudo mais preciso e detalhado da influência dos genes na manifestação de características de importância económica nas espécies pecuárias. As técnicas de genética molecular surgem como uma ferramenta adicional para utilizar em diversas áreas, através da inclusão de informações referentes ao genótipo dos animais, desde a identidade individual ou familiar, o conhecimento da variabilidade genética individual e populacional, o melhoramento de características quantitativas ou qualitativas, à suscetibilidade\resistência a doenças. No entanto, saber interpretar essas informações genéticas é essencial para que os criadores otimizem os animais que dispõem, tendo e consideração a utilização que pretendem. As técnicas de biologia molecular assentam em alguns conceitos básicos, que convém relembrar. A reação em cadeia da polimerase (PCR), desenvolvida em 1980 por Kary Mullis, permite amplificar uma ou mais sequências específicas de ADN por meio de uma enzima termoestável in vitro, a partir de quantidades reduzidas de material biológico, utilizando pequenas sequências de ADN, denominadas iniciadores, complementares às extremidades do segmento do ADN relevante, flanqueando-o e definindo deste modo a região alvo a amplificar. Através da PCR é possível analisar sequências de ADN extraídas de amostras biológicas, (sangue, pelo, Figura 1 – Aparelhos termocicladores carne, sémen, cartilagem, osso, etc.). É um processo praticamente automatizado, que utiliza aparelhos, termocicladores (Figura 1), que permitem a variação de temperatura durante o tempo específico para que ocorra replicação de um determinado fragmento de ADN, de forma fácil, rápida e seletiva.

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A visualização dos produtos amplificados por meio da PCR poderá ser realizada através de uma eletroforese, em gel de agarose ou em sequenciador automático. Esta técnica permite a separação dos fragmentos de ADN segundo o seu tamanho. Moléculas de pequenas dimensões movimentam-se mais facilmente através do gel do que as de maiores dimensões, permitindo a sua demarcação. No caso da eletroforese em gel de agarose, os diferentes tamanhos traduzir-se-ão em “bandas”, que se situarão em diferentes locais consoante o seu peso molecular. A eletroforese em sequenciador automático tem uma visualização mais fácil e precisa do tamanho dos fragmentos, permitindo a diferenciação de apenas um nucleótido.

Figura 2 – Sequenciador automático (ABI310) e tina de eletroforese com gel de agarose

Ao compararmos as sequências de ADN entre espécies podemos verificar que existe uma homologia genética grande (cerca de 98%), nos animais domésticos (Carroll, 1995). No entanto, em diversos segmentos ou regiões, o ADN apresenta diferenças nas sequências, de indivíduo para indivíduo, dentro da mesma espécie ou até mesmo raça e família, tornando praticamente impossível encontrar dois animais idênticos. As sequências de ADN que expressam variabilidade entre indivíduos, mesmo que geneticamente relacionados (familiares), são denominadas de marcadores moleculares. Existem vários tipos de marcadores moleculares (p.ex. microssatélites, SNP’s, etc), com diferentes características, mas fielmente observados pelas técnicas da genética molecular. Os microssatélites, pelas suas características e custo de utilização, são atualmente os marcadores recomendados não só para a identificação individual e realização de testes de paternidade como também para a análise da diversidade genética de uma população. Estes marcadores são altamente polimórficos (variações de indivíduo para indivíduo), o que permitem distinguir os animais, mesmo que aparentados.

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Identificação Animal A importância da identificação animal é sobejamente conhecida, nomeadamente no maneio e gestão da exploração, na circulação animal e comércio dos animais e dos seus produtos (rastreabilidade), sanidade animal e saúde pública, para o melhoramento genético, gestão e conservação dos recursos genéticos animais (RGAn). Em praticamente todas as espécies de animais de produção é exigida a sua identificação pouco tempo depois do nascimento. Consoante a espécie, os animais terão que ser identificados obrigatoriamente com marcas auriculares oficiais (brincos), microchips, bolos reticulares ou tatuagem e, facultativamente, com qualquer outro tipo de método de identificação, permanente ou temporária, invasivo ou não invasivo, gerador de amostra (tecido biológico) para genotipagem ou não. Neste trabalho, referimo-nos apenas à identificação animal por análise de ADN. A identificação de regiões do ADN, marcadores moleculares, permite avaliar as diferenças genéticas entre dois ou mais indivíduos para diversos fins, nomeadamente na identificação do animal. A combinação de vários marcadores, devidamente escolhidos e utilizados em cada população de acordo com as suas características, conferem a cada individuo um padrão de ADN único, comparável a uma impressão digital (Figura 3), que pode ser usado para fins de identificação.

Figura 3 – Impressão digital

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Podemos então dizer que, o conjunto de variações na sequência de ADN é próprio de cada indivíduo, formando uma combinação ÚNICA por animal (Figura 4).

Figura 4 – Exemplo de perfil genético de um animal (eletroesferograma)

A tecnologia laboratorial desenvolvida para os animais é idêntica à utilizada nos humanos, e consiste num conjunto de procedimentos que visam a identificação de regiões genéticas específicas do ADN (marcadores microssatélites). Estes marcadores são regiões do genoma, altamente polimórficas (variações de individuo para indivíduo), transmitidos de pais para filhos. Cada animal recebe metade do ADN da mãe e a outra metade do pai. A comparação dos padrões de ADN do filho com os padrões de ADN correspondentes da mãe e do pai, permite avaliar se o indivíduo é ou não compatível com os supostos pais (pai e mãe), que lhe foram atribuídos pelo criador ou pela entidade responsável pelo registo genealógico ou pela raça. O LGM utiliza os marcadores moleculares (microssatélites) sugeridos por um organismo internacional (ISAG) que orienta e regulamenta sobre diversas análises que têm como base a identificação animal através do ADN. Através desta técnica de análise do ADN podem identificar-se animais, bem como verificar se duas amostras pertencem ao mesmo animal. Esta análise é particularmente utilizada na rastreabilidade genética de produtos de origem animal, possibilitando a comparação dos padrões genéticos, por exemplo, do pedaço de carne comprado no supermercado e do animal que lhe deu origem. A mesma análise poderá ser efetuada em processos de “perícia forense”, sobretudo em casos de furto de animais, bem como em estudos da evolução ou migração populacional de espécie/raça, importantes na implementação e execução dos programas de conservação e melhoramento dos recursos genéticos animais para a alimentação e agricultura.

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Rastreabilidade Genética A implementação de sistemas de identificação animal que permitam seguir os animais desde a exploração onde nasceram até ao consumidor, é considerada hoje em dia uma peça fundamental para garantir a segurança alimentar, sanidade animal e manter a confiança dos consumidores, potenciando ainda a valorização dos produtos. A identificação animal em vida é efetuada com recurso a marcas (brincos ou outras) que, com maior ou menor dificuldade, podem extraviar-se ou serem manipuladas de forma fraudulenta. Do mesmo modo, a utilização de etiquetagem após desmancha pode sofrer utilização fraudulenta. A confirmação e credibilização deste sistema podem ser conseguidas através de um sistema baseado na análise de ADN. A sua aplicação no setor das carnes implica a organização de um sistema de recolha organizado de amostras biológicas (sangue/pelo) colhidas em vida, cujo perfil de ADN poderá posteriormente ser comparado com amostras (sangue/carne) colhidas em qualquer fase do seu processamento e comercialização (Figura 5).

Figura 5 – Processamento da amostra de sangue

O principal desafio que poderá condicionar a sua aplicação generalizada e em grande escala é o desenvolvimento de um sistema economicamente viável de colheita, preservação e catalogação e análise de amostras de toda a população (Cunningham et al., 2001). Contudo, a sua aplicação a populações mais reduzidas, como mecanismo suplementar de garantia durante a certificação de carnes IGP ou DOP, é viável e muito mais simples, pelo conjunto de procedimentos que já são exigidos. Estas ferramentas de biologia molecular permitem assegurar e garantir a eficácia dos sistemas de identificação animal “do estábulo ao prato”. As análises genéticas baseiam-se no conceito de que cada animal tem um determinado perfil genético que é único, e que se mantém inalterado ao longo de toda a vida, pelo que pode ser determinado em qualquer momento, mesmo após o abate do animal, originando sempre o mesmo padrão. Os testes realizaram-se assim por comparação dos perfis das amostras tomadas em diferentes pontos do circuito

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mas que supostamente pertencem ao mesmo animal e por isso deverão originar padrões semelhantes nos eletroferogramas (Figura 6).

Padrão único Figura 6 – Esquema de análise nos diferentes pontos do circuito de produção

A sustentabilidade de um sistema de rastreabilidade passaria necessariamente pela garantia da existência de amostras in vivo de todos os animais que nascem em cada exploração ou que entram em determinado circuito de comercialização, podendo a amostra ser recolhida sistematicamente na altura da aplicação do brinco de identificação, o que permitiria recolher em simultâneo um pouco de tecido da própria orelha que seria identificado e mantido congelado até ao momento em que fosse necessário o seu processamento analítico com fins identificativos. Um sistema deste tipo permite a aplicabilidade de ferramentas de rastreabilidade e autenticidade, utilizando os conhecimentos técnico-científicos da biologia molecular, garantindo a identidade do animal/produto na comercialização, reforçando a confiança dos consumidores e elevando a credibilidade da atividade dos produtores. O LGM tem como objetivo responder com precisão às dúvidas dos criadores no que respeita às informações sobre a qualidade genética dos seus animais e do uso correto dessas informações para ajudar a produzir produtos de origem animal de alta qualidade, de forma segura, eficiente e responsável.

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Perícia Forense O termo Perícia Forense deve ser compreendido como o conjunto de todos os tipos de conhecimentos científicos e tecnológicos existentes, utilizados para desvendar crimes (no caso da perícia policial). A utilização das técnicas de biologia molecular, cuja fiabilidade é muito superior à de outros meios de prova, faz do exame de ADN um método que deve ser potencializado nos casos duvidosos de justiça. Estas técnicas são, há largos anos, utilizadas na perícia forense em humanos, mas podem e devem ser utilizadas também em casos que envolvam animais. Neste sentido, podemos dizer que o INIAV colabora com o Ministério Público na identificação genética de animais vivos/mortos ou vestígios, utilizando o conhecimento científico e tecnológico em casos de Investigação Forense. Os casos de queixa-crime são diversos e não são comparáveis, no entanto, abordaremos as situações mais frequentes, que são sobretudo de três tipos: casos de furto de animais, controlo de registos e acidentes com animais (Figura 7).

Figura 7 – Casos mais frequentes de queixa-crime

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Na maior parte dos casos de perícia forense, há uma ordem do tribunal para dar início ao processo, com indicação da necessidade de realização de análises genéticas, à qual, de imediato, se segue indicação sobre as datas de marcação das colheitas de amostras biológicas aos intervenientes no caso. As amostras são, normalmente, recolhidas por veterinários acompanhados de agentes oficiais. Estes últimos, por sua vez, são responsáveis pela entrega das referidas amostra no LGM. Com a entrega das amostras, o LGM fica notificado na qualidade de “Perito” e procede à realização das análises de acordo com o caso. Numa fase inicial, a perícia de identificação consiste em obter o perfil genético de todas as amostras que deram entrada no LGM. A análise dos resultados passa, sobretudo, por dois tipos de estudo: 

Análise molecular para efeito de teste de paternidade Perícias de investigação de parentesco biológico, passando pela análise comparativa dos perfis genéticos dos parentes com o próprio animal. Mediante comparação, poder-se-á concluir qual a probabilidade de parentesco ou, alternativamente, concluir pelo afastamento da hipótese de parentesco.

Comparação molecular de amostras presumivelmente do mesmo animal - Perícias de identificação de amostras desconhecidas, através da análise comparativa dos perfis genéticos do animal

Em resumo, mediante a obtenção de perfis genéticos de um ou vários animais e de perfis genéticos obtidos a partir de amostra ou amostras problema, e, sobretudo, mediante a análise e estudo comparativo de todos os perfis, resultará o relatório de Exame Pericial, emitido pelo LGM e enviado a tribunal (Figura 8). O LGM tem como objetivo demonstrar que as tecnologias de genética molecular são ecologicamente corretas, economicamente viáveis, socialmente justas, e que permitem evitar perdas e conflitos para os criadores.

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Figura 8 – Esquema do circuito processual dos diferentes casos de queixa-crime


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Referências Carroll, S. B., 1995. Homeotic genes and the evolution of arthropods and chordates. Nature 376: 479–485. Cunningham E.P. and Meghen C.M., 2001. Biological identification systems: genetic markers. Scientific and Technical Review 20(2): 491-499. Gamarra, David, Andrés López-Oceja , Susana Jiménez-Moreno, Marian M. de Pancorbo, 2015. “Forensic efficacy of twelve STRs in Spanish cattle”. Forensic Science International: Genetics Supplement Series 5 (2015) e253–e255. Mullis, Kary, 1987. Process for Amplifying Nucleic Acids. U.S. Patent. - July 28.

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CAPÍTULO 7 - PATERNIDADE: SER OU NÃO SER Maria de Fátima M. M. Santos Silva (Unidade Investigação e Serviços de Biotecnologias e Recursos Genéticos do Instituto Nacional de Investigação Agrária e Veterinária – Polo de Investigação da Fonte Boa 2005-048 Vale de Santarém) santossilva.fatima@iniav.pt Resumo Ser ou não ser um determinado individuo, um familiar ou elemento de um determinado grupo, é atualmente uma questão de grande relevância para a produção animal, nomeadamente no que diz respeito à conservação e melhoramento dos recursos genéticos animais. A evolução nos últimos anos das técnicas de biologia molecular, dos equipamentos a ela associados, do software informático disponível e da capacidade de processamento dos equipamentos, possibilita a correta atribuição dos progenitores a qualquer animal sem grande dificuldade, assim como o estudo das suas populações ou raças. No Laboratório de Genética Molecular da Estação Zootécnica Nacional (EZN), INIAV I.P., realizam-se projetos de Investigação e prestam-se serviços, nomeadamente em análises de paternidades para apoio a associações de criadores ou a criadores particulares que o solicitem. Nesta apresentação falar-se-á brevemente dos fundamentos dos testes de paternidade, fazendo também referência às metodologias utilizadas no laboratório da EZN. Introduz-se o conceito de caracterização genética de populações com microssatélites e mostram-se dois exemplos da sua aplicabilidade através de trabalhos realizados na EZN. Abstract To be or not to be a certain individual, a relative or element of a certain group, is currently a matter of great relevance for animal production, especially with regard to the conservation and improvement of animal genetic resources. The evolution in the last years of molecular biology techniques and associated equipment, computer software and processing capacity, allows the correct assignment of the progenitors to any animal without great difficulty, as well as the study of populations or breeds. In the Laboratory of Molecular Genetics of Estação Zootécnica Nacional (EZN), INIAV I.P., research projects are carried out and services are provided in particular in paternity analyzes to support associations or private breeders. In this presentation we will briefly discuss the fundamentals of paternity tests, also making reference to the methodologies used in the EZN laboratory. We introduce the concept of population genetic characterization with microsatellites and show two examples of its use in research work conducted at the EZN. Introdução A evolução na gestão das explorações nomeadamente no que diz respeito aos recursos genéticos e respetivos programas de conservação ou melhoramento depara-se com exigências de informação acurada e de transmissão da mesma.

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A identificação, a nível do individuo, ascendente ou descendente é indispensável, sendo também muito útil o reconhecimento dos indivíduos como elementos de um determinado grupo ou população, e a caracterização genética dessa mesma população. É uma ideia intuitiva que a identificação correta dos progenitores se torna um dos elementos essenciais para o sucesso de qualquer programa de melhoramento. Uma exploração poderá ter muitos registos produtivos, que absorveram bastantes recursos humanos e financeiros, no entanto para que essa informação venha a ser útil necessita de ser respaldada pela fiabilidade das relações genealógicas a que diz respeito, caso contrário poderá partir-se de falsas premissas que limitarão necessariamente o resultado final. Ainda que haja, da parte dos criadores, todo o interesse em ter essa informação, e possa existir cuidado na sua obtenção, os erros na atribuição das paternidades continuam a ser frequentes, pois torna-se complicado em determinadas condições de exploração, com grandes rebanhos, vários reprodutores em cobrição com controlo reprodutivo escasso e partos múltiplos, como sucede com frequência nos pequenos ruminantes. Estes erros podem ter consequências negativas consideráveis sobre os programas de melhoramento pois comprometem o ganho genético previsto para a descendência, pondo em causa o sucesso do projeto a que se destinavam. As preocupações na correta atribuição das genealogias não são de agora, sobretudo em espécies pecuárias em que alguns reprodutores podem atingir valores muito elevados. Desde há muito que a produção animal se socorre das técnicas científicas disponíveis para esse objetivo, sendo os primeiros estudos genéticos realizados com base na análise de polimorfismos bioquímicos e proteicos. Os grupos sanguíneos desempenharam um papel fundamental na identificação até ao início deste século, de forma mais ou menos restrita em determinadas espécies como os equídeos. Hoje em dia, com a revolução da biologia molecular as técnicas evoluíram substancialmente e existem ferramentas alternativas bastante poderosas disponíveis, para utilização generalizada nesta área, perfeitamente aplicáveis à produção animal de forma rotineira. Ferramentas disponíveis Esta evolução, consequência do desenvolvimento das novas tecnologias do DNA recombinante, de amplificação de ADN como a PCR, de equipamentos como os sequenciadores automáticos, software informático e computadores com grande capacidade de processamento, permitiu que o século XXI tivesse o seu início com a sequenciação completa do genoma humano. Os novos conhecimentos possibilitam olhar para o interior do genoma e detetar as zonas-alvo que nos interessam, já que a sequência de DNA revela variações entre indivíduos, designadas polimorfismos, que nos podem ser úteis para diversos propósitos. A partir dos anos 80, a utilização dos polimorfismos de DNA como marcadores moleculares tornou-se um auxiliar real do melhoramento animal.

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Os marcadores moleculares são, de acordo com a Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO), fragmentos ou sequências de DNA identificáveis que podem ser utilizadas para detetar polimorfismos. Existem várias categorias e tipos de marcadores disponíveis, detetáveis segundo diferentes técnicas e utilizados para diferentes aplicações. De entre os marcadores moleculares, os microssatélites destacaram-se em estudos de história das populações, caracterização de raças, na estimação de distâncias genéticas, evolução das populações, relações genéticas intra e inter raça, assim como na identificação individual e implementação de testes de paternidade. Para apoiar o desenvolvimento de estudos moleculares em raças de animais domésticos, a FAO tornou pública em 2000, uma lista de microssatélites recomendados para diversas espécies animais, nomeadamente para ovinos, posteriormente revista e atualizada com a colaboração da Internacional Society of Animal Genetics (ISAG). Microssatélites Os microssatélites, ou short tandem repeats (STRs), são sequências nucleotídicas de 2 a 8 pares de bases que aparecem repetidas em tandem na cadeia de ADN. A frequência dos diversos microssatélites difere de acordo com o genoma estudado, sendo as repetições dinucleotídicas as mais comuns. Os polimorfismos de um dado microssatélite são identificados pelas diferenças no número de repetições e são referidos como alelos. A partir dos finais dos anos oitenta a sua utilização vulgarizou-se em áreas de interesse da medicina, das ciências forenses e da produção animal, devido à descoberta da sua abundância nos genomas de diversos organismos, inclusive no ser humano, associada a um conjunto de características favoráveis, como: a distribuição por todo o genoma, o elevado polimorfismo, com grande nível de informação genética por locus, o tipo de hereditariedade mendeliana simples e codominância, que permite distinguir facilmente os indivíduos homozigóticos e os heterozigóticos. São, além disso, facilmente amplificáveis por PCR, o que permite utilizar ADN genómico oriundo de diversos tipos de amostra, e a sua análise, ainda que algo morosa, não é difícil nem cara. A nível da produção animal tem tido grande aplicação na identificação de indivíduos, em testes de paternidade, na rastreabilidade dos produtos de origem animal e em estudos populacionais, nomeadamente na caracterização genética de raças/populações. Testes de paternidade O teste de paternidade por análise de ADN consiste num conjunto de procedimentos que visam a confirmação da ascendência de um determinado indivíduo, tanto na linha paterna como na materna, através da identificação de polimorfismos em regiões genéticas específicas do ADN (marcadores microssatélites) dos indivíduos em causa.

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Os polimorfismos, ou alelos, num dado microssatélite diferem de indivíduo para indivíduo, tornando praticamente impossível encontrar dois animais idênticos, quando o número de microssatélites analisado é suficiente. O perfil genético do animal é definido pelo genótipo em cada locus de um painel adequado de marcadores moleculares, de forma que cada indivíduo tem um padrão de ADN único. Os alelos em cada locus identificam-se após amplificação e eletroforese, através dos tipos de picos que originam, por diferentes cores e pesos moleculares. São normalmente classificados com recurso a números na maioria das espécies; contudo, em alguns casos, como por exemplo os equídeos e os asininos, a classificação é feita por meio de letras. A figura 1 mostra o eletroferograma representativo do perfil genético de um ovino, para 10 microssatélites.

Figura 1. Eletroferograma de um ovino para 10 microssatélites

Em cada locus, o único pico (no caso de um animal homozigótico), ou os dois picos (para um heterozigótico) são convertidos em números, normalmente em função do seu número de pares de bases, o que no caso da eletroferograma apresentado teria a conversão seguinte:

Tabela 2. Perfil Genético correspondente ao eletroferograma da figura1:

OarCP49 OARFCB20 MAF65 MCM527 OARFCB304 OARAE129

ADCYC HCS

CSRD247 MAF214

100

90

125

165

166

135

242

267

227

181

100

112

125

167

172

137

244

273

231

189

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Considerando que cada indivíduo recebe metade do ADN da mãe e a outra metade do pai, o mesmo acontece com os padrões de ADN referido. Dada a hereditariedade codominante dos microssatélites, o par de alelos do descendente é obrigatoriamente oriundo dos respetivos progenitores, pelo que tem que fazer parte do património genético dos mesmos. Neste pressuposto, o teste de paternidade faz-se por comparação dos perfis de ADN do filho com os perfis de ADN dos progenitores, e baseia-se no princípio de exclusão genética. Através desta comparação, é possível avaliar se o indivíduo é ou não compatível com os pais que lhe foram atribuídos, já que se os padrões de ADN do filho não corresponderem aos da mãe, terão que ser obrigatoriamente transmitidos pelo pai. Se esses padrões também não corresponderem aos do suposto pai, então este deverá ser excluído como pai. A compatibilização pressupõe a comparação direta do par de alelos da descendência em cada marcador molecular com os correspondentes alelos dos candidatos a progenitores, originando um dos seguintes resultados:  

Compatível - quando o descendente apresenta em cada microssatélite um alelo comum a cada progenitor, resultando o seu genótipo de uma combinação dos alelos dos pais, (filho1, tabela 2); Não Compatível - desde que não apresente qualquer alelo comum com os progenitores, em pelo menos um dos microssatélites considerados, não sendo o genótipo do individuo a combinação alélica do dos país, (filho2, tabela 2);

Tabela 2.Perfil Genético correspondente a um par de progenitores e a dois supostos filhos na espécie caprina.

Locus Filho 1 Filho 2

Mãe

Pai

CSRD

ILSTS

ILSTS

ILSTS

INRA

INRA

247

19

8

87

23

05

230/

148/

168/

139/

205/

238

152

178

139

205

240/

148/

180/

139/

207/

MAF

McM

OARFC

SRCRSP

SRCRSP

SRCRSP

65

527

B 20

5

23

8

173/

121/

154/

101/

165/

99/

224/

175

135

168

121

181

99

232

173/

121/

158/

101/

165/

99/

224/

INRA 06

INRA 63

115/

119/

115

123

115/

113/

244

152

182

139

209

115

125

175

135

160

121

181

99

232

238/

148/

176/

139/

205/

115/

111/

173/

121/

162/

99/

171/

99/

224/

238

152

178

139

205

115

119

175

131

168

101

181

99

224

230/

148/

168/

139/

205/

115/

111/

175/

117/

154/

99/

165/

81/

232/

238

154

176

139

205

115

123

175

135

154

121

181

99

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A situação de compatibilidade ou não compatibilidade pode verificar-se para apenas um dos progenitores. Pode acontecer também que ambos candidatos a pais sejam compatíveis separadamente mas não no seu conjunto e

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nesse caso é também necessário recorrer a um painel adicional para descobrir qual dos progenitores é realmente compatível. Para avaliar a eficácia nos testes de exclusão de paternidade, utiliza-se um parâmetro que se obtém matematicamente e fornece a probabilidade de exclusão a priori por marcador (PEL) ou do conjunto (PEC) de marcadores utilizados. É um valor que indica a probabilidade do painel de marcadores para excluir um indivíduo compatível com o progenitor por mero acaso, ou seja, a capacidade de excluir uma falsa paternidade (Martinez, 2001). Quando um progenitor é excluído, a probabilidade de exclusão é de 100%, pois não há possibilidade que o progenitor transmita determinado alelo presente no indivíduo, ainda que se possa aceitar a possibilidade de uma mutação inesperada, e, nesse caso, só se deveria excluir um progenitor com base em mais do que um marcador (Arbona, 2011). A fiabilidade do teste de paternidade é tanto maior quanto maior a probabilidade de exclusão do painel de microssatélites considerado, que por sua vez depende da qualidade de cada marcador e do seu conjunto. A figura 2 mostra a Probabilidade de exclusão por marcador num painel de 12 marcadores na raça ovina Serra da Estrela e 10 na raça caprina Serrana. 0,90

Serra da Estrela

Serrana

0,80 0,70 0,60 PEL

0,50 0,40 0,30 0,20 0,10

HS C O ar CP 49 M cM 5 CD 27 R O AR D24 7 FC B0 02 O 0 ar AE 12 9 M AF 21 4 M AF 65 SR CR SP BM 8 18 18

O AR FC B3 04 AD CY C

0,00

Locus

Figura 2. Probabilidade de exclusão por Locus, PEL, nas raças ovina Serra da Estrela e caprina Serrana

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Em qualquer dos casos, é possível apreciar que a PEL pode variar bastante de marcador para marcador, daí que seja fundamental, à hora de implementar um painel de paternidade, fazer um estudo prévio dos microssatélites a utilizar. O ideal seria ter um painel por raça, o que na prática não é exequível, sendo que o que se faz normalmente é implementar painéis diferentes por espécie. Na figura 3 apresenta-se a probabilidade de exclusão acumulada com 10 loci microssatélites na raça caprina Serrana.

E1 29 CS RD 24 7 M cM 52 O 7 ar FC B3 04 SR CR SP 8 O ar FC B2 0 M AF 21 4 AD CY C

O ar A

M

AF 65

1.00 0.95 0.90 0.85 0.80 0.75 0.70 0.65 0.60 HS C

PEC

Como pode verificar-se, à medida que se incluem mais marcadores os ganhos são menores e partir de determinada altura são muito pequenos.

Locus

Figura 3. Probabilidade de exclusão combinada, PEC, na raça caprina Serrana

Na prática, com um conjunto de cerca de 10 marcadores adequadamente escolhidos, e da utilização conjunta destes, é possível estabelecer um programa de confirmação de paternidades em que o resultado de compatibilidade tem uma probabilidade de cerca de 99,99%. Contudo, há que ter em atenção que, se estivermos em presença de animais muito aparentados, a Probabilidade de Exclusão diminui bastante. Nessa situação, pode ser necessário utilizar para alguns casos, um painel de microssatélites adicional, além do painel de rotina habitual. Para evitar estas situações, recorre-se atualmente a painéis com mais microssatélites, sempre que possível. É recomendável seguir as recomendações da ISAG nesta matéria, e aderir aos testes de comparação inter-laboratorial promovidos por esta entidade internacionalmente reconhecida, pois permitem aferir os resultados e uniformiza-los entre laboratórios. No Laboratório de genética Molecular (LGM) da Estação Zootécnica Nacional (INIAV) fazem-se análises de paternidades em várias espécies, essencialmente para dar apoio aos criadores, garantindo a fiabilidade dos registos dos animais nos livros

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genealógicos e na aplicação aos programas de melhoramento. No caso dos Equinos e Asininos, no Laboratório as análise são feitas no laboratório de Alter do Chão. Para cada espécie existe um painel de rotina, com o número de microssatélites a seguir indicado, e um ou dois painéis adicionais, para utilização em quando necessário.

Figura 4. Painel de paternidades utilizado no LGM para diferentes espécies

Nos anos de 2015/16 o laboratório participou no “ISAG Comparison Test” para Bovinos, Caprinos, Ovinos e Equinos (Asininos) e em 2016/17 apenas para Bovinos, Suínos, Equinos e Asininos, pois não se realizou para pequenos ruminantes. Ser ou não ser: caracterização genética - nota breve Os microssatélites são também uma ferramenta poderosa para o estudo dos animais como elementos de um grupo, população ou raça. A caracterização genética destes grupos deve ser o passo prévio na altura de definir estratégias para a sua salvaguarda. A caracterização das raças permite-nos conhecer a variabilidade genética intra população e a relação genética entre populações. Para proceder à caracterização genética de uma determinada população, é necessário um painel adequado de 20 a 30 microssatélites e várias outras populações que sejam ponto de comparação.

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A análise permite identificar os alelos de cada população e os alelos partilhados pelas diferentes populações, o que possibilita o cálculo de importantes indicadores populacionais (n.º médio de alelos, heterozigotia, distâncias genéticas indicadores de fixação…etc.), através dos quais é possível avaliar a variabilidade intra e inter racial, o grau de diferenciação ou proximidade genética das populações, problemas de consanguinidade, etc. Estes elementos podem constituir um apoio fundamental nas tomadas de decisão acerca das populações, concretamente na identificação de populações especialmente valiosas para a conservação da espécie, no reconhecimento pelos serviços oficiais de populações que se identificam como raças, na gestão correta dos rebanhos pelas associações (nomeadamente na escolha de reprodutores), controlo da consanguinidade, e na definição de estratégias de conservação ou melhoramento. São também necessários para a obtenção da informação exigida para implementação de testes de paternidade e rastreabilidade genética. Desde o início do laboratório em 2003 que na EZN se têm vindo a realizar estudos de caracterização genética de várias espécies e raças autóctones, de Suínos, Ovinos, Bovinos, Caprinos e Galináceos. Em 2003, a pedido da Direção Geral de Veterinária, iniciou-se um estudo sobre uma população de Suínos que, supostamente, seria o que restava do porco Malhado de Alcobaça que tinha sido à época considerado já extinto. Para avaliar a população em questão, realizou-se um estudo de caracterização morfológica, demográfica, produtiva e genética da população comparativamente às outras raças de suínos autóctones e exóticas, que esteve também na base de uma tese de mestrado. Os resultados da caracterização genética (Vicente et al., 2008) apresentam-se na figura 5, na forma de uma árvore filogenética radial das Figura 5. Dendograma de indivíduos e árvore filogenética radial de 7 populações suínas populações e de um dendrograma de indivíduos.

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Como pode ver-se nos gráficos, especialmente no dendrograma de indivíduos, a população Malhado de Alcobaça, a preto, diferencia-se claramente das restantes. De facto, este estudo culminou com o reconhecimento da raça pelos serviços oficiais em 2005, e com o acesso ao programa PRODER em 2010. A caracterização genética de raças autóctones Ovinas Churras (SantosSilva et al., 2008) (figura 6) mostrou que estas raças constituem um importante reservatório de diversidade genética, ainda que o nível de diferenciação das populações próximas seja bastante baixo. Verifica-se que as raças do Norte do País revelam entre si pouca diferenciação, enquanto a raça Churra Algarvia, muito afastada geograficamente, se separa bem das restantes. A raça exótica Assaf, que serviu de referência, destacou-se claramente nas populações estudadas. Diversas populações mostraram também níveis de consanguinidade que requerem alguma atenção para evitar perdas de diversidade genética.

Figura 6. Dendograma de indivíduos de 7 populações ovinas

Tal como estes exemplos de aplicação deste tipo de estudos, também os outros estudos realizados na área da caracterização originaram informação valiosa para a gestão das raças, contribuindo de forma decisiva para o objetivo último, o de conservação das raças como garantia de salvaguarda dos recursos genéticos animais para as gerações vindouras.

Referências Arbona, M., 2011. Avances del programa de selección/conservación de la oveja Roja Mallorquina. Tesis de Máster en Zootecnia y gestión sostenible: Ganadería ecológica e integrada FAO - Food and Agriculture Organization of the United Nations, 2004. Secondary Guidelines for Development of Nacional Farm Animal Genetic resources Management Plans – Measurement of Domestic animal Diversity (MoDAD): recommended Microsatellites Markers. Rome Martínez, A., 2001. Caracterización genética del cerdo Ibérico mediante marcadores moleculares. Tesis Doctoral. Departamento de Genética, Universidad de Córdoba.

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Santos-Silva F., Ivo R. S., Sousa, M. C. O., Carolino M. I., Ginja C. and L. T. Gama, 2008. Assessing genetic diversity and differentiation in Portuguese coarse-wool sheep breeds with microsatellite markers, small ruminant research. Small Rumin. Res. (78), pp. 32-40 Vicente, A. A., Carolino M. I., Sousa, M. C. O., Ginja, C., Silva F. S., Martinez A. M., Vega-Pla J. L., Carolino, N. and L. T. Gama, 2008. Genetic diversity in native and commercial breeds of pigs in Portugal assessed by microsatellites. J.Anim.Sci., 86(10), pp. 2496-507.

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HIPERLIGAÇÕES DE INTERESSE Parceiros do projeto ALT Biotech RepGen: Instituto Nacional de Investigação Agrária e Veterinária, I.P. – Polo de Santarém: http://www.iniav.pt/menu-de-topo/quem-somos/polos-de-atividade-e-servicosdesconcentrados/polo-de-santarem Instituto Politécnico de Santarém - Escola Superior Agrária de Santarém: http://si.esa.ipsantarem.pt/esa_si/web_page.inicial Instituto Politécnico de Portalegre – Escola Superior Agrária de Elvas: http://www.esaelvas.pt/pt/ ACOS - Associação de Agricultores do Sul: http://www.acos.pt/ Outras ligações: Sociedade Portuguesa de Recursos Genéticos Animais: http://www.sprega.com.pt/ Rede ConBiand: http://www.uco.es/conbiand/Bienvenida.html

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