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2005 年 3 月 湖南师范大学自然科学学报 Vol. 28  No. 1                       Journal of Natural Science of Hunan Normal University Mar. ,2005 第 28 卷 第 1 期

CCoAOMT 基因反义表达载体的构建

及转化苎麻的研究

Ξ

陈建荣1 ,2 ,张学文3 ,郭清泉1 3 ,唐香山3 ,杨友才1 (1. 湖南农业大学农学院苎麻研究所 ,中国 长沙  410128 ;2. 吉首大学生物资源与环境学院 ,中国 吉首  416000 ; 3. 湖南农业大学生物技术系 ,中国 长沙  410128)

摘  要  采用 RT2PCR 的方法 ,克隆烟草木质素合成关键酶咖啡酰甲基转移酶 ( CCoAOMT) 基因并测序 . 构建 CCoAOMT 基因反义表达载体 ,通过农杆菌介导法对苎麻进行遗传转化 ,得到转基因植株 . 采用 PCR 方法对其进行

分子检测 . 为利用基因工程技术 ,创造适合我国国情的环保型低木质素苎麻转基因新品种奠定了基础 . 关键词  苎麻 ( Boehmeria nivea) ; CCoAOMT 基因 ; 反义 RNA ;转化 中图分类号  Q813. 1     文献标识码  A     文章编号  100022537 (2005) 0120075203

Co nstructio n of CCoAOMT Antisense Expre ssio n Vector and Transformatio n of Ra mie CHEN Jian2rong

1 ,2

, ZHANG Xue2wen , GUO Qing2quan 3

13

, TANG Xiang2shan , YANG You2cai 3

1

(1. Institution of Ramie ,Hunan Agricultural University ,Changsha 410128 , China ;2. College of Biology Resources and Environment , Jishou University , Jishou 416000 , China ;3. Departement of Biotechnology , Hunan Agricultural University ,Changsha 410128 , China)

Abstract  cDNA encoding caffeoyl CoA O2methyltransferase ( CCoAOMT) from Nicotiana tabacum was cloned by RT2PCR and sequenced. The antisense expression gene of CCoAOMT was constructed and transformed into Boehmeria nivea via Agrobacterium tumef aciens (LBA4404) transformation. Transgenic plants were identified with PCR. It probes a way to breeding low lignin Ramie fibre to facilitate Ramie textile industry. Key words  Ramie ( Boehmeria nivea ) ;lignin ;antisense RNA ;transformation

苎麻纤维含木质素 1 %~2 % ,是比较顽固的杂质 ,少量木质素的存在对苎麻纺织性能仍有较大影响 . 纺 织工业中脱木质素的化学药品投入及废液的处理需要大量耗能并增加成本 ,对江河湖海的污染较大 . 通过基 因工程技术改良苎麻品质进行低木质素育种 ,降低木质素的含量或改变其组分 ,将是解决这一问题的有效方 法 . 在国际上通过转基因技术调控植物木质素含量与组分已成为热点 . 木质素生物合成途径的基础研究也进 展迅速 ,国内外研究人员已分离克隆了多个木质素生物合成途径中的关键酶基因 ,并构建了单价与双价反义 表达载体 ,得到木质素含量下降或木质素组分改变的转基因植物[1~4 ] . 近年来 ,利用反义 RNA 技术转化植物得到了木质素含量和化学组分改变的植物 , 涉及的植物包括拟南 芥、 烟草 、 百日草 、 杨树 、 火炬松等 [4 ] . 利用 CCoAOMT 基因调节植物木质素合成的研究获得了令人满意的结 果 . 反义抑制 CCoAOMT 的转基因烟草与杨树 ,不仅木质素含量降低 ,伴随 S/ G 比值增加 ,木质素结构更为疏 Ξ 收稿日期 :2004210225 基金项目 : 国家“863”资助项目 (2001AA241211 ,2004AA241210) ,湖南省自然科学基金项目 (03JJ Y3046) 作者简介 : 陈建荣 (19732) ,女 ,湖南芷江人 ,湖南农业大学讲师 ,湖南农业大学博士研究生 . 通讯作者 : 郭清泉 ,Email :qingqg @yahoo. com

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松 ,易于去除 . 目前尚未发现转基因植物出现非正常生长[5~7 ] . 本研究克隆了烟草木质素合成关键酶2咖啡酰甲基转移酶 ( CCoAOMT) 基因 , 构建了烟草 CCoAOMT 基因 反义表达载体 ,并对苎麻进行遗传转化 ,得到了具有抗性的愈伤组织 ,进而分化得到了转基因植株 ,为利用基 因工程技术抑制苎麻木质素生物合成 ,创造适合我国国情的环保型低木质素苎麻转基因新品种奠定了基础 .

1  材料与方法 1. 1  材料 苎麻 ( Boehmeria niveaLinn , Gaud) . 采用本研究所组培苗 , 烟草 ( Nicotiana tabacum ) 采用 K326 的感花叶病 植株 . 1. 2  方法 1. 2. 1  烟草全长 CCoAOMT 基因 cDNA 的克隆  取感染花叶病毒的烟草叶片具叶脉的部分加液氮研磨 , 采 用 TRIZOL ( GIBCOBRL) 提取总 RNA ,用 Poly AT tract mRNA Isolation System Ⅲ( Promege) 试剂盒纯化 mRNA. 以 mRNA 为模板 , 用 Reverse Transcription System ( Promege ) 试剂盒反转录 , 通过 GenBank 联机检索 , 根据烟草 CCoAOMT 的核酸序列 (U 62 734) 用 Primer3 软件在线设计引物 ,正向引物为 5’ 2atccacttcaacaccaacga23’,反向引 物为 5’ 2aacgaatgatacagaacagg23’. 以 cDNA 作为模板进行 PCR ,用 QIAquick Gel Extraction kit (QIAGEN) 回收 PCR 产物 ,克隆到 pUCm2T 载体 ( Sangon) . 经过 Amp 抗性和 IPTG/ X2gal 蓝白斑筛选 ,菌落 PCR 检测 ,质粒 PCR 和酶 切检测 ,并测序 . 1. 2. 2  CCoAOMT 基因反义表达载体的构建与工程根癌农杆菌的获得  用核酸限制性内切酶 Xba Ⅰ和 Sac

Ⅰ从克隆载体 pUCm2T 上释放烟草 CCoAOMT 基因 ,所释放的片段上游为 Sac Ⅰ的粘末端 ,下游为 Xba Ⅰ的粘 末端 . 表达载体 pB Ⅰ121 的 CaMV 35S 启动子下游有一个 Xba Ⅰ切点 ,NOS 终止子上游有一个 Sac Ⅰ的切点 , 当用核酸限制性内切酶 Xba Ⅰ和 Sac Ⅰ处理时 ,将载体切去 GUS 编码序列 . 电泳回收烟草 CCoAOMT 基因 ,连 接到 pB Ⅰ121 载体 CaMV 35S 启动子下游构建烟草反义 CCoAOMT 基因表达载体pB Ⅰ1212antiNTCCoAOMT ( 图 1) . 热激法将重组质粒转化到大肠杆菌进行大量制备 . 采用电激法将烟草反义 CCoAOMT 基因表达载体 pB Ⅰ 1212antiNTCCoAOMT 质粒转化根癌农杆菌 LBA4404 ,菌落及质粒 PCR 检测工程根癌农杆菌 . 1. 2. 3  农杆菌共培转化苎麻叶盘  将苎麻试管苗

的幼嫩叶片切去叶缘和主脉后切成 0. 5 ~ 1. 0 cm2 的小块 ,在培养基上预培养一段时间 . 将培养好的 农杆菌 4 000 g 离心收集 ,用 1/ 2 MS 液体培养基重 悬浮农杆菌 , 稀释至适当的浓度 . 将预培养的叶片 取出浸泡在农杆菌菌液中 ,浸泡适当时间后取出吸 去多余的菌液 ,将叶片放到培养基上 ,暗培养 . 共培 养一段时间后将叶片取出 , 用 1/ 2 MS 液体培养基 洗涤叶片 ,去掉粘附在叶片上的农杆菌 , 接种到含 有 Kan 和 Carb 的培养基上抑制农杆菌的生长并同 时筛选具有抗性的转基因愈伤组织 .

2  结果与分析 2. 1  CCoAOMT 反义表达载体的构建

pB Ⅰ1212antiNTCCoAOMT 的构建

图 1  烟草反义 CCoAOMT 基因表达载体

用正向引物与反向引物 , 以 cDNA 作为模板 PCR ,获得长约 800 bp 的 PCR 产物 ( 见图 2) , 经回收克隆到 pUCm2T 载体 , 获得重组质粒 pUCm2NTCCoAOMT. 在添加了氨苄青霉素的 IPTG/ X2gal 平板上筛选白色菌落 ,菌落经 PCR 检测后 ,液体培养 , 提取质粒 , 质粒酶 切检测 ( 见图 3) . 重组菌送生物技术公司测序 ( Sango ) , 测序结果通过 GenBank/ DDBJ / EMBL 数据库进行核苷 酸同源性比较 ( Http :/ www. ncbi . nlm. nih. gov/ blastn) ,同源性比对结果表明核苷酸水平的同源性达 99 % ,所获 © 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.

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第 1 期            陈建荣等 :CCoAOMT 基因反义表达载体的构建及转化苎麻的研究              77

得的序列包含了整个读码框序列 .

  泳道 1 :DNA 分子量标准 ( GeneRulerTM1kb ladder) ;

泳道 1 :DNA 分子量标准 ( GeneRulerTM 1kb ladder) ; 泳道 2 :

  泳道 2 :RT2PCR 烟草 CCoAOMT 基因扩增产物 .

pUCm2NTCCoAOMT 重组质粒 ; 泳道 3 :pUCm2NTCCoAOMT 重

图 2  RT2PCR 获得的烟草 CCoAOMT 基因电泳结果

组质粒酶切结果 . 图 3  pUCm2NTCCoAOMT 重组质粒酶切电泳结果

  按 1. 2. 2 介绍的克隆方法 , 将 CCoAOMT cDNA 克 隆在植物表达载体 pBI121 的 CaMV 35S 启动子下游与 NOS 终止子之间 ( 如图 1) ,经分子检测烟草全长反义 CCoAOMT 基因克隆在了预期的位点 , 构建成了反义表

达载体 pBI1212antiNTCCoAOMT. 工程农杆菌 LBA4404 (pBI1212antiNTCCoAOMT) 经菌落 PCR 的验证 , 结果表 明工程农杆菌含有目的基因片段与克隆载体上的目的 基因片段大小一致 ( 见图 4 ) , 可以用于对苎麻离体叶 片的遗传转化 . 2. 2  转反义 CCoAOMT 基因苎麻的获得 在 MS + BA 3 mg/ L + NAA 0. 01 mg/ L + Kan 50 mg/ L + Carb 500 mg/ L 培养基上 ,21 d 出现抗性愈伤组织 , 而没有获得外源抗性基因的叶片部分死亡 ( 见图 5 ) , 将抗性愈伤组织继代 ,50 d 开始陆续见有芽点分化 ( 图 6) . 将长至 3~4 cm 的植株接种至 MS + NAA 0. 05 mg/

泳道 1 :DNA 分子量标准 ( GeneRulerTM 1 kb ladder) ; 泳道 2 : 克 隆载体重组质粒 (pUCm2NTCCoAOMT) PCR 扩增条带 , 阳性对 照 ; 泳 道 3 : 烟 草 CCoAOMT 基 因 反 义 表 达 载 体 ( pBI1212 antiNTCCoAOMT) PCR 扩增条带 ; 泳道 4 :工程农杆菌 LBA4404 (pBI1212antiNTCCoAOMT) 扩增条带 ; 泳道 5 : 农杆菌 LBA4404

菌落 PCR ,阴性对照 . 图 4  烟草 CCoAOMT 基因反义表达载体构建后的验证电泳

L 的培养基上 ,一周后生根 ,成转基因小植株 .

图 5  经遗传转化的苎麻离体叶片分化出愈伤组织

图 6  经遗传转化的苎麻愈伤组织分化出小植株

  分别提取苎麻非转基因材料的总 DNA 和苎麻转基因材料的总 DNA ,以扩增烟草 CCoAOMT 基因的引物 进行扩增 ,结果在苎麻非转基因材料的总 DNA 中未见扩增分子 ,而在苎麻转基因的 3 个材料的总 DNA 中扩 增到阳性带 ( 见图 7) . 证明苎麻转基因小植株已经获得外源的反义烟草 CCoAOMT 基因 . © 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.

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3  讨论 烟草反义 CCoAOMT 基因表达载体转化苎麻 ,获得 了转基因植株 ,由于烟草 CCoAOMT 基因与苎麻同源基 因的同源性 ,有望通过反义 RNA 技术 ,抑制苎麻相应 基因的表达 ,进而降低苎麻木质素含量 ,但其对苎麻木 质素含量的影响效果还在进一步的研究中 . 理论上来 看利用苎麻 CCoAOMT 基因 cDNA 更为理想 . 目前本研 究小组已经从苎麻中获得内源的 CCoAOMT 基因 ,利用 苎麻内源的反义 CCoAOMT 基因对木质素代谢的抑制 作用正在进一步研究中 . 本论文部分工作在作物基因工程湖南省重点实 验室完成 . 本所李利良参与了组织培养部分工作 . 在 此一并表示感谢 !

泳道 1 :DNA 分子量标准 ( GeneRulerTM1kb ladder) ; 泳道 2 : 重组质粒 pBI1212antiNTCCoAOMT PCR 扩增 ,阳性对照 ; 泳 道 3 :非转基因苎麻总 DNA 扩增结果 , 阴性对照 ; 泳道 4 ~5 :分别为 2 个转基因苎麻植株总 DNA 扩增结果 . 图 7  转 antiNTCCoAOMT 基因苎麻的 PCR 分子检测

参考文献 : [1 ]  ROSS WHETTEN ,RON SEDEROFF. Lignin biosynthesis[J ] . The Plant Cell , 1995 ,7 :1 00121 003. [ 2 ]  LI LAIGENG, XIAO FEI CHENG, JACQUELINE LESHKEVICH ,et al . The last step of syringyl monolignol biosynthesis in angiosperms is regulated by a novel gene encoding sinapyl alcohol dehydrogenase[J ] . The Plant Cell , 2001 ,13 :1 56721 585. [ 3 ]  YE ZHENG2HUA , KNEUSEL RICHARD E , ULRICH MATERN. An alternative methylation pathway in lignin biosynthesis in zinnia[J ] . The Plant Cell , 1994 ,6 :1 42721 439. [4 ]  魏建华 ,宋艳茹 . 木质素生物合成途径及调控的研究进展 [J ] . 植物学报 , 2001 , 43 (8) :7712779. [5 ]  ZHONG R Q , HERBERT W , NEGREL J . Dual methylation pathway in lignin biosynthesis[J ] . Plant Cell , 1998 ,10 :2 03322 045. [6 ]  MEYERMANS H , MORREEL K, LAPIERRE C. Modifications in lignin and accumulation of phenolic glucosides in poplar xylem upon down2regulation of caffeoyl2coenzyme A O2methyltransferase , an enzyme involved in lignin biosynthesis[J ] . J Biol Chem , 2000 ,275 : 36 8992360 909. [ 7 ]  ZHONG R Q , MORRISON W H , HIMMELSBACH D S. Essential role of caffeoyl coenzyme A O2methyltransferase in lignin biosynthesis in woody poplar plants[J ] . Plant Physiol , 200 ,124 :5632578.

( 上接第 61 页)

  结果表明 : 在 1. 5 h 内 ,已使酯化率达到 92. 4 %. 而在其后的 1 h 内酯化率只提高 0. 1 %. 因此上述反应 条件下 ,反应时间为 1. 5 h 基本可达到酯化极限 .

3  结果与讨论 采用 Keggin 钨磷杂多酸 H3 PW12O40 催化合成乳酸丁酯的最佳条件为 : 醇酸摩尔比 1. 3∶1 , 催化剂用量为 0. 2 g ( 0. 4 %) ,带水剂用量为 20 mL ,液相温度 94 ℃,反应时间为 1. 5 h. 此方法具有反应时间短 ,无环境污染 、 无设备腐蚀的优点 ,并且催化剂杂多酸可重复利用[5 ] ,有可能进一步开发成为工业生产乳酸丁酯的新工艺 . 参考文献 : [1 ]  济南轻工业所 . 合成食用香精手册 [M] . 北京 : 轻工业出版社 ,1985. [2 ]  杜少斌 ,徐元植 . 杂多酸及其盐的催化研究新进展 [J ] . 石油化工 ,1993 ,22 :694. [3 ]  焦肇林 . 稀土氧化物作为邻苯二酸酐和辛醇酯化催化剂的研究 [J ] . 催化学报 ,1987 ,8 :221. [4 ]  GEORGE B. Kauffmanand and paul f. vartanisn[J ] . J Chemical Education ,1973 ,(3) :212. [5 ]  王恩波 . Keggin 结构钼系杂多蓝的离析和性质研究 [J ] . 中国科学 (B 辑) ,1990 ,2 :130.

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