Page 1

ЦИТОГЕНЕТИЧНО ПРОУЧВАНЕ НА СЛУЧАИ С МУЛТИПЛЕН МИЕЛОМ Л. Митев Военномедицинска академия - София


Дефиниция Мултипленият миелом представлява В- клетъчно заболяване, което се характеризира с клонална пролиферация на миеломните клетките в костния мозък.

Честота 10-15% от всички онкохематологични заболявания


Фиг.№1 Нормално развитие на плазматичните клетки


Диагностични критерии 1. Наличие на М-протеин в серума или урината. 2. Наличие над 10% клонални плазматични клетки в КМ 3. Лабораторни находки за органно засягане: - хиперкалциемия - бъбречна недостатъчност - анемия - костни лезии


Електрофореза на серум с М-градиент

Имунофиксация на серум

Фиг. №2 Електрофоретично доказване и типизиране на мултипления миелом


Имунофенотипизиране

1. Положителна експресия на CD79a, VS38c, CD138 и CD38. 2. Негативна експресия на CD19 и CD45 на миеломните клетки за разлика от нормалните плазмоцити. 3. Аберантна експресия на CD56, CD117, CD52, CD10, циклин Д1, както и на миелоидни и моноцитни антигени.


Генетични нарушения Цитогенитични нарушения Бройни аномалии 67-90% – анеуплоидни клонове

► Хипердиплоидни. Асоциирани са с ниска честота на преобразования в 14q32. Срещат се при възрастни пациенти с IgG k.

► Не хипердиплоидни (хиподиплоидни, псевдодиплоидни и близотетраплоидни). Асоциирани са с висока честота на преобразувания в 14q32 и 13q-. Срещат се при по-млади пациенти с IgA λ. най- чести тризомии: +3, +5, + 7, +9, +11, +15, +19 най- чести монозомии: -13, -14, -16, и -22.

и 21.


Структурни аномалии ► Преобразувания в локуса на тежките имуноглобулинови вериги 14q32 - 55-70 %

► Делеция на 13q (15%) или монозомия на 13 (85%) –30-50 %

► Преобразувания на хромозома №1 – 30-40%

► Преобразувания на c-MYC локуса - 15-44%

- 11q13 -- циклин D1 (15(15-18%) - 16q23 – C-MAF (5%) - 4p16.3 – FGFR3/MMSET (15%) - 6p21 – циклин D3 (3%) - 20q11 – MAFB (2%)

Минимален делеционен район 13q 13q-14. 14. Вероятно засягане на гена RB

- на късото рамо: рамо: делеция на 1p111p11-21 и транслокации - на дългото рамо: рамо: дубликации в q12q12-22 и q31q31-42

Въвлича се предимно в транслокации. транслокации. Характерен е за напредналите стадии на заболяването. заболяването. ПоПо- често се засяга c-MYC и попо-рядко N-MYC.


FGFR3/MMSET

D3 D1 c-MYC

C-MAF IgH

MAFB

Фиг. №3 Локализация на генетичните нарушения на ММ в човешкия геном


Прогностични субгрупи ► С добра прогноза - хипердиплоиден кариотип - t(11;14) - t(6;14)

► Високо рискови нарушения - Не хипердиплоиден кариотип - 13q-/-13 и нарушение на хромозома №1 - t(4;14) – инхибитор на FGFR3 - t(14;16) и t(14;20) - 17p-, p53 инактивация


Молекулярни нарушения Мутация на KRAS и NRAS

40% при новодиагностицирани 64-70% в терминалните стадии. Причинява интерлевкин 6 независим растеж чрез MAPK път.

Фиг. №4 Активационна мутация на MAPК път


Молекулярни нарушения Делеция на 17p13 и мутация на p53 Мутация (5%) или делеция (10%) на р53 (17p-). Характерна е за терминалните фази на заболяването и е асоциирана с лоша прогноза, хиперкалциемия, често екстрамедуларна прогресия на заболяването и наличие на циркулиращи плазматични клетки.

Фиг. №5 Инактивационна мутация на пътя на RB1 и p53


Молекулярни нарушения - дерегулация на NF-kB

Амплификации на позитивни или делеция на негативни регулатори довежда до хиперактивация на NF-kB (50%).

bortezomib

Фиг. №6 Активационни мутации на пътя на NF-kB


Усилена апоптоза

RAS(MAPK)

Потискане C-myc

NF-kB

Циклин D123

? Rb/p53 Малигнена клетъчна пролиферация

Активиран Блок на апоптозата

Малигнена трансформация прогресия на заболяването

Фиг. №7 Връзка между биохимичните пътища на RAS, циклин D, Rb/p53 и NF-kB при ММ


Методи за изследване 1. Конвенционален цитогенетичен анализ (n=25) 2. Флуоресцентна in situ хибридизация със следните комбинирани локус - специфични сонди (n=7): - 11q23/13q14, 19q13/17p13, 15q22/6q21 - 14q32 сплит проба - двуцветна двойнофузионна проба за t(11;14) 3. Молекулярен анализ на KRAS и BRAF с PCR в реално време на принципа на алел специфична амплификация (n=10).


Таблица №1 Генетични находки при пациентите с мултиплен миелом №

Име

Пол/ Възраст

Киничен стадий

Кариотип

FISH

КRAS

I Пациенти с нормален кариотип 1

К.Н.Г.

М/56

46,XY[20]

-

2

А.Д.А

М/69

46,XY[30]

-

3

Г.Х.

М/55

IIA

46,XY[30]

-

4

Д.Д.

М/46

IIA

46,XY[15]

-

5

Х.М.

М/50

IIB

46,XY[18]

-

6

И.Д.

М/76

IIB

46,XY[20]

-

7

M.В.З.

Ж/73

46,ХХ[5]

-

8

П.С.М.

М/45

46,XY[11]

-

9

Р.М.Ж.

Ж/46

46,XX[9]

-

10

Й.М.М.

Ж/77

46,XX[15]

-

11

М.В.И.

М/56

III

46,XY[15]

-

(+)

12

В.И.С.

Ж/54

III

46,XX[25]

+19q(12%) 17p- (4%)

(-)

13

Р.В.П.

Ж/61

46,ХХ[8]

-

(+)

14

И.Д.М.

М/54

46,XY[15]

11q- (10%) 13q- (6%)

15

И.Н.К.

М/67

-

-

16

Д.Б.Д.

Ж/69

-

13q 13q-(90%)

17

Й.Ц.М.

Ж/47

-

-

(-)

18

К.Н.Д.

Ж/69

-

-

(+)

19

Д.Б.Д.

Ж/69

-

-

(-)

20

Л.Й.Д.

М/45

-

-

(-)

21

А.Н.Р.

Ж/50

-

-

(-)

II

III

(-)


Таблица №1 №

Име

Пол/ Възраст

Киничен стадий

Кариотип

FISH

КRAS

II Пациентни с патологичен кариотип Пациенти с единична аномалия 22

Х.Х.

М/77

IIB

46,XY,-7[20]

-

23

C.Г.С.

М/57

IIIA

46,XY[20]

-

24

Н.Д.Н

М/61

III

46,XY,t(11;14)(q13;q32)

25

К.К.

М/76

IV

46,X,-Y[4]/ 46,XY[16]

-

26

A.Ф.

М/60

IIB

46,XY,der(10)t(9;10)(10pter->10q25.2::9q13-->9qter) [8]/ 46,XY[40]

-

27

Д.К.

М/68

IIB

46,XY,t(8;15)(q24.1;p12)[20]/ 46,XY[5]

-

2RG1R1G

Пациенти с комплексен кариотип 28

К.Ш.

М/56

IIIB

46,XY,+3,-14,der(16)(q11)[15]/ 46,XY[20]

-

29

Ц.Н.П

Ж/44

III

46,ХХ[46]/46,X,-X,del(1)(p13p22),+3,+5, t(X;9)(q13q34),12p+,-13[4]

-

30

Г.Н.

М/65

IIIB

46,X,der(Y)t(y;1)(1qter->1q12::Yq12->Ypter),+3,-13, -14,t(17;18)(p11;p13)[10]/ 46,XY[10]

-

31

С.Н.

Ж/54

IIIB

76,X,-X,del(X)(q22),+i(1)(q10),idic(1;1)(1qter->cen>1p32::1p32->cen->1qter),+2,+del(2)(p11)x3, -4,+del(6)(q16)x2,+der(7)t(7;?)(q32;?),+10,+11,+12, +13,+14,+15,-16,-19,-20,-21,-22[20]

-

32

И.К.И

М/68

88,XXYY,+del(1)(q23),+der(1)t(1;?)x2,del(1)(p22?)x2,+2,+ 2,+3,+4,+4,+5,+5,+6,+6q,+8,+8,+9,+10,+10,+11, +11,+12,rob.t(13;15),13q+x2,+15,-16,+17,+19,+19, +20,+20,+21,+21,+22,+22,+6mor,+dmin

-

(-)


1

2

6

13

19

3

7

14

20

4

8

9

10

16

15

21

11

17

5

12

18

22 X

Фиг. №8 G – лентуван кариотип показващ 43,Х,-Y,-5,-21


Фиг. №9 G-лентуван кариотип показващ t(11;14)(q13;q32)


A

Б

Фиг. №10 Флуоресцентна in situ хибридизация на костен мозък с двуцветна двойнофузионна проба специфична за BCL1/IGH t(11;14)(q13;q32) A) Метафазна пластинка показваща положителен сигнал за BCL1/IGH (1G/1R/2F) Б) Интерфазни ядра показващи положителен сигнал за BCL1/IGH (1G/1R/2F)


Фиг. №11 G – лентуван кариотип показващ 46,XY,+3,-14,del(16)(q11)


Фиг. №12 G – лентуван кариотип показващ 46,X,der(Y),t(Y;1),+3,-13,-14,t(17;18)


1

2

6

7

13

19

14

20

4

3

8

9

10

15

21

11

16

22

5

17

12

18

X

Фиг. №13 G – лентуван кариотип показващ 45,X,-X,del(1)(p11p22),+3,+5,9q+,+10,12p+,-13,-21,-22


2

1

3

7

6

13

14

19

20

8

4

9

16

15

21

10

22

5

11

17

12

18

X

Фиг. №14 G – лентуван кариотип показващ 46,X,-X,del(1)(p11p22),+del(3)(q12),4q-?,+5,9q+,-13,-20,+fr


1

19

2

6

7

13

14

20

3

8

15

9

4

10

11

5

12

16

17

18

21

22

X

Фиг. №15 G – лентуван кариотип с 76 хромозоми и комплексено нарушение включващо и аномалии на хромозома №№1 и 6


Фиг. №16 Частичен G-лентуван кариотип, показващ idic(1;1)


Фиг. №17 G – лентуван кариотип с 89 хромозоми и комплексено нарушение включващо и аномалии на хромозома №№1 и 6


Фиг. №18 G – лентуван кариотип с 83 хромозоми и комплексено нарушение включваща и аномолия на 6q


Фиг. №19 Флуоресцентна in situ хибридизация показваща 13q- (2G1R)


Фиг. №20 Флуоресцентна in situ хибридизация показваща 11q- (1G2R)


Фиг. №21 Флуоресцентна in situ хибридизация показваща +19q (3G2R)


Фиг. №22 Флуоресцентна in situ хибридизация показваща +19q13 в интерфазно ядро (3G2R) и нормална находка на метафазна пластинка за 19q13/p53 (2G2R)


Фиг. №23 Флуоресцентна in situ хибридизация показваща +19q13 и 17p- в интерфазно ядро (3G2R) и нормална находка на метафазна пластинка за 19q13/p53 (2G2R)


100 80 60

60 40 Положителна контрола Муттация на KRAS Негативна контрола

20

30

0

Пациент с мутация на KRAS в кодон 12

Честота на KRAS мутацията

Фиг. №24 Мутации на KRAS


30

100

25

80 20

60

86%

93%

27

15

40

10

20

5

7

0

1

0

14%

7% с 17p-

без 17p-

2 с 17p-

без 17p-

Фиг. №25 Честота на 17p- при мултиплен миелом


120

46%

100 54%

80 60 40 20

43%

58%

Единични аномалии

Коммплексни аномалии

0 ЦГА

FISH+KRAS

Фиг. №26 Честота на цитогенетичните аномалии и комплексните нарушения


6 4 2 0

1q

13q-

1p

-13

+3

6q-

17p11q- 14q

19q+

Др.

Фиг. №27 Разпределение на цитогенетичните находки спрямо броя на пациентите


10 8 6 4 2 0 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

Х

Фиг. № 28 Разпределение на структурните аномалии по хромозоми

Y


Фиг. №29 Локализация на местата на счупвания в човешкия геном при настоящото проучване


Изводи 1. Мултипленият миелом включва различни субгрупи с диагностично и прогностично значение, което изисква диференциран терапевтичен подход. 2. Флуоресцентната in situ хибридизация и молекулярният анализ на KRAS повишават възможностите за откриване на клонални нарушения. 3. На основата на нашето проучване и данните от научната литература предлагаме следния минимален панел за генетично субкласифициране на мултипления миелом:


1q21/1p36 t(14;16) 14q32

t(11;14) t(4;14)

13q14/p53

KRAS Диагностичен алгоритъм за субкласифициране на ММ

6c_25  
6c_25  
Advertisement