Page 1

РОЛЯ НА ХЕПСИДИНА В РЕГУЛАЦИЯТА НА ОБМЯНАТА НА ЖЕЛЯЗОТО Д-р Милена Велизарова, дм Доц. Бисера Атанасова, дм Проф. Камен Цачев, дм Катедра по клинична лаборатория и клинична имунология София

VI Национална конференция по клинична лаборатория с международно участие 3-5 септември 2010 год. Боровец


Желязото- есенциално и токсично •

Есенциален олигоелемент за всички еукариоти

Физиологични реакции: кислороден транспорт, електронен транспорт, тъканно дишане, клетъчна пролиферация и диференциация,  регулация на генната експресия и др. •    

Хиперферемията е свързана с повишена онкогенеза, нарушена функция на редица паренхимни органи и нернодегенеративни заболявания


ИКОНОМИЯ НА ЖЕЛЯЗО


Съвременно познание за хомеостазата на желязо Абсорция на желязо в дуоденума • Хемово желязо – лесна и бърза абсорбция чрез наскоро открития хем-носещ протеин 1 (HCP1)- включен също и в усвояване на фолатите. Освобождаването на желязото от хема става с помощта на хем-оксидаза-1 (НО-1). • Не-хемово желязо- слаба абсорбция (10%). – Аскорбиновата киселина увеличава абсорбцията на нехемово желязо. – Fe2+ по- добре се абсорбира от Fe3+.


Съвременно познание за хомеостазата на желязо  Дуоденален цитохром В (DcytB): фериредуктаза (Fe3+→ Fe2+)  Двувалентен метален транспортер 1 (DMT1, Nramp2, DCT1)  Феритин-съхранение  Феропортин: базолатерален транспортер  хефестин (интестинални клетки) или церулоплазмин (неинтестинални клетки): ферооксидаза (Fe2+ → Fe3+)


Съвременно познание за хомеостазата на желязо  Изнесеното от феропортина желязо се залавя от трансферина, който се секретира от хепатоцитите, сертолиевите клетки и кръвно-мозъчната бариера.  Рецептори за трансферин (TfR)-димер от 2 еднакви субединици, разположен върху еритроидни предшественици и активирани лимфоцити.  Афинитетът на трансферин към TfR1 е около 30 пъти по-голям отколкото към TfR2.  Генът, кодиращ синтеза на TfR1 е разположен в хромозома 3, в съседство с гена за синтез на човешки плазмен трансферин.


Рецептор-контролирана ендоцитоза на Tf  Инвагиниране на комплекса рецептор-лиганд (Tf-TfR) и образуване на ендозоми.  Протониране на ендозомите → комформационни промени → освобождаване на желязо.  Желязото се редуцира от цитоплазмени фероредуктази до Fe2+.  В еритроидните клетки желязото се използва за синтез на хем и преминава през йон- непропускливата митохондриална мембрана с помощта на митоферин.  Желязото се доставя до ферохелатазата и се включва в синтезата на протопорфирин IX.


Резервни форми на желязо  Феритин- интрацелуларен хетерополимер, изграден от 24 субединици, които каптират до 4500 атома Fe3+. Открива се във всички тъкани, но главно в черен дроб, слезка и костен мозък.  Хемосидерин- хетерогенен агрегат от желязо, лизозомни компоненти и вътреклетъчни отпадъци. Превръщането на феритин в хемосидерин играе защитна роля срещу токсичността на свободното желязо.


Рециклиране на желязото • Повторно използване на желязото от разрушените еритроцити с помощта на макрофагите. • НО-1 играе важна роля за освобождаване на желязото от хема в цитозола. • Предполага се, че феропортина е експортер на желязо от макрофагите.


ОСИГУРЯВАНЕ НА БАЛАНСА НА ЖЕЛЯЗО  Липса на ефективен механизъм за екскреция на излишното желязо  Регулация единствено на интестинално ниво, като абсорбцията съответства на системните нужди от желязо.

Finch, C. REGULATORS of iron balance in humans. Blood 84, 1697–1702 (1994).


Хепсидин- уринарен антимикробен пептид, синтезиран в черния дроб Park CH, J Biol Chem 2001; 276:7806-10

 25 аминокиселинен пептид, получен чрез посттранслационна модификация от 84 аминокиселинен пропептид- препрохепсидин.  За първи път е описан от три независими лаборатории като синтезиран в черния дроб компонент на вродения имунитет с антимикробна HEP-(atic) активност.

CIDIN (antimicrobial)


Структура на хепсидина  Генът за хепсидина при човек (HAMP) е разположен в 19q13.1 хромозома и кодира синтезa на 84 аа прекурсорен протеин.  Пре-прохепсидинът търпи посттранслационни промени и ензимно се разгражда на 25 аа форма (биоактивен), 22 аа (само в урина) и 20 аа форма. 25 аа форма (биоактивна) на хепсидин


Хепсидинът регулира чревната абсорбция и разпределението на желязото в организма Резервна форма

Рециклиране

Храна


Хепсидинът се свързва с феропортина Мутация в гена за феропортин

Комплексът хепсидин-феропортин се интернализира в цитоплазмени лизозоми и се хидролизира. Премахвайки феропортина от плазмената мембрана, Нр прекъсва износа на желязо от клетките.


ФЕРОПОРТИН • Единственият клетъчен експортер на желязо ??? • Открива се в дуоденални клетки, хепатоцити, макрофаги и плацента

Liu X, Blood Cell Mol Dis 2005


Феропортинът е белязан с протеин, флуоресциращ в зелено


Ефект от взаимодействието между хепсидин и феропортин върху експорта на клетъчното желязо

Hematology 2006;2006:505-516 Copyright ©2006 American Society of Hematology. Copyright restrictions may apply.


РЕГУЛАЦИЯ НА ХЕПСИДИНОВАТА ПРОДУКЦИЯ ПОЗИТИВНИ РЕГУЛАТОРИ

ВЪЗПАЛЕНИЕ ЖЕЛЯЗО

НЕГАТИВНИ РЕГУЛАТОРИ

АНЕМИЯ ХИПОКСИЯ

ХЕПСИДИН


• •

• •

Хепсидиновата mRNA се увеличава при: Внос на желязо с храната Инфламаторни токсини, медииращи синтезата на IL-6. Хепсидиновата mRNA намалява при: Хипоксемия Увеличена загуба на еритроидно желязо (флеботомия или хемолиза)


ПРОДУКЦИЯТА НА ХЕПСИДИН СЕ РЕГУЛИРА ОТ СЕРУМНИТЕ НИВА НА ЖЕЛЯЗО


Абсорбцията на желязо предизвиква пропорционално увеличение на уринния хепсидин в рамките на няколко часа 5 4 Hepcidin (fold change)

100 80

3

60

2

40

1

20

0

0 0

Fe 65 mg iron

10

20

30

40

Tf saturation (%)

hepcidin Tf sat

50

hours after Fe ingestion

Courtesy by Tom Ganz & Ella Nemeth (unpublished)


РЕГУЛАЦИЯ НА ХЕПСИДИНА ПРИ АНЕМИЯ

Pak M, Blood 2006


PHLEBOTOMY-INDUCED ANEMIA DECREASES HEPCIDIN mRNA IN MICE

BLEED

Pak M, Blood 2006


РЕГУЛАЦИЯ НА ХЕПСИДИНА ПРИ АНЕМИЯ Pak M, Blood 2006

sTfR


РЕГУЛАЦИЯ НА ХЕПСИДИНА ВЪЗПАЛЕНИЕ

СЕРУМНО НИВО НА ЖЕЛЯЗО

ЕРИТРОПОЕТИЧНИ СИГНАЛИ


Основните патогенетични механизми на АХЗ са: - Нарушена пролиферация и диференциация на еритроидни прекурсори; -↓ Отговор към еритропоетин; -↓ Преживяемост на еритроцити; -Засилен трансмембранен интрацелуларен железен инфлукс (активиран DMT1) и дефектен експорт (супресия на феропортина), с резултат- натрупване на желязо в макрофагите.


Антиинфламаторните цитокини стимулират продукцията на Нр и намаляват количеството на феропортина

Hershko, C. Blood 2006;108:2890-2891- IL-6

IS A POTENT STIMULATOR OF HEPCIDIN PRODUCTION

Copyright ©2006 American Society of Hematology. Copyright restrictions may apply.


Анемия при хронично заболяване

X X Hentze . . . Andrews, Cell 117: 285 (2004)


Анемия при хронични заболявания възпаление

хепсидин

желязо

Част от патогенетичната верига на организма за неспецифична антимикробна защита. ↓ Fe води до супресия на инфекцията чрез лишаване на бактериите от необходимото за разтежа им желязо; ↑ Fe в макрофагите спомага за унищожаване на бактериите (NADPHox-dip.)


1.

Увеличените нива на хепсидин в урината могат да служат като диагностичен тест за анемия при хронични заболявания.

2.

При наличие на железен дефицит при хронично възпаление, хепсидинът е намален, което прави хепсидина потенциален маркер за диагноза на желязодефицитна анемия при хронични възпалителни процеси.

Blood 101: 2461 (2003)


Желязорезистентна желязодефицитна анемия (IRIDA). • Клинично се изявява с желязодефицитна анемия, която не се повлиява от перорален (частично се влияе от парентерален) внос на желязо. • Мутации в гена TMPRSS6, кодиращ синтезата на сериновата протеаза matriptase-2 , се асоциират с високи нива на хепсидин (Nat Genet, 2008, 40:561)


• Уринният хепсидин е увеличен при данни за наличен железен дефицит. • ?Вероятно причината е намалена чревна абсорбция на желязо въпреки железния дефицит. • Все още не е уточнено как мутацията води до силно увеличените нива на хепсидин. • ? матриптаза-2 е негативен регулатор на хепсидиновата транскрипция.


Какво се случва при дефицит на хепсидин?


Случайни мутации в хепсидиновия ген (HAMP)водят до свръхобременяване с желязо и развитие на хемохроматоза

• • • •

Мъж, 29 г. кардиомиопатия хипогонадизъм цироза

Roetto A et al., Nature Genetics 2003


ГЕНЕТИЧНО ДЕТЕРМИНИРАНИ ХЕМОХРОМАТОЗИ OMIM КЛАСИФИКАЦИЯ ГЕН

ХРОМ.

ХЕПСИДИН

6p21.3

1q21

↓↓

(HAMP)

19q13.1

n.d.

• Type 3:

TfR2

7q22

• Type 4:

Ferroportin

2q32

• Type 1: “classical” HFE • Type 2: ”juvenile” 2A:

HJV

2B:

Hepcidin


Опростена класификация на вродената хемохроматоза • Дефицит на хепсидин (автозомно рецесивно) – първичен: мутации в хепсидина – вторичен: мутации в HFE, TfR2 или HJV

• Резистентност към хепсидин – Някои мутации във Ferroportin (автозомно доминанатно): нарушено свързване или интернализация на феропортин с хепсидина)


Хепсидинов модел на HFE-хемохроматоза Pietrangelo A, NEJM 2004


Вторично свръхобременяване с желязо • Резултат от заболявания с неефектична еритропоеза и анемии, изискващи чести хемотрансфузии- таласемии, МДС и др. • Ниските хепсидинови нива, които се срещат основно при таласемия интермедия в сравнение с майор, се дължат на засилената еритропоеза и в по-малка степенна претоварване с желязо. • Интересно е, че при таласемични пациенти концентрацията на уринния хепсидин се увеличава в отговор на трансфузиите след 3-4 дни. Това се дължи на известно “успокояване “ на анемията, което намалява нуждите на КМ от желязо.


Методи за определяне на хепсидин


Методични проблеми при определяне на хепсидин  Регистрирани са големи преданалитични колебания на Нр в урината, което може да се свърже с влиянието на гломерулната филтрация върху уринните нива. Повечето данни дават предимство на методите за измерване на Нр в серум.  Значителната интраиндивидуална вариация (при здрави пациенти) затруднява изработване на референтни граници.  Въпреки наличието на вариации в серумните и уринните нива, определянето на хепсидин може да разграничи различните нарушения в хомеостазата на желязо.  За да се намалят преданалитичните вариации, е добре да се изследват едновременно серумни и уринни проби, получени в един и същ час от денонощието.


Имунохимични методи Разработването на конвенционален имунохимичен метод за определяне на хепсидин среща трудности, свързани с получаването на антихепсидинови антитела, поради:  малък размер на белтъчната молекула (25 аа) с недостатъчни епитопи;  висока степен на сходство на хепсидина при различни животински видове, което предопределя нисък имунен отговор;  ограничена наличност на антигена със специфична конфигурация на молекулата- форма на фиба, стабилизирана от 4 дисулфидни моста.


ELISA за хепсидин  Стандартен ELISA с Аb срещу прохепсидинрезултатите не показват очакваните промени при възпаление.  Конкурентен ELISA- понадеждно измерване на серумни нива на Нр.  Резултатите за уринните нива на хепсидин се изразяват като ng hepsidin/mg creatinine.


SELDI-TOF-MS Surface Enhanced Laser Desorption IonizationTime Of Flight-Mass Spectrometry based on Protein Chip Arrays


SELDI-TOF-MS - предимства Игнорират се трудностите в производството на антитела и антигени. Особено подходящ за определяне на пептиди с ниско молекулно тегло. Могат бързо да се анализират проби без предварителна обработка на материала. Възможност за определяне на hepcidin-22 и hepcidin-20. Използва се хепсидинов аналог като вътрешен стандарт за коригиране на аналитичните вариации и влиянието на матрикса в пробата. Позволява едновременен анализ на голяма серия от проби.


SELDI-TOF-MS


SELDI

Висока корелация на резултатите при определяне на уринен хепсидин чрез имунохимични методи и SELDI-TOF-MS 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0

r=0.77 ρ=0.643 P=0.024

0

100

200

300

400

500

IMMUNOCHEMICAL METHOD

600

700


На кратко... • Хепсидинът е регулатор на желязото в организма, който поддържа плазмените и резервните нива на желязо в нормални граници. • Хепсидинът регулира навлизането на желязо в плазмата от дуоденалните ентероцити, от макрофагите и от хепатоцитите. • Хепсидинът въздейства чрез свързване с феропортина и предизвиква неговата интернализация и разграждане. • Продукцията на хепсидин се регулира от нивата на плазменото желязо, от активността на еритропоезата и от възпалителни цитокини. • Излишък от хепсидин води до хипоферемия и анемия при възпаление. • Дефицит на хепсидин, или резистентност към неговото действие, води до развитие на хемохроматоза.

6c_22  
6c_22  
Advertisement