Page 1

LC-MS/MS В КЛИНИЧНАТА ЛАБОРАТОРИЯ Добрин А. Свинаров


СИНОПСИС УТВЪРДЕНИ И НОВИ ПРИНЦИПИ НА СЕЛЕКТИВНОСТ РАЗДЕЛЯНЕ ПО РЕАКЦИЯ – SRM, MRM

(QQQ)

РАЗДЕЛЯНЕ ПО МАСА – ОРБИТРАП ТЕХНОЛОГИЯ

ОБЛАСТИ НА ПРИЛОЖЕНИЕ ВРОДЕНИ ГРЕШКИ НА ОБМЯНАТА (ВГО) ЛЕКАРСТВЕН МОНИТОРИНГ И ТОКСИКОЛОГИЯ ХОРМОНИ И ВИТАМИНИ ДЕФИНИТИВНИ МЕТОДИ D.Svinarov©2010


QQQ МАССПЕКТРОМЕТРИЯ – MS/MS Йонен

MS1

MS2

източник

детектор

C8

* Количествен резултат D.Svinarov©2010

Колизия

MRM MRM (SRM) (SRM)

Комютър


Trajectories in the orbitrap φ z

Frequency of rotation ωφ Frequency of radial oscillations ωr Frequency of axial oscillations ωz D.Svinarov©2010


Orbitrap™ Mass Spectrometers

D.SvinarovŠ2010


Simulated Resolution = 15,000 (Mix 1:3) Resolution 15,000 292.04031 C 10 H 15 O 5 N P S

100 90 80

Relative Abundance

70 60

292.02656 C 8 H 11 O 3 N 5 Cl S

50 40 30 20 10 0 291.98

292.00

292.02

292.04 m/z

D.SvinarovŠ2010

292.06

292.08


Simulated Resolution = 20,000 (Mix 1:3) Resolution 20,000 292.04031 C 10 H 15 O 5 N P S

100 90 80

Relative Abundance

70 60 50 292.02656 C 8 H 11 O 3 N 5 Cl S

40 30 20 10 0 291.98

292.00

292.02

292.04 m/z

D.SvinarovŠ2010

292.06

292.08


Simulated Resolution = 25,000 (Mix 1:3) Resolution 25,000 292.04031 C 10 H 15 O 5 N P S

100 90 80

Relative Abundance

70 60 50 40 292.02656 C 8 H 11 O 3 N 5 Cl S

30 20 10 0 291.98

292.00

292.02

292.04 m/z

D.SvinarovŠ2010

292.06

292.08


Simulated Resolution = 35,000 (Mix 1:3) Resolution 35,000 292.04031 C 10 H 15 O 5 N P S

100 90 80

Relative Abundance

70 60 50 40 292.02656 C 8 H 11 O 3 N 5 Cl S

30 20 10 0 291.98

292.00

292.02

292.04 m/z

D.SvinarovŠ2010

292.06

292.08


Simulated Resolution = 50,000 (Mix 1:3) Resolution 50,000 292.04031 C 10 H 15 O 5 N P S

100 90 80

Relative Abundance

70 60 50 40 292.02656 C 8 H 11 O 3 N 5 Cl S

30 20 10 0 291.98

292.00

292.02

292.04 m/z

D.SvinarovŠ2010

292.06

292.08


Simulated Resolution = 100,000 (Mix 1:3) Resolution 100,000 292.04031 C 10 H 15 O 5 N P S

100 90 80

Relative Abundance

70 60 50 40 292.02656 C 8 H 11 O 3 N 5 Cl S

30 20 10 0 291.98

292.00

292.02

292.04 m/z

D.SvinarovŠ2010

292.06

292.08


Measured vs. Simulated at 100,000 (Mix 1:3) Parathion

Thiamethoxam 292.04031 C10H15O5NOPS

100 90 80 70

Measured

Relative Abundance

60 50 292.02656

Simulated

C8H11ClN5O3S

40 30 20 10 0 291.98

292.00

292.02

292.04 m/z

D.SvinarovŠ2010

292.06

292.08


ТРАДИЦИОНЕН НЕОНАТАЛЕН СКРИНИНГ

• ЕДНА БОЛЕСТ

PKU

• ЕДИН ТЕСТ

BIA

• ЕДИН МАРКЕР

Phe

• ЕДНА cutcut-off (N/Abn (N/Abn) Abn)

3 mg/dL mg/dL


MS/MS МАСОВ НЕОНАТАЛЕН СКРИНИНГ

• МНОГО БОЛЕСТИ

(ВГО)n

• ЕДИН ТЕСТ

MS/MS

• МНОГО МАРКЕРИ

(AА,AC)n

• МНОГО cutcut-offs

0.1-1,000 µM


МАСОВ МАСОВ НЕОНАТАЛЕН НЕОНАТАЛЕН СКРИНИНГ СКРИНИНГ ЗА ЗА ВГО ВГО ЧРЕЗ ЧРЕЗ МS/MS МS/MS

42 АНАЛИТИ

НАД 30 ВГО

Phenylketonuria MSUD Homocystinuria Tyrosinemia type I Argininosuccinic acidemia Citrullinemia type I Hyperphenylalaninemia Tyrosinemia type II Biopterin defects (Bios) Tyrosinemia type III Biopterin (Reg) Argininemia Hypermethioninemia Citrullinemia type II

MCAD deficiency VLCAD deficiency LCHAD deficiency TFP deficiency Carnitine uptake defect Glutaric acidemia type II

D.Svinarov©2010

Време <2 мин

Isovaleric acidemia Glutaric acidemia type I Methylglutaconic acidemia Malonic acidemia HMG deficiency 3MCC deficiency BKT deficiency Multiple carboxylase deficiency Methylmalonic acidemia (MUT) Methylmalonic acidemia (Cbl A,B) Propionic acidemia

Национална Генетична Лаборатория


ЛЕКАРСТВЕН МОНИТОРИНГ И ТОКСИКОЛОГИЯ ИМУНОСУПРЕСОРИ – 169 ЛАБОРАТОРИИ В РТ LC-MS/MS МЕТОДИ – 92 ЛАБОРАТОРИИ (54%) ДРУГИ МЕТОДИ – 77 ЛАБОРАТОРИИ (46%) ПРОТЕАЗНИ И ТИРОЗИНКИНАЗНИ ИНХИБИТОРИ НЕВРОЛЕПТИЦИ И АНТИДЕПРЕСАНТИ ТОКСИКОЛОГИЧЕН СТРИНИНГ ТОКСИКОКИНЕТИЧЕН МОНИТОРИНГ D.Svinarov©2010


RIS, C23H27FN4O2, M = 410.49 RISPER_FS_PR_01 #125-132 RT: 1.68-1.77 AV: 8 T: + p Full ms2 411.11@-33.00 [ 100.00-500.00] 191.07 100

NL: 1.51E8

95 90

N

85 80 75

N

70

N

RelativeAbundance

65 60

O

N

55

O

50 45 40 35 30 25

F

20 15 10 5

110.08

163.07

0 D.SvinarovŠ2010 150

220.82 200

269.26 285.01 250

300 m/z

328.27

358.09 394.21 411.22 350

400

451.05 450

469.81 500


OHR, C23H27FN4O3, M = 426.49 9OHRIS_JHANSSEN_FS_PR_01 #242-248 RT: 3.27-3.35 T: + p Full ms2 427.17@-32.00 [ 100.00-500.00] 207.10 100 95

AV: 7

NL: 1.20E8

OH

90

N

85 80 75

N

70

N

RelativeAbundance

65

O

60

N

55

O

50 45 40 35 30 25

F

20 15 10

110.01

5 136.96

0 D.Svinarov©2010 150

179.03

232.93 200

262.05 290.26 312.94 330.51 250

300 m/z

350

378.60 408.91 400

427.11

479.47 450

500


Example Calibration Curves CLAR Y = 0.00125445+0.0619453*X R^2 = 0.9997 W: 1/X

OHCL Y = -0.00212051+0.0567143*X R^2 = 0.9997 W: 1/X

100

30

80

25 A re a R a tio

Area R atio

35

60

20 15

40 10 20

5

0

0 0

500

D.Svinarov©2010

1000 µg/L

1500

0

200

400 µg/L

600


Validation parameters tested at LLOQ, QC-L, QC-M, and QC-H  Selectivity: confirmed with matrix effect (ME) of 86-107 % for CLAR, OHCL, and Rx, and relative ME of 87-99% for RIS and OH-RIS, by analysis of 6 different plasma sources  Accuracy: LLOQ ± 11 %, batch ± 3.7 %, between run ± 5.3% (d)  Precision: LLOQ < 11 %, batch < 3.8 %, between run < 6.0% (CV)  Recovery,%: 78-87 (CLAR), 83-88 (OHCL), 85-94 (Rx)  Linearity, µg/L: 1. 08÷1725 (CLAR), 0.36÷572.5 (OHCL)  Stability: freeze-thaw - 3 cycles of 24 h, post-preparative - 48 h, short-term – 6 h, daylight - 3 h, stock solution and long-term - 30 days @ -20oC D.Svinarov©2010


ХОРМОНИ И ВИТАМИНИ СТЕРОИДНИ ХОРМОНИ ЕДНОВРЕМЕНЕН АНАЛИЗ НА СТЕРОИДИ И МЕТАБОЛИТИ ТЕСТОСТЕРОН ПРИ ДЕЦА И ЖЕНИ!

ЩИТОВИДНИ ХОРМОНИ И БРЕМЕННОСТ ИМУНОЛОГИЧНИТЕ МЕТОДИ СА НЕПОДХОДЯЩИ СЛЕД ML III

ПРЕДИЗВИКАТЕЛСТВОТО ВИТАМИН Д D.Svinarov©2010


LLOQ Sample Mass-spectrogram LNG (50.0 ng/L) RT: 0.01 - 6.00 SM: 9G RT: 4.67 NL: 2.34E3 TIC F: + c SRM ms2 313.13@-20.00 [ 244.99-245.49] MS Val1_CC1

100 90 80

RT: 0.01 - 6.00 SM: 7G

60 50 40 30

90 80 70 60 50 40 30

3.65 20

20

10

10

0

1.00 2.30

2 4 Time (min) D.SvinarovŠ2010

RT: 4.83 NL: 5.95E4 TIC F: + c SRM ms2 303.26@-32.00 [ 108.69-109.19] MS Val1_CC1

100

R e la tiv e A b u n d a n c e

R e la tiv e A b u n d a n c e

70

MTS

0

6

1.10 2.29

3.80

2 4 Time (min)

6


LNG, C21H28O2, M = 312.446 ESI_LNG_FS_PR_601 #37-45 RT: 0.36-0.44 T: + p Full ms2 313.13@-20.00 [ 50.00-350.00]

AV: 9

NL: 8.27E6 313.29

100 95 90 85 80 75 70

RelativeAbundance

65 60 55 245.24

50 45 40 35 30 25

185.11 109.01

20

132.96

15

170.90 10 5

83.32 67.15

92.84

295.30

227.11

159.00 187.28 199.04

276.96 267.02

211.15

331.28

0

D.SvinarovŠ2010

100

150

200 m/z

250

300

350


ПРЕДИЗВИКАТЕЛСТВОТО ВИТАМИН Д КЛАСИЧЕСКА РОЛЯ В КАЛЦИЕВАТА ХОМЕОСТАЗА МИНЕРАЛНА КОСТНА ПЛЪТНОСТ, ЗДРАВИ ЗЪБИ, ФУНКЦИЯ НА ДОЛНИ КРАЙНИЦИ, ФРАКТУРЕН РИСК

НО - УБИКВИТЕРНОСТ НА 1,25ОНD РЕЦЕПТОР! ВИТАМИН Д – РЕГУЛАТОР НА ИМУННАТА СИСТЕМА И КЛЕТЪЧНИТЕ ПРОЦЕСИ НА ДИФЕРЕНЦИАЦИЯ, ПРОЛИФЕРАЦИЯ И АПОПТОЗА

D.Svinarov©2010


ПРЕДИЗВИКАТЕЛСТВОТО ВИТАМИН Д ВЪЗМОЖНА РОЛЯ ПРИ МС, РА И АСТМА, УВЕЛИЧЕН РИСК ОТ ТУБЕРКУЛОЗА, ПНЕВМОНИЯ, ПЕРИДОНТИТ, НАМАЛЕН МУСКУЛЕН ТОНУС И СЛАБОСТ НА ДОЛНИТЕ КРАЙНИЦИ ПРОТЕКТИВНА РОЛЯ ПРИ СС БОЛЕСТИ и ДИАБЕТ Тип 1 НАЙ-СОЛИДНИ ДОКАЗАТЕЛСТВА ЗА ПРОТЕКТИВНА РОЛЯ ПРИ РАК НА : КОЛОН, ГЪРДА, ПРОСТАТА, ОВАРИИ, ПАНКРЕАС D.Svinarov©2010


ПРЕДИЗВИКАТЕЛСТВОТО ВИТАМИН Д ДОКАЗАТЕЛСТВАТА ДО СЕГА 50% ↓ РИСК ОТ КОЛОРКТАЛЕН РАК ПРИ 25ОНD > 83 nmol/L СРАВНЕН С 25ОНD < 30 nmol/L 50% ↓ РИСК ОТ РАК НА ГЪРДАТА ПРИ 25ОНD > 130 nmol/L СРАВНЕН С 25ОНD < 33 nmol/L

ДНЕВНИ НУЖДИ: 400-2000-10000 IU дневно ПРОБЛЕМЪТ UVB – ПОЛЗИ И ВРЕДИ / ЖИВОТ В МОЛОВЕТЕ

МЕТОДИЧНИ ПРОБЛЕМИ - 25ОНD2 / 25ОНD3 / 1,25ОНD D.Svinarov©2010


ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПРЕХОДЪТ ОТ ЕКЗОТИКА КЪМ РУТИНА Е ЗАВЪРШЕН И СЕГА LC-MS/MS ЗАПЪЛВА ОПРЕДЛЕНА НИША В АНАЛИТИЧНИЯ АРСЕНАЛ НА СЪВРЕМЕННАТА КЛИНИЧНА ЛАБОРАТОРИЯ D.Svinarov©2010


Благодаря за вниманието!

D.Svinarov©2010

6c_04  
6c_04  
Advertisement