Page 1

МОЛЕКУЛЯРНО БИОЛОГИЧНО ПРОУЧВАНЕ НА ОНКОГЕНА К-RAS ПРИ СЛУЧАИ С КОЛОРЕКТАЛЕН КАРЦИНОМ Л. Митев1, A.Факирова2 , А.Михова2, К.Кацаров3, Е.Белоконски4 1Катедра

клинична лаборатория и имунология, 2Катедра по патохистология,3 Клиника по гастроентерология и 4Катедра спешна медицина и коремна хирургия, Военномедицинска академия, София


Биомаркери в онкологията Биомаркерите са лабораторни показатели, които дават обективна оценка както за нормалните и патологични процеси, така и за отговора от приложената терапия или за необходимостта от провеждането на специфично лечение.

Atkinson, AJ et al. Clin.Pharmacol. Ther. 2001; 69:89-95. Trusheim MR et al. Nature Rev Drug Discov. 2007; 6:287-293


ВИДОВЕ БИОМАРКЕРИ ■ ГЕНЕТИЧНИ ■ ПРОТЕОМНИ

ЛАБОРАТОРНИ

■ МЕТАБОЛИТНИ ■ ХИСТОЛОГИЧНИ ■ ЦИТОМОРФОЛОГИЧНИ

■ ПРОГНОСТИЧНИ ■ МАРКЕРИ НА БИОЛОГИЧНАТА ПРОГРЕСИЯ

КЛИНИЧНИ

■ РИСКОВИ БИОМАРКЕРИ ■ ПРЕДИКТИВНИ ■ ЕФЕКТ ОТ ЛЕКАРСТВЕНАТА ТЕРАПИЯ ■ ИЗБОР НА ТЕРАПЕВТИЧЕН ПОДХОД


Клоналност на туморите Нормална

Нормални клетки

клетъчна

Мутантни клетки

популация

Нормална клетъчна популация с единична мутантна клетка

Патологичен клон

Клоналност – способност за формиране на популация от клетки с еднакви или сходни генетични нарушения (цитогенетични и/или молекулярни), които произлизат от единична прекурсорна клетка.


Цитогенетични биомаркери Интерстициална делеция

Терминална Делеция

Инсерция

Реципрочна транслокация

Дубликация

Инверсия

Ринг Хромозома

Робертсонова Транслокация

Изохромозома


Молекулни биомаркери Нуклеотидна Делеция

Нуклеотидна Инсерция

Нуклеотидна Субституция


Цитогенетични и молекулни биомаркери при колоректалния карцином Цитогенетични биомаркери: 5q-,17p-, 18q-,1q-, 4p-, 6p-, 6q-, 8p-, 9q- и 22qМолекулни биомаркери: KRAS, APC, BRAF, DCC, p53, hMLH1, hMLH2 и др.


Биологична характеристика на KRAS ■ Генът

се обозначава като KRAS, а протеинът като K-ras

■ Член

е на RAS онкогенната супер фамилия и е близкородствен на HRAS и NRAS. ■ Генът

продуцира 21 kDa G протеин, който е GTP свързващ и втори посрeдник на MAPK сигналeн път . ■ Места

на мутация:

• Екзон 1: кодон 12 (GGT wt = Gly) и кодон 13 (GGC wt = Gly) • Eкзон 2: кодон 61 (CAA wt = Gln)


Биологична характеристика на KRAS Структура на KRAS Gly 12 и 13

GTP СВЪРЗВАЩА ОБЛАСТ

G област

Хипервариабилен район


Биологична характеристика на KRAS Див тип (WT или wt): KRAS генът, който не съдържа мутацията ■

Мутантен K-ras протеин: белтъкът, който съдържа мутацията. Тя предпазва хидролизата на GTP-ата от GTP до GDP. Резултатът е: K-ras остава в активно състояние и не може да бъде инхибиран.

inactive GDP

active

inactive GDP

active GTP

GTP


ТОЧКОВА МУТАЦИЯ В ДНК: ЗАМЯНА НА G C T Нoрмален протоонкоген

---GGT-----CCA-----GGU---

ДНК

иРНК

---GLYCINE---

АК

Онкоген

---TGT-----ACA-----UGU----CYSTEINE--


Интегрална схема нe биохимичните пътища, които се активират чрез рецептора на EPF

1. RAS / RAF / MAPK - път 2. WNT / APC / beta – катенинов път 3. TGFβ - път


Разпределение на мутациите на KRAS при различните тумори Тип на тумора Панкреас Дебело черво Бял дроб Яйчник Пикочен мехур Мултиплен миелом

Съобщена честота на мутиралия KRAS

72 – 90% 32 – 57% 15 – 50% 5 – 50% 14 – 38% 16 – 33%

Friday BB and Adjei AA. Biochim. Biophys. Acta. 2005; 1756:127-144.


ОСНОВНИ МЕТОДИ ЗА ОТКРИВАНЕ НА KRAS МУТАЦИЯТА

1. Полимеразна верижна реакция в реално време 2. Директно сенквениране на ДНК 3. Високоразделителен метод на топене на ДНК


Клинично приложение на KRAS 1. Избор на терапевтичен подход а. Химиотерапия б. Терапия с моноклонални антитела срещу рецептора за епидермалния растежен фактор (HER 1) (panitumumab или cetuximab) 2. Диагностика и прогноза на колоректалния карцином.


Вариант 1. Не се открива мутация на KRAS

EGF

EGFR( - ) Моноклоналните антитела срещу EGFR блокират свързването на EGF с рецептора на EGF. По този начин се блокира клетъчната сигнализация на всички етапи на MAPK път, включително и на ниво KRAS.

КRAS (-) MAPК (-)

Ядро

Резултатът е: терапията с моноклонални антитела е ефективна и туморът спира да расте.

Туморен растеж (-)


Вариант 2. Открива се мутация на KRAS

EGF

EGFR ( - ) Мутиралият KRAS е постоянно активиран . Не зависимо, че моноклоналните антитела блокират рецептора за EGF, се осъществява постоянна активация на MAPK път.

Резултатът е : терапията с моноклонални антитела не е ефективна и туморът продължава да расте.

КRAS(+) MAPК(+)

Ядро

Туморен растеж (+)


Спорадичен колоректален карцином Микросателитно стабилни тумори

КRAS(к12) BRAF hMLH

Герминативна линия-MMRwt

мет. hMLH

МСН

BRAF KRAS

МСН

КRAS(к13) BRAF

не мет.

Наследствен неполипозен колоректален карцином Герминативна линия-MMR мut

МСН

КRAS(к13) BRAF

Лабораторна интерпретация на молекулните промени при колоректален карцином


Клонална еволюция на колоректалния карцином 2 Мутация на RAS

1 Загуба на

тумор супресорния ген APC

Нормални епителна тъкан

4 Загуба на тумор

3 Загуба на тумор

супресорния ген DCC

Малък полип

супресорния ген p53

5 Допълнителни

Аденом

мутации

Карцином


Аденома

Аденома

Аденома

II

III

Мутация на RAS

18q- или мутация на DCC

17p- или мутация на p53

Карцинома

I 5q – или мутация на APC Нормална клетъчна популация

Други мутации или хромозомни аномалии

Клонална еволюция на колоректалния карцином

Метастази


Интегрална схема на сигналните пътища в клетката


Цел на проучването 1. Да се определи честота на пациентите с мутация на KRAS . 2. Да се определи честотата на мутациите в кодон 12 и 13 на екзон I на КRAS. 3. Да се определи честотата на мутации в различните степени на диференцираност на колоректалния карцином 4. Да се определи честотата на вида на точковите мутации


Материал и методи 1. Брой изследвани пациенти 37 (12 жени и 25 мъже) 2. Материал за изследване: срези от парафинови блокчета 3. Степен на дифиренциация на тумора:14 пациента с G1,16 с G2, 7 с G3 4. Методи: • автоматична екстракция на ДНК: ДНК екстрактор – iPrepTM (invitrogen) • полимеразна верижна реакция в реално време: Rotor Gene 6000 5. Реактиви: • кит за молекулярен анализ на K-ras TheraScreen (DXS Англия)


Проба с флуоресцентен рипортер

Флуоресцентният сигнал се емитира, когато пробата се свързва специфично

Принцип на флуоресценото оцветяване при PCR реакция


Мутация

Промяна на базите

Gly12Ala

(GGT>GCT)

Gly12Asp

(GGT>CAT)

Gly12Arg

(GGT>CGT)

Gly12Cys

(GGT>TGT)

Gly12Ser

(GGT>AGT)

Gly12Val

(GGT>GTT)

Gly13Asp

(GGT>GAC)

Видове мутации, които се определят с кита на TheraScreen


Графичен израз на PCR реакцията при нормален KRAS (кривата на стандартната проба е обозначена )


61

12ASP assay + Sample3 Unknown 24,17

Графичен израз на PCR реакцията при мутирал KRAS (кривата на патологичната проба е обозначена с червена стрелка)


Резултати 70

63%

60 50 40 30

27%

20 10 0

Фиг.1. Честота на пациентите с мутация на KRAS

пациенти без мутация пациенти с мутации


70%

Резултати

70 60 50 40

30%

30 20 10 0

Фиг.2. Разпределение на мутациите в кодон 12 и 13

пациенти с мутация в кодон 12 пациенти с мутация в кодон 13


Резултати

50%

50 40 30

30%

20 10 0

10%

10%

Фиг.3. Разпределение по вид мутация

ASP VAL SER ALA


80

Резултати

70 60 50

пациенти без мутация пациенти с мутация

40 30 20 10 0

G1

G2

G3

Фиг.4. Процентно разпределение на пациентите с и без мутация на КRAS в зависимост от степентта на диференциация на тумора. (G1- високо; G2- средно; G3ниско диференциран карцином)


ИЗВОДИ 1. Установената честотата на мутацията на KRAS при пациенти с колоректален карцином (27%) е пониска от съобщената в научната литература. 2. Най-често мутира кодон 12 на екзон I на KRAS, а най-честата мутация е замяната на GLY c ASP 3. Не бе доказана връзка между молекулярнобиологичните промени на KRAS и степента на диференцираност на туморите с изключение на ниско диференцираните карциноми. При тях бе установен по-висок процент на мутации в сравнение с останалите хистологични варианти.

5c_09  
5c_09  
Advertisement