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SESIÓN IV:

Método de identificación y separación de las proteínas:


COMPETENCIA Describe y explica los diversos métodos de separación de las proteínas, experimenta a través del método de la electroforesis el cálculo de los pesos moleculares de las proteínas y valora su importancia en la búsqueda del conocimiento de la ciencia.


Desde el siglo pasado las separaciones analíticas se llevaban a cabo por métodos clásicos como son la precipitación, destilación y extracción. Los esfuerzos por conocer más sobre la composición y función de las proteínas han obligado a buscar nuevas técnicas.

Unas tienen que ver con las propiedades físicas y estructurales de las moléculas que se pretende separar, otras se derivan de los objetivos del análisis (sensibilidad, resolución, tiempo de análisis, necesidad de una detección específica).


El método de selección incluye los pasos necesarios para la obtención, preparación y posible fraccionamiento de la muestra. Las técnicas analíticas pueden englobarse en dos grandes grupos: Técnicas espectroscópicas y las Técnicas de separación. La primera, proporcionan, para cada compuesto analizado, una información compleja, relacionada con sus características estructurales específicas. La segunda se utilizan para resolver los componentes de una mezcla y la señal obtenida puede utilizarse con fines analíticos cuantitativos o cualitativos.


Actualmente las separaciones analíticas se realizan fundamentalmente por cromatografía y electroforesis. La cromatografía comprende un conjunto importante y diversos de métodos que permite a los científicos separar componentes estrechamente relacionados en mezclas complejas, lo que en muchas ocasiones resulta imposible por otros medios. Se pueden separar moléculas en función de sus cargas, tamaños y masas moleculares. También a través de la polaridad de sus enlaces, sus potenciales redox, etc.


La cromatografía no solo permite la separación de los componentes de una mezcla, sino también su identificación y cuantificación. El análisis cualitativo está basado en la medida de parámetros cromatográficos (tiempos y volúmenes de retención) mientras que el análisis cuantitativo está basado en la medida de alturas o áreas de picos cromatográficos que se relacionan con la concentración. La columna cromatográfica y la forma con la que se diseña, constituye el corazón de la separación.


Electroforesis Capilar La electroforesis capilar es una técnica alternativa de la electroforesis convencional y surge debido a que la velocidad de separación y resolución de los compuestos mejora a medida que aumenta el campo eléctrico aplicado. El mecanismo de separación está basado en las relaciones carga/masa de los analitos. Su utilidad está en la separación de proteínas y péptidos entre otras sustancias (ADN por ejemplo)


En resumen la cromatografía y la electroforesis son ahora técnicas ampliamente utilizadas en la resolución de macromoléculas de interés en la industria biotecnológica, biológica y bioquímica.


Electroforesis

Muestra

1. Se realiza sobre un soporte sólido o semisólido, para minimizar efectos de difusión

-

+

2. Se somete el conjunto a un campo eléctrico constante, a un pH fijo; las proteínas migran conforme a su carga eléctrica

3. Terminada la carrera electroforética, las proteínas se tiñen con un colorante adecuado (p.e., Azul de Coomassie)


Cromatografía: La palabra Cromatografía significa "escribir en colores", ya que cuando fue desarrollada los componentes separados eran colorantes. Las técnicas cromatográficas se basan en la aplicación de la mezcla en un punto (punto de inyección o aplicación) seguido de la influencia de la fase móvil. Existen varios tipos de cromatografía:

Cromatografía en columna Cromatografía en capa fina. Cromatografía en papel. Cromatografía de líquidos de alta eficiencia. Cromatografía de gases


La Cromatografía en columna.- Utiliza columnas de vidrio rellenas de Alúmina (Al2O3), Sílica u Oxido de magnesio. Este método de separación necesita hacer pasar la mezcla, empleando un disolvente.

La Cromatografía en capa fina.- utiliza una placa de vidrio recubierta con fase estacionaria (generalmente del tipo de escrito para la cromatografía en columna con variantes). La Cromatografía en papel.- utiliza tiras de papel cromatográfico los cuales se introducen en la cuba cromatográfica.


La Cromatografía de líquidos de alta eficiencia (HPLC).es parecida a la Cromatografía en columna, sólo que se aplica el flujo a presión (entre 1500 a 2200 psi), el tamaño de partícula es entre 3 y 10 micras, la longitud de la columna es entre 5 y 25 cm y requiere de equipo sofisticado. La Cromatografía de gases.- En este tipo de Cromatografía la fase móvil es un gas llamado gas portador o acarreador y la fase estacionaria puede ser un sólido o una película de líquido de alto punto de ebullición (generalmente Polietilén - Glicol o Silición).


Muestra: tres componentes mezclados

Fase estacionaria

Fundamento de la cromatograf铆a Se dispone una mezcla sobre una fase estacionaria

Se hace fluir una fase m贸vil sobre la estacionaria

Fase m贸vil

Dependiendo de la afinidad relativa por ambas fases, los componentes de la mezcla primitiva se separan


Tipos de cromatografía 1. Intercambio iónico - Separa según carga eléctrica - Fase estacionaria: grupos cargados unidos a un soporte insoluble - Fase móvil: gradiente de sal o de pH

2. Partición - Separa según solubilidad en solventes - Fase estacionaria: Un solvente sobre un soporte sólido - Fase móvil: El otro solvente fluyendo


3. Afinidad - Separa según la afinidad de la proteína por un ligando inmovilizado - Fase estacionaria: ligando unido a soporte insoluble - Fase móvil: (1) solución sin ligando (2) solución con ligando libre.


4. Hidrofóbica - Separa según hidrofobicidad - Fase estacionaria: grupos hidrofóbicos unidos a un soporte insoluble - Fase móvil: gradiente inverso de sal 5. Exclusión molecular - Separa según tamaño molecular - Fase estacionaria: dextrano o agarosa entrecruzados - Fase móvil: solución tamponada


Intercambio iónico

+

+ + + + + + + +

-

-

-

-

+

+ + + + + + + +

+

-

-

-

- -

+ +

+ + + + + +

- - - - - - -

Proteínas adsorbidas A baja concentración A mayor concentración de sal se desprenden al intercambiador de sal, se desprenden las proteínas menos las proteínas más iónico electronegativas electronegativas


Peso molecular de las proteínas 1.

Métodos primitivos: presión osmótica, ultra centrifugación analítica, etc.

2. Cromatografía de exclusión molecular 3. Electroforesis SDS-PAGE 4. Cálculo directo a partir de estructura primaria


Cromatograf铆a de exclusi贸n molecular


ABSORCION a 280 nm Se fundamenta en la absorción a 280 nm producida por los aminoácidos aromáticos Phe, Tyr y Trp - Sensible y fácil de practicar - Requiere soluciones puras de proteína; no es aplicable a mezclas - Distintas proteínas dan diferente grado de absorción, dependiendo de su contenido en aa. aromáticos


INTERÉS CLÍNICO PARA LA DETECCIÓN ANTICUERPOS ANTI-VIH

El síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), es una enfermedad infecciosa de origen viral, caracterizada por una fuerte depresión de la inmunidad.


Como se ha reconocido en la mayoría de los agentes infecciosos, los humanos responden a la infección por VIH produciendo una antigenemia y anticuerpos. Aun cuando la dinámica de la respuesta puede diferir, la mayoría de los individuos producirán una antigenia y anticuerpos a los productos virales durante el curso de la infección.

Se han aislado dos tipos de virus relacionados al grupo de lentivirus, de linfocitos de pacientes que sufrían SIDA.


El primero conocido como VIH-1 aislado en Francia y más tarde en USA. El segundo VIH2, aislado de dos pacientes que vivían en África comprobándose era el responsable de un nuevo foco de SIDA en África Occidental.


PRINCIPIO DE LA PRUEBA Es una prueba de enzima-inmunoensayo indirecto para la detección de varios anticuerpos VIH-1 y VIH-2 en suero o plasma humano. Su principio está en una fase sólida recubierta con antígenos purificados (proteína recombinandte GP-160 y péptidos y glicoproteínas de envoltura del VIH-1 y VIH-2), y anticuerpos de cabra anti-IgG e IgM humanos, purificados por cromatografía de afinidad y conjugados con peroxidasa.


EL PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO INCLUYE LOS SIGUIENTES PASOS DE REACCIONES: 1.- Las muestras de suero y controles a determinar se distribuyen en las celdillas de la microplaca. Si existen anticuerpos VIH-1 y VIH2 se fijan al antígeno inmobilizado en la fase sólida. 2.- Luego del período de incubación, se lavan las celdillas y se añaden anticuerpos anti-IgG e IgM humanos conjugados con la peroxidasa, formando un complejo en la fase sólida en función de la captura de fracción de IgG p IgM.


3.- La presencia de la enzima inmovilizada en el complejo se desarrolla mediante la reacción por la adición del sustrato después de que las fracciones libres del complejo hayan sido eliminadas 4.- La reacción enzimática separa mediante adición del ácido sulfúrico 4N, y se realiza la lectura en un espectrofotómetro a 492/620 nm

Las absorbancias obtenidas en la lectura de una muestra permite determinar la presencia o ausencia de anticuerpos VIH-1 y VIH-2


El Ensayo Wester Blot es el inmunoblot más conocido, también como ensayo Wester blot(WB), es la prueba suplementaria más frecuentemente usada para el diagnóstico de infección por VIH. Este ensayo se usa para demostrar los anticuerpos de VIH en individuos asintomáticos o sintomáticos, cuyos resultados del ELISA (Enzime Linked Inmuno Sorbent Assay) son negativos en repetidas oportunidades. Las proteínas que son codificadas por genes estructurales del VIH son separadas por electroforesis en un gel de poliacrilamida


El peso molecular de estas proteínas difiere y por lo tanto migra a diferentes sitios en el gel. Las proteínas de peso molecular más bajo migra hacia la parte más baja del gel. Las proteínas derivadas de VIH generalmente incluyen p17, p24, p31, gp41, p55, p66, gp120 y gp160. Las proteínas separadas por electroforesis son transferidas a un papel de nitrocelulosa, el cual es cortado en tiras para uso en el ensayo. Estas tiras de proteínas virales se incluyen en kits de WB comercial.


RepresentaciĂłn esquemĂĄtica de los resultados de Wester blot (A) resultado positivo.(reactivo con todos los antĂ­genos (B) resultado negativo


INFECCIÓN VIRAL POR EL VIH EN EL LINFOCITO


metodo de separacion de proteinas