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Biol. Rocío Shantal Suárez Mercado1, Dr. Eugenio Pérez Molphe Balch1, M. en C. Martha Cristina González Díaz1, M. en C. Lucia Isabel Chávez Ortiz1. 1. Universidad Autónoma de Aguascalientes, Centro de Ciencias Básicas, Departamento de Química, Av. Universidad 940, Aguascalientes, Ags. C.P. 20131, México. Maestría en Ciencias: área Biotecnología Vegetal.

OBJETIVOS

Figura 3. Se muestran algunas especies que presentaron raíces adventicias. Imágenes: a) Echinocereus longisetus var delaetii (E. delaetii); b) E. ferreirianus var lindsayi (E. lindsayi); c) E. knippelianus (E. knippelianus var kruegeri); d) E. schmollii; e) Echinomastus erectocentrus; f) Mammillaria crinita (M. zeilmanniana); g) Echinocereus (Morangaya) pensilis; h) Polaskia chichipe; i) Isolatocereus dumortieri (Stenocereus dumortierii); j) M. jaliscana; k) Browningia candelaris; l) Selenicereus validus; m) Frailea asterioides; n) Matucana madisoniorum; o) Hylocereus undatus; p) Coryphantha radians; q) Myrtillocactus schenckii; r) C. macromeris; s) Mammillaria solisioides; t) Echinofossulocactus sp.; u) Myrtillocactus geometrizans.

Generar raíces transformadas en especies de cactáceas de los géneros: Browningia, Carnegiea, Cephalocereus, Coryphantha, Echinocereus, Echinofossulocactus, Equinomastus, Epicatus, Frailea, Hylocereus, Isolatocereus, Mammilaria, Mammilloydia, Melocactus, Myrtillocactus, Pachycereus, Pelecyphora, Peniocereus, Polaskia, Selenicereus y Thelocactus. En aquellas especies en las que haya sido posible generar raíces transformadas, analizar el crecimiento de las mismas.

Figura 4. Se muestran raíces adventicias con numerosos pelos radicales durante su cultivo. Imágenes: A) Selenicereus validus; B) Mammillaria oteroi; C) Coryphantha macromeris; D y E) M. bocasana var bocasana; F) Hylocereus undatus; G) Polaskia chichipe.

METODOLOGÍA Primeramente, la cepa Agrobacterium rhizogenes A4, tipo agropina que contiene el plásmido silvestre RiA4 y al vector binario pESC4 con los genes nptII y gus, se cultivo en medio YM líquido y sólido, con 50mg/L de Rinfampicina y Kanamicina, para utilizarlo en la inducción de raíces. Inducción de raíces transformadas Se indujo la transformación de 59 especies de cactáceas, cultivadas in vitro, pertenecientes a los géneros antes mencionados. Cocultivo: se cortaron 40 explantes transversales por cada especie de cactácea, estos se fueron colocando en 45 ml de medio líquido con 45 µl de antioxidantes (100 mg/L de ácido cítrico y 100 mg/L de ácido ascórbico). Después se transfirieron a 45 ml de medio líquido con 5 ml de bacteria y 25 µl de acetosiringona 200mM, y se incubaron durante 30 minutos. Posteriormente, se transfirieron a cajas de Petri con medio MS semisólido y se incubaron a 25°C en la oscuridad por 72 hrs. Medio de selección: los explantes se transfieren al medio de cocultivo (45ml MS líquido con 500mg/L de Claforán) y se incubaron por 30 minutos. Se transfirieron los explantes a cajas de Petri con medio de selección (MS sólido con 50mg/L de Kanamicina y 25mg/L de Claforán). Por último, se incubaron los explantes a 25°C en la oscuridad hasta la obtención de raíces. Análisis de raíces generadas Se midieron y contaron las raíces cada 15 días durante 2 meses (Figura 1).

Figura 6. Se observan tres explantes de diferentes especies con un gran número de raíces adventicias después de 60 días que presentaron raíces. Imágenes: A y B) Melocactus curvispinus var curvispinus (M. oaxacensis); C y D) Mammillaria bocasana var bocasana; E) Coryphantha macromeris. Figura 5. Se observan explantes de diferentes especies con un crecimiento después de 15 días que generaron raíces. Imágenes: A y B) Mammillaria perezdelarosae; C y D) M. hutchisoniana subsp. louisae; E y F) Echinocereus knippelianus (E. knippelianus var kruegeri); G y H) M. oteroi; I, J, K, L) E. schmollii por ambos lados.

Se realizaron curvas de crecimiento para representar su crecimiento con el método convencional (Figura 7) donde se tomó en cuenta el tiempo en días; a los 0, 15, 30, 45 y 60 días, contra la longitud que alcanzaron en centímetros más su error estándar. Coryphantha macromeris Longitud (cm)

0.6

Figura 1. Crecimiento de raíces. Se muestra la manera en que se midieron las raíces por dos meses cada 15 días marcando las raíces con plumones.

Figura 7. Muestra la curva de crecimiento de las raíces generadas por la especie Coryphantha macromeris durante 60 días de cultivo. Media ± EE. N = 224.

0.4 0.3 0.2 0.1 0 0

Finalmente se llevo a cabo la prueba histoquímica del gen GUS en las raíces como lo describe Stomp (1992).

15

30

45

60

Tiempo (días)

El análisis preliminar que se les realizó a ocho especies que generaron raíces mostró una coloración azul en las raíces y los explantes de seis especies, lo que indica que son positivos a la prueba histoquímica del gen gus.

RESULTADOS De las 59 especies que se les indujo la transformación, el 85% de estas generaron raíces como se representa en la Figura 2.

15% Especies que generaron raíces

85%

0.5

Especies que no generaron raíces

Figura 20. Raíces presuntamente transformadas. Se presentan las raíces y explantes que fueron positivos al gen gus. Imágenes: A) raíz de Isolatocereus dumortieri (Stenocereus dumortierii); B y C) raíces de Cephalocereus senilis; D y E) raíz y explante respectivamente de Melocactus curvispinus var curvispinus (M. oaxacensis); F) raíz y explante de Coryphantha macromeris; G y H) raíces de Hylocereus undatus; I) raíz de Mammillaria theresae.

Figura 2. La presente gráfica indica qué especies si generaron raíces y cuáles no, donde se observa que el 85% de las especies lograron generar al menos una raíz.

A continuación en el Cuadro 1 se presentan los resultados que se han obtenido hasta el momento de las especies a las que se les indujo la transformación con A. rhizogenes A4 que han mostrado mejores resultados. No. Total % No. de raíces explantes de Explantes por explante con raíz raíces con raíz (media ± DE) Browningia candelaris** 40 14 81 35 5.79 ± 4.53 Coryphantha clavata 40 10 158 25 15.8 ± 12.56 Coryphantha macromeris 40 16 235 40 14.69 ± 11.49 Echinocereus knippelianus (E. knippelianus var kruegeri) 40 13 81 32.5 6.23 ± 5.97 Hylocereus undatus 40 18 108 45 6 ± 3.69 Mammillaria carmenae 40 6 55 15 9.17 ± 8.50 Mammillaria bocasana var bocasana 40 5 72 12.5 14.4 ± 18.76 Mammillaria sphacelata var sphacelata 40 16 177 40 11.06 ± 7.11 Mammillaria theresae 40 13 93 32.5 7.15 ± 4.34 Melocactus curvispinus var curvispinus (M. oaxacensis)* 40 11 119 27.5 10.82 ± 14.96 Thelocactus hexaedrophorus var hexaedrophorus* 40 17 133 42.5 7.82 ± 9.58 * Especies que presentaron un explante con raíces que no se pudieron medir por tener una gran cantidad o estar sobrepuestas, los cuales no se toman en cuenta en las tres últimas columnas. ** Especies sudamericanas.

Especies

N

Cuadro 1. Respuesta de 10 especies de cactus mexicanas y 1 especie sudamericana a la infección con A. rhizogenes A4. Todos los parámetros se midieron durante 60 días cada 15 días. El número de raíces por explante presenta la media ± la desviación estándar (DE).

CONCLUSIONES Se concluye que el 85% de las especies tratadas con A. rhizogenes A4 generaron raíces; donde el 95%de los géneros que se infectaron presentaron raíces; solamente el género Epicatus tuvo resultado negativo. Las tres especies sudamericanas que se probaron generaron raíces. La especie que presento una mayor cantidad de raíces por explante fue Coryphantha clavata y el mayor numero de explantes lo exhibió la especie Mammillaria hutchisoniana subsp. louisae Asimismo muchas de las raíces generadas presentaban numerosas ramificaciones y pelos radicales lo cual es una característica de las raíces transformadas. Las curvas de crecimiento indican que el mayor crecimiento se da dentro de los primeros 30 días. En lo que respecta a la prueba GUS, seis especies, de ocho que se analizaron hasta el momento, presentaron una coloración azul en las raíces, revelando que son positivos a la prueba, es decir contienen el gen gus.


Raíces Transformadas de Cactáceas