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SECCIÓN

Capítulo 39: El código genético

16

Síntesis de proteínas y tecnología del DNA recombinante

E Capítulo 40: El mecanismo de la síntesis de proteínas

Capítulo 41: Tecnología del DNA recombinante

n las secciones 14 y 15 vimos cómo se replica y se transcribe la información genética. Completaremos nuestro estudio del dogma central investigando la última etapa: la síntesis de proteínas, o traducción. La síntesis de proteínas se denomina traducción porque es el proceso bioquímico que traduce la información contenida en los ácidos nucleicos en la información contenida en una secuencia de aminoácidos. La piedra Rosetta del proceso de traducción es el código genético, un código que establece una correspondencia entre una secuencia de tres bases de nucleótidos, denominada codón, y un aminoácido determinado. La traducción es un paso decisivo del dogma central, ya que las proteínas desempeñan prácticamente todas las funciones bioquímicas, incluyendo la síntesis del DNA y del RNA. Como corresponde a su papel de enlace entre el lenguaje de los ácidos nucleicos y el lenguaje de las proteínas, el proceso de síntesis de proteínas depende por completo tanto de los ácidos nucleicos como de factores proteicos. La síntesis de proteínas tiene lugar en los ribosomas —enormes complejos que están formados por tres moléculas grandes de RNA y más de 50 proteínas. Curiosamente, el ribosoma es una ribozima; es decir, los RNA que componen el ribosoma son los que desempeñan las funciones más importantes. Las moléculas de RNA de transferencia, el RNA mensajero y muchas proteínas intervienen, junto a los ribosomas, en la síntesis de proteínas. La primera conexión entre los aminoácidos y los ácidos nucleicos la llevan a cabo unas enzimas denominadas aminoacil-tRNA sintetasas. Al enlazar de manera específica un aminoácido concreto a cada tRNA, estas enzimas son los verdaderos traductores del código genético.

673


Comenzaremos nuestro estudio de la traducción investigando, en primer lugar, el código que enlaza el alfabeto de los ácidos nucleicos con el alfabeto de los aminoácidos. A continuación, estudiaremos algunos de los principales protagonistas del proceso de traducción. Completaremos nuestro estudio de la traducción aprendiendo cómo cooperan todos los componentes para orquestar la síntesis de proteínas de forma precisa y controlada. En el último capítulo de esta sección, y del propio libro, completaremos nuestro estudio de las técnicas bioquímicas, una tarea que ya comenzamos en el Capítulo 5, analizando la tecnología del DNA recombinante. A pesar de que solo hay dos capítulos dedicados a las herramientas de la bioquímica, todo lo que hemos aprendido, y todo lo que los futuros estudiantes de bioquímica van a aprender, se ha conseguido gracias al uso creativo de técnicas como las estudiadas en el Capítulo 5 y las que se van a estudiar en el Capítulo 41.

✓✓ Al final de esta sección, usted debería ser capaz de: ✓✓ 1  Describir el código genético. ✓✓ 2  Identificar el paso de la síntesis de proteínas en el que se lleva a cabo la traducción. ✓✓ 3  Enumerar los componentes clave de la maquinaria de la síntesis de proteínas. ✓✓ 4  Describir las funciones del RNA y de las proteínas en la síntesis de proteínas. ✓✓ 5  Explicar el papel del ribosoma en la síntesis de proteínas. ✓✓ 6  Comparar y contrastar la síntesis de proteínas bacteriana y la eucariótica. ✓✓ 7  Explicar cómo se regula la síntesis de proteínas. ✓✓ 8  Enumerar las herramientas clave de la tecnología del DNA recombinante y explicar cómo se utilizan para clonar el DNA.

674


C a p í tul o

39

El código genético

39.1 El código genético conecta la información de los ácidos nucleicos con la de las proteínas

39.2 Los aminoácidos se activan uniéndose al RNA de transferencia

39.3 Un ribosoma es una partícula de ribonucleoproteína que consta de dos subunidades

La piedra Rosetta tiene grabado un decreto promulgado durante la dinastía ptolemaica, que gobernó Egipto entre los años 305 AC y 30 AC. El texto contiene tres traducciones del mismo pasaje —una en griego y dos en egipcio (jeroglíficos y escritura demótica)— y permitió a los investigadores descifrar los jeroglíficos. El código genético, descifrado por los bioquímicos, permite traducir la información de los ácidos nucleicos en la secuencia de una proteína. [Getty Images/The Bridgeman Art Library.]

M

ucha gente se pasa horas haciendo pesas con el fin de esculpir sus cuerpos. El entrenamiento intensivo con pesas puede duplicar o triplicar el tamaño de un músculo. Estas personas están alterando su comportamiento para cambiar la bioquímica de sus músculos; están estimulando la síntesis de proteínas musculares. La síntesis de proteínas se denomina traducción porque el alfabeto de cuatro letras de los ácidos nucleicos se traduce en el alfabeto completamente distinto, de 20 letras, de las proteínas. Comenzaremos nuestro estudio de la síntesis de proteínas analizando el código que conecta estos dos alfabetos y la maquinaria que se necesita para interpretar el código.

675


676  39  El código genético ✓✓1  Describir el código genético.

39.1 El código genético conecta la información de los ácidos nucleicos con la de las proteínas Para poder traducir cualquier cosa, tiene que haber un diccionario —una piedra Rosetta— que relacione los dos lenguajes. El código genético es la conexión que relaciona la secuencia de bases del DNA (o de sus transcritos de RNA) con la secuencia de aminoácidos de las proteínas. ¿Cuáles son las características de este código? 1. Tres nucleótidos codifican un aminoácido. Las proteínas se construyen a partir de un conjunto básico de 20 aminoácidos, pero en los ácidos nucleicos solo hay cuatro bases. Un simple cálculo demuestra que se necesita un mínimo de tres bases para codificar, por lo menos, 20 aminoácidos. Experimentos genéticos han demostrado que, de hecho, un aminoácido está codificado por un grupo de tres bases, denominado codón. 2. El código no se solapa. Consideremos una secuencia de bases ABCDEF. En un código que se solape, ABC especificaría el primer aminoácido, BCD el segundo, CDE el tercero, y así sucesivamente. En un código que no se solapa, ABC designa el primer aminoácido, DEF el segundo, y así sucesivamente. De nuevo, experimentos genéticos han demostrado que el código que no se solapa. 3. El código carece de signos de puntuación. En principio, una base (a la que designamos Q) podría funcionar como una “coma” entre codones.

. . . QABCQDEFQGHIQJKLQ . . . Sin embargo, no es este el caso, ya que la secuencia de bases se lee de forma secuencial desde un punto de partida fijo y sin signos de puntuación. 4. El código genético tiene direccionalidad. El código se lee desde el extremo 5 del RNA mensajero hacia su extremo 3. 5. El código genético está degenerado. En el contexto del código genético, degeneración significa que algunos aminoácidos están codificados por más de un codón, puesto que hay 64 posibles tripletes de bases y solo 20 aminoácidos. De hecho, 61 de los 64 posibles tripletes especifican aminoácidos concretos y tres tripletes (los denominados codones Stop) designan la terminación de la traducción. Por tanto, para la mayoría de los aminoácidos hay más de un codón. Los codones que especifican el mismo aminoácido son sinónimos. Por ejemplo, CAU y CAC son sinónimos para la histidina. Se han descifrado los 64 codones (Tabla 39.1). Tan solo el triptófano y la metionina están codificados por un solo triplete. Los otros 18 aminoácidos están codificados por dos o más. De hecho, leucina, arginina y lisina están codificados por seis codones cada uno. ¿Cuál es el significado biológico de la intensa degeneración del código genético? Si el código no estuviese degenerado, 20 codones designarían a los aminoácidos y 44 codones darían lugar a la terminación de la cadena. Por lo tanto, la probabilidad de que una mutación diese lugar a la terminación de la cadena sería mucho mayor en el caso de un código no degenerado. Normalmente, las mutaciones que dan lugar a la terminación de la cadena generan proteínas inactivas. La degeneración permite que haya mutaciones que no cambian el aminoácido codificado, como cuando un codón muta a un sinónimo, o que las mutaciones generen el codón para otro aminoácido. Este último tipo de mutaciones se denominan sustituciones, muchas de las cuales son inofensivas. Por tanto, la degeneración minimiza los efectos perjudiciales de las mutaciones.

El código genético es, prácticamente, universal La mayoría de los organismos utilizan el mismo código genético. Esta universalidad explica el hecho de que las proteínas humanas, como la insulina, se pueda sintetizar en la bacteria E. coli y ser utilizada posteriormente para el tratamiento de la diabetes. Sin embargo, los estudios de secuenciación de genomas han demostrado que no todos los genomas se traducen mediante el mismo código. Por ejemplo, los protozoos


39.1  El código genético 677

Tabla 39.1 El código genético Primera posición (Extremo 59)

U

C

A

G

Segunda posición U

C

A

G

Tercera posición (Extremo 39)

Phe

Ser

Tyr

Cys

U

Phe

Ser

Tyr

Cys

C

Leu

Ser

Stop

Stop

A

Leu

Ser

Stop

Trp

G

Leu

Pro

His

Arg

U

Leu

Pro

His

Arg

C

Leu

Pro

Gln

Arg

A

Leu

Pro

Gln

Arg

G

Ile

Thr

Asn

Ser

U

Ile

Thr

Asn

Ser

C

Ile

Thr

Lys

Arg

A

Met

Thr

Lys

Arg

G

Val

Ala

Asp

Gly

U

Val

Ala

Asp

Gly

C

Val

Ala

Glu

Gly

A

Val

Ala

Glu

Gly

G

Nota: esta tabla identifica el aminoácido codificado por cada triplete. Por ejemplo, el codón 59-AUG-39 del mRNA especifica la metionina, mientras que CAU especifica la histidina. Los codones UAA, UAG y UGA son señales de terminación. Además de codificar los residuos internos de metionina, AUG forma parte de la señal de iniciación.

ciliados se diferencian de los demás organismos porque, en ellos, los codones UAA y UGA no son señales de terminación sino que codifican aminoácidos; la única señal de terminación que tienen es UGA. Las primeras variantes del código genético se descubrieron en las mitocondrias de una serie de especies, seres humanos incluidos (Tabla 39.2). El código genético de las mitocondrias puede ser distinto de el del resto de la célula porque el DNA mitocondrial codifica un conjunto distinto de moléculas de RNA de transferencia, moléculas adaptadoras que reconocen los codones alternativos. Por tanto, el código genético no es del todo universal, pero casi.

Tabla 39.2 Codones característicos de las mitocondrias humanas Codón

Código estándar

Código mitocondrial

UGA

Stop

Trp

UGG

Trp

Trp

AUA

Ile

Met

AUG

Met

Met

AGA

Arg

Stop

AGG

Arg

Stop

Las moléculas de RNA de transferencia tienen un diseño común La fidelidad de la síntesis de proteínas requiere el reconocimiento exacto de los codones de tres bases en el RNA mensajero. Un aminoácido, por sí solo, no presenta la suficiente complejidad estructural como para reconocer un codón. En consecuencia, se necesita algún tipo de adaptador. El RNA de transferencia (tRNA) actúa como molécula adaptadora entre el codón y el aminoácido que especifica. El tRNA funciona como adaptador uniéndose a un codón específico y llevando consigo un aminoácido para que sea incorporado a la cadena polipeptídica. Hay por lo menos una molécula de tRNA para cada aminoácido. Estas moléculas tienen muchas características estructurales en común, como cabría esperar, ya que todas las moléculas de tRNA tienen que ser capaces de interaccionar casi de igual forma con los ribosomas, con los mRNA y con los factores proteicos que intervienen en la traducción. Todas las moléculas de RNA de transferencia conocidas presentan las siguientes características: 1. Cada una de ellas es una única hebra que contiene entre 73 y 93 ribonucleótidos (~25 kDa). 2. La estructura tridimensional de la molécula tiene forma de L (Figura 39.1). 3. Contienen muchas bases atípicas, normalmente entre 7 y 15 por cada tRNA. Algunas son derivados metilados o dimetilados de A, U, C o G. La metilación evita


678  39  El código genético

Extremo CCA

Figura 39.1  Estructura del RNA de transferencia. Observe la estructura en forma de L de este modelo esquemático del fenilalanil-tRNA de levadura. La región CCA se encuentra al final de uno de los brazos y el bucle anticodón está situado al final del otro. [Elaborada a partir de 1EHZ.

Bucle anticodón

pdb.]

la formación de determinados pares de bases, consiguiendo así que algunas de las bases estén accesibles y puedan establecer interacciones con otros componentes de la maquinaria de traducción. Además, la metilación confiere cierto carácter hidrofóbico a algunas regiones de los tRNA, lo que puede ser importante a la hora de interaccionar con las proteínas necesarias para la síntesis de proteínas. Bases modificadas, como la inosina, también forman parte del tRNA. En el tRNA, las inosinas se forman mediante la desaminación de la adenosina, que se produce después de haberse sintetizado el transcrito primario.

O N

HN

N

N

ribosa Inosina

NH2 CH3

N O

O

N

H

ribosa 5-Metilcitidina (mC)

HN O

N

H H H H

4. Cuando se dibujan en dos dimensiones, todas las moléculas de tRNA se pueden representar mediante un patrón en forma de hoja de trébol, en el que aproximadamente la mitad de los nucleótidos del tRNA están formando dobles hélices con bases emparejadas (Figura 39.2). Hay cinco grupos de bases que no están formando pares de bases: en el extremo 3, la región CCA terminal, que

ribosa Dihidrouridina (UH2)

3′

OH A C C Extremo 5′ fosforilado

Lugar donde se une el aminoácido

Tallo aceptor

5′ p

Bucle TψC

Bucle DHU

U

A UH2

G

C G

C T ψ

G "Brazo extra" (variable)

Figura 39.2  Estructura general de las moléculas de RNA de transferencia. Se representa la estructura de la molécula de tRNA según el modelo de hoja de trébol. Al comparar las secuencias de bases de muchos tRNA se pone de manifiesto una serie de características conservadas.

U

Bucle anticodón


39.1  El código genético 679

forma parte de una zona denominada tallo aceptor; el bucle TC, que debe su nombre a la secuencia ribotimina-pseudouracilo-citosina; el “brazo extra”, que contiene un número variable de residuos; el bucle DHU, que contiene varios residuos de dihidrouracilo y el bucle anticodón. La diversidad estructural generada por esta combinación de hélices y bucles que contienen bases modificadas garantiza que cada tRNA se pueda distinguir de manera inequívoca de los demás, a pesar de que su estructura global sea similar 5. El extremo 5 de un tRNA está fosforilado. Normalmente, el residuo del extremo 5 es pG. 6. El aminoácido activado se une a un grupo hidroxilo del residuo de adenosina situado al final de la secuencia CCA del extremo 3, que forma parte del tallo aceptor. Esta región es una única hebra flexible situada en el extremo 3 de los tRNA maduros. 7. El anticodón está ubicado en un bucle próximo al centro de la secuencia.

Algunas moléculas de RNA de transferencia reconocen más de un codón debido al balanceo de las bases emparejadas ¿Qué reglas dirigen el reconocimiento de un codón por parte del anticodón de un tRNA? Una sencilla hipótesis afirma que cada una de las bases del codón forma un par de bases de tipo Watson-Crick con una base complementaria del anticodón. Entonces, el codón y el anticodón se encontrarían alineados de forma antiparalela. Recordemos que, por convención, las secuencias de nucleótidos se escriben en el sentido 5 → 3, a menos que se especifique lo contrario. Por tanto, el anticodón de AUG se escribe CAU, pero el emparejamiento real con el codón sería Anticodón 3

5

U

A

C

A

U

G

5

3

Codón

Según este modelo, cada anticodón particular solo puede reconocer un codón. Sin embargo, las cosas no son tan sencillas. Algunas moléculas de tRNA pueden reconocer más de un codón. Por ejemplo, consideremos el alanil-tRNA de levadura, con el anticodón IGC, donde I representa al nucleósido inosina. Este anticodón se une a tres codones: GCU, GCC y GCA. Las primeras dos bases de estos codones son las mismas, mientras que la tercera es diferente. Tabla 39.3 Emparejamientos permitidos en la tercera base del ¿Podría ser que, a veces, el reconocimiento de la tercera base de un codón, según la hipótesis del balanceo codón fuese menos exigente que el reconocimiento de las otras Primera base del anticodón Tercera base del codón dos? El patrón de degeneración del código genético indica que ese C G podría ser el caso. Miremos de nuevo la Tabla 39.1. En términos A U generales, XYU y XYC siempre codifican el mismo aminoácido; XYA y XYG casi siempre. Esta mayor libertad de apareamiento de U AoG la tercera posición se denomina balanceo. Asumiendo cierta liberG UoC tad estérica (balanceo) en el emparejamiento de la tercera base del I U, C o A codón, los anticodones del tRNA se pueden unir a los codones del mRNA de la forma reflejada en la Tabla 39.3. Se pueden establecer dos generalizaciones relacionadas con la interacción codón-anticodón: 1. Las primeras dos bases de un codón se emparejan de forma estándar. El reconocimiento es exacto. Por tanto, los codones que se diferencian en cualquiera de las dos primeras bases tienen que ser reconocidos por distintos tRNA. Por ejemplo, tanto UUA como CUA codifican la leucina, pero son leídos por distintos tRNA. 2. La primera base de un anticodón determina si una molécula de tRNA concreta es capaz de leer uno, dos o tres tipos de codones: C o A (un codón), U o G (dos codones) o I (tres codones). Por tanto, parte de la degeneración del código genético


680  39  El código genético surge de la imprecisión (balanceo) en el emparejamiento de la tercera base del codón con la primera base del anticodón. Vemos aquí una razón de peso para la frecuente aparición de la inosina, uno de los nucleótidos atípicos, en los anticodones. La inosina maximiza el número de codones que pueden ser leídos por una determinada molécula de tRNA.

La síntesis de proteínas grandes requiere que la frecuencia de los errores sea baja El proceso de la transcripción es análogo a copiar, palabra por palabra, una página de un libro. No hay cambios en el alfabeto o en el vocabulario; por tanto, la probabilidad de que se altere el significado es pequeña. La traducción de la secuencia de bases de una molécula de mRNA en una secuencia de aminoácidos es similar a traducir la página de un libro a otro idioma. La traducción es un proceso complejo, que implica muchos pasos y docenas de moléculas. En cada paso existe la posibilidad de cometer un error. La complejidad de la traducción crea un conflicto entre dos requisitos: el proceso no solo tiene que ser preciso sino también lo suficientemente rápido como para satisfacer las necesidades de una célula. ¿Cómo de rápido es “lo suficientemente rápido”? En E. coli, la traducción se lleva a cabo a una velocidad de 40 aminoácidos por segundo, una velocidad verdaderamente impresionante teniendo en cuenta la complejidad del proceso. ¿Cómo de precisa ha de tiene que ser la síntesis de proteínas? La longitud media de una proteína de E. coli es de 300 aminoácidos, y hay algunas docenas de proteínas con más de 1.000 aminoácidos. Consideremos posibles tasas de error a la hora de sintetizar proteínas de este tamaño. Tal y como muestra la Tabla 39.4, una frecuencia de error de 1022 (un aminoácido incorrecto por cada 100 incorporados correctamente a una proteína) sería intolerable, incluso para proteínas pequeñas. Normalmente, una tasa de error de 1023 daría lugar a la síntesis sin errores de proteínas de 300 residuos (~33 kDa) pero no de proteínas de 1.000 residuos (~110 kDa). Por tanto, para producir de manera eficiente las proteínas de mayor tamaño, la frecuencia de los errores no debe superar Table 39.4 Precisión de la síntesis de proteínas un valor aproximado de 1024. Se pueden concebir Probabilidad de sintetizar una proteína sin errores frecuencias de error más reducidas; sin embargo, Número de residuos de aminoácido salvo en el caso de las proteínas más grandes, no incrementarían de forma espectacular el porcentaje de Frecuencia de la inserción proteínas que se sintetizan con la secuencia exacta. de un aminoácido 100 300 1.000 Además, es probable que estas bajas tasas de error incorrecto solo se puedan conseguir a costa de una disminución -2 10 0,366 0,049 0,000 de la velocidad de la síntesis de proteínas, ya que se 10-3 0,905 0,741 0,368 necesitaría más tiempo para corregir los errores. De 10-4 0,990 0,970 0,905 hecho, las tasas de error observadas se acercan a 1024. -5 En el transcurso de la evolución, se seleccionó una 10 0,999 0,997 0,990 frecuencia de error en torno a 1024 por residuo de Nota: la probabilidad p de formar una proteína sin errores depende de n, el número de aminoácido para poder sintetizar de manera preciaminoácidos y de e, la frecuencia de la inserción de un aminoácido incorrecto; p 5 (1-e)n. sa proteínas formadas por hasta 1.000 aminoácidos, manteniendo al mismo tiempo una rápida velocidad de síntesis de proteínas.

✓✓2  Identificar el paso de la síntesis de proteínas en el que se lleva a cabo la traducción.

39.2 Los aminoácidos se activan uniéndose

al RNA de transferencia

Los aminoácidos necesarios para la síntesis de proteínas primero se tienen que unir a moléculas de tRNA específicas. Esta reacción es decisiva, ya que empareja un aminoácido con el tRNA que contiene el anticodón apropiado. Básicamente, la unión de un aminoácido a un tRNA concreto es el paso de traducción de la síntesis de proteínas.


39.2  Aminoacil-tRNA sintetasas 681

Estas moléculas de tRNA unidas a aminoácidos son los verdaderos sustratos para la síntesis de proteínas. Cuando un aminoácido se ha unido a un tRNA, se podrá incorporar a una cadena polipeptídica naciente en la posición dictada por el anticodón del tRNA. Sin embargo, la formación de un enlace peptídico entre aminoácidos libres no es favorable desde el punto de vista termodinámico y, por tanto, hay que aportar energía para hacer que esta reacción sea exergónica. Para que se lleve a cabo la síntesis de proteínas primero hay que activar el aminoácido. En la síntesis de proteínas, los intermediarios activados son aminoácidos unidos mediante un enlace éster al grupo hidroxilo en posición 2 o 3 de la unidad de ribosa del extremo 3 del tRNA. Un éster formado entre un aminoácido y un tRNA se denomina un aminoacil-tRNA o, a veces, un tRNA cargado (Figura 39.3). Para cada aminoácido hay, normalmente, una enzima activadora y, por lo menos, un tipo de tRNA.

O C R

O

R’

Éster

Aminoacil-tRNA

NH3

Los aminoácidos se activan primero mediante adenilación La activación de los aminoácidos está catalizada por aminoacil-tRNA sintetasas específicas. El primer paso consiste en la formación de un aminoacil-adenilato a partir de un aminoácido y ATP. En esta molécula, el grupo carboxilo del aminoácido se encuentra unido al grupo fosforilo del AMP; por tanto, también se le denomina aminoacil-AMP.

O

+H

3N

R H

O

– P

O O

adenina

O

HO

OH

O

H2C O  O

OH O  O

3

Adenina

O P OH

O

O

H2C

Aminoacil-adenilato

El siguiente paso consiste en la transferencia del grupo aminoacilo del aminoacil-AMP a una molécula de tRNA concreta para formar un aminoacil-tRNA.

O O

Aminoácido 1 ATP N aminoacil-AMP 1 PPi O

Aminoácido

R H

Citosina

Brazo CCA del tRNA

O P OH

O

Aminoacil-AMP 1 tRNA N aminoacil- tRNA 1 AMP La suma de los pasos de activación y de transferencia es

Aminoácido 1 ATP 1 tRNA N aminoacil- tRNA 1 AMP1 PPi El DG° de esta reacción está cercano a cero porque la energía libre de la hidrólisis del enlace éster del aminoacil- tRNA es parecido al de la hidrólisis del ATP a AMP y PPi. Como ya hemos visto en muchas ocasiones, la reacción está impulsada por la hidrólisis del pirofosfato. La suma de estas tres reacciones es muy exergónica:

Aminoácido 1 ATP 1 tRNA 1 H2O N aminoacil- tRNA 1 AMP1 2 Pi Por tanto, durante la síntesis de cada aminoacil-tRNA se consume el equivalente a dos moléculas de ATP. Para un aminoácido concreto, los pasos de activación y de transferencia están catalizados por la misma aminoacil-tRNA sintetasa. De hecho, el intermediario aminoacil-AMP no se disocia de la sintetasa, sino que se encuentra fuertemente unido al centro activo de la enzima mediante interacciones no covalentes. La traducción se lleva a cabo mediante la formación de un enlace éster entre un aminoácido y un tRNA específico. Por lo tanto, las aminoacil-tRNA sintetasas son los verdaderos traductores del código genético.

O

H2C

Citosina

O tRNA

5

Figura 39.3  Aminoacil-tRNA. Los aminoácidos se acoplan a los tRNA por medio de enlaces éster con el grupo hidroxilo en posición 29 o 39 del residuo de adenosina del extremo 39. Se muestra un enlace con el grupo hidroxilo en posición 39


682  39  El código genético

Las aminoacil-tRNA sintetasas poseen lugares para la activación de los aminoácidos con gran capacidad discriminatoria

CH3 H O H C H C +H N COO– 3 Treonina

H3C CH

H +H N 3

C

CH3

COO–

Valina

O H CH2 H C +H N COO– 3 Serina

Thr

Treonina Ion zinc

Ala

His Asp His

Cys

Figura 39.4  Centro activo de la treonil-tRNA sintetasa. Observe que el lugar para la unión del aminoácido incluye un ion zinc (bola de color verde) que está coordinado con la treonina por medio de sus grupos amino e hidroxilo. Centro para la corrección de errores

Centro de activación

Figura 39.5  Corrección de errores en el aminoacil-tRNA. El brazo CCA de un aminoacil-tRNA es flexible y puede desplazar el aminoácido desde el centro de activación al centro para la corrección de errores. Si el aminoácido encaja bien en el centro para la corrección de errores, se escinde el aminoácido mediante hidrólisis.

Para que la síntesis de proteínas sea precisa, el aminoácido correcto se tiene que unir al tRNA correcto. Cada aminoacil-tRNA sintetasa es muy específica para un aminoácido concreto. De hecho, una sintetasa solo incorporará un aminoácido incorrecto en una de cada 104 ó 105 reacciones catalíticas. ¿Cómo se consigue este nivel de especificidad? Cada aminoacil-tRNA sintetasa se aprovecha de las propiedades del aminoácido que utiliza como sustrato. Consideremos, por ejemplo, el reto al que se enfrenta la treonil-tRNA sintetasa. La treonina se parece a otros dos aminoácidos —concretamente, a la valina y a la serina. La forma de la valina es casi exactamente igual a la de la treonina, salvo por la presencia de un grupo metilo en lugar de un grupo hidroxilo. Al igual que la treonina, la serina posee un grupo hidroxilo, pero carece del grupo metilo. ¿Cómo puede la treonil-tRNA sintetasa evitar el acoplamiento de estos aminoácidos incorrectos al treonil-tRNA (en forma abreviada, tRNAThr)? La estructura del lugar de unión al aminoácido de la treonil-tRNA sintetasa pone de manifiesto cómo se evita el acoplamiento con la valina (Figura 39.4). El centro activo de la enzima contiene un ion zinc. La treonina se une al ion zinc por medio de su grupo amino y del grupo hidroxilo de su cadena lateral. El grupo hidroxilo de la cadena lateral también es reconocido por un residuo de aspartato que se une a él mediante un puente de hidrógeno. El grupo metilo presente en la valina en el lugar de este grupo hidroxilo no puede participar en estas interacciones; no se unirá al centro activo y, por tanto, no se adenilará y no será transferido al treonil-tRNA. El lugar del zinc no está tan bien capacitado para discriminar contra la serina, ya que este aminoácido posee un grupo hidroxilo que se puede unir al zinc. De hecho, cuando solo se dispone de este mecanismo, la treonil-tRNA sintetasa acopla erróneamente la serina al treonil-tRNA a una velocidad que es entre 1022 y 1023 veces la de la treonina. Como ya se ha comentado (p. 680), es probable que esta tasa de error dé lugar a multitud de errores en la traducción. ¿Cómo se evita la formación de Ser-tRNAThr?

La corrección de errores por parte de las aminoacil-tRNA sintetasas aumenta la fidelidad de la síntesis de proteínas Además de su centro activo, la treonil-tRNA sintetasa posee un centro para la corrección de errores situado a 20 Å del centro activo. Este centro acepta la serina unida al tRNAThr e hidroliza el enlace entre la serina y el tRNAThr, proporcionando a la sintetasa una oportunidad para corregir sus errores y mejorar su precisión para que llegue a ser de menos de un error por cada 104. El brazo CCA con la serina unida puede oscilar hacia fuera del centro activo y adentrarse en el centro para la corrección de errores (Figura 39.5). De este modo, el aminoacil-tRNA se puede corregir sin disociarse de la sintetasa. ¿Qué evita la hidrólisis del Thr-tRNAThr ? La discriminación entre la serina y la treonina es relativamente sencilla porque la treonina contiene un grupo metilo extra, y este grupo metilo evita que el Thr-tRNAThr encaje en el centro para la corrección de errores. La mayoría de las aminoacil-tRNA sintetasas contienen centros para corregir errores, además de los centros de acilación. Estas parejas de centros que se complementan entre sí actúan como un doble filtro para garantizar una fidelidad muy elevada. En general, el centro activo rechaza los aminoácidos que sean más grandes que el correcto porque no hay espacio suficiente para ellos, mientras que los centros para la corrección de errores escinden las especies activadas que sean más pequeñas que la correcta.

Las sintetasas reconocen los bucles del anticodón y los tallos aceptores de las moléculas de RNA de transferencia ¿Cómo seleccionan las sintetasas a los tRNA que utilizan como sustrato? Este paso, de enorme importancia, es el punto en el que tiene lugar la “traducción” —en el que se establece la correlación entre el vocabulario de los aminoácidos y el de los ácidos nucleicos. En cierto modo, las aminoacil-tRNA sintetasas son las únicas moléculas de la biología que “se saben” el código genético. El reconocimiento preciso de los tRNA es tan importante para la elevada fidelidad de la síntesis de proteínas como la selección exacta de los aminoácidos.


39.3  El ribosoma 683

A priori, el anticodón del tRNA parecería ser un buen identificador, ya que cada tipo de tRNA tiene uno distinto. De hecho, algunas sintetasas reconocen sus tRNA sustrato, principalmente, en base a sus anticodones, aunque también pueden reconocer otros aspectos de la estructura del tRNA. La evidencia más directa de cómo tiene lugar el reconocimiento procede de estudios cristalográficos de los complejos formados entre las sintetasas y los tRNA que reconocen. La Figura 39.6 muestra los aspectos de la molécula de tRNA que son reconocidos por las aminoacil-tRNA sintetasas. Hay que destacar el hecho de que muchos de los lugares de reconocimiento son bucles ricos en bases atípicas que pueden proporcionar identificadores estructurales. 1 Extremo 5’ 63

Bucle TC

4 72

51

Bucle DHU

13

3’ Extremo CCA

69

22 Bucle variable

41

29 36 Bucle 35 anticodón 34

Figura 39.6  Lugares reconocidos en el tRNA. Los círculos representan nucleótidos y el tamaño de los círculos representa la frecuencia con que son utilizados como lugares de reconocimiento por parte de las aminoacil-tRNA sintetasas. Los números indican las posiciones de los nucleótidos en la secuencia de bases, comenzando por el extremo 59 de la molécula de tRNA. [Tomada de M. Ibba y D. Söll, Annu. Rev. Biochem. 69:617–650, 1981, p. 636.]

39.3 Un ribosoma es una partícula de ribonucleoproteína que consta de dos subunidades Ahora nos centraremos en los ribosomas, las máquinas moleculares que coordinan la interacción entre los tRNA cargados, el mRNA y las proteínas para que se lleve a cabo la síntesis de proteínas. Un ribosoma de E. coli es un ensamblaje de ribonucleoproteína con una masa de aproximadamente 2.700 kDa, un diámetro de unos 250 Å, y un coeficiente de sedimentación (p. 76) de 70S. Los 20.000 ribosomas de una célula bacteriana representan casi la cuarta parte de su masa. Un ribosoma se puede descomponer en una subunidad grande (50S) y una subunidad pequeña (30S) (Figura 39.7). Estas subunidades se pueden disociar aún más, con lo que se obtienen los RNA y las proteínas de que se componen. La subunidad pequeña consta de 21 proteínas diferentes (denominadas de S1 a S21) y una molécula de RNA de 16S. La subunidad grande contiene 34 proteínas diferentes (denominadas de L1 a L34) y dos moléculas de RNA, una de 23S y otra de 5S.

Los RNA ribosómicos desempeñan un papel central en la síntesis de proteínas El prefijo ribo del término ribosoma es apropiado, ya que el RNA representa casi las dos terceras partes de la masa de estos grandes ensamblajes moleculares. Los tres RNA presentes —el de 5S, el de 16 y el de 23S— son decisivos para la arquitectura y

?

PREGUNTA RÁPIDA 1  ¿Por qué la

síntesis de los aminoacil-tRNA es el paso decisivo en la síntesis de proteínas?


684  39  El código genético

Subunidad de 50S

Ribosoma de 70S

Subunidad de 30S

Figura 39.7  El ribosoma, a alta resolución. Modelos detallados del ribosoma basados en los resultados de estudios cristalográficos del ribosoma de 70S y de las subunidades de 30S y de 50S. (Izquierda) Vista de la región de la subunidad de 50S que interacciona con la subunidad de 30S; (centro) vista lateral del ribosoma de 70S; (derecha) vista de la región de la subunidad de 30S que interacciona con la subunidad de 50S. El RNA de 23S se muestra de color amarillo, el RNA de 5S de color naranja, el RNA de 16S de color verde, las proteínas de la subunidad de 50S de color rojo y las proteínas de la subunidad de 30S de color azul. Observe que la interfaz entre las subunidades de 50S y de 30S está formada, exclusivamente, por RNA. [Elaborada a partir de 1GIX.pdb y 1GIY.pdb.]

función de los ribosomas. Estos RNA ribosómicos (rRNA) se pliegan adoptando estructuras complejas con muchas regiones cortas de doble hélice (Figura 39.8). Durante muchos años, se creía que las proteínas que formaban parte de los ribosomas eran las que orquestaban la síntesis de proteínas y que los RNA actuaban principalmente como plataformas estructurales. Pero esta idea planteaba una desconcertante cuestión evolutiva al estilo de la del “huevo o la gallina”: concretamente, ¿cómo se pueden sintetizar proteínas complejas si se necesitan proteínas complejas para la síntesis de proteínas? El descubrimiento del RNA catalítico (p. 668) hizo que los bioquímicos fuesen más receptivos ante la posibilidad de que el RNA desempeñase un papel mucho más activo en la función de los ribosomas. Análisis estructurales más detallados permitieron determinar que los centros catalíticos clave de los ribosomas están formados casi exclusivamente por RNA. El papel de las proteínas es secundario. La casi ineludible conclusión es que en un principio, en las primeras etapas de la evolución de la vida, el ribosoma estaba formado tan solo por RNA y que las proteínas se fueron incorporando más tarde para hacer un ajuste fino de sus propiedades funcionales. Esta conclusión tiene la agradable consecuencia de esquivar la cuestión del huevo y la gallina.

El RNA mensajero se traduce en dirección 5 → 3 La secuencia de aminoácidos de una proteína se traduce a partir de la secuencia de nucleótidos de un mRNA, y la dirección de la traducción es 5 → 3. La dirección de la traducción tiene consecuencias importantes. Recordemos que la transcripción también se produce en la dirección 5 → 3 (p. 630). Si la dirección de la traducción fuese contraria a la de la transcripción, solo se podrían traducir moléculas de mRNA sintetizadas por completo. Por el contrario, como las direcciones son iguales, el mRNA se puede traducir mientras todavía se está sintetizando. En procariotas, casi no se pierde tiempo entre la transcripción y la traducción. El extremo 5 del mRNA interacciona con los ribosomas muy poco después de haberse creado, mucho antes de que se termine de sintetizar el extremo 3 de la molécula de mRNA. Una característica importante de la expresión génica en procariotas es que la traducción y la transcripción están íntimamente acopladas tanto en el tiempo como en el espacio. Muchos ribosomas pueden estar traduciendo una molécula de mRNA de forma simultánea. Esta síntesis en paralelo aumenta notablemente la eficacia de la traducción del mRNA. El grupo de ribosomas que se encuentra unido a una molécula de mRNA se denomina un polirribosoma o un polisoma (Figura 39.9, en la p. 686).


39.3  El ribosoma 685 AA

G U C C 1100 C GC CAA 700 G C AG A C C UA G A A G UG G G ACGAGC C C U U A U C C U U U G U U G C C C G G UC A AUGC A UCUGGAGGA AU G GCG C A A G A G UGCUCG A G G G G U A G G A A A C A A G G G C C GG UGG A C CUU AA G A G CGG UGGCG A G G UC U A U U G U G G A U C G C G A C G U A G C A U GU G C G C G G C G G C A GA C G U U C G U U C AG G C G U U A A A G A G G U A A C 1200 U G U C G C G A G C UC G G C G UC A U A U G A A A U A C G C G AU G C U G C C G C G U A A G 800 A U A G A A A U CG A U G C GU AUGAGAAU A A U G U A C G G GC C G C G C A A G G C U G A C U U U U GA A G GG U U U GA G GA C G G C G U C G UA A C C G AAC U AC G A C UGCAUCUGA CU GGC A AGC A UU A U AA C C U G G G C C 1000 C G C A U UU G C C C G C A UC G G G C C C GUGU A GA CU G A UUGUUUG G GC U A C G UC CC C C A A C G C A AG G UU A G G UA A A G G U A C G G G U UG 600 G A G G C A C C A A U C G CA G U A G U A U C UU C C G G C C G A G G A C G G G C A A A C G G G U U GC G C U C G U C G A C UUG G A U A AU AC C U A A AC C A C C C A G G G A U C G G G U A UA U G G A C U A U C AGCUGAA C C U G A C U G U A G C UG A C G C AG C U U G C C G A C G A G A G G G U C U A A G A C G C G A GC C A A U A A U U A A G C G C U U A C A G U G C G G A A A U G G C U G U C G C A A C C A U CA A U G U G G U G C A C G A G G G A G UA C G G C C G U A A G U U A C G C C C GU A C G U G U U C U A A 900 A G C G A A G G A CUCA UUGGA A G ACAA C U AA G C AAA C G U G A G G A G C A U C U A AG G G C G AC A G G AU U G U CG G GA C CA C G A U U G A C GGG G G C C C G C A C A A G G UA G C G G GC C G GC A G GG UAC U U A 500 C C G C U A CU A U AC A U A A C UGU UCCGGGC G GA G A A U G A U G A C C C A U U U GA 1300 U U U AG G U UAA G GAG C U G C U A C A G C A C A GC A GU A C GGGUU U U C U G A G G C A A 10 C 1400 C A U G G A U G C G UCCGG UA UGU G C A A G A U U G U A G U G C C A A U C A G A A 400 C C G U C A U G U U G C A U A A G G C A U A UG G G G 1500 A C A G G C G C G C GA A G C C C A C A A U A AGC CUG A UGC A G U C U U A G C G G C G 5 G C C C A U G G A C A C G UA GCGGGU A A C G U A UA A CCGUAGG G U U C A A U A AC G C G A G G A U C A U A G A C U GUUGG C GU C C A C G C A G A A G C G GG C A A G U A U G U G CA G U C A U G C A CG C G G A A G C C G C A G A G U C A G C A G U G U C U A U C A C C G C GA AA C C A GG G U GUC A C G GU C A G GA A GA A GC A UC C A A U U G U G U 300 G U U A A G C G G U G C A U C U U U U U C C G A 1542 U G AG GU C A A G G U C G G U G G A GG GA 3 A C G AU C A 100 C G A U GU CA A A U CU GC C A G G A U U G G C GU A G C CG A G A G A A U U C A C A G C C G A C GU U A C A GU U G A U A A U G G G C G U U UA A C G C U G C G G G AU G A C G G C A C U C G U C G C G A U A U G C A G A A U G G A U A C A G U G C AC U G U GC G U C G G G G U G A G C C UC G C A A UG G U C G U A A U C G GA AUA GC A CUA CUGG GGG C CUCUU GGGGG A C A U U CC GGGGAG CGCCA CGAUGGC A AG A A UA A U U 200 A A A A C C GC A U G C A G AC

(A)

U U G G G U U G U A A A

(B)

Figura 39.8  Patrón de plegamiento del RNA ribosómico. (A) Estructura secundaria del RNA ribosómico de 16S deducida a partir de la comparación de secuencias y de los resultados obtenidos mediante estudios químicos. (B) Estructura terciaria del RNA de 16S determinada por cristalografía de rayos X. [(A) Cortesía del Dr. Bryn Weiser y del Dr. Harry Noller; (B) elaborada a partir de 1FJG.pdb.]


Resumen

Figura 39.9  Polisomas. La transcripción de un segmento de DNA de E. coli genera moléculas de mRNA que son traducidas inmediatamente por multitud de ribosomas. [Tomada de O. L. Miller, Jr., B. A. Hamkalo y C. A. Thomas, Jr. Science 169:392–395, 1970.]

?

PREGUNTA RÁPIDA 2  ¿Cuáles son

los componentes principales que se necesitan para la síntesis de proteínas y que se han comentado en este capítulo?

39.1 El código genético conecta la información de los ácidos nucleicos con la de las proteínas La síntesis de proteínas se denomina traducción porque la información presente en forma de una secuencia de ácido nucleico se traduce a un lenguaje distinto, la secuencia de aminoácidos de una proteína. El código genético es la relación que existe entre la secuencia de bases de un DNA (o de su transcrito en forma de RNA) y la secuencia de aminoácidos de una proteína. Los aminoácidos están codificados por grupos de tres bases (denominados codones) comenzando a partir de un punto fijo. De los 64 codones, 61 codifican aminoácidos concretos, mientras que los otros tres codones son señales para la terminación de la cadena. Por tanto, para la mayoría de los aminoácidos hay más de una palabra del código. En otras palabras, el código está degenerado. El código genético es prácticamente igual en todos los organismos. Los RNA mensajeros contienen señales de inicio y de parada para la traducción, lo mismo que hacen los genes para indicar dónde empieza y dónde termina la transcripción. La traducción está mediada por la interacción coordinada de más de un centenar de macromoléculas entre las que se incluyen el mRNA, los rRNA, los tRNA, aminoacil-tRNA sintetasas y factores proteicos. Dado que las proteínas suelen estar formadas por entre 100 y 1.000 aminoácidos, la frecuencia con la que se incorpora un aminoácido incorrecto en el transcurso de la síntesis de proteínas debe ser inferior a 1024. Los RNA de transferencia son los adaptadores que establecen la conexión entre un ácido nucleico y un aminoácido. Estas moléculas, hebras sencillas de unos 80 nucleótidos, tienen una estructura en forma de L. 39.2 Los aminoácidos se activan uniéndose al RNA de transferencia Cada aminoácido se activa y se une a un RNA de transferencia específico por medio de una enzima denominada aminoacil-tRNA sintetasa. Esta enzima forma un enlace éster entre el grupo carboxilo de un aminoácido y el grupo hidroxilo en posición 2 o 3 de la unidad de adenosina de una secuencia CCA situada en el extremo 3 del tRNA. Para cada aminoácido hay, al menos, una aminoacil-tRNA sintetasa específica y al menos un tRNA específico. Una sintetasa utiliza los grupos funcionales y la forma del aminoácido que reconoce para evitar la incorporación de un aminoácido incorrecto a un tRNA. Algunas sintetasas tienen un centro adicional para corregir errores, en donde los aminoácidos incorporados erróneamente se eliminan mediante hidrólisis. Una sintetasa reconoce el anticodón, el tallo aceptor y, a veces, otras partes de su tRNA sustrato. Mediante el reconocimiento específico tanto de los aminoácidos como de los tRNA, las aminoacil-tRNA sintetasas implementan las instrucciones del código genético. 39.3 Un ribosoma es una partícula de ribonucleoproteína que consta de dos subunidades La síntesis de proteínas se lleva a cabo en los ribosomas —partículas de ribonucleoproteína (unos dos tercios de RNA y un tercio de proteína) que están formados por una subunidad grande y por una subunidad pequeña. En E. coli, el ribosoma de 70S (2.700 kDa) está formado por una subunidad de 30S y otra de 50S. La subunidad de 30S consta de un RNA ribosómico de 16S y 21 proteínas distintas; la subunidad de 50S consta de un RNA ribosómico de 23S, otro de 5S y 34 proteínas distintas. Las proteínas se sintetizan en la dirección amino-carboxilo, y el ribosoma lee el mRNA en la dirección 5 → 3. Como el RNA también se transcribe en la dirección 5 → 3, en procariotas, la traducción del mRNA puede comenzar antes de completar la transcripción.

Términos clave traducción (p. 675) código genético (p. 676) codón (p. 676) RNA de transferencia (tRNA) (p. 677)

686

bucle anticodón (p. 679) balanceo (p. 679) aminoacil-tRNA sintetasa (p. 681) ribosoma (p. 683)

subunidad de 50S (p. 683) subunidad de 30S (p. 683) RNA ribosómico (rRNA) (p. 683) polisoma (p. 684)


Problemas 687

?

Respuestas a las PREGUNTAS CLAVE

1. Las moléculas de aminoacil-tRNA son los verdaderos sustratos para la síntesis de proteínas. Además, la síntesis de los aminoacil-tRNA es el paso en el que se lleva a cabo la traduc-

ción de la información de los ácidos nucleicos en la información de los aminoácidos.

2. Ribosomas, tRNA, mRNA y aminoacil-tRNA sintetasas.

Problemas 1. Código mínimo. ¿Cuál es el mínimo número de bases contiguas que se necesita para codificar 20 aminoácidos? Razone su respuesta. ✓  1

7. Secuencias codificadas. (a) Escriba la secuencia de una molécula de mRNA sintetizada a partir de una hebra molde de DNA que tenga la siguiente secuencia. ✓  1

Casi universal. ¿Por qué el código ha permanecido casi invariable durante los miles de millones de años de la evolución, desde las bacterias a los seres humanos? ✓  1

5¿-ATCGTACCGTTA-3¿

2. Pooh y Christopher Robin. Asigne a cada término la descripción correspondiente. (a) Traducción (b) Código genético (c) Codón (d) tRNA (e) Bucle anticodón

  1. El lector del código   2. Libertad de apareamiento   3. Síntesis de proteínas  4. Tres nucleótidos   5. C  ontiene un RNA de 16S   6. I nteracciona con el codón   7. P  ortador de aminoácidos activados   8. C  ontiene un RNA de 28S y otro de 5S   9. L  ugar donde se lleva a cabo la síntesis de proteínas 10. C  onvierte la información de ácidos nucleicos en información de proteínas

(b) ¿Qué secuencia de aminoácidos está codificada en la siguiente secuencia de bases de una molécula de mRNA? Suponga que la pauta de lectura comienza en el extremo 5.

5¿-UUGCCUAGUGAUUGGAUG-3¿ (c) ¿Cuál es la secuencia del polipéptido formado al añadir poli(UUAC) a un sistema libre de células que está sintetizando proteínas y que no necesita un codón de inicio?

3. Un código por el que vivir. ¿Cuáles son las características fundamentales del código genético? ✓  1

8. Descifrando el código, 1. Las moléculas de RNA sintéticas con una secuencia definida fueron cruciales a la hora de descifrar el código genético. Para sintetizarlas, primero se tenían que sintetizar moléculas de DNA que sirviesen de molde. H. Gobind Khorana sintetizó, mediante métodos de química orgánica, dos desoxirribonucleótidos complementarios, cada uno de ellos con nueve residuos: d(TAC)3 y ­d(GTA)3. Posteriormente, las dobles hélices parcialmente solapadas que se formaron al mezclar estos oligonucleótidos sirvieron de molde para la síntesis, por parte de la DNA polimerasa, de largas moléculas repetitivas de DNA de doble hélice. El siguiente paso consistía en obtener largas hebras de polirribonucleótidos con una secuencia complementaria a tan solo una de las dos hebras del DNA. ¿Cómo consiguió Khorana obtener únicamente poli(UAC)? ¿Y solo ­poli(GUA)? ✓  1

Degeneración. Normalmente, la degeneración es algo que se debería evitar salvo, quizás, en circunstancias muy bien controladas. Sin embargo, para el código genético, estar degenerado representa una ventaja. ¿Qué significa la afirmación de que el código genético está degenerado? Expliqué por qué un código degenerado es útil. ✓  1

9. Descifrando el código, 2. La palabra GGG del código no se puede descifrar del mismo modo que las palabras UUU, CCC y AAA, porque la poli(G) no actúa como molde para la síntesis de proteínas. La poli(G) forma una estructura helicoidal de triple hebra. ¿Por qué no se puede utilizar como molde? ✓  1

4. La probabilidad de que salga bien. Calcule la probabilidad de sintetizar sin errores una proteína de 50 aminoácidos y una proteína de 300 aminoácidos si la frecuencia con que se inserta un aminoácido incorrecto es de 1022. Repita los cálculos con frecuencias de error de 1024 y de 1026.

10. Solapado, o no. En un código de tripletes que no se solapan, cada grupo de tres bases en una secuencia ABCDEF... especifica solo un aminoácido —ABC especifica el primero, DEF el segundo, y así sucesivamente— mientras que en un código de tripletes que se solapa por completo, ABC especifica el primer aminoácido, BCD el segundo, CDE el tercero, y así sucesivamente. Suponga que puede mutar un nucleótido individual de un codón y detectar la mutación en la secuencia de aminoácidos. Diseñe un experimento que permita establecer si el código genético se solapa o no. ✓  1

(f) Balanceo (g) Aminoacil-tRNA sintetasa (h) Ribosoma (i) Subunidad de 50S (j) Subunidad de 30S

5. Cuidado, pero no demasiado. ¿Por qué resulta crucial que la síntesis de proteínas tenga una tasa de error de 1024? 6. Dando tumbos. Explique cómo es posible que algunas moléculas de tRNA reconozcan más de un codón. ✓  1


688  39  El código genético 11. Tres significados. El RNA transcrito a partir de una región del DNA del fago T4 contiene la secuencia 5-AAAUGAGGA-3. En teoría, esta secuencia es capaz de codificar tres polipéptidos distintos. ¿Cuáles son? ✓  1 12. Sinónimos valiosos. Normalmente, las proteínas tienen un bajo contenido en Met y Trp, contenido intermedio de His y Cys y contenido elevado de Leu y Ser. ¿Qué sugiere esta observación sobre la relación que hay entre el número de codones para un aminoácido y la frecuencia con que aparece en las proteínas? ¿Cuál podría ser la ventaja selectiva de esta relación? 13. Una nueva traducción. Un RNA de transferencia con un anticodón UGU se conjuga enzimáticamente con cisteína marcada con 14C. A continuación, la unidad de cisteína se modifica químicamente a alanina. El aminoacil-tRNA modificado se añade a un sistema que está sintetizando proteínas que contiene los componentes normales, excepto este tRNA. El mRNA añadido a esta mezcla contiene la siguiente secuencia:

5¿-UUUUGCCAUGUUUGUGCU-3¿ ¿Cuál es la secuencia del correspondiente péptido marcado radiactivamente? 14. Cosas en común. ¿Qué características comparten todas las moléculas de tRNA? ✓  2 15. El viejo baile de los dos pasos. ¿Cuáles son las dos reacciones que se necesitan para formar un aminoacil-tRNA? ✓  2 16. El mismo, pero distinto. ¿Por qué las moléculas de tRNA tienen que tener unas características estructurales exclusivas y otras características estructurales comunes? ✓  2 17. Cárgalo. En el contexto de la síntesis de proteínas, ¿qué quiere decir que un aminoácido está activado? ✓  2 18. 1 5 2, para valores suficientemente grandes de 1. Para activar un aminoácido, se utiliza el equivalente energético de dos moléculas de ATP, a pesar de que solo se utiliza una molécula de ATP. Explique por qué. 19. Tamices. Poniendo la treonil-tRNA como ejemplo, explique la especifidad en el caso de la formación de treonil-­ tRNA. ✓  2 20. Sabiduría. Las aminoacil-tRNA sintetasas son los únicos componentes de la maquinaria de expresión génica que conocen el código genético. Explique por qué. ✓  2

Problemas para atrevidos

21. Una hebra más resistente. El RNA se hidroliza fácilmente en un medio alcalino, mientras que el DNA no. ¿Por qué? 22. Mecanismo de la sintetasa. La formación de isoleucil-tRNA tiene lugar mediante la formación reversible de un intermediario Ile-AMP unido a la enzima. Pronostique si se formaría ATP marcado con 32P a partir de 32PPi cuando se incuba cada uno de los siguientes conjuntos de componentes con la enzima activadora específica. ✓  2 (a) ATP y 32PPi (b) tRNA, ATP y 32PPi (c) Isoleucina, ATP y 32PPi 23. Encontrando la dirección. Se llevó a cabo una serie de experimentos para establecer la dirección en que crece la cadena durante la síntesis de proteínas. Se trataron reticulocitos (glóbulos rojos jóvenes) que estaban sintetizando hemoglobina activamente con [3H]-leucina. En un periodo de tiempo más corto del necesario para sintetizar una cadena completa, se tomaron muestras de hemoglobina, se separaron las cadenas a y b, y se analizó la distribución de 3H en sus secuencias. En las primeras muestras, solo las regiones próximas a los extremos carboxilo contenían radiactividad. En muestras tomadas más tarde, la radiactividad también aparecía en los extremos amino. Explique cómo, a partir de estos resultados, se puede determinar la dirección del crecimiento de la cadena en la síntesis de proteínas. 24. Misión posible. Su misión, en caso de que la acepte, consiste en determinar la dirección en que se lee el mRNA durante la síntesis de proteínas. Se le proporciona el siguiente polinucleótido sintético 5

A

A

A ( A

A

A )n A

A

3

C

como molde para un sistema libre de células que está sintetizando proteína, que también hemos tenido la amabilidad de suministrarle. El polipéptido producido fue O +H

3N

Lys (Lys)n Asn C – O

¿Qué indica la naturaleza de este producto en relación con la dirección en que se lee el mRNA? ✓  1

En la dirección www.whfreeman.com/tymoczko2e se pueden encontrar lecturas recomendadas para este capítulo.


C a p í t u l o

40

40.1 La síntesis de proteínas descodifica la información del mRNA 40.2 La peptidiltransferasa cataliza la síntesis de enlaces peptídicos 40.3 Las bacterias y los eucariotas difieren en la iniciación de la síntesis de proteínas 40.4 Diversas biomoléculas pueden inhibir la síntesis de proteínas 40.5 Los ribosomas unidos al retículo endoplasmático sintetizan proteínas de membrana y proteínas que van a ser secretadas 40.6 La síntesis de proteínas se regula mediante una serie de mecanismos

El mecanismo de la síntesis de proteínas

La estrategia de las cadenas de montaje permite producir de manera rápida y precisa muchos objetos, automóviles incluidos. Esta estrategia también se utiliza durante la síntesis de proteínas, donde incluso las cadenas polipeptídicas muy largas se pueden ensamblar rápidamente y con una precisión impresionante. [Images of Birmingham Premium/Alamy.]

L

a síntesis de proteínas es un proceso complicado y, desde el punto de vista energético, caro, que consta de tres partes: iniciación, elongación y terminación. Durante la iniciación, la maquinaria de traducción tiene que localizar el codón de inicio (el codón Start) correcto. Durante la elongación, a medida que se va sintetizando la proteína desde su extremo amino hasta su extremo carboxilo, los codones se leen secuencialmente en dirección 5 S 39. Cuando se llega a un codón de terminación, unas proteínas especiales hidrolizan el enlace que une el polipéptido al último RNA de transferencia, liberando así la proteína completa. La maquinaria de traducción se desmonta y está lista para comenzar otra ronda de síntesis de proteínas. Comenzaremos nuestro estudio de la síntesis de proteínas analizando este proceso en procariotas. Después, compararemos la síntesis de proteínas procariótica con la eucariótica. Por último, examinaremos cómo afectan los factores ambientales a la síntesis de proteínas y cómo se regula este proceso.

✓✓3  Enumerar los componentes clave de la maquinaria de la síntesis de proteínas. ✓✓4  Describir las funciones del RNA y de las proteínas en la síntesis de proteínas.

40.1 La síntesis de proteínas descodifica la información del mRNA El primer paso de la síntesis de proteínas es la iniciación. Este paso requiere la cooperación del ribosoma, del tRNA, del mRNA y de varios factores proteicos. Comenzaremos el estudio de este proceso analizando los lugares de unión a los tRNA que hay en los ribosomas.

689


690  40 El mecanismo de la síntesis de proteínas

Los ribosomas tienen tres lugares de unión a moléculas de tRNA que conectan las subunidades de 30S y de 50S Los tres lugares de unión a moléculas de tRNA de los ribosomas están dispuestos de modo que permiten la formación secuencial de enlaces peptídicos entre los aminoácidos codificados por los codones del mRNA (Figura 40.1). El fragmento de mRNA que se está traduciendo en un momento dado se encuentra unido a la subunidad de 30S. Cada una de las moléculas de tRNA está en contacto con la subunidad de 30S y con la subunidad de 50S. En el extremo correspondiente a la subunidad de 30S, dos de las tres moléculas de tRNA están unidas al mRNA mediante pares de bases anticodón-codón. Estos lugares de unión se denominan lugar A (de aminoacil) y lugar P (de peptidil). La tercera molécula de tRNA está unida a un lugar adyacente denominado lugar E (de exit, que en inglés significa “salida”). (A)

(B)

Lugar E Lugar P Lugar A

Lugar E

Lugar P

mRNA Lugar A

Figura 40.1  Lugares de unión para los RNA de transferencia. (A) Se muestran tres moléculas de tRNA en los lugares de unión para los tRNA del ribosoma de 70S. Estos lugares se denominan A (de aminoacil), P (de peptidil) y E (de salida, “exit” en inglés). Cada molécula de tRNA establece contactos con la subunidad de 30S y con la de 50S. (B) Las moléculas de tRNA en los lugares A y P forman pares de bases con el mRNA. [(B) Elaborada a partir de 1JGP.pdb.]

El otro extremo de cada molécula de tRNA interacciona con la subunidad de 50S. Los tallos aceptores de las moléculas de tRNA que ocupan los lugares A y P convergen en un lugar, que es donde se forma el enlace peptídico. Un túnel conecta este lugar con la parte posterior del ribosoma, que es por donde va pasando la cadena polipeptídica durante su síntesis (Figura 40.2).

50S Canal para el polipéptido

E

A

5’

mRNA

E

P

A 3’

30S

Figura 40.2  Ribosoma activo. Esta representación esquemática muestra las relaciones que se establecen entre los componentes clave de la maquinaria de traducción.

La señal de inicio es AUG (o GUG) precedida de varas bases que se emparejan con el RNA ribosómico de 16S ¿Cómo comienza la síntesis de proteínas? O en otras palabras, ¿cómo se colocan los codones apropiados en los lugares A y P? La posibilidad más sencilla sería que los tres primeros nucleótidos de cada mRNA actuasen como el primer codón; no se necesitaría ninguna señal especial de inicio. Sin embargo, los experimentos indican que, en procariotas, la traducción no comienza inmediatamente después del extremo 59 del mRNA. De hecho, el primer codón que se traduce se encuentra, casi siempre, a más de 25 nucleótidos de distancia del extremo 59. Además, en procariotas, muchas moléculas de mRNA son policistrónicas, o poligénicas —es decir, codifican dos o más cadenas polipeptídicas. Recordemos que, en el operón lac, el mRNA producido codifica tres enzimas (p. 638). Cada una de estas tres proteínas tiene sus propias señales de inicio y de parada en el mRNA. De hecho, todas las moléculas de mRNA conocidas contienen señales que definen el inicio y el final de cada cadena polipeptídica codificada.


40.1  La síntesis de proteínas 691 5

3

A G C A C G A GG G G A A A U C U G A U G G A A C G C U A C

E. coli trpA

U U U G G A U GG A G U G A A A C G A U G G C G A U U G C A

E. coli araB

G GU A A C C A G GU A A C A A C C A UG C G A G UG UU G

E. coli thrA

C A A U U C A GG G U G G U G A A U G U G A A A C C A G U A

E. coli lacl

A A U C U U G G A G G C U U UU U U A U G G U U C G U U C U

Proteína A del fago X174

U A A C U A A GG A U G A A A U G C A U G U C U A A G A C A

Replicasa del fago Q

U C C U A G G A G GU U U G A C C U A UG C G A G C U UU U

Proteína A del fago R17

A U G U A C U A A G G A G G UU G U A U G G A A C A A C G C

cro del fago 

Forma pares de bases con el rRNA de 16S

Forma pares de bases con el tRNA iniciador

Figura 40.3  Lugares de iniciación. Secuencias de algunas moléculas de mRNA bacterianas y

tRNAf + Metionina

víricas que contienen los lugares de iniciación para la síntesis de proteínas. La comparación de estas secuencias pone de manifiesto algunas características recurrentes.

Sintetasa

Una pista relacionada con el mecanismo de iniciación fue el descubrimiento de que, en E. coli, casi la mitad de los residuos del extremo amino de las proteínas son metioninas. De hecho, el codón de inicio (codón Start) del mRNA es AUG (metionina) o, con mucha menor frecuencia, GUG (valina). Sin embargo, la tarea de iniciar la síntesis de proteínas no recae únicamente en el codón de inicio. Además, cada región iniciadora contiene una secuencia rica en purinas, denominada secuencia de Shine-Dalgarno, centrada aproximadamente a unos 10 nucleótidos de distancia, por el lado 59, del codón iniciador (Figura 40.3). En el mRNA, las secuencias de nucleótidos que no se traducen, como la secuencia de Shine-Dalgarno, se denominan regiones no traducidas (UTR) y pueden estar en el extremo 59 del mRNA (59-UTR) o en el extremo 39 (39-UTR). Normalmente, las regiones no traducidas funcionan regulando el uso de las moléculas de mRNA. La secuencia de Shine-Dalgarno interacciona con una secuencia complementaria localizada en el extremo 39 del rRNA de 16S que forma parte de la subunidad pequeña del ribosoma. De este modo, en procariotas, dos tipos de interacciones determinan dónde comienza la síntesis de proteínas: (1) el emparejamiento de las bases del mRNA con el extremo 39 del rRNA de 16S y (2) el emparejamiento del codón iniciador del mRNA con el anticodón de una molécula de tRNA iniciador.

H3N+

CH3

H

O O tRNAf

Metionil-tRNAf (Met-tRNAf) N10-formiltetrahidrofolato Transformilasa Tetrahidrofolato

O NH

S

H

CH3

H

O O tRNAf

La síntesis de proteínas bacteriana comienza con el formilmetionil-RNA de transferencia Como ya se ha comentado, en muchas proteínas de E. coli, el primer aminoácido es metionina. Sin embargo, el residuo de metionina situado en el extremo amino de las proteínas de E. coli suele estar modificado. De hecho, en bacterias, la síntesis de proteínas comienza con el aminoácido modificado N-formilmetionina (fMet). Un tRNA especial lleva la formilmetionina al ribosoma para iniciar la síntesis de proteínas. Este tRNA iniciador (en forma abreviada, tRNAf ) es distinto del tRNA que inserta la metionina en posiciones internas (en forma abreviada, tRNAm). El subíndice “f ” indica que la metionina unida al tRNA iniciador se puede formilar, algo que no es posible cuando se encuentra unida al tRNAm. Aunque prácticamente todas las proteínas que se sintetizan en E. coli comienzan con formilmetionina, en aproximadamente la mitad de las proteínas se elimina la N-formilmetionina cuando la cadena naciente tiene una longitud de 10 aminoácidos. La misma aminoacil-tRNA sintetasa une la metionina a estos dos tipos de tRNA. A continuación, una enzima específica formila el grupo amino de la molécula de metionina unida al tRNAf (Figura 40.4). En esta reacción, el donador de formilos activados es el N10-formiltetrahidrofolato, un derivado del folato que transporta unidades monocarbonadas activadas (p. 546). La metionina libre y el metionil-tRNAm no son sustratos para esta transformilasa.

S

Formilmetionil-tRNAf (fMet-tRNAf)

Figura 40.4  Formilación del metionil-tRNA. En primer lugar, el tRNA iniciador (tRNAf) se carga con metionina y, después, se transfiere un grupo formilo desde el N10-formiltetrahidrofolato al metionil-tRNAf.

CH3 S CH2 O H2C H

C

N H

H C

fMet

C O


Subunidad ribosómica de 30S Factores de iniciación

30S ⋅IF1⋅IF3 IF2(GTP)⋅ fMet-tRNA f + mRNA

fMet IF2 GTP

IF3 IF1

5′

mRNA

AUG

Complejo de iniciación de 30S

IF1 + IF3 Subunidad de 50S + H2O IF2, GDP + Pi

fMet

AUG

Complejo de iniciación de 70S

Figura 40.5  Iniciación de la traducción en procariotas. Primero, los factores de iniciación ayudan al ensamblaje del complejo de iniciación de 30S y, después, al del complejo de iniciación de 70S.

Durante la formación del complejo de iniciación de 70S, el formilmetionil-tRNAf se sitúa en el lugar P del ribosoma Para que comience la síntesis de proteínas, el mRNA y el formilmetionil- tRNAf tienen que acceder al ribosoma. ¿Cómo se lleva a cabo esta tarea? Tres factores de iniciación de naturaleza proteica son esenciales: IF1, IF2 y IF3. En primer lugar, la subunidad de 30S del ribosoma forma un complejo con IF1 y con IF3 (Figura 40.5). La unión de estos factores a la subunidad de 30S evita que se una de forma prematura a la subunidad de 50S formando un complejo de 70S carente de mRNA y de tRNAf, que no es funcional. El factor de iniciación 2, una GTPasa, se une a GTP y el consiguiente cambio de conformación permite a IF2 asociarse con el formilmetionil- tRNAf. El complejo IF2-GTP-tRNA iniciador se une a la posición correcta del mRNA (gracias a la interacción entre la secuencia de Shine-Dalgarno y el rRNA de 16S) y a la subunidad de 30S formando el complejo de iniciación de 30S. Cuando se une la subunidad de 50S, se hidroliza el GTP unido a IF2, dando lugar a la liberación de los factores de iniciación. El resultado es el complejo de iniciación de 70S. Cuando se ha formado el complejo de iniciación de 70S, el ribosoma está listo para la fase de elongación de la síntesis de proteínas. La molécula de fMet-tRNAf ocupa el lugar P del ribosoma, orientada de forma que su anticodón esté formando pares de bases con el codón de iniciación del mRNA. Los otros dos lugares de unión a moléculas de tRNA, el lugar A y el lugar E, se encuentran vacíos. Esta interacción establece la pauta de lectura para la traducción de la totalidad del mRNA. Una vez localizado el codón iniciador, se definen grupos de tres nucleótidos que no se solapan y que, posteriormente, serán traducidos a medida que se lleva a cabo la síntesis de proteínas.

Los factores de elongación suministran los aminoacil-tRNA al ribosoma Llegados a este punto, el fMet-tRNAf ocupa el lugar P y el lugar A está vacante, como ya hemos comentado. La molécula concreta que se inserte en el lugar A vacío depende del codón del mRNA en el lugar A. Sin embargo, el aminoacil-tRNA apropiado no se limita a disociarse de la sintetasa y difundir hasta el lugar A sino que es llevado a ese lugar mediante una proteína de 43 kDa denominada factor de elongación Tu (EF-Tu), que necesita GTP para su actividad. El factor de elongación Tu solo se une al aminoacil-tRNA en su forma unida al GTP (Figura 40.6). La unión del EF-Tu al aminoacil-tRNA desempeña una función doble. En primer lugar, EF-Tu protege el delicado enlace éster del aminoacil-tRNA de la hidrólisis. En segundo lugar, el GTP del EF-Tu solo se hidroliza a GDP cuando el complejo EF-Tu-aminoacil-tRNA y el ribosoma se han unido de forma correcta. Si el anticodón no está correctamente emparejado con el codón no se produce la hidrólisis y el aminoacil-tRNA no se transfiere al ribosoma.

EF-Tu Nucleótido de guanina

Figura 40.6  Estructura del factor de elongación Tu. Estructura de un complejo formado por el factor de elongación Tu (EF-Tu) y un aminoacil-tRNA. Observe el dominio GTPasa (sombreado de color púrpura) en el extremo amino de EF-Tu. Este dominio GTPasa es parecido al de otras proteínas G. [Elaborada a partir de 1B23.pdb.]

692

AminoaciltRNA


40.2 Peptidiltransferasa 693

Este mecanismo permite que la energía libre de la hidrólisis del GTP contribuya a la precisión de la síntesis de proteínas. A continuación, EF-Tu vuelve a su forma GTP gracias a un segundo factor de elongación, el factor de elongación Ts. El EF-Ts induce la disociación del GDP. El GTP se une a EF-Tu y, al mismo tiempo, se libera el EF-Ts. Hay que destacar el hecho de que EF-Tu no interacciona con el fMet-tRNAf. Por tanto, este tRNA iniciador no es conducido hasta el lugar A. Por el contrario, el Met-tRNAm, al igual que los demás aminoacil-tRNA, se une a EF-Tu. Estos descubrimientos explican el hecho de que los codones AUG internos no sean leídos por el tRNA iniciador. Por el contrario, IF2 reconoce al fMet-tRNAf pero no a los demás tRNA. El ciclo de elongación prosigue hasta llegar a un codón de terminación.

40.2 La peptidiltransferasa cataliza la síntesis de enlaces peptídicos Cuando el lugar P y el lugar A se encuentran ocupados por moléculas de aminoacil-tRNA, todo está listo para la formación de un enlace peptídico: la molécula de formilmetionina unida al tRNA iniciador será transferida al grupo amino del aminoácido que ocupa el lugar A. La formación del enlace peptídico, una de las reacciones más importantes de la vida, es un reacción espontánea, desde el punto de vista termodinámico, y está catalizada por una región del rRNA de 23S de la subunidad de 50S denominada centro peptidiltransferasa. Este centro catalítica está situado en un lugar profundo de la subunidad de 50S, cerca del túnel que permite a la cadena naciente abandonar el ribosoma. El ribosoma, que multiplica la velocidad de formación de enlaces peptídicos por un factor de 107, debe gran parte de su poder catalítico a lo que se denomina catálisis por proximidad y orientación. El ribosoma posiciona y orienta los dos sustratos de modo que estén situados de forma que se aproveche la reactividad intrínseca entre un grupo amino y un éster. El grupo amino del aminoacil-tRNA del lugar A está en una posición idónea para atacar el enlace éster que hay entre el tRNA iniciador y la molécula de formilmetionina en el lugar P. El centro peptidiltransferasa también incluye bases que promueven esta reacción ayudando a formar un grupo —NH2 en el aminoacil-tRNA del lugar A y ayudando a estabilizar el intermediario tetraédrico que se forma. Desde muchos puntos de vista, esta reacción es análoga a la reacción catalizada por serinproteasas como la quimotripsina (Capítulo 8), pero en sentido inverso. El peptidil-tRNA es análogo a la forma acil-enzima de una serinproteasa, que se genera utilizando la energía libre asociada a la ruptura de un enlace amida. En el ribosoma, la energía libre necesaria para formar la especie análoga, un aminoacil-tRNA, procede del ATP que se escinde mediante la aminoacil-tRNA sintetasa, antes de la llegada del tRNA al ribosoma.

La formación de un enlace peptídico va seguida de una translocación de los tRNA y del mRNA, impulsada por el GTP Con la formación del enlace peptídico, la cadena peptídica se encuentra ahora unida al tRNA cuyo anticodón se encuentra en el lugar A de la subunidad de 30S. Un cambio en la interacción con la subunidad de 50S ha colocado el extremo CCA de ese mismo tRNA, junto con su péptido, en el lugar P de la subunidad grande (Figura 40.7). El tRNA del lugar P de la subunidad de 30S está ahora descargado. Para que prosiga la traducción, el mRNa se tiene que translocar (desplazar) de forma que el codón para el siguiente aminoácido ocupe el lugar A. Esta translocación tiene lugar mediante la acción de una enzima denominada factor de elongación G o translocasa (Figura 40.8). El EF-G utiliza la energía de la hidrólisis del GTP para forzar su entrada en el lugar A de la subunidad de 30S y obligar a los tRNA y al mRNA a moverse a lo largo del ribosoma la distancia equivalente a un codón. Posteriormente, el EF-G se disocia del ribosoma. Al completarse este paso, el peptidil-tRNA se encuentra ahora ocupando por completo el lugar P y el tRNA iniciador descargado se ha disociado del mRNA y

✓✓5  Explicar el papel del ribosoma en la síntesis de proteínas.


50S

Enlace peptídico

Túnel

E

P E

P

A A

5’

3’

5’

3’

30S

5’

3’

Formación del enlace peptídico

Unión del aminoacil-tRNA

GTP Translocación

Factor de elongación G GDP + Pi

Figura 40.7  Mecanismo de la síntesis de proteínas. El ciclo comienza con el peptidil-tRNA en el lugar P. Un aminoacil-tRNA se une al lugar A. Cuando ambos lugares están ocupados, se forma un nuevo enlace peptídico. Los tRNA y el mRNA se translocan mediante la acción del factor de elongación G, que desplaza el tRNA desacilado al lugar E. Una vez allí, el tRNA tiene libertad para disociarse y completar el ciclo.

5’

3’

5’

3’

Disociación del tRNA

EF-G

50S

GTP GTP

GDP H2O

5’

Pi

3’ 30S

Figura 40.8  TMecanismo de la translocación. En su forma unida a GTP, el EF-G se une al lugar de unión para EF-Tu de la subunidad de 50S. Esta unión estimula la hidrólisis del GTP, que provoca un cambio conformacional en EF-Gque obliga a los tRNA y al mRNA a moverse a través del ribosoma la distancia correspondiente a un codón.

ocupa el lugar E. Al disociarse del tRNA iniciador, el ribosoma ha vuelto a su estado inicial, salvo por el hecho de que la cadena peptídica se encuentra unida a un tRNA distinto (ver la Figura 40.8). Hay que señalar que, a lo largo de este ciclo, la cadena peptídica permanece en el lugar P de la subunidad de 50S, creciendo en dirección al túnel de salida. Este ciclo se repite a medida que nuevos aminoacil-tRNA llegan al lugar A, permitiendo la elongación del polipéptido de forma indefinida. No olvidemos que toda esta actividad se lleva a cabo 40 veces por segundo y que el polipéptido se sintetiza en la dirección extremo amino S extremo carboxilo (Figura 40.9). Muchos ribosomas pueden estar traduciendo una molécula de mRNA de forma simultánea, formando un polirribosoma o un polisoma (ver la Figura 39.3).

694


40.2 Peptidiltransferasa 695 NH3+

R1 H +H

3N

+H N 3

O

+

H3N

O

H

C

H

C

R1

R1

R2

O

O

3N

O

NH

R2 H

tRNA2

+H

C

C

tRNA3

H

O

NH

R3 H

C

O

O

O

tRNA1

H O

O

O R2

R3

H

O

C

HN

tRNA2

tRNA3

Figura 40.9  Crecimiento de la cadena polipeptídica. Las proteínas se sintetizan mediante la adición sucesiva de aminoácidos al extremo carboxilo.

La síntesis de proteínas finaliza mediante factores de liberación que leen los codones Stop La fase final de la traducción es la terminación. ¿Cómo finaliza la síntesis de una ­cadena polipeptídica cuando se llega a un codón Stop? En las células normales no hay moléculas de tRNA con anticodones complementarios a los codones Stop —UAA, UGA o UAG. En vez de eso, estos codones Stop son reconocidos por proteínas denominadas factores de liberación (RF). Uno de estos factores de liberación, RF1, reconoce UAA o UAG. Un segundo factor, RF2, reconoce UAA o UGA. Un tercer factor, RF3, otra GTPasa, participa en las interacciones que se establecen entre RF1 o RF2 y el ribosoma. Los RF1 y RF2 son proteínas compactas que, cuando están unidas al ribosoma, se despliegan para rellenar el hueco que hay entre el codón Stop del mRNA y el centro peptidiltransferasa de la subunidad de 50S (Figura 40.10). El RF interacciona con el centro peptidiltransferasa por medio de un bucle que contiene una secuencia glicina-glicina-glutamina (GGQ) muy conservada, cuya glutamina está metilada en el átomo de nitrógeno del grupo amida de la cadena lateral. Esta glutamina modificada es decisiva a la hora de promover, con la ayuda de la peptidiltransferasa, el ataque de una molécula de agua al enlace éster que hay entre el tRNA y la cadena polipeptídica para dejarla libre. El polipéptido liberado abandona el ribosoma. El RNA de transferencia y el RNA mensajero permanecen unidos brevemente al ribosoma 70S hasta que la totalidad del complejo se disocia gracias a la hidrólisis del GTP, que se produce en respuesta a la unión de EF-G y de otro factor denominado factor liberador del ribosoma (RRF).

?

PREGUNTA RÁPIDA 1  ¿Cuáles son

las funciones de los factores proteicos necesarios para la síntesis de proteínas?

RF1

5’

UAA

3’

Péptido escindido del tRNA UAA

Figura 40.10  Terminación de la síntesis de proteínas. Un factor de liberación reconoce un codón Stop en el lugar A y estimula la liberación de la proteína completa del tRNA situado en el lugar P.

UAA


696  40 El mecanismo de la síntesis de proteínas ✓✓6  Comparar y contrastar la síntesis de proteínas bacteriana y la eucariótica.

capuchón 5’

GUCAACGGU AUG CUGAGU mRNA Factores de iniciación + GTP Met-tRNAi Subunidad de 40S

Met

GUCAACGGU AUG CUGAGU ATP

Met

ADP + Pi

GUCAACGGU AUG CUGAGU ATP

Met ADP + Pi

GUCAACGGU AUG CUGAGU n ATP n ADP + Pi

Met

GUCAACGGU AUG CUGAGU Subunidad de 60S Factores de iniciación

Met

GUCAACGGU AUG CUGAGU

Figura 40.11  Iniciación de la traducción en eucariotas. En eucariotas, la iniciación de la traducción comienza con el ensamblaje de un complejo sobre el capuchón 5 que incluye la subunidad de 40S y el Met-tRNAi. Impulsado por la hidrólisis del ATP, este complejo escanea el mRNA hasta encontrar el primer AUG. Entonces, se incorpora la subunidad de 60S para formar el complejo de iniciación de 80S.

40.3 Las bacterias y los eucariotas difieren en la iniciación de la síntesis de proteínas En eucariotas y en arqueobacterias, el esquema básico de las síntesis de proteínas es similar al de las bacterias. Los principales aspectos estructurales y mecanísticos se repiten en todos los dominios de la vida. Sin embargo, la síntesis de proteínas eucariótica requiere más componentes proteicos que la síntesis de proteínas bacteriana y algunos pasos son más complejos. Algunas de las similitudes y diferencias que merece la pena destacar son: 1. Ribosomas. Los ribosomas eucarióticos son más grandes. Están formados por una subunidad grande de 60 S y una subunidad pequeña de 40 S que, al juntarse, forman un complejo de 80S con una masa de 4.200 kDa, en comparación con los 2.700 kDa del ribosoma bacteriano de 70S. La subunidad de 40 S contiene un RNA de 18S homólogo al RNA bacteriano de 16S. La subunidad de 60 S contiene tres RNA: el RNA de 5S, homólogo al rRNA bacteriano de 5S, el RNA de 28S, homólogo a la molécula bacteriana de 23S; y el RNA de 5,8S, homólogo al extremo 59 del RNA bacteriano de 23S. 2. tRNA iniciador. En eucariotas, el aminoácido iniciador es la metionina en vez de la N-formilmetionina. Sin embargo, como ocurre en bacterias, hay un tRNA especial que interviene en la iniciación. Este aminoacil-tRNA se denomina Met-tRNAi o Met-tRNAf (el subíndice “i” significa iniciación, y el “f ” indica que se puede formilar in vitro). 3. Iniciación. En eucariotas, el codón de iniciación siempre es AUG. A diferencia de las bacterias, los eucariotas no tienen una secuencia específica rica en purinas en el lado 59 para distinguir los AUG iniciadores de los internos. En vez de ello, se suele seleccionar como punto de partida el AUG más próximo al extremo 59 del mRNA. Una subunidad de 40S del ribosoma, unida a la Met-tRNAi se une al capuchón del extremo 59 del mRNA eucariótico (p. 663) y busca un codón AUG moviéndose paso a paso en dirección 39 (Figura 40.11). Este proceso de escaneado está catalizado por helicasas que se desplazan a lo largo del mRNA impulsadas por la hidrólisis del ATP. El emparejamiento del anticodón del Met-tRNAi con el codón AUG del mRNA es la señal de que se ha encontrado el objetivo. En casi todos los casos, el mRNA eucariótico solo tiene un lugar de inicio y, por tanto, sirve de molde para la síntesis de una única proteína. Por el contrario, un mRNA bacteriano puede tener múltiples secuencias de Shine-Dalgarno y, por tanto, múltiples lugares de inicio, de manera que puede servir de molde para la síntesis de varias proteínas. Los eucariotas utilizan muchos más factores de iniciación que las bacterias y sus interacciones son mucho más complejas. Un factor iniciador eucariótico se abrevia eIF. Por ejemplo, el eIF-4E es una proteína que se une directamente al capuchón 7-metilguanosina (capuchón 59, p. 663), mientras que el eIF-2, asociado al GTP, suministra el Met-tRNAi al ribosoma. La diferencia en el mecanismo de iniciación entre bacterias y eucariotas es, en parte, consecuencia del distinto procesamiento del RNA. En bacterias, el extremo 59 del mRNA es fácilmente reconocible por los ribosomas inmediatamente después de la transcripción. Por el contrario, en eucariotas, el pre-mRNA se tiene que procesar y transportar hasta el citoplasma antes de iniciar la traducción. El capuchón 59 proporciona un punto de partida fácilmente reconocible. 4. La estructura del mRNA. El mRNa eucariótico es circular. La proteína eIF-4E que se une a la estructura del capuchón del mRNA también se une a la cola de poli(A) mediante dos intermediarios proteicos. La proteína eIF-4E se une primero a la proteína eIF-4G que, a su vez, se une a una proteína asociada a la cola de poli(A), la proteína que se une a poli(A) (PABP1; Figura 40.12). De este modo, el capuchón y la cola se acercan formando un círculo de mRNA. La estructura circular puede hacer más fácil que se vuelvan a unir los ribosomas después de haber terminado la síntesis de la proteína. Tanto en condiciones normales como patológicas, la regulación de la actividad de eIF4G es un punto de control clave. Tanto el síndrome X-frágil, la forma más frecuente de discapacidad mental hereditaria, como el cáncer de próstata y otros tipos de cáncer están relacionados con una alteración en el funcionamiento del eIF-4G.


40.3  Iniciación bacteriana y eucariótica 697 5 m 7G elF-4E

elF-4G PABP1 PABP1

mRNA

3 A A

AAAAA

AA

80S

Figura 40.12  El mRNA eucariótico forma un círculo gracias a sus interacciones con proteínas. [Tomada de H. Lodish y col., Molecular Cell Biology, 6.ª ed. (W. H. Freeman and Company, 2008), Fig. 4.28.]

5. Elongación y terminación. Los factores de elongación eucarióticos EF1a y EF1bg son los homólogos de los factores bacterianos EF-Tu y EF-Ts, mientras que el factor eucariótico EF2 se corresponde con el EF-G bacteriano (la translocasa). En eucariotas, la terminación la lleva a cabo un único factor de liberación, eRF1, a diferencia de los dos que operan en bacterias. Por último, el eIF-3, al igual que su homólogo bacteriano IF3, evita la reasociación de las subunidades ribosómicas en ausencia de un complejo de iniciación. 6. Organización. En los eucariotas superiores, los componentes de la maquinaria de traducción se organizan en forma de grandes complejos asociados al citoesqueleto. Se cree que esta asociación favorece la eficacia de la síntesis de proteínas. Recordemos que la organización de los procesos bioquímicos complejos en complejos físicos es un aspecto recurrente de la bioquímica.

  Aspecto clínico Mutaciones en el factor de iniciación 2 provocan un curioso estado patológico Las mutaciones en el factor de iniciación 2 eucariótico dan lugar a una misteriosa enfermedad denominada enfermedad de la sustancia blanca evanescente (VWM), en la que las células nerviosas del cerebro desaparecen y son sustituidas por líquido cerebroespinal (Figura 40.13). La sustancia blanca del cerebro está formada fundamentalmente por axones nerviosos que conectan la sustancia gris del cerebro con el resto del organismo. La muerte, que sobreviene a causa de la fiebre o del coma generalizado, puede producirse en cualquier momento en un intervalo comprendido entre unos pocos años y décadas después de aparecer la enfermedad. Un aspecto particularmente enigmático de la enfermedad es su especificidad tisular. Es de esperar que una mutación en un proceso bioquímico tan importante para la vida como lo es la iniciación de la síntesis de proteínas sea letal o que, por lo menos, afecte a todos los tejidos del organismo. Las enfermedades como la VWM muestran de manera gráfica que, aunque se han realizado grandes avances en bioquímica, todavía se necesita mucha más investigación para comprender la complejidad de la salud y de la enfermedad.  ■

Figura 40.13  Efectos de la enfermedad de la sustancia blanca evanescente. (A) En el cerebro normal, las imágenes obtenidas mediante resonancia magnética (MRI) permiten visualizar la sustancia blanca, que aparece en color gris oscuro. (B) En el cerebro enfermo, la MRI pone de manifiesto que la sustancia blanca es reemplazada por el fluido cerebroespinal, que aparece de color blanco. [Cortesía de (A)

(B)

Marjo S. van der Knaap, M.D., Ph.D., VU University Medical Center, Holanda.]


698  40 El mecanismo de la síntesis de proteínas

40.4 Diversas biomoléculas pueden inhibir la síntesis de proteínas Se han identificado muchos compuestos químicos que inhiben diversos aspectos de la síntesis de proteínas. Estos compuestos químicos son potentes herramientas experimentales y fármacos valiosos desde el punto de vista clínico.

  Aspecto clínico

+

NH2

NH2

H2N

NH

NH2

HN

OH HO OH O

Algunos antibióticos inhiben la síntesis de proteínas +

O

CHO

Las diferencias entre los ribosomas eucarióticos y bacterianos se puede aprovechar para el desarrollo de antibióticos (Tabla 40.1). Por ejemplo, el antibiótico estreptomicina, un trisacárido muy alcalino, interfiere con la unión del formilmetionil-tRNA a los ribosomas y, por tanto, evita la correcta iniciación de la síntesis de proteínas. Otros antibióticos aminoglicósidos, como la neomicina, la kanamicina y la gentamicina, interfieren con la interacción entre el tRNA y el rRNA de 16S de la subunidad de 30S (p. 683). El cloranfenicol actúa inhibiendo la actividad de la peptidiltransferasa. La eritromicina se une a la subunidad de 50S y bloquea la translocación.

H3C HO HO O CH2OH H3CHN

O

Tabla 40.1 Antibióticos que inhiben la síntesis de proteínas

OH

Antibiótico

Estreptomicina

Acción

Estreptomicina y otros aminoglicósidos

Inhibe la iniciación y provoca la lectura errónea del mRNA (en bacterias)

Tetraciclina

Se une a la subunidad de 30S e inhibe la unión de los aminoacil-tRNA (en bacterias)

Cloranfenicol

Inhibe la actividad peptidiltransferasa de la subunidad ribosómica de 50S (en bacterias)

Cicloheximida

Inhibe la translocación (en eucariotas)

Eritromicina

Se une a la subunidad de 50S e inhibe la translocación (en bacterias)

Puromicina

Provoca la terminación prematura de la cadena actuando como un análogo del aminoacil-tRNA (en bacterias y en eucariotas)

El antibiótico puromicina inhibe la síntesis de proteínas tanto en bacterias como en eucariotas haciendo que las cadenas polipeptídicas nacientes se liberen antes de completar su síntesis. La puromicina es un análogo de la parte terminal del aminoacil-tRNA (Figura 40.14). Se une al lugar A del ribosoma e inhibe la entrada del aminoacil-tRNA. Además, la puromicina contiene un grupo a-amino. Este grupo amino, como el del aminoacil-tRNA, forma un enlace peptídico con el grupo carboxilo de la cadena peptídica en crecimiento. El producto, un péptido unido covalentemente a un residuo de puromicina en su extremo carboxilo, se disocia del ribosoma. Aunque ya no se utiliza en medicina, la puromicina se utiliza fundamentalmente como herramienta experimental para la investigación de la síntesis de proteínas. La cicloheximida, otro antibiótico, bloquea la translocación en los ribosomas eucarióticos, lo que le convierte en una valiosa herramienta de laboratorio para bloquear la síntesis de proteínas en células eucarióticas.  ■


O tRNA

O

– P

N

O O

HO

H

HN

H3CO

O Aminoiácido

H

+

NH3

N

OH O +

NH3

Aminoacil-tRNA

N

N

O

OH

O

R

N N

Puromicina

CH3

N

N

N

O

H3C

NH2

Figura 40.14  Acción antibiótica de la puromicina.  La puromicina se parece al extremo aminoacilo de un aminoacil-tRNA. Su grupo amino se une al grupo carboxilo de la cadena polipeptídica naciente formando un aducto que se disocia del ribosoma. Este aducto es estable porque la puromicina posee un enlace amida (mostrado de color rojo) en vez de un enlace éster.

  Aspecto clínico En eucariotas, la toxina de la difteria bloquea la síntesis de proteínas inhibiendo la translocación Muchos antibióticos, obtenidos a partir de bacterias con fines medicinales, son inhibidores de la síntesis de proteínas bacteriana. Sin embargo, algunas bacterias producen inhibidores de la síntesis de proteínas que también inhiben la síntesis de proteínas eucariótica, dando lugar a enfermedades como la difteria, que fue una de las principales causas de mortalidad infantil antes de la llegada de estrategias de inmunización eficaces. Los síntomas incluyen graves dolores de garganta, ronquera, fiebre y dificultades respiratorias. Los efectos letales de esta enfermedad se deben, principalmente, a una toxina de naturaleza proteica producida por Corynebacterium diphtheriae, una bacteria que crece en el tracto respiratorio superior de las personas infectadas. Normalmente, unos pocos microgramos de la toxina de la difteria son letales para una persona no inmunizada porque la toxina inhibe la síntesis de proteínas. Poco después de entrar en una célula diana, la toxina es escindida en un fragmento A de 21 kDa y un fragmento B de 40 kDa. En el citoplasma, un único fragmento A de la toxina puede matar una célula. ¿Por qué es tan letal? La diana del fragmento A es EF2, el factor de elongación que cataliza la translocación en la síntesis de proteínas eucariótica. El EF2 contiene diftamida, un residuo de aminoácido atípico, de función desconocida, que se forma mediante la modificación post-traduccional de la histidina. El fragmento A de la toxina de la difteria cataliza la transferencia de la unidad ADP-ribosa del NAD+ al anillo de la diftamida (Figura 40.15). O

H N

Pierre Paul Émile Roux (1853–1933), médico francés, colaborador de Louis Pasteur y cofundador del Instituto Pasteur, desarrolló una de las primeras vacunas contra la difteria que tuvo éxito. [Fotografía procedente de Archives Charme/Bridgeman Art Library.]

H N O

O O – O

O

N

NH2 H

P O O – O

P

HO

OH

N

NH2

O O

N N N

HO

OH ADP-ribosa

N+(CH

3)3

Figura 40.15  Bloqueo de la translocación provocado por la toxina de la difteria.La toxina de la difteria bloquea la síntesis de proteínas en eucariotas catalizando la transferencia de una unidad ADP-ribosa desde el NAD+ a la diftamida, un residuo de aminoácido modificado del factor de elongación 2 (translocasa). La diftamida se forma mediante la modificación post-traduccional (en color azul) de un residuo de histidina.

699


Esta ADP-ribosilación de una única cadena lateral de EF2 bloquea su capacidad para llevar a cabo la translocación de la cadena polipeptídica en crecimiento. La síntesis de proteínas se detiene, lo que explica la extraordinaria toxicidad de la toxina de la difteria. ■

  Aspecto clínico La ricina modifica de forma letal el RNA ribosómico de 28S Figura 40.16  Semillas de ricino. Las semillas del ricino (Ricinus communis) son una fuente abundante de aceites que tienen muchas aplicaciones, entre las que se incluye la producción de biodiesel. Las semillas también son ricas en la toxina ricina. [Ted Kinsman/Photo Researchers.]

El 7 de Setiembre de 1978, un agente del Departamento de Seguridad del Estado de la Unión Soviética (KGB), utilizando un arma construida en un paraguas, introdujo un perdigón impregnado de ricina en el muslo del disidente búlgaro Georgi Markov, mientras cruzaba el puente de Waterloo en Londres. El Sr. Markov sintió un fuerte pinchazo, como si le hubiese picado un insecto. Murió cuatro días después

La ricina es una biomolécula que aparece frecuentemente en las noticias por su potencial uso como agente bioterrorista. La ricina es una proteína pequeña (65 kDa) que se encuentra en las semillas (en las habas) del ricino, Ricinus communis (Figura 40.16). Se trata, de hecho, de una molécula mortal, ya que una cantidad tan pequeña como 500 mg es letal para un ser humano adulto y una única molécula puede inhibir toda la síntesis de proteínas en una célula, dando lugar a la muerte celular. La ricina es una proteína heterodimérica compuesta por una cadena catalítica A unida mediante un único puente disulfuro a una cadena B. La cadena B permite a la toxina unirse a la célula diana y esta unión da lugar a la absorción del dímero por endocitosis, lo que acaba produciendo la liberación de la cadena A en el citoplasma. La cadena A es una N-glicosidasa que escinde la adenina de un nucleósido de adenosina concreto del rRNA de 28S. La eliminación de la base adenina desactiva por completo el ribosoma, ya que evita la unión de los factores de elongación. De este modo, tanto la ricina como la toxina de la difteria actúan inhibiendo la fase de elongación de la síntesis de proteínas; la ricina lo hace modificando covalentemente el rRNA y la toxina de la difteria lo hace modificando covalentemente el factor de elongación.  ■

40.5 Los ribosomas unidos al retículo endoplasmático sintetizan proteínas de membrana y proteínas que van a ser secretadas

Figura 40.17  Ribosomas unidos al retículo endoplasmático.  En esta micrografía electrónica, los ribosomas aparecen como pequeños puntos negros unidos al lado citoplasmático del retículo endoplasmático que le confieren una apariencia rugosa. Por el contrario, el retículo endoplasmático liso está desprovisto de ribosomas. [Tomada de G. K. Voletz, M. M. Rolls, y T. A. Rapoport, EMBO Rep. 3:944–950, 2002.]

700

No todas las proteínas recién sintetizadas están destinadas a funcionar en el citoplasma. En E. coli, una proteína recién sintetizada puede permanecer en el citoplasma o puede ser enviada a la membrana plasmática, a la membrana externa, al espacio que hay entre ellas o al medio extracelular. Las células eucarióticas pueden dirigir las proteínas a destinos internos como las mitocondrias, el núcleo y el retículo endoplasmático, un proceso denominado tráfico intracelular de proteínas o envío de las proteínas a su punto de destino. ¿Cómo se consigue enviar proteínas a su punto de destino? Hay dos mecanismos generales que permiten enviar las proteínas a su destino. En un mecanismo, la proteína se sintetiza en el citoplasma y, después, la proteína completa se envía a su destino intracelular de forma post-traduccional. Las proteínas destinadas al núcleo, cloroplastos, mitocondrias y peroxisomas son enviadas mediante este proceso general. El otro mecanismo, denominado la ruta secretora, dirige las proteínas al retículo endoplasmático (RE), el extenso sistema de membranas que representa aproximadamente la mitad de las membranas de una célula, de forma cotraduccional —es decir, mientras se está sintetizando la proteína. Las proteínas enviadas a su destino por la ruta secretora incluyen las proteínas de secreción, las residentes en el RE, en el aparato de Golgi, en los lisosomas, las proteínas integrales de la membrana de estos orgánulos, así como las proteínas integrales de la membrana plasmática. Centraremos nuestra atención únicamente en la ruta secretora. En las células eucarióticas, un ribosoma se encuentra libre en el citoplasma a menos que vaya dirigido al retículo endoplasmático. La región que se une a ribosomas se denomina RE rugoso debido a su apariencia granulosa, como ya se comentó en el Capítulo 1, que le diferencia del RE liso, que está desprovisto de ribosomas (Figura 40.17).


40.5  Ribosomas unidos a membrana 701

La síntesis de proteínas comienza en ribosomas que se encuentran libres en el citoplasma La síntesis de proteínas enviadas a su destino por medio de la ruta secretora comienza en un ribosoma libre, pero, poco después de comenzar, la síntesis se detiene hasta que el ribosoma sea dirigido al lado citoplasmático del retículo endoplasmático. Cuando el ribosoma se adhiere a la membrana, la síntesis de proteínas se reanuda. A medida que la cadena polipeptídica recién formada abandona el ribosoma, es trasportada a través de la membrana hacia el lumen del retículo endoplasmático. Los ribosomas libres que están sintetizando las proteínas que se van a utilizar dentro de la células son idénticos a los que están unidos al RE. ¿Qué proceso es el que hace que los ribosomas que están sintetizando una proteína destinada al interior del RE se unan al RE?

Las secuencias señal identifican las proteínas que tienen que ser translocadas a través de la membrana del retículo endoplasmático La maquinaria necesaria para dirigir un ribosoma el RE y translocar la proteína naciente a través del ER consta de cuatro componentes. 1. La secuencia señal. La secuencia señal es una secuencia de entre 9 y 12 residuos de aminoácidos hidrofóbicos que, algunas veces, contiene aminoácidos cargados positivamente. Normalmente, esta secuencia se encuentra cerca del extremo amino de la cadena polipeptídica naciente. La presencia de la secuencia señal identifica al péptido naciente como uno que debe atravesar la membrana del RE. Algunas secuencias señal se mantienen en la proteína madura, mientras que otras son escindidas por medio de una peptidasa de la señal en el lado de la membrana del ER orientado hacia el lumen (ver la Figura 40.18). 2. La partícula que reconoce la señal (SRP). La SRP reconoce la secuencia señal y se une a la secuencia y al ribosoma tan pronto como la secuencia señal asoma por fuera del ribosoma. A continuación, la SRP conduce el ribosoma y su cadena polipeptídica naciente hacia la membrana del RE. Al igual que las proteínas G consideradas anteriormente, la SRP es una proteína que se une al GTP y que tiene actividad GTPasa. La SRp se une a todos los ribosomas, pero solo se une con fuerza a los ribosomas que muestran la secuencia señal. Por tanto, la SRP chequea todos los ribosomas hasta que localiza uno que presenta la secuencia señal. Cuando la SRP se encuentra unida a la secuencia señal, las interacciones entre el ribosoma y la SRP ocluyen el lugar de unión al EF, deteniendo así la síntesis de proteínas. 3. El receptor de SRP. El complejo ribosoma-SRP difunde hacia el retículo endoplasmático, donde SRP se une al receptor de SRP (SR), una proteína integral de la membrana que consta de dos subunidades, una de las cuales es, al igual que SRP, una GTPasa. 4. El translocón. El complejo SRP-SR conduce al ribosoma hasta la maquinaria de translocación, denominada translocón, un ensamblaje de múltiples subunidades de proteínas integrales de la membrana y de proteínas periféricas. El translocón es un canal por el que se introducen proteínas. Este canal se abre cuando el translocón y el ribosoma se encuentran unidos. La síntesis de proteínas se reanuda, y la cadena polipeptídica naciente pasa hacia el lumen del RE a través del canal que forma el translocón. La Figura 40. 18 muestra las interacciones entre los componentes de la maquinaria de translocación. Tanto SRP como SR contienen moléculas de GTP que, cuando se unen las dos proteínas, se encuentran alineadas en un centro activo compartido. Cuando el ribosoma ha sido entregado al translocón, las moléculas de GTP se hidrolizan, SRP y SR se disocian y la SRP queda libre para buscar otra secuencia señal y comenzar un nuevo ciclo. De este modo, la SRP actúa de forma catalítica. La peptidasa de la señal, que se encuentra asociada al translocón en el lumen del RE, escinde la secuencia señal de la mayor parte de las proteínas. Posteriormente, las proteínas que ahora se encuentran en el lumen del retículo endoplasmático serán introducidas en vesículas de transporte. Las vesículas de transporte emergen del retículo endoplasmático y son dirigidas hacia diversos lugares de la célula.

?

PREGUNTA RÁPIDA 2  ¿Qué cuatro

componentes son necesarios para la translocación de proteínas a través de la membrana del retículo endoplasmático?


mRNA

5

1

SRP

2

N Secuencia señal

Membrana del RE

5

4

Receptor de SRP Citoplasma

3

GDP + Pi

3

GTP

α

6

GDP + Pi

7

GTP

β

Lumen del RE

8

Translocón (cerrado)

Translocón (abierto)

Peptidasa de la señal Secuencia señal escindida

Proteína plegada

Figura 40.18  El ciclo de la SRP. (1) La síntesis de proteínas comienza en los ribosomas libres. (2) Cuando la secuencia señal asoma por el ribosoma, se une a la partícula que reconoce la señal (SRP) y la síntesis de proteínas se detiene. (3) El complejo SRP-ribosoma se acopla al receptor de SRP integrado en la membrana del RE. (4) El complejo ribosoma-polipéptido naciente se transfiere al translocón. La SRP y el receptor de SRP hidrolizan de forma simultánea el GTP que tienen unido. Se reanuda la síntesis de proteínas y la SRP queda libre para unirse a otra secuencia señal. (5) La peptidasa de la señal puede eliminar la secuencia señal a medida que se interna en el lumen del RE. (6) La síntesis de proteínas prosigue y la proteína se sintetiza directamente en el interior del RE. (7) Al completarse la síntesis de proteínas, el ribosoma se libera y el túnel para proteínas del translocón se cierra. [Tomada de H. Lodish y col., Molecular Cell Biology, 6.ª ed. (W. H. Freeman and Company, 2008), Fig. 13.6.]

✓✓7  Explicar cómo se regula la síntesis de proteínas.

40.6 La síntesis de proteínas se regula mediante una serie de mecanismos La síntesis de proteínas se puede controlar en varias etapas del proceso de traducción. Veremos primero cómo se controla la síntesis de proteínas por medio del hierro, un nutriente esencial necesario para la síntesis de hemoglobina, citocromos y muchas otras proteínas. Recordemos que el hierro es un componente clave de la cadena respiratoria, la principal fuente de ATP en los organismos aeróbicos (Capítulo 20). Sin embargo, un exceso de hierro puede ser bastante perjudicial porque, desprovisto de un entorno proteico adecuado, el hierro puede iniciar una serie de reacciones que generan radicales libres que pueden dañar proteínas, lípidos y ácidos nucleicos. A lo largo de la evolución, los animales han desarrollado sofisticados sistemas para acumular hierro en tiempos de escasez y para almacenar los excedentes de hierro de forma segura para su posterior utilización. Entre las proteínas más importantes se encuentran la transferrina, una proteína que transporta hierro en el torrente sanguíneo, el receptor de la transferrina, una proteína de membrana que se une a la transferrina cargada de hierro e inicia su entrada en las células y la ferritina, una proteína que almacena hierro de forma extraordinariamente eficaz y que se encuentra principalmente en el hígado y en los riñones.

El uso del RNA mensajero está sujeto a regulación Durante la respuesta a cambios en la concentración de hierro, los niveles de expresión de la ferritina y del receptor de la transferrina están inversamente relacionados. Cuando hay escasez de hierro, aumenta la cantidad de receptor de la transferrina y no se sintetiza nueva ferritina, o se sintetiza muy poca. Curiosamente, la síntesis del

702


40.6  Regulación de la síntesis de proteínas 703

mRNA para estas proteínas no se modifica de forma acorde. En vez de ello, la regulación tiene lugar a nivel de la traducción. Consideremos primero la ferritina. El mRNA de la ferritina contiene en su región 59 no traducida una estructura tallo-bucle denominada elemento de respuesta al hierro (IRE) (Figura 40.19). Esta estructura tallo-bucle se une a una proteína denominada proteína de unión a IRE (IRE-BP), que bloque la iniciación de la traducción. Cuando los niveles de hierro aumentan, la IRE-BP se une al hierro. La IRE-BP se encuentra unida al hierro no se puede unir al RNA, porque los lugares de unión al hierro y al RNA se solapan de forma considerable. Por tanto, en presencia de hierro, el mRNA para la ferritina se libera de la IRE-BP y se traduce produciendo ferritina, que se encarga de hacer acopio del exceso de hierro. A C A A C U U C G C U G A G G

G

.U .G .U .U .G .G .A .C .C .G .C .U .C .C

C Elemento de respuesta al hierro

5′-

Figura 40.19  El elemento de respuesta al hierro.   El mRNA para la ferritina incluye

Región codificante

en su región 59 no traducida una estructura tallo-bucle denominada elemento de respuesta al hierro (IRE). El IRE se une a una proteína específica que bloquea la traducción de este mRNA cuando la concentración de hierro es baja.

-3′

La estabilidad del RNA mensajero también se puede regular El mRNA para el receptor de la transferrina también tiene varias regiones parecidas al IRE. A diferencia de las del mRNA para la ferritina, estas regiones se encuentran en la región 39 no traducida en vez de en la región 59 no traducida (Figura 40.20). Cuando la concentración de hierro es reducida, IRE-BP se une a estos IRE. Sin embargo, dada la ubicación de estos lugares de unión, el mRNA para el receptor de la transferrina todavía se puede traducir. ¿Qué ocurre cuando los niveles de hierro aumentan y el IRE-BP ya no se une al mRNA para el receptor de la transferrina? Liberado de la IRE-BP, el mRNA para el receptor de la transferrina se degrada rápidamente. Por tanto, un aumento de los niveles celulares de hierro da lugar a la destrucción del mRNA para el receptor de la transferrina y, por consiguiente, a una reducción de la producción del receptor de la transferrina. La IRE-BP actúa como un sensor de hierro. Si hay suficiente hierro presente como para unirse a IRE-BP, se sintetizará ferritina para almacenar el hierro. Análogamente, si hay hierro suficiente como para ser almacenado, no se necesita producir el receptor que se encarga de absorberlo. Una señal ambiental —la concentración de hierro— controla la traducción de las proteínas necesarias para el metabolismo de este metal. Elementos de respuesta al hierro

Figura 40.20  mRNA para el receptor de la transferrina.  Este mRNA tiene una serie 5′-

Región codificante

-3′

Los RNA pequeños pueden regular la estabilidad del RNA mensajero y su utilización En los últimos años, se ha descubierto un mecanismo totalmente nuevo para la regulación de la síntesis de proteínas. En un principio, la ribointerferencia (RNAi) se consideró un proceso que daba lugar a la degradación del mRNA, inducido por la presencia de moléculas de RNA de doble hebra (dsRNA). La RNAi, observada en todos los eucariotas, puede haber surgido a lo largo de la evolución como un mecanismo protector contra los virus que en algún punto de su ciclo vital utilizan dsRNA. En la RNAi, una RNasa denominada Dicer, escinde los RNA de doble hebra generando

de elementos de respuesta al hierro (IRE) en su región 39 no traducida. Cuando la proteína de unión a los IRE se une a estos elementos, estabiliza el mRNA pero no interfiere en su traducción.


704  40 El mecanismo de la síntesis de proteínas fragmentos de 21 nucleótidos. Los componentes de hebra sencilla de los productos de la escisión, denominados RNA interferentes pequeños (siRNA) se unen a miembros de una clase de proteínas que se conoce con el nombre de familia Argonauta formando un complejo silenciador inducido por el RNA (RISC). Este complejo utiliza el siRNA de hebra sencilla para localizar y degradar los mRNA complementarios. La investigación de la RNAi condujo al descubrimiento de una nueva clase de moléculas de RNA que regulan la expresión génica de forma post-transcripcional. Mientras que los siRNA proceden de un RNA exógeno (de un virus o introducido experimentalmente), los micro RNA (miRNA) son una clase de RNA no codificantes que se generan a partir de precursores más grandes, genéticamente codificados. Estas moléculas de RNA con una longitud de ~21 nucleótidos se escinden de forma similar a la descrita en el proceso de RNAi. Un procesamiento más intenso da lugar a la degradación de una de las hebras de este dsRNA de ~21 pares de bases; la otra hebra se asocia con Argonauta formando RISC, que también se denomina microRNP (miRNP). Se cree que el complejo funciona de una de las dos formas posibles. Si el Figura 40.21  El microRNA en acción.   Los microRNA se unen a miembros de la familia Argonauta, y su función consiste en localizar moléculas específicas de mRNA para escindirlas.

Segmentos escindidos del mRNA

miRNA

mRNA Argonauta

RNA pequeño que forma parte del complejo se une a un mRNA mediante pares de bases exactos de tipo Watson-Crick, el mRNA se destruye (Figura 40.21). Si la complementariedad no es exacta, el mRNA, sencillamente, no se traduce. En cualquiera de las dos formas de actuación, se inhibe la síntesis de proteínas. Al principio, se pensó que la regulación génica mediante miRNA estaba limitada a un pequeño número de especies. Sin embargo, estudios posteriores han puesto de manifiesto que esta forma de regulación génica es prácticamente ubicua en eucariotas. De hecho, se han identificado más de 700 miRNA codificados en el genoma humano. Cada miRNA puede regular muchos genes distintos porque en cada mRNA hay muchas secuencias diana distintas. Se ha estimado que el 60% de todos los genes humanos están regulados por uno o más miRNA. Se demostrado que los microRNA regulan una amplia gama de procesos bioquímicos, entre los que se incluyen el desarrollo, la diferenciación celular y la oncogénesis —el desarrollo del cáncer. El descubrimiento de los RNA pequeños que regulan la expresión génica es uno de los descubrimientos bioquímicos más apasionantes de los últimos años. El esclarecimiento del mecanismo de acción exacto de estos RNA es un área activa de la investigación bioquímica.

Resumen 40.1 La síntesis de proteínas descodifica la información del mRNA La síntesis de proteínas se lleva a cabo en tres fases: iniciación, elongación y terminación. En bacterias, el mRNA, el formilmetionil-tRNAf (el tRNA iniciador especial que reconoce AUG) y una subunidad ribosómica de 30S se asocian con la ayuda de los factores de iniciación para formar un complejo de iniciación de 30S. Después, este complejo se une a una subunidad ribosómica de 50S para formar un complejo de iniciación de 70S, en el que el fMet-tRNAf ocupa el lugar P del ribosoma. El factor de elongación Tu suministra los aminoacil-tRNA apropiados al lugar A (aminoacil) del ribosoma en forma de un complejo ternario EF-Tuaminoacil-tRNA-GTP. El EF-Tu actúa protegiendo el aminoacil-tRNA de una hidrólisis prematura e incrementando la fidelidad de la síntesis de proteínas, ya que garantiza la formación del emparejamiento correcto anticodón-codón antes de que se hidrolice el GTP y se libere el aminoacil-tRNA en el lugar A. 40.2 La peptidiltransferasa cataliza la síntesis de enlaces peptídicos Cuando el grupo amino del aminoacil-tRNA ataca el enlace éster del peptidil-tRNA se forma un enlace peptídico. El ribosoma cataliza la formación del


Resumen 705

enlace peptídico utilizando la catálisis de proximidad y orientación, y estabilizando el estado de transición. Una vez formado el enlace peptídico, los tRNA y el mRNA se tienen que translocar para que pueda comenzar el siguiente ciclo. El tRNA desacilado se desplaza al lugar E para, después, abandonar el ribosoma, y el peptidil-tRNA se traslada del lugar A al lugar P. El factor de elongación G utiliza la energía libre de la hidrólisis del GTP para impulsar la translocación. La síntesis de proteínas termina gracias a los factores de liberación, que reconocen los codones de terminación UAA, UGA y UAG y provocan la hidrólisis del enlace éster que une el polipéptido al tRNA.

40.3 Las bacterias y los eucariotas difieren en la iniciación de la síntesis de proteínas En eucariotas, el esquema básico de la síntesis de proteínas es similar al de las bacterias, aunque hay algunas diferencias significativas. Los ribosomas eucarióticos (80S) están formados por una subunidad pequeña de 40 S y por una subunidad grande de 60 S, De nuevo, el aminoácido iniciador es la metionina, pero no está formilada. La iniciación de la síntesis de proteínas es más compleja en eucariotas que en bacterias. Casi siempre, el codón AUG más próximo al extremo 59 del mRNA es el punto de partida. La subunidad de 40S del ribosoma encuentra este lugar uniéndose al capuchón 59 y, posteriormente, escaneando el RNA hasta encontrar la secuencia AUG. El mRNA eucariótico forma un círculo mediante interacciones entre el factor eucariótico de iniciación 4 y la proteína que se une a poli(A). 40.4 Diversas biomoléculas pueden inhibir la síntesis de proteínas La síntesis de proteínas es el lugar donde actúa una serie de antibióticos. Casi todos los aspectos de la síntesis de proteínas son sensibles a un antibiótico o a otro. El hecho de que muchos antibióticos actúen sobre la síntesis de proteínas bacteriana pero no en la eucariótica, les convierte en sustancias muy útiles desde el punto de vista clínico. Toxinas como la de la difteria o la ricina son letales porque inhiben la síntesis de proteínas. La toxina de la difteria modifica y desactiva un factor proteico, mientras que la ricina elimina una base del rRNA de 18S, con lo que anula su actividad catalítica. 40.5 Los ribosomas unidos al retículo endoplasmático sintetizan proteínas de membrana y proteínas que van a ser secretadas Las proteínas contienen señales que determinan su destino final. En eucariotas, algunas proteínas son transportadas a orgánulos, como las mitocondrias y los núcleos, de forma post-traduccional. Otras proteínas, siguiendo la ruta secretora, se adentran en el retículo endoplasmático de forma cotraduccional. La síntesis de proteínas se lleva a cabo en el citoplasma, a menos que la cadena naciente presente una secuencia señal que dirija el ribosoma al retículo endoplasmático. Las secuencias señal amino terminales constan de un segmento hidrofóbico de entre 10 y 15 residuos, precedida de una región básica. Una partícula que reconoce la señal (SRP) detecta las secuencias señal y conduce los ribosomas que las contienen hacia el RE. Un ciclo GTP-GDP libera la secuencia señal de la SRP y, posteriormente, disocia la SRP de su receptor. A continuación, la cadena naciente es translocada a través de la membrana del RE. 40.6 La síntesis de proteínas se regula mediante una serie de mecanismos En eucariotas, los genes que codifican proteínas que transportan y almacenan el hierro están regulados a nivel de la traducción. Los elementos de respuesta al hierro (IRE), estructuras presentes en determinadas moléculas de mRNA, se unen a la proteína de unión a IRE cuando no se encuentra unida al hierro. Que la expresión de un gen se estimule o se inhiba en respuesta a cambios en los niveles de hierro de una célula depende de la ubicación del IRE en el mRNA. Recientemente se han descubierto unos microRNA que también pueden regular la síntesis de proteínas, bien provocando la degradación del RNA o bien inhibiendo la traducción del mRNA.


706  40 El mecanismo de la síntesis de proteínas

Términos clave subunidad de 30S (p. 690) subunidad de 50S (p. 690) secuencia de Shine-Dalgarno (p. 691) factor de iniciación (p. 692) factor de elongación Tu (EF-Tu) (p. 692) factor de elongación Ts (EF-Ts) (p. 693) centro peptidiltransferasa (p. 693) factor de elongación G (EF-G) (p. 693)

?

polisoma (p. 694) factor de liberación (p. 695) envío de proteínas a su destino (p. 700) secuencia señal (p. 701) peptidasa de la señal (p. 701) partícula que reconoce la señal (SRP) (p. 701) receptor de SRP (SR) (p. 701)

translocon (p. 701) transferrin (p. 702) transferrin receptor (p. 702) ferritin (p. 702) iron-response element (IRE) (p. 703) IRE-binding protein (IRE-BP) (p. 703) RNA interference (RNAi) (p. 703) microRNA (miRNA) (p. 704)

Respuestas a las PREGUNTAS RÁPIDAS

1.  Factores proteicos modulan la iniciación de la síntesis de proteínas. El papel de IF1 y de IF3 consiste en evitar la unión prematura de las subunidades ribosómicas de 30S y de 50S, mientras que IF2 suministra el Met-tRNAf al ribosoma. También se necesitan factores proteicos para la elongación (EF-G y EF-Tu), para la terminación (factores de liberación, RF) y para la disociación del ribosoma (factores de liberación del ribosoma, RRF).

2.  La secuencia señal, la partícula que reconoce la señal (SRP), el receptor de SRP y el translocón.

Problemas 1. La torre de Babel. ¿Por qué la síntesis de proteínas también se denomina traducción? 2. Frases correctas. ¿Qué quiere decir el término pauta de lectura? 3. Emparéjelos. Relacione cada término de la derecha con los términos a, b o c de la izquierda. ✓ 3 y 4 (a)  Iniciación _______ (b)  Elongación _______ (c)  Terminación _______

 1. GTP  2. AUG  3. f Met  4. RRF  5. IF2  6. Shine–Dalgarno  7. EF-Tu  8. Peptidiltransferasa  9. UGA 10. Transformilasa

4. ¿Esfuerzo baldío? Las moléculas de RNA de transferencia son bastante grandes, teniendo en cuenta que el anticodón solo contiene tres nucleótidos. ¿Cuál es la función del resto de la molécula de tRNA? ✓  3 5. Ribosomas ligeros y pesados. La centrifugación en gradiente de densidad es una técnica que permite la separación de moléculas biológicas y de complejos moleculares en función de diferencias en la densidad. Se aislaron ribosomas a partir de bacterias cultivadas en un medio “pesado” (13C y 15N) y a partir de bacterias cultivadas en un medio “ligero” (12C y 14N). Se añadieron estos ribosomas de 70S a un sistema in vitro en el que se estaba llevando a cabo la síntesis de proteínas. Varias horas más tarde, se extrajo una alícuota y se analizó mediante centrifugación en gradiente de densidad. ¿Cuántos tipos de ribosomas de 70S de distinta densidad esperaría encontrar en el gradiente de densidad? ✓ 4 y 5

6. El precio de la síntesis de proteínas. ¿Cuál es el mínimo número de moléculas de ATP y GTP que se consumen durante la síntesis de una proteína de 200 residuos, partiendo de los aminoácidos? Al hacer este cálculo, considere que la hidrólisis del PPi es equivalente a la hidrólisis del ATP. 7. Mutación vírica. Un transcrito de mRNA de un gen del fago T7 presenta la siguiente secuencia de bases T 5-AACUGCACGAGGUAACACAAGAUGGCU-3 Pronostique el efecto de una mutación que cambie la G marcada por la flecha por una A. ✓  3 8. Aumentando la fidelidad. Compare la precisión de (a) la replicación del DNA, (b) la síntesis de RNA y (c) la síntesis de proteínas. ¿Qué mecanismos se utilizan para garantizar la fidelidad de cada uno de estos procesos? ✓  4 9. Hay que saber dónde mirar. Normalmente, los RNA mensajeros bacterianos contienen muchos codones AUG. ¿Cómo identifica el ribosoma el AUG que especifica la iniciación? ✓ 4

y5

10. Desencadenado por la hidrólisis del GTP. Los ribosomas aceleran notablemente la hidrólisis del GTP unido al complejo formado por el EF-Tu y el aminoacil-tRNA. ¿Cuál es la relevancia biológica de esta intensificación de la actividad GTPasa por parte de los ribosomas? ✓  4 11. Bloqueando la traducción. Diseñe una estrategia experimental para interrumpir la expresión de un mRNA específico sin cambiar el gen que codifica la proteína o los elementos de control del gen. ✓  3 12. Problema direccional. Suponga que dispone de un sistema de síntesis de proteínas que está sintetizando una proteína que


Problemas 707

14. Básicamente es lo mismo, pero ... Enumere las diferencias que hay entre la síntesis de proteínas bacteriana y la síntesis de proteínas eucariótica. ✓  6 15. Transporte a través de membranas. ¿Qué cuatro componentes se necesitan para la translocación de proteínas a través de la membrana del retículo endoplasmático? ✓  4 16. Como un perro pastor. ¿Cuál es la función de la partícula que reconoce la señal en la translocación de proteínas? ✓  4 y 5 17. Empujar, no tirar. ¿Cuál es la fuente de energía que impulsa el movimiento cotraduccional de proteínas a través de la membrana del retículo endoplasmático? ✓  5 18. Cadena de montaje. ¿Por qué es ventajoso el hecho de que la síntesis de proteínas se lleve a cabo por medio de polisomas? ✓  5 19. Regulación del hierro. ¿Qué efecto esperaría observar tras la adición de un elemento de respuesta al hierro (IRE) al extremo 59 de un gen que normalmente no esté regulado por los niveles de hierro? ¿Y si lo añade en el extremo 39? ✓  7 20. Pronosticando la regulación mediante microRNA. Suponga que ha identificado un miRNA que tiene la secuencia 59-GCCUAGCCUUAGCAUUGAUUGG-39. Proponga una estrategia para identificar el mRNA que podría estar regulado por este miRNA, conociendo las secuencias de todos los mRNA codificados por el genoma humano. ✓  7 Problemas de integración de capítulos

21. Dèjá vu. ¿Qué proteína de las cascadas de proteínas G desempeña un papel similar al factor de elongación Ts? ✓  4 22. Parecido familiar. El factor de elongación eucariótico 2 se inhibe por la ADP-ribosilación catalizada por la toxina de la difteria. ¿Qué otras proteínas G son sensibles a esta forma de inhibición?

(a) Síntesis de glucógeno (d) Síntesis de DNA (b) Síntesis de ácidos grasos (e) Síntesis de RNA (c) C5 S C10 S C15 en la síntesis (f) Síntesis de de colesterol proteínas X

+

X

X

X

+

+

X

X

+

X

Tipo 1

X

Tipo 2

24. El paso final. ¿Qué aspecto de la estructura primaria permite transferir la información lineal de los ácidos nucleicos a la estructura tridimensional funcional de las proteínas? Problemas de interpretación de daos para atrevidos

25. Helicasa ayudante. El factor de iniciación eIF-4 presenta actividad RNA helicasa dependiente de ATP. Se ha propuesto que otro factor de iniciación, eIF-4H, ayuda en la actividad de eIF-4. El gráfico A muestra algunos resultados experimentales obtenidos mediante un ensayo que puede medir la actividad de la helicasa eIF-4 en presencia de eIF-4H. ✓  4 Hélices desenrolladas (fmol)

13. Dispositivo temporizador. El EF-Tu, un miembro de la familia de proteínas G, desempeña un papel fundamental en la fase de elongación de la traducción. Supongamos que se añade un análogo del GTP que se hidroliza lentamente a un sistema que está en fase de elongación. ¿Cuál sería el efecto sobre la velocidad de síntesis de proteínas? ✓  4

23. Comparando formas de elongación. En la ilustración adjunta se representan dos mecanismos básicos para la elongación de biomoléculas. En el tipo 1, el grupo activador (X) se libera de la cadena creciente. En el tipo 2, el grupo activador se libera de la unidad entrante a medida que se incorpora a la cadena creciente. Indique si cada una de las siguientes biosíntesis se lleva a cabo mediante un mecanismo de tipo 1 o de tipo 2:

(A)

eIF-4A + eIF-4H

30

20

Solo eIF-4A

10

Solo eIF-4H 0

2

4

6

8

10

Tiempo (minutos)

12

14

16

(a) ¿Qué efectos produce la presencia de eIF-4H sobre la actividad helicasa de eIF-4? (b) ¿Por qué la medida de la actividad helicasa de eIF-4H sola es un importante experimento control? (c) Después, se midió la velocidad inicial de la actividad helicasa de 0,2 mM eIF-4 en presencia de cantidades variables de eIF-4H (gráfico B) ¿Qué proporción entre eIF-4H y eIF-4 dio lugar a la actividad óptima? Velocidad inicial de desenrollamiento de las hélices (fmoles minuto−1)

llamaremos A. Además, se sabe que la proteína A tiene cuatro lugares sensibles a la tripsina, situados a la misma distancia uno de otro, y que la digestión con tripsina genera los péptidos A1, A2, A3, A4 y A5. El péptido A1 es el péptido amino terminal y el péptido A5 es el péptido carboxilo terminal. Por último, se sabe que el sistema necesita 4 minutos para sintetizar una proteína A completa. A t = 0, se añaden los 20 aminoácidos, todos ellos marcados con 14C. ✓  4 (a) A t = 1 minuto, se aísla la proteína A intacta del sistema, se corta con tripsina y se aíslan los cinco péptidos. ¿Cuál es el péptido marcado con más intensidad?? (b) A t = 3 minutos, ¿cuál será el orden de marcaje de los péptidos, de más pesado a más ligero? (c) ¿Qué nos indica este experimento sobre la dirección en que se lleva a cabo la síntesis de proteínas?

(B)

6

4

2

0

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

eIF-4H añadido ( M)

0,30

0,35

0,40


708  40 El mecanismo de la síntesis de proteínas

(C)

OD 254

0,06

2,0

eIF-4A + eIF-4H

0,04

0,02

1,5

Solo eIF-4A 1,0

0,00 0,5 −15

−18

−21

−24

Estabilidad de la hélice (G en kcal mol −1)

−27

(e) ¿Cómo afectaría el eIF-4H a la actividad helicasa de eIF4A? [Datos tomados de N. J. Richter, G. W. Rodgers, Jr., J. O. Hensold, y W. C. Merrick. Further biochemical and kinetic characterization of human eukaryotic initiation factor 4H. J. Biol. Chem. 274:35415–35424, 1999.]

26. Separación por tamaños. Se aisló la maquinaria para la síntesis de proteínas a partir de células eucarióticas y se trató brevemente con una baja concentración de RNasa. Después, se sometió la muestra a una centrifugación en gradiente de sacarosa. El gradiente se fraccionó y se midió la absorbancia, o densidad óptica (OD), a 254 nm de cada fracción. Se obtuvieron los datos mostrados en la gráfica A.✓  4

0

20

60

80

100

Parte inferior

Antes de aislar la maquinaria de síntesis de proteínas, se cultivaron las células a bajas concentraciones de oxígeno (condiciones de hipoxia). De nuevo, se repitió el experimento omitiendo el tratamiento con RNasa (gráfica C). 0,06

0,04

0,02

0,00

0

20

(C) Parte superior

0,06

40

(B) Parte superior

OD 254

ln (velocidad inicial de desenrollamiento de las hélices)

(d) A continuación, se ensayó el efecto de la estabilidad de la hélice RNA-RNA sobre la velocidad inicial de desenrollamiento en presencia y en ausencia de eIF-4H (gráfico C). ¿Cómo varía el efecto de eIF-4H en función de la estabilidad de la hélice?

40

60

80

100

Parte inferior

OD 254

(c) ¿Cuál es el efecto de hacer crecer las células en condiciones de hipoxia? [Datos tomados de M. Koritzinsky y col. EMBO J. 25:1114–1125, 2006.]

0,04

27. Suprimiendo los cambios en la pauta de lectura. La inserción de una base en una secuencia codificante da lugar a un cambio en la pauta de lectura que, en la mayoría de los casos, genera una proteína que no funciona. Proponga una mutación en un tRNA que elimine el cambio de la pauta de lectura.

0,02

0,00

0

20

(A) Parte superior

40

60

80

100

Parte inferior

(a) ¿Qué representan los tres picos de absorbancia de la gráfica A? Se repitió el experimento, aunque esta vez, se omitió el tratamiento con la RNasa. (b) ¿Por qué el patrón obtenido tras la centrifugación que se muestra en la gráfica B es más complejo? ¿Qué representa la serie de picos que aparecen cerca del fondo del tubo de centrífuga?

28. Ataque molecular. ¿Cuál es el nucleófilo en la reacción catalizada por la peptidiltransferasa? Sugiera un posible mecanismo para esta reacción. ✓  5 29. La increíble E. coli. A diferencia de lo que ocurre en E. coli, la mayoría de las bacterias no contienen una dotación completa de aminoacil-tRNA sintetasas. Por ejemplo, Helicobacter pylori, la bacteria que provoca úlceras de estómago, tiene tRNAGln, pero carece de Gln-tRNA sintetasa. Sin embargo, la glutamina es un aminoácido frecuente en las proteínas de H. pylori. Sugiera un mecanismo mediante el cual se pueda incorporar la glutamina a las proteínas de H. pylori. (Pista: la Gln-tRNA sintetasa puede acilar mal el tRNAGln.) ✓  4

En la dirección www.whfreeman.com/tymoczko2e se pueden encontrar lecturas recomendadas para este capítulo.


C a p í t u l o

41

Tecnología del DNA recombinante

41.1 La genética inversa permite la síntesis de ácidos nucleicos a partir de una secuencia de proteína

41.2 La tecnología del DNA recombinante ha revolucionado todos los aspectos de la biología

41.3 Los genes eucarióticos se pueden manipular con una precisión considerable

A menudo, las enfermedades hereditarias son el resultado de un gen defectuoso o de un gen que falta. Uno de los objetivos de la bioquímica consiste en tratar este tipo de enfermedades sustituyendo el gen defectuoso por una versión funcional. En el ejemplo de manipulación de genes ilustrado aquí, se insertó en un embrión de ratón un gen recombinante formado por el gen de la actina, una proteína del citoesqueleto, unido al gen de la proteína fluorescente verde. La fotografía fluorescente del ratón muestra la localización de la proteína fluorescente verde (GFP) unida a las moléculas de actina. El pelo no contiene actina y, por tanto, no emite fluorescencia. [Dr. Charles Mazel/Visuals Unlimited/Corbis.]

C

uando hicimos un repaso de las técnicas experimentales en el Capítulo 5, nos centramos en la purificación de proteínas, en técnicas inmunológicas y en la determinación de la secuencia de aminoácidos. En este capítulo ampliaremos nuestro repertorio de técnicas para incluir aquellas que se utilizan con ácidos nucleicos —concretamente, las que forman parte de la tecnología del DNA recombinante. Seguiremos con nuestro estudio del receptor de estrógenos, un factor de transcripción que regula ciertos genes en respuesta a la presencia de la hormona esteroidea estradiol (p. 651). En este caso, utilizaremos la proteína receptora purificada para aislar el DNA que la codifica, para expresar el receptor en bacterias, para investigar la naturaleza de su gen y, después, para descubrir si existen parientes de esta proteína en otros organismos o proteínas similares en el mismo organismo.

41.1 La genética inversa permite la síntesis de ácidos nucleicos a partir de una secuencia de proteína En el Capítulo 5 purificamos el receptor utilizando anticuerpos monoclonales. ¿Cuál es el siguiente paso a la hora de caracterizar el receptor? Hay muchas posibles respuestas a esta pregunta, pero una especialmente frecuente es el aislamiento del DNA que codifica

709


710  41  Tecnología del DNA recombinante el receptor. Hay “bibliotecas” de secuencias de DNA en las que podemos buscar las secuencias que corresponden al receptor. Por ejemplo, una biblioteca de DNA complementario (cDNA) es una colección de secuencias de DNA que representa a todos los mRNA expresados por una célula. La enzima transcriptasa inversa utiliza el mRNA como molde para sintetizar una copia de DNA, o DNA complementario. Si podemos aislar el cDNA del receptor de estrógenos, podemos insertar el DNA en bacterias y las bacterias producirán el receptor de estrógenos para nuestros experimentos. ¿Cómo podemos encontrar el receptor de estrógenos en la biblioteca de cDNA? Podemos utilizar nuestro receptor de estrógenos purificado para generar una sonda que nos permita identificar las secuencias de DNA de la biblioteca que corresponden al receptor de estrógenos.

La secuencia de una proteína nos conduce a la información de los ácidos nucleicos En el Capítulo 5 analizamos las técnicas que se utilizan para secuenciar una proteína completa. Para buscar en bibliotecas de DNA necesitamos una sonda —un compuesto químico de algún tipo capaz de reconocer las secuencias de DNA que corresponden al receptor de estrógenos. Para generar sondas que nos permitan buscar el gen del receptor de estrógenos en una biblioteca de cDNA necesitamos conocer solo una parte de la estructura primaria del receptor. El conocimiento de la estructura primaria de una proteína permite utilizar la genética inversa —la generación de secuencias de DNA que corresponden a una parte de la secuencia de aminoácidos, en base al código genético. Estas secuencias de DNA se pueden utilizar como sondas para aislar el gen que codifica la proteína o el cDNA que corresponde al mRNA. Por ejemplo, la sonda de hebra sencilla se puede marcar radiactivamente para, después, mezclarla con bibliotecas de DNA. La sonda se emparejará, o hibridará, con una molécula de DNA complementaria, identificando la molécula de DNA como aquella que codifica la secuencia de la proteína que se utilizó para generar la sonda. Utilizando el receptor purificado como material de partida, podemos utilizar el procedimiento de degradación de Edman (p. 84) para determinar la secuencia de aminoácidos de una parte del receptor. Con esta información y una copia del código genético (p. 677) a mano, podemos convertir la información de la secuencia de una proteína en la información de una secuencia de ácido nucleico y, después, en una sonda de DNA.

Se pueden sintetizar sondas de DNA mediante métodos automatizados Se puede sintetizar una hebra de DNA mediante la adición secuencial de monómeros activados a una cadena creciente que esté unida a un soporte insoluble. Los monómeros activados son desoxirribonucleósido 39-fosforamiditas protonadas en las que todos los grupos reactivos del nucleótido, menos uno, están protegidos, ya que se encuentran unidos de forma provisional a grupos no reactivos. OCH3 Grupo dimetoxitritilo (DMT) C O

H3CO

H2 C

base (protegida)

O

O Grupo-cianoetilo (CE) NC

H2 C C H2

P O

N

C CH H

CH3 CH3

H3C CH3

Un desoxirribonucleósido 3-fosforoamidita al que se le han añadido los grupos DMT y CE


41.2  Tecnología del DNA recombinante 

711

En el paso número 1, el átomo de fósforo en posición 39 de esta unidad entrante se une a la cadena en crecimiento formando un triéster de fosfito (Figura 41.1). En el paso número 2, el triéster de fosfito se oxida por el iodo para estabilizar el nuevo enlace. En el paso número 3, se elimina el grupo protector del grupo OH en posición 59 de la cadena en crecimiento mediante la adición de ácido dicloroacético. En este momento, la cadena de DNA se ha alargado una unidad y está lista para otro ciclo de adición. Cada ciclo solo tarda unos pocos minutos y, normalmente, lleva a cabo la elongación de más del 99% de las hebras. base n + 1 CE

DMT

O

base n + 1 CE

O P

O

3

base n

NR2 + HO

3

5

O

Resina

1 Acoplamiento

DMT

3

O

5

Monómero activado

O

base n O P

O

5

3

O

5

Intermediario triéster de fosfito

Hebra en crecimiento

Oxidación por I2

Repeat

base n + 1

base n

CE

HO

3

O

base n + 1 CE

O P O

5

O

3

Resina

O

Resina

3 Ácido dicloroacético

DMT

O

5

Hebra alargada

3

5

O

2

base n O P O

O

3

O

Resina

5

Intermediario fosfotriéster

La capacidad para sintetizar de forma rápida hebras de DNA con cualquier secuencia seleccionada abre numerosas vías experimentales. Por ejemplo, un oligonucleótido sintético marcado en uno de sus extremos con 32P o con un marcador fluorescente puede ser utilizado para buscar una secuencia complementaria en una colección de secuencias de DNA. En nuestro experimento, prepararemos una sonda radiactiva de DNA que corresponda a una parte de la estructura primaria del receptor de estrógenos. Utilizaremos esta sonda para hacer búsquedas en colecciones de secuencias de DNA que codifiquen el receptor de estrógenos. Sin embargo, antes de hacerlo, tenemos que examinar las características prácticas del DNA que estamos buscando y, durante este proceso, examinaremos algunas de las herramientas de la tecnología del DNA recombinante.

Figura 41.1  Síntesis de una hebra de DNA por el método del triéster de fosfito.

41.2  La tecnología del DNA recombinante ha revolucionado todos los aspectos de la biología

✓  8  Enumerar las herramientas clave de la tecnología del DNA recombinante y explicar cómo se utilizan para clonar el DNA.

La tecnología del DNA recombinante, desarrollada a principios de la década de 1970, ha hecho que la biología pase de ser una ciencia exclusivamente analítica a ser una ciencia sintética. Aplicando la tecnología del DNA recombinante es posible construir en el laboratorio nuevas combinaciones de genes no relacionados. Estas nuevas combinaciones se pueden clonar —amplificar un gran número de veces— mediante su inserción en células adecuadas, donde serán replicadas por la maquinaria de síntesis de DNA del huésped. Con frecuencia, los genes introducidos se transcriben y se traducen en su nuevo entorno, dando lugar a proteínas que normalmente no se encontrarían en la célula huésped. Recordemos también que la tecnología del DNA recombinante permite a los investigadores eliminar genes específicos de un genoma (knock-out) o añadirlos (knock-in) (p. 622).

El monómero activado que se añade a la hebra en crecimiento es un desoxirribonucleósido 39--fosforamidita que contiene un grupo protector dimetoxitritilo (DMT) unido al átomo de oxígeno en posición 59, un grupo protector b-cianoetilo (bCE) unido al átomo de oxígeno del grupo fosforilo en posición 39 y un grupo protector en la base.


712  41  Tecnología del DNA recombinante

Las enzimas de restricción cortan el DNA generando fragmentos específicos

AUn palíndromo (del griego palindromos, ”volver sobre sus pasos”) es una palabra, frase o verso que se lee igual de izquierda a derecha que de derecha a izquierda (p. ej. radar).

Las enzimas de restricción son, quizás, las herramientas que han hecho posible el desarrollo de la tecnología del DNA recombinante. Las enzimas de restricción, también denominadas endonucleasas de restricción, reconocen determinadas secuencias de bases en el DNA de doble hélice y escinden las dos hebras por lugares específicos. Para los bioquímicos, estos bisturís de exquisita precisión constituyen un maravilloso regalo de la naturaleza. Son imprescindibles para analizar la estructura de los cromosomas, para secuenciar moléculas muy largas de DNA, para aislar genes y para crear nuevas moléculas de DNA que se puedan clonar. Se han encontrado enzimas de restricción en una amplia gama de bacterias. Su función biológica consiste en escindir y, por tanto, destruir moléculas foráneas de DNA, como el DNA de los virus que atacan bacterias (bacteriófagos). El DNA de la propia célula no se degrada porque las secuencias reconocidas por sus propias enzimas de restricción están metiladas. Muchas enzimas de restricción reconocen secuencias específicas de entre cuatro y ocho pares de bases, denominadas lugares de corte, e hidrolizan un enlace fosfodiéster en un lugar específico de cada una de las hebras en esta región. Una característica llamativa de estos lugares de corte es que casi siempre poseen simetría rotacional binaria. En otras palabras, la secuencia que reconocen es palindrómica, o una repetición invertida, y los lugares de corte se disponen simétricamente. Por ejemplo, la secuencia reconocida por una enzima de restricción de Streptomyces achromogenes es: Lugar de corte

5 G G A T C C 3 3 C C T A G G 5

5 G A A T T C 3 3 C T T A A G 5

5 G G C C 3 3 C C G G 5

5 G C G C 3 3 C G C G 5

5 C T C G A G 3 3 G A G C T C 5

BamHI

EcoRI

HaeIII

HhaI

XhoI

Figura 41.2  Especificidad de algunas endonucleasas de restricción. Las secuencias reconocidas por estas enzimas presentan un eje de simetría binario centrado en el punto de color verde. Los lugares de corte están señalados mediante flechas rojas. A la derecha de cada secuencia se indica el nombre abreviado de la enzima de restricción que la reconoce. Los cortes pueden ser escalonados o romos.

La agarosa es un polisacárido que se obtiene de las algas. Al calentarlo en agua se disuelve; al enfriarse, forma un gel que se utiliza como soporte para la electroforesis.

5 C

C

G

C

G

G 3

3 G

G

C

G

C

C 5

Lugar de corte

Eje de simetría

En cada hebra, la enzima escinde el enlace fosfodiéster C-G situado en el lado 39 del eje de simetría. Se han purificado y caracterizado cientos de enzimas de restricción. Sus nombres están formados por una abreviatura de tres letras que hace referencia al organismo de donde procede (p. ej., Eco para Escherichia coli, Hin para Haemophilus influenzae, Hae para Haemophilus aegyptius), seguida (si es preciso) de una indicación de la cepa en cuestión y de un número romano (en el caso de que se haya identificado más de una enzima de restricción a partir de la misma cepa). En la Figura 41.2 se muestra la especificidad de varias enzimas de este tipo. Las enzimas de restricción se utilizan para cortar moléculas de DNA en fragmentos específicos que puedan ser analizados y manipulados con más facilidad que la molécula completa original.

Los fragmentos de restricción se pueden separar y visualizar mediante electroforesis en gel Es posible detectar fácilmente pequeñas diferencias entre moléculas de DNA similares, ya que sus fragmentos de restricción se pueden separar y visualizar mediante electroforesis en gel. En el Capítulo 5, vimos el uso de la electroforesis en gel para separar moléculas de proteína. En principio, la electroforesis en gel de los ácidos nucleicos es parecida a la electroforesis en gel de proteínas. Sin embargo, al trabajar con ácidos nucleicos, la muestra no está desnaturalizada y, con frecuencia, el gel se elabora con agarosa en vez de con poliacrilamida. Como el esqueleto fosfodiéster del DNA posee gran cantidad de cargas negativas, esta técnica también resulta adecuada para separar fragmentos de ácidos nucleicos. En la mayoría de los geles, cuanto más corto sea el fragmento de DNA, mayor será la distancia que recorra. Los geles de poliacrilamida se utilizan para separar, en función de su tamaño, fragmentos con una longitud de hasta 1.000 pares de bases, mientras que para separar mezclas de fragmentos más grandes (de hasta 20 kb) se emplean geles de agarosa, más porosos. Una característica importante de estos geles es su elevado poder de resolución. En determinados tipos de gel se pueden distinguir fragmentos de varios cientos de nucleótidos cuya longitud difiere en un solo nucleótido. Las bandas o manchas que el DNA forma en los geles se pueden visualizar tiñendo el gel con bromuro de etidio, que emite una intensa fluorescencia de color naranja cuando se


encuentra unido a una molécula de DNA de doble hélice (Figura 41.3). Se puede ver fácilmente una banda que contenga tan sólo 50 ng de DNA. Es posible identificar un fragmento de restricción que contenga una determinada secuencia de bases hibridándolo con una hebra de DNA complementario marcada como, por ejemplo, nuestra sonda para el receptor de estrógenos (Figura 41.4). A partir de una mezcla, se separan los fragmentos de restricción mediante electroforesis en un gel de agarosa, se desnaturalizan para formar DNA de hebra sencilla y se transfieren a una lámina de nitrocelulosa. Las posiciones que ocupan los fragmentos de DNA en el gel se mantienen en la hoja de nitrocelulosa, donde son expuestos a una sonda de DNA de hebra sencilla, marcada con 32P. A continuación, se coloca una película de rayos X sobre la nitrocelulosa. La radiactividad de la sonda revelará (oscurecerá) la película de rayos X. Este proceso, denominado autorradiografía, permite determinar la posición del dúplex formado por el fragmento de restricción y la sonda. De esta manera se puede identificar con facilidad un fragmento concreto de entre una mezcla que contenga millones de fragmentos distintos. Esta poderosa técnica se conoce como transferencia Southern (“Southern blotting”), porque fue inventada por Edwin Southern.

A

B

C

Fragmentos de DNA

Figura 41.3  Patrón de una electroforesis en gel realizada tras una digestión con enzimas de restricción. Este gel muestra los fragmentos Electroforesis

Transferencia de DNA (“blotting”)

Adición de una sonda de DNA marcada con 32P

Visualización de la sonda de DNA

Autorradiografía

obtenidos tras cortar el DNA del virus SV40 con tres enzimas de restricción distintas. La fluorescencia de los fragmentos se debe a la tinción del gel con bromuro de etidio. [Cortesía del Dr. Jeffrey Sklar.]

Gel de agarosa

Lámina de nitrocelulosa

Autorradiograma

Figura 41.4  Transferencia Southern. Un fragmento de DNA que contiene una secuencia específica se puede identificar separando una mezcla de fragmentos por electroforesis, transfiriéndolos a nitrocelulosa e hibridándolos con una sonda complementaria a la secuencia buscada y que esté marcada con 32P. A continuación, el fragmento que contiene la secuencia buscada se visualiza por autorradiografía.

De forma similar, se pueden separar moléculas de RNA por electroforesis en gel y se pueden identificar secuencias concretas mediante hibridación, tras haber sido transferidas a nitrocelulosa. Esta técnica análoga para el análisis de RNA se ha denominado de forma un tanto caprichosa transferencia northern (“northern blotting”). Siguiendo con este juego de palabras se ha acuñado el término transferencia western (“western blotting”), que hace referencia a una técnica que permite detectar una proteína concreta tiñéndola con un anticuerpo específico (Capítulo 5). Las transferencias Southern, northern y western también se conocen como transferencias de DNA, de RNA y de proteínas, respectivamente.

Las enzimas de restricción y la DNA ligasa son herramientas clave para formar moléculas de DNA recombinante Comencemos por ver de qué manera se pueden construir nuevas moléculas de DNA en el laboratorio, a modo de preparación para, después, poder aislar el gen que codifica el receptor de estrógenos. Nuestro objetivo inmediato consiste en insertar el DNA que codifica el receptor en un segmento de DNA, denominado vector, que sea absorbido y replicado fácilmente por las bacterias. Las bacterias que contienen el DNA foráneo se pueden aislar, o clonar. A continuación, las bacterias clonadas pueden producir gran cantidad de proteínas receptoras con las que poder llevar a cabo experimentos. ¿Cómo construimos una molécula de DNA recombinante? Un fragmento de DNA que nos interese se une covalentemente a un DNA vector. La característica fun-

Las herramientas de la tecnología del DNA recombinante han inspirado a una serie de artistas. Íñigo Manglano-Ovalle utilizó fotografías de análisis del DNA para su Portrait of the Artist and His Parents (DNA Paternity Test), 1999. [Cortesía del artista.]

713


714  41  Tecnología del DNA recombinante damental de un vector es que se puede replicar de forma autónoma en un huésped apropiado. Los plásmidos (moléculas circulares de DNA que aparecen de forma natural en bacterias y que actúan como cromosomas accesorios) y el bacteriófago lambda (el fago l), un virus, son vectores de clonaje que se utilizan mucho con E. coli. La escisión del vector por un único lugar específico mediante una enzima de restricción lo puede dejar listo para aceptar un nuevo fragmento de DNA. Uno de los primeros vectores desarrollados fue el plásmido pSC101. La enzima de restricción EcoRI corta esta molécula circular de DNA de doble hélice de 9,9 kb por un único sitio. Los cortes escalonados que produce esta enzima generan extremos complementarios de una sola hebra que, como presentan afinidad específica entre sí, se conocen con el nombre de extremos cohesivos o pegajosos. Cualquier fragmento de DNA que tenga los mismos extremos cohesivos se puede insertar en este plásmido. Estos fragmentos se pueden obtener a partir de un fragmento más grande de DNA, utilizando la misma enzima de restricción que se utilizó para abrir el DNA del plásmido (Figura 41.5). GAATTC CTTAAG

GAATTC CTTAAG Escisión con la enzima de restricción EcoRI

Figura 41.5  Unión de moléculas de DNA por el método de los extremos cohesivos. Dos moléculas de DNA, cortadas con una misma enzima de restricción como, por ejemplo EcoRI,pueden unirse formando moléculas recombinantes.

G AATTC CTTAA G

G AATTC CTTAA G Hibridación de los fragmentos de DNA y unión con la DNA ligasa

G AATTC CTTAAG

GAATT C C TTAAG

Los extremos de hebra sencilla del fragmento son complementarios a los del plásmido cortado. Por tanto, el fragmento de DNA y el plásmido escindido pueden hibridar y, a continuación, quedar unidos gracias a la DNA ligasa.

41.3  Los genes eucarióticos se pueden manipular con una precisión considerable Es posible introducir genes eucarióticos en bacterias utilizando la tecnología del DNA recombinante, tal y como hemos visto hasta ahora. Posteriormente, las bacterias se pueden utilizar como si fuesen fábricas para elaborar el producto génico deseado, normalmente, una proteína. En el caso del receptor de estrógenos, nuestro plan de ataque consiste en la generación de este tipo de factorías moleculares. Sin embargo, primero tenemos que generar un DNA que codifique el receptor de estrógenos.

El DNA complementario obtenido a partir del mRNA se puede expresar en células huésped

El genoma de los retrovirus es un RNA que se replica por medio de un DNA intermediario. La conversión de la información del RNA en información del DNA está catalizada por la transcriptasa inversa. El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), causante del SIDA, es un retrovirus.

¿Cómo se puede clonar y expresar el DNA de mamíferos en E. coli? Recordemos que la mayoría de los genes de mamífero son mosaicos de intrones y exones (p. 663). Estos genes interrumpidos no se pueden expresar en bacterias, ya que carecen de la maquinaria necesaria para escindir los intrones y eliminarlos del transcrito primario. Sin embargo, este problema se puede soslayar introduciendo en las bacterias un DNA recombinante que sea complementario al mRNA maduro, es decir, un cDNA. Por ejemplo, la proinsulina, un precursor de la insulina, se sintetiza mediante bacterias que albergan plásmidos que contienen el DNA complementario al mRNA de la proinsulina (Figura 41.6). De hecho, las bacterias producen gran parte de la insulina que hoy en día utilizan millones de diabéticos. Como ya sabemos, la clave para construir el DNA complementario es la enzima transcriptasa inversa, una DNA polimerasa dirigida por el RNA que se obtiene a partir de retrovirus. La transcriptasa inversa sintetiza una hebra de DNA complementaria a un molde de RNA si se le proporciona un DNA cebador que esté formando pares de bases con el RNA y que posea un grupo OH libre en posición 39. Podemos


Gen de la proinsulina Transcriptasa inversa

Proinsulina

mRNA

Incorporación al plásmido

Infección en E. coli

(A)n Páncreas

mRNA de la proinsulina de mamífero

cDNA de la proinsulina

Plásmido recombinante

utilizar como cebador una secuencia sencilla formada por residuos de timidina unidos, o sea, un oligo(T). Esta secuencia oligo(T) se empareja con la secuencia poli(A) del extremo 39 de la mayoría de las moléculas de mRNA eucarióticas (p.663), tal y como se muestra en la Figura 41.7. A continuación, la transcriptasa inversa sintetiza el resto de la hebra de cDNA en presencia de los cuatro desoxirribonucleósidos trifosfato. Posteriormente, la hebra de RNA de este híbrido RNA-DNA se hidroliza aumentando el pH. A diferencia del RNA, el DNA es resistente a la hidrólisis alcalina. Para convertir la hebra sencilla de DNA en un DNA de doble hebra hay que generar otro lugar que actúe como cebador. La enzima transferasa terminal añade nucleótidos —por ejemplo, varios residuos de dG— al extremo 39 del DNA de hebra sencilla para que sirvan como plataforma para el cebador. Un oligo(dC) puede unirse a los residuos dG y servir de cebador para la síntesis de la segunda hebra del DNA. La segunda hebra de DNA se sintetiza tal y como lo haría en la naturaleza, con la DNA polimerasa y los dNTP. A esta doble hélice de DNA se le pueden añadir adaptadores sintéticos, segmentos de DNA sintetizados en el laboratorio que contienen varios lugares de restricción, para poder ligarla a un vector adecuado. Se puede fabricar DNA complementario para todos los mRNA presentes en una célula, insertarlo en vectores y, posteriormente, introducirlo en bacterias. De este modo, cada bacteria contendrá, junto a su propio cromosoma circular, un vector con un fragmento de DNA insertado. Una colección de vectores de este tipo constituye una biblioteca de cDNA.

3 HO

Oligo (T) cebador TTT n T 5

Transcriptasa inversa dNTPs

cDNA 3 HO

AAA n A

OH 3 Cola de poli(A)

5 mRNA

3 HO 5

GG n GG CC n CC

mRNA

TTT n T cDNA de doble hebra

AAA n A

5

Bacteria transformada

Figura 41.6  Síntesis de proinsulina en bacterias. La proinsulina, un precursor de la insulina, puede ser sintetizada por clones de E. coli transformados (alterados genéticamente). Los clones contienen el DNA que codifica la proinsulina de mamífero.

Digestión alcalina del mRNA molde

TTT n T AAA n A

Incorporación de oligo(dG) al extremo 3 del cDNA

5

OH 3

Oligo(dC) cebador DNA polimerasa dNTPs

OH 3

3 HO

GG n GG

Figura 41.7  Formación de un cDNA de doble hebra. A partir del mRNA se puede generar un DNA complementario (cDNA) de doble hebra. La transcriptasa inversa sintetiza primero una hebra de cDNA utilizando como molde el mRNA y después, tras la digestión del mRNA, la DNA polimerasa utiliza la hebra de cDNA recién sintetizada como molde para formar una doble hélice.

TTT n T

5

?

PREGUNTA RÁPIDA  ¿Por qué las enzimas de restricción son unas herramientas tan importantes para la tecnología del DNA recombinante?

El cDNA del receptor de estrógenos se puede identificar mediante una búsqueda en una biblioteca de cDNA Con estas técnicas a nuestra disposición, volvamos a nuestros experimentos con el receptor de estrógenos. Utilizaremos la sonda que hemos sintetizado anteriormente para explorar una biblioteca de cDNA generada a partir de un tejido sensible al receptor de estrógenos, como el útero de la rata. Para nuestros experimentos, utilizaremos una biblioteca de cDNA del fago l.

715


Figura 41.8  Exploración de una biblioteca de cDNA en busca de un gen determinado. En este caso, se analiza una placa de Petri para localizar las calvas que contienen el cDNA del receptor de estrógenos. Calvas formadas en la placa de Petri original Se aplica un filtro de nitrocelulosa

Réplica en nitrocelulosa de la placa de Petri original NaOH  sonda marcada con 32P

Clon que contiene el gen de interés

Película de rayos X

Autorradiografía de la nitrocelulosa expuesta a la sonda marcada

Lugar del promotor bacteriano Inserto de DNA eucariótico

EVector de expresión (plásmido) Transformación de E. coli

Bacterial colonies on agar plate

Colonia que produce la proteína de interés

Transferencia de colonias a una réplica de la placa de Petri Lisis bacteriana para dejar expuestas las proteínas Transferencia de las proteínas a una lámina de nitrocelulosa Adición de un anticuerpo específico para la proteína de interés, marcado radioactivamente

La mancha oscura en la película identifica la colonia bacteriana que expresa el gen de interés Autorradiograma

716

En primer lugar, se siembra una suspensión diluida de los fagos recombinantes sobre un césped bacteriano (Figura 41.8). Allí donde una partícula vírica se encuentre con una bacteria y la infecte se desarrollará una calva en la placa de Petri que contiene fagos idénticos. A continuación, se hace una réplica de esta placa original, colocando una hoja de nitrocelulosa por encima. Las bacterias infectadas y el DNA de los fagos liberado por las células lisadas se adhieren a esta hoja formando un patrón de manchas cuya posición se corresponde con la de las calvas formadas en la placa de Petri original. Las bacterias intactas depositadas sobre esta hoja se lisan con NaOH que, de paso, también desnaturaliza el DNA haciéndolo accesible para la hibridación con una sonda de hebra sencilla marcada con 32P. La sonda solo se unirá a la secuencia de DNA que codifique el cDNA del receptor de estrógenos. Posteriormente, una autorradiografía permitirá determinar la posición de las manchas de la réplica que albergan el DNA recombinante. Las calvas correspondientes se extraen de la placa de Petri original intacta y se cultivan por separado. Un único investigador puede examinar fácilmente un millón de clones en un día. El vector que contiene el cDNA para el receptor de estrógenos se puede aislar y transcribir. El mRNA resultante se puede traducir in vitro para producir receptores para los experimentos.

Se pueden explorar las bibliotecas de DNA complementario en busca de las proteínas sintetizadas Los vectores que hemos visto hasta ahora simplemente transportan el DNA incorporado y permiten la transcripción del DNA insertado. Sin embargo, con el uso de un vector especialmente preparado, se pueden aislar las bacterias que realmente estén expresando el receptor de estrógenos. Las moléculas de DNA complementario se pueden insertar en unos vectores especialmente diseñados por ingeniería genética que favorecen la expresión eficaz de estas moléculas en huéspedes como E. coli. Estos plásmidos o fagos se denominan vectores de expresión. Estos vectores maximizan la transcripción del DNA insertado utilizando un potente promotor. Los vectores de expresión también contienen un segmento de DNA que codifica un lugar de unión al ribosoma en el mRNA que se transcribe a partir del cDNA insertado. De este modo, las moléculas de cDNA insertadas en estos vectores no sólo se transcriben sino que también se traducen. Se pueden detectar los clones que contienen el cDNA gracias a su capacidad para dirigir la síntesis de una proteína foránea en bacterias. Partiendo de una réplica de una placa de Petri se lisan las manchas que contienen bacterias para que liberen las proteínas, que se quedarán unidas a un filtro de nitrocelulosa que hemos colocado enzima. Utilizando técnicas inmunológicas similares a las mencionadas en el Capítulo 5, se puede utilizar el anticuerpo monoclonal contra el receptor de estrógenos para identificar las colonias bacterianas que albergan el correspondiente vector con el cDNA (Figura 41.9). Tener un cDNA del receptor de estrógenos nos permite llevar a cabo una serie de experimentos para determinar las propiedades bioquímicas de la proteína. Por ejemplo, ya hemos visto anteriormente que el receptor de estrógenos es un factor de transcripción que actúa uniéndose al DNA de genes seleccionados (p. 651). Utilizando el receptor clonado, podemos realizar experimentos para determinar la secuencia de DNA a la que se une con más fuerza el receptor. Podríamos investigar si el receptor reacciona con otras proteínas cuando se une al DNA. De hecho, los conocimientos que se pueden adquirir solo están limitados por nuestra imaginación y por nuestra pericia experimental. Sin embargo, disponer del cDNA del receptor nos dice muy poco sobre el gen que codifica el propio receptor. ¿Tiene intrones el gen? ¿Qué secuencias reguladoras controlan su expresión? Para responder a estas preguntas, y a otras similares, tenemos que aislar el gen que codifica el receptor. Para ello, volvamos a la biblioteca, pero en esta ocasión, a una biblioteca genómica. Figura 41.9  Exploración de los vectores de expresión para detectar la presencia del receptor de estrógenos. Un método para explorar los clones de cDNA consiste en identificar los productos proteicos expresados tiñéndolos con un anticuerpo específico.


A partir de la digestión del DNA genómico se pueden clonar genes específicos Veamos ahora cómo podemos clonar un gen que solo aparece una vez en el genoma, como es el caso del gen que codifica el receptor de estrógenos. La estrategia consiste en preparar una gran colección (biblioteca) de fragmentos de DNA genómico y, después, identificar aquellos miembros de la colección que poseen el gen de interés. En primer lugar, se somete una muestra que contiene muchas copias del DNA genómico total —en nuestro caso, DNA de rata— a fragmentación mecánica o se digiere parcialmente mediante enzimas de restricción de modo que se obtengan fragmentos de gran tamaño. Este proceso genera una población prácticamente aleatoria de fragmentos de DNA que se solapan. A continuación, se separan estos fragmentos mediante electroforesis en gel para aislar el conjunto de fragmentos que tengan una longitud de unas 15 kb, un tamaño apropiado para poder insertarlos en vectores. Se añaden adaptadores sintéticos a los extremos de estos fragmentos, se generan extremos cohesivos y, a continuación, se insertan los fragmentos en un vector, como el DNA del fago l, preparado con los mismos extremos cohesivos (Figura 41.10). Posteriormente, se infectan bacterias de E. coli con estos fagos recombinantes. Estos fagos se replican y acaban provocando la lisis de sus hospedadores bacterianos. El lisado resultante contiene fragmentos de DNA de rata alojados en un número de partículas víricas lo suficientemente elevado como para garantizar que prácticamente todo el genoma se encuentra representado. Estos fagos constituyen una biblioteca genómica. Posteriormente, se pueden explorar esta biblioteca de manera similar a como se hacía en el caso de una biblioteca de cDNA. Es poco probable que el gen de interés se encuentre en un único fragmento de DNA, ya que, normalmente, los genes tienen más de 15 kb, el tamaño de los fragmentos empleados para construir la biblioteca genómica. En consecuencia, varios clones de la biblioteca genómica albergarán diversas partes del gen para el receptor de estrógenos. Hay que aislar y secuenciar estos clones para determinar la secuencia del gen completo.

a b c d DNA genómico Fragmentación por medios mecánicos o por digestión enzimática Unión a fragmentos de DNA de λ

Empaquetamiento In vitro

Viriones λ que albergan fragmentos de DNA foráneo Amplificación tras infectar E. coli

Biblioteca genómica en fagos λ

Figura 41.10  Creación de una biblioteca genómica. Se puede crear una biblioteca genómica a partir de la digestión de un genoma complejo entero.

El DNA se puede secuenciar mediante la terminación controlada de la replicación El análisis de la estructura del DNA y de su papel en la expresión génica también se ha visto notablemente facilitado por el desarrollo de poderosas técnicas para la secuenciación de moléculas de DNA. La clave para la secuenciación del DNA consiste en la generación de fragmentos de DNA cuya longitud depende de la última base de la secuencia. Se pueden generar conjuntos de fragmentos de este tipo mediante la interrupción controlada de la replicación (el método didesoxi de Sanger), un método desarrollado por Frederick Sanger y sus colaboradores. Se lleva a cabo el mismo proceso, de forma simultánea, en cuatro mezclas de reacción. En cada mezcla se utiliza una DNA polimerasa para sintetizar la hebra complementaria a una corta secuencia que forma parte de la molécula de DNA de hebra sencilla que se va a secuenciar. El cebador para la síntesis es un fragmento sintetizado por métodos químicos, complementario a una parte de la secuencia cuya composición se ha llegado a conocer gracias a otros estudios. Cada mezcla de reacción contiene, además de los cuatro desoxirribonucleósidos trifosfato (marcados radiactivamente), una pequeña cantidad del análogo 29,39-didesoxi de uno de los nucleótidos, uno diferente para cada mezcla de reacción. 2–

O

O

O O P

O

P

O O O

P

O O

H2 C H

base

O H H

3

H

H 2

H

Análogo 2 ,3-didesoxi

La incorporación de este análogo impide todo crecimiento posterior de la nueva hebra, ya que carece del grupo hidroxilo en posición 39, que es esencial para la formación del siguiente enlace fosfodiéster. La concentración del análogo didesoxi es lo suficientemente pequeña como para que la terminación de la síntesis de la hebra

717


718  41  Tecnología del DNA recombinante Molde  cebador d C T P T TP d AT P d GT P  DNA polimerasa

 d d AT P

 d d CT P

 d d GT P

Molde

C TA AGC TCGAC T

C TA AGC TCGAC T

C TA AGC TCGAC T

C TA AGC TCGACT

Productos

G AT TCG AGC TG A G AT TCG A GA

GAT TCG AG C GAT T C

GAT TCGAGC T G GAT TCGA G GAT TC G G

GAT TCGAGC T GAT T GA T

A

C

G

T

Figura 41.11  Estrategia del método de terminación de la hebra para secuenciar el DNA. Los fragmentos se generan al añadir el análogo 29,39-didesoxi de un dNTP a cada una de las cuatro mezclas de polimerización. Por ejemplo, la adición del análogo didesoxi del dATP da lugar a fragmentos terminados en A. La hebra no se puede extender más allá del análogo didesoxi. [Tomada de B. A. Pierce, Genetics, 3.ª ed. (W. H. Freeman and Company, 2008), p. 526.]

 ddTTP

Secuencia de la hebra complementaria

3' A G T C G A G C T T A G 5'

5' T C A G C T Autorradiograma C de la electroforesis G en gel A A T C 3' Secuencia de la hebra molde original

tenga lugar únicamente de forma esporádica. La polimerasa añadirá unas veces el nucleótido correcto y otras veces el análogo didesoxi, parando la reacción. Por ejemplo, en presencia del análogo didesoxi del dATP se producirán fragmentos de distinta longitud, pero todos terminarán por el análogo didesoxi (Figura 41.11). Es importante destacar que este análogo didesoxi del dATP se insertará únicamente allí donde haya una T en el DNA que se está secuenciando. Por tanto, los fragmentos de diferente longitud corresponderán a las posiciones de T. A continuación, los cuatro conjuntos de fragmentos cuya secuencia está interrumpida (uno por cada análogo didesoxi) se someten a electroforesis y la secuencia de bases del nuevo DNA se lee a partir del autorradiograma de las cuatro calles. Una alternativa muy eficaz a la autorradiografía es la detección por fluorescencia. Se incorpora un marcador fluorescente a cada análogo didesoxi —de manera que cada uno de los cuatro terminadores de la cadena tenga un color distinto (p. ej., uno que emita luz de color azul para la terminación en A y uno que emita luz de color rojo para la terminación en C). Utilizando una mezcla de terminadores, solo hay que hacer una única reacción y, posteriormente, se separan los fragmentos resultantes mediante electroforesis. Las bandas de DNA que se van separando durante la electroforesis se detectan gracias a su fluorescencia; la secuencia de sus colores proporciona directamente la secuencia de las bases (Figura 41.12). La detección de la fluorescencia


ATAGTGT CACCT A A A T AGCTTGGCG TAAT CAT GG TCATAGCT 100 110 120 130

es más interesante, ya que elimina el uso de compuestos radioactivos y se puede automatizar fácilmente. De hecho, utilizando este método, los modernos secuenciadores de DNA pueden secuenciar más de un millón de bases al día. Aplicando estas herramientas de secuenciación a la investigación del gen para el receptor de estrógenos se descubre que el gen tiene una longitud de más de 140 kb y contiene 8 exones. Además de las cajas TATA y CAAT (p. 648), la región corriente arriba del gen contiene un promotor P1 que se activa mediante el factor de transcripción AP2g. Curiosamente, ciertos cánceres de mama dependen de la presencia del receptor de estrógenos para crecer de forma maligna, y AP2g podría desempeñar un papel decisivo a la hora de regular el gen para el receptor de estrógenos en células cancerosas.

Figura 41.12  Detección por fluorescencia de los fragmentos oligonucleotídicos producidos por el método didesoxi. Se inicia una reacción de secuenciación con los cuatro didesoxinucleótidos responsables de la terminación de la hebra, cada uno marcado con un compuesto fluorescente que emite a una longitud de onda distinta (p. ej., rojo en el caso de la T). Cada uno de los cuatro colores representa una base diferente en el registro cromatográfico obtenido tras realizar medidas de fluorescencia a cuatro longitudes de onda. [Tomada de A. J. F. Griffithsy col. An Introduction to Genetic Analysis, 8.ª ed. (W. H. Freeman and Company, 2005).]

  Aspecto clínico y biológico Los métodos de secuenciación de “última generación” permiten la rápida determinación de la secuencia completa de un genoma Desde la introducción del método didesoxi de Sanger a mediados de la década de 1970 se han realizado avances significativos en las tecnologías de secuenciación de DNA, que permiten la lectura de secuencias cada vez más largas con un mayor grado de precisión y en menos tiempo. El reciente desarrollo de métodos de secuenciación “de última generación” ha llevado esta tecnología hasta niveles insospechados. Combinando los avances tecnológicos en la manipulación de volúmenes muy pequeños de líquido, la óptica de alta resolución y la potencia de computación, estas técnicas de secuenciación permiten la secuenciación en paralelo de más de 400.000 fragmentos individuales de DNA, cada uno de ellos con una longitud de varios cientos de bases. Por tanto, un único experimento de secuenciación que dure 10 horas puede generar más de 100.000.000 de bases (100 megabases). Aunque aún existen importantes obstáculos, esta capacidad de secuenciación sugiere que la rápida secuenciación del genoma de un individuo cualquiera a bajo coste es una posibilidad muy real. Las secuencias genómicas individuales aportarán información sobre la variación genética que existe en las poblaciones y nos podrá llevar hacia una nueva era de medicina personalizada, en la que todos estos datos puedan ser utilizados en la toma de decisiones relacionadas con el tratamiento. La comparación con genomas de otros organismos supone una fuente de información a la hora de comprender el genoma humano. La secuenciación del genoma del chimpancé, nuestro pariente vivo más cercano, está a punto de terminar. Los genomas de otros mamíferos ampliamente utilizados en la investigación biológica, como el ratón o la rata, ya se han completado. Los estudios comparativos ponen de manifiesto que, para nuestro asombro, el 99% de los genes humanos tienen análogos en los genomas de estos roedores. Sin embargo, a lo largo de los 75 millones de años de evolución que, según las estimaciones, han transcurrido desde que humanos y roedores compartieron un ancestro común, estos genes se han redistribuido sustancialmente entre los cromosomas (Figura 41.13). También se han determinado los genomas de otros organismos para ser utilizados de forma específica en estudios de genómica comparativa. Por ejemplo, se han secuenciado los genomas de dos especies del pez globo: Takifugu ribripes y Tetraodon nigroviridis. Sorprendentemente, el estudio comparativo de los genomas de estas especies con el de los seres humanos sacó a la luz más de 1.000 genes humanos que previamente habían pasado desapercibidos. La genómica comparativa es una herramienta poderosa, tanto para la interpretación del genoma humano como para la comprensión de los principales eventos que dieron lugar al origen de géneros y especies.   ■

719


1

2

3

Cromosomas humanos 4 5 6 7

8

9

1

2 6

10

11

12

13

14

15

16

17

22

X

3

20

7 9

4

4

2 3 10

3 1

1

7

4

8

9 19

7

8

12

13

19

8

11 15

19 4 19

11 16 10 11

11 19 11 15 6

16

3

1

18 11

10 22 21 19 12

21

9

1

6

20

8

16

10

19

10 2 11 15

2

Cromosomas de ratón 4 5 6 7

3

22 7 2 16 5

12

13

14

15 3

2 7

10

7

14 5

6

14

17

17

16 22

8

3

22

13

5

16 5

12

21

6 16 21 6 19 18 2

18 10 18 5 18

Y 19

X

Y

11

Y

9 10

X

Figura 41.13  Comparación de genomas. Representación esquemática de la comparación del genoma humano y el de ratón que muestra una redistribución de fragmentos cromosómicos de gran tamaño. El número que aparece junto a los cromosomas del ratón indica el correspondiente DNA cromosómico humano.

Secuencia colindante

Mediante la reacción en cadena de la polimerasa es posible amplificar enormemente secuencias de DNA seleccionadas Secuencia diana

1

Adición de cebadores en exceso Separación de hebras por calentamiento

2

Enfriamiento para hibridar los cebadores

Cebadores

3

Síntesis de nuevo DNA

Figura 41.14  Primer ciclo de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Un ciclo consta de tres pasos: separación de las hebras, hibridación de los cebadores y alargamiento de los cebadores por síntesis de DNA.

720 

Hagamos un resumen de nuestros logros investigadores conseguidos hasta el momento. Hemos purificado el receptor de estrógenos utilizando el anticuerpo monoclonal que hemos generado (Capítulo 5). Utilizando la genética inversa, hemos sintetizado una sonda de DNA que nos ha permitido aislar el cDNA del receptor, así como el gen del receptor. Por último, hemos deducido la secuencia de DNA del gen. Aunque hay muchos experimentos que se pueden llevar a cabo en base a lo ya logrado, comencemos un nuevo proyecto de investigación que nos familiarice con una de las técnicas más poderosas de la bioquímica experimental. Hasta ahora, nuestro sistema experimental ha sido el útero de la rata. Podemos preguntarnos si el gen del receptor se transcribe en otros tejidos, como el cerebro o el hígado. Podríamos, de hecho, explorar bibliotecas de cDNA de estos tejidos, en busca de un clon que contenga el cDNA del receptor, tal y como ya hemos comentado. Sin embargo, utilizaremos un método de detección mucho más rápido. Estudiaremos el cDNA obtenido a partir de cerebro, de hígado y de otros tejidos y determinaremos, utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la presencia del cDNA (y, por consiguiente, el mRNA) del receptor. Consideremos un DNA de doble hebra que contiene una secuencia diana que nos interesa, flanqueada por un DNA que no nos interesa. En nuestro ejemplo, nos interesa el supuesto cDNA del receptor en el cerebro, en el hígado o en el músculo. Si este DNA está presente, lo podemos detectar si primero amplificamos la cantidad de DNA presente. Se pueden obtener fácilmente millones de copias de la secuencia diana por PCR si se conocen las secuencias que la flanquean, y nosotros sabemos cuáles son estas secuencias porque disponemos de la secuencia de DNA del receptor. La PCR se lleva a cabo añadiendo los siguientes componentes a una disolución que contiene la secuencia diana: (1) un par de cebadores que hibridan con las secuencias que flanquean a la secuencia diana, (2) los cuatro desoxirribonucleósidos trifosfato (dNTPs), y (3) una DNA polimerasa termoestable. Un ciclo de PCR consta de tres pasos (Figura 41.14): 1. Separación de las hebras. Calentando la disolución a 95°C durante 15 segundos se separan las dos hebras de la molécula de DNA parental.


41.3  Manipulación de genes eucarióticos 721

2. Hibridación de los cebadores. A continuación se enfría bruscamente la disolución a 54°C, para que cada cebador pueda hibridar con una de las hebras del DNA. Un cebador hibrida con el extremo 39 de la hebra que contiene la secuencia diana y el otro cebador hibrida con el extremo 39 de la hebra complementaria. Como los cebadores se encuentran en exceso no se forman moléculas de doble hélice a partir de las hebras del DNA original. Normalmente, los cebadores tienen una longitud de entre 20 y 30 nucleótidos.

COMIENZA EL PRIMER CICLO Secuencia colindante

Adición de cebadores en exceso Separación por calentamiento Enfriar

3. Síntesis de DNA. Posteriormente se calienta la disolución a 72°C, la temperatura óptima para la Taq DNA polimerasa. Esta polimerasa termoestable proviene de Thermus aquaticus una bacteria termófila que vive en fuentes termales. La polimerasa elonga ambos cebadores en dirección a la secuencia diana, ya que la síntesis de DNA se lleva a cabo en el sentido 59 S 39. La síntesis de DNA tiene lugar sobre las dos hebras y se extiende más allá de la secuencia diana. Estas tres etapas —separación de las hebras, hibridación de los cebadores y síntesis de DNA— constituyen un ciclo de la amplificación por PCR y se pueden realizar de forma repetitiva mediante un simple cambio de la temperatura de la mezcla de reacción. Gracias a la termoestabilidad de la polimerasa es posible llevar a cabo la PCR en un recipiente cerrado; no se añade ningún reactivo después del primer ciclo. Para comenzar el segundo ciclo, se calientan las moléculas de doble hélice, con lo que se generan cuatro dobles hélices, tras lo cual, se inicia el tercer ciclo (Figura 41.15). Al final del tercer ciclo, aparecen dos hebras cortas que están formadas, únicamente, por la secuencia diana —que también incluye las regiones a las que se unen los cebadores—. Los ciclos siguientes amplificarán la secuencia diana de forma exponencial. El número de hebras más grandes aumenta de forma aritmética y, a partir de ellas, se pueden seguir sintetizando más hebras cortas. En condiciones ideales, después de n ciclos, la secuencia que nos interesa se habrá amplificado 2n veces. Tras 20 ciclos, la amplificación es de un millón de veces y tras 30 ciclos, que se pueden llevar a cabo en menos de una hora, de mil millones de veces. Merece la pena destacar algunas características de este extraordinario método de amplificación del DNA. En primer lugar, no es necesario conocer la secuencia del fragmento diana. Lo único que hay que conocer son las secuencias que la flanquean. En segundo lugar, la secuencia diana puede ser mucho mayor que los cebadores. Se han amplificado por PCR secuencias diana de más de 10 kb. En tercer lugar, para amplificar secuencias diana no es necesario que los cebadores se emparejen perfectamente con las secuencias que la flanquean. Utilizando cebadores obtenidos a partir de un gen de secuencia conocida se puede realizar una búsqueda de posibles variaciones sobre un mismo tema. De este modo se están descubriendo familias de genes gracias a la PCR. En cuarto lugar, la PCR es muy

Figura 41.15  Los diversos ciclos de la reacción en cadena de la polimerasa. Las dos hebras cortas que se originan al final del tercer ciclo (junto con las otras hebras más largas, que no se muestran) corresponden a la secuencia diana. Los siguientes ciclos amplificarán de forma exponencial la secuencia diana y de forma aritmética la secuencia parental.

Secuencia diana

Cebadores Adición de DNA polimerasa termoestable Síntesis de nuevo DNA

COMIENZA EL SEGUNDO CICLO

Separación por calentamiento Enfriar Los cebadores en exceso siguen presentes

La DNA polimerasa termoestable sigue presente La síntesis de DNA prosigue

Hebras cortas

COMIENZA EL TERCER CICLO

Calentamiento, hibridación de los cebadores, alargamiento Las hebras cortas, que corresponden a la secuencia diana, se amplifican de forma exponencial

CICLOS SIGUIENTES


722  41  Tecnología del DNA recombinante

4g  1kb TS

8g

D pantalones camisa

V

 1kb

específica debido a la rigurosidad de la hibridación a temperaturas relativamente elevadas. La rigurosidad es la exactitud con que debe producirse el emparejamiento entre el cebador y la secuencia diana, y se puede controlar mediante la temperatura y la concentración salina. A temperaturas elevadas, sólo se amplifica el DNA que está localizado entre los cebadores. Mediante PCR se puede acceder a un gen que represente menos de una millonésima parte del DNA total de un organismo superior. En quinto lugar, la sensibilidad de la PCR es exquisita. Es posible amplificar una única molécula de DNA para visualizarla posteriormente mediante una electroforesis en gel. De hecho, si se desea, es posible extraer el DNA amplificado del gel para insertarlo en un vector y clonarlo. El análisis por PCR para detectar la presencia del receptor de estrógenos en las bibliotecas de cDNA de varios tejidos pone de manifiesto que hay cantidades significativas del mRNA del receptor en la hipófisis, en el hueso, en el hígado y en las células musculares, así como en los tejidos reproductores, incluyendo los ovarios, las glándulas mamarias y el útero.

  Aspecto clínico y biológico La PCR es una poderosa técnica para el diagnóstico médico, la medicina forense y los estudios de evolución molecular

Figura 41.16  DNA y medicina forense. Se recogió DNA de las manchas de sangre encontradas en los pantalones y en la camisa de un acusado, se amplificó por PCR y, a continuación, se comparó con el DNA de la víctima y con el DNA del acusado, utilizando electroforesis en gel y autorradiografía. El DNA de las manchas de sangre de la ropa del acusado coincidía con el patrón de la víctima, pero no con el del acusado. La probabilidad de encontrar una coincidencia fortuita entre el patrón de DNA de la ropa y el de la víctima es de aproximadamente una entre treinta y tres mil millones. Las calles , 1 kb y TS corresponden a muestras de DNA control; la calle D contiene DNA del acusado; la calle “pantalones” y las dos calles “camisa” contienen DNA procedente de las manchas de sangre encontradas en la ropa del acusado; la calle V contiene una muestra de DNA obtenida a partir de la sangre de la víctima. [Cortesía de Cellmark Diagnostics, Germantown, Maryland.]

La PCR puede proporcionar valiosa información para los diagnósticos médicos. Utilizando cebadores específicos es posible detectar con facilidad bacterias y virus. Por ejemplo, la PCR puede detectar la presencia del virus de la inmunodeficiencia humana en personas que aún no han desplegado una respuesta inmunitaria contra este patógeno y que, por tanto, no serían detectadas mediante un test basado en la presencia de anticuerpos. La detección de bacilos de Mycobacterium tuberculosis en muestras de tejidos es un proceso lento y laborioso. Utilizando la PCR se pueden detectar fácilmente, aunque sólo haya 10 bacilos de la tuberculosis por cada millón de células humanas. La PCR es un método prometedor para la detección temprana de ciertos tipos de cáncer. Esta técnica permite identificar las mutaciones de ciertos genes que controlan el crecimiento, como los genes ras (p. 225). La capacidad para amplificar enormemente regiones de DNA seleccionadas también puede aportar gran cantidad de información durante el seguimiento de la quimioterapia contra el cáncer. Los tests que utilizan PCR pueden detectar cuándo se han eliminado las células cancerosas para poder interrumpir el tratamiento; del mismo modo, también pueden detectar una recaída y la necesidad de reanudar inmediatamente el tratamiento. La PCR es ideal para detectar leucemias causadas por una reorganización de los cromosomas. La PCR también está repercutiendo en la medicina legal y forense. El perfil del DNA de un individuo posee gran valor distintivo, ya que muchos loci genéticos son muy variables dentro de una población. Por ejemplo, las variaciones en uno de estos lugares específicos determina qué tipo de HLA (antígeno leucocitario humano) posee una persona; los órganos transplantados son rechazados cuando los tipos de HLA del donante y del receptor no se parecen lo suficiente. Se está utilizando la amplificación por PCR de múltiples genes para determinar el parentesco biológico en casos de disputa de la paternidad y en casos de inmigración. Los análisis por PCR de manchas de sangre y de muestras de semen han supuesto la culpabilidad o la inocencia en numerosos casos de asalto y violación. La raíz de un único cabello suelto encontrado en la escena de un crimen contiene suficiente DNA como para ser analizado por PCR (Figura 41.16).  ■

Los niveles de expresión génica se pueden examinar de forma exhaustiva Veamos ahora una última técnica, una que nos permite ver cómo las señales ambientales (p. ej., la presencia de hormonas o los estados patológicos, como el cáncer) afectan a la expresión de un conjunto de genes en un tejido. La mayor parte de los genes se encuentran en igual cantidad en todas las células —a saber, una copia en cada célula haploide o dos copias en cada célula diploide. Sin embargo, el nivel de expresión de cada gen, estimado a partir de la cantidad de mRNA, puede variar ampliamente, desde la no expresión hasta la presencia de cientos de copias de mRNA en cada célula. Los patrones de expresión génica varían de un tipo de célula a otro,


41.3  Manipulación de genes eucarióticos 723

Fluorescencia

Ciclo

10

1

10

0

10

1

10

2

(B) 35 30

Umbral

CT

Fluorescencia

(A)

Diferentes tumores Diferentes genes

lo que diferencia, por ejemplo, a una célula muscular de una célula nerviosa. Incluso dentro de una misma célula, los niveles de expresión génica pueden variar a medida que la célula responde a cambios en las condiciones fisiológicas. Hay que destacar el (A) se corresponden con los niveles de hecho de que, algunas veces, los niveles de mRNA 1 proteínas expresadas, pero no siempre se cumple10esta correlación. Por tanto, hay que 0los datos de los niveles de mRNA. tener cuidado a la hora de interpretar únicamente 10 La cantidad de transcritos individuales de mRNA se puede determinar por medio Umbral 1 10 de la PCR cuantitativa (qPCR), también denominada PCR en tiempo real. En primer lugar se purifica el RNA de la célula o del tejido 10 de2interés. A partir de esta muestra de CT RNA se obtiene el cDNA utilizando la transcriptasa inversa. En una de las variantes de 6 10 14 18los 22 cebadores 26 30 34 38 adecua42 46 50 la qPCR, se amplifica el transcrito de interés por PCR,2utilizando

CT 2 6 10 14 18 22 26 30 34 38 42 46 50

Ciclo

25 20 15 10

100 101 102 103 104 105 106

Cantidad inicial

Figura 41.17  PCR cuantitativa. (A) En la qPCR se monitoriza la fluorescencia durante el (B)

CT

transcurso de la amplificación por PCR para así determinar CT, el número del ciclo en el que 35 la señal excede un umbral mínimo definido. Cada color representa una cantidad inicial de DNA 30 distinta. (B) Los valores de CT son inversamente proporcionales al número de copias del cDNA molde25original. [Tomada deN. J. Walker, Science 296:557–559, 2002.] 20

dos y15en presencia del colorante denominado SYBR Green I, que cuando está unido al DNA10de doble hebra emite una fluorescencia intensa. Durante los ciclos iniciales de la 100 101 102 103 104 105 106 PCR no hay suficiente número de dobles hélices como para poder detectar la señal de Cantidad inicial fluorescencia. Sin embargo, a medida que se van repitiendo los ciclos de PCR, la intensidad de la fluorescencia excede el umbral mínimo de detección y sigue aumentando a medida que aumenta el número de dobles hélices correspondientes al transcrito de interés (Figura 41.17). Es importante señalar que el número del ciclo en el que se empieza a detectar la señal de fluorescencia porque ya se ha superado un umbral determinado (CT) es inversamente proporcional al número de copias del molde original. Tras haber establecido la relación entre el número inicial de copias y el CT utilizando un estándar conocido, se pueden seguir haciendo experimentos de qPCR para determinar el número de copias de cualquier transcrito de interés que hay en la muestra original, siempre y cuando se disponga de los cebadores adecuados. Aunque la qPCR es una técnica poderosa para cuantificar un pequeño número de transcritos en un experimento dado, hoy en día es posible utilizar nuestro conocimiento de las secuencias genómicas completas para investigar el transcriptoma completo, el patrón y el nivel de expresión de todos los genes de una célula o tejido concreto. Uno de los métodos más potentes desarrollado hasta la fecha con este propósito se basa en la hibridación. Fijando oligonucleótidos o cDNAs sobre un soporte sólido como, por ejemplo, un portaobjetos para microscopio, se generan micromatrices de DNA o chips de genes. Posteriormente, el cDNA marcado fluorescentemente forma híbridos sobre el chip, poniendo así de manifiesto el nivel de expresión de cada gen, que se puede identificar gracias a que se conoce su posición exacta sobre el chip. La intensidad de la mancha fluorescente sobre el chip indica el grado de transcripción de un gen determinado. La Figura 41.18 muestra el patrón de genes que se inducen o se reprimen en varios tumores de cáncer de mama, y la Figura 41.19 muestra cómo varía la transcripción en levaduras sometidas a distintas condiciones. Analizando el contenido total de mRNA con estos chips se puso de manifiesto, por ejemplo, que el grado de expresión de aproximadamente el 50% de los genes de levadura es constante: entre 0,1 y 1 copia de mRNA por célula. Este método detectó fácilmente las variaciones en los niveles de expresión que experimentaron determinados genes en distintas condiciones de crecimiento.

Figura 41.18  Análisis de la expresión génica mediante micromatrices. Utilizando micromatrices de DNA (chips de genes) es posible analizar de forma simultánea el nivel de expresión de miles de genes. En este caso, el análisis de 1.733 genes pertenecientes a 84 muestras distintas de tumores de mama indica que los tumores se pueden dividir en distintas clases en función de sus patrones de expresión génica. El color rojo representa la inducción del gen y el color verde representa la represión del gen. [Tomada de C. M. Perou y col., Nature 406:747–752, 2000.]

Genes diferentes

Choque térmico a 37°C

Agotamiento del nitrógeno

Privación de aminoácidos

Figura 41.19  Monitorización de los cambios de la expresión génica en levaduras. El análisis con micromatrices muestra los niveles de expresión de los genes de levadura en condiciones diferentes. [Tomada de V. R. Iyer y col., Nature 409:533–538, 2001.]


724  41  Tecnología del DNA recombinante

Resumen 41.1 La genética inversa permite la síntesis de ácidos nucleicos a partir de una secuencia de proteína La información de la secuencia de aminoácidos obtenida a partir del receptor purificado puede utilizarse para sintetizar sondas de DNA que correspondan a la secuencia de aminoácidos, un proceso denominado genética inversa. La técnica consiste en ir añadiendo desoxinucleótidos modificados de uno en uno para formar una hebra creciente conectada a un soporte insoluble. Se pueden sintetizar fácilmente hebras de DNA con una longitud de hasta 100 nucleótidos. 41.2 La tecnología del DNA recombinante ha revolucionado todos los aspectos de la biología La tecnología del DNA recombinante ha revolucionado la biología y está basada en el repertorio de enzimas que actúan sobre los ácidos nucleicos. De entre todas ellas, las enzimas de restricción constituyen un grupo clave. Estas endonucleasas reconocen secuencias de bases específicas en la doble hélice de DNA y escinden ambas hebras formando fragmentos específicos de DNA. Estos fragmentos de restricción se pueden separar y visualizar mediante electroforesis en gel y se pueden insertar en vectores para generar moléculas de DNA recombinante. 41.3 Los genes eucarióticos se pueden manipular con una precisión considerable Se pueden construir nuevos genes en el laboratorio, introducirlos en células huésped y expresarlos. Las nuevas moléculas de DNA se obtienen uniendo fragmentos que tienen extremos cohesivos complementarios, producidos por la acción de una endonucleasa de restricción. La DNA ligasa repara los cortes en las cadenas de DNA. Los vectores que propagan el DNA incluyen plásmidos y el fago l. Utilizando estas técnicas, se pueden generar bibliotecas de cDNA de cualquier tejido y bibliotecas genómicas de cualquier organismo. Estas bibliotecas se pueden explorar utilizando sondas de DNA. Una vez insertado en bacterias mediante un vector adecuado, el DNA foráneo se puede expresar. Mediante una sonda de DNA, se pueden clonar genes específicos a partir de una biblioteca genómica. Se han desarrollado técnicas de secuenciación rápida para analizar con más detalle las moléculas de DNA. El DNA se puede secuenciar mediante la interrupción controlada de la replicación. Los fragmentos producidos se separan por electroforesis en gel y se visualizan mediante la autorradiografía tras el marcaje del extremo 59 con 32P o mediante marcaje fluorescente. La reacción en cadena de la polimerasa permite amplificar enormemente segmentos específicos de DNA in vitro. La región amplificada está determinada por la situación de una pareja de cebadores que se añaden al DNA diana junto con una DNA polimerasas termoestable y desoxirribonucleótidos trifosfato. Las micromatrices de DNA, o chips génicos, permiten detectar cambios en la transcripción de cientos de genes de forma simultánea. El análisis de las micromatrices muestra cómo responde la transcripción a diversas condiciones fisiológicas o patológicas, como la presencia de una hormona o la transformación a un estado canceroso.

Términos clave biblioteca de DNA complementario (cDNA) (p. 710) transcriptasa inversa (p. 710) DNA complementario (cDNA) (p. 710) genética inversa (p. 710) enzima de restricción (p. 712) transferencia Southern (p. 713) transferencia northern (p. 713)

vector (p. 713) plásmido (p. 713) bacteriófago lambda (fago l) (p. 714) extremos cohesivos (p. 714) DNA ligasa (p. 714) vector de expresión (p. 716) biblioteca genómica (p. 717)

terminación controlada de la replicación (método didesoxi de Sanger) (p. 717) reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (p. 720) PCR cuantitativa (qPCR) (p. 723) micromatriz de DNA (chip de genes) (p. 723)


Problemas 725

?

Respuesta a la PREGUNTA RÁPIDA

Gracias a su elevado grado de especificidad, las enzimas de restricción permiten escindir el DNA de doble hebra de

forma precisa. Básicamente, son bisturís moleculares.

Problemas 1. Construyendo una biblioteca. ¿Qué es una biblioteca de cDNA? ¿Cómo se construye? ✓  8 2. Distintas bibliotecas. ¿Qué diferencias hay entre una biblioteca de cDNA y una biblioteca genómica? ✓  8 3. No es el calor, ... ¿Por qué la Taq polimerasa es especialmente útil para la PCR? ✓  8 4. Marie y Pierre. Asigne a cada término la descripción correspondiente. ✓  8 (a) Biblioteca de cDNA _______ (b) Genética inversa _______ (c) Enzima de restricción _______ (d) Vector _______ (e) Extremos cohesivos _______ (f) DNA ligasa _______ (g) Biblioteca genómica _______ (h) Método didesoxi de Sanger _______ (i) Reacción en cadena de la polimerasa _______ (j) Micromatriz de DNA _______

  1. Escinde la doble hélice de DNA en secuencias específicas   2. Mide la expresión de muchos genes  3. Secuenciación por terminación de la hebra   4. Secuencias de DNA que representan un mRNA   5. Fragmento de DNA captado y replicado por bacterias   6. Fragmentos de DNA, albergados en fagos, que representan la totalidad de un genoma   7. Une dos moléculas de DNA   8. Generación de secuencias de DNA a partir de secuencias de proteína   9. Amplifica secuencias de DNA seleccionadas 10. Hebras sencillas de DNA complementarias

5. Diseño de sondas. ¿Cuál de las siguientes secuencias de aminoácidos daría lugar a la mejor sonda oligonucleotídica?

✓  8

Ala-Met-Ser-Leu-Pro-Trp Gly-Trp-Asp-Met-His-Lys Cys-Val-Trp-Asn-Lys-Ile Arg-Ser-Met-Leu-Gln-Asn 6. El molde correcto. La ovoalbúmina es la proteína mayoritaria de la clara de huevo. El gen de la ovoalbúmina de pollo contiene ocho exones separados por siete intrones. Si se quiere producir la proteína en E. coli, ¿qué deberíamos utilizar, el cDNA de la ovoalbúmina o el DNA genómico de la ovoalbúmina? ¿Por qué?

7. Frecuencia de escisión. La enzima de restricción AluI escinde la secuencia 59-AGCT-39 y NotI la secuencia 59-GCGGCCGC-39. Cuando se digiere un DNA de doble hebra ¿cuál será la distancia promedio entre los lugares de escisión de cada enzima? Considere que el DNA contiene la misma proporción de A, G, C y T. 8. Los cortes correctos. Suponga que se prepara una biblioteca genómica humana mediante la digestión exhaustiva del DNA humano con la enzima de restricción EcoRI. Se generarían fragmentos con una longitud media de 4 kb. ¿Es este un procedimiento apropiado para clonar genes de gran tamaño? ¿Por qué? o ¿Por qué no? ✓  8 9. Leyendo secuencias. En la ilustración adjunta se muestra un autorradiograma de un gel de secuenciación con cuatro calles de fragmentos de DNA. ✓  8 Terminación A

G

C

T

(a) ¿Cuál es la secuencia del fragmento de DNA? (b) Suponga que el método didesoxi de Sanger determina que la secuencia de la hebra molde es 59-TGCAATGGC-39. Dibuje la posición de las bandas del gel que nos permitiría llegar a esta conclusión. 10. Una escisión reveladora. La anemia falciforme es consecuencia de una mutación en el gen de la cadena b de la hemoglobina humana. En el mutante, el cambio de GAG a GTG elimina un lugar de restricción para la enzima MstII, que reconoce la secuencia diana CCTGAGG. Estos hallazgos constituyen la base de un método de diagnóstico para detectar la presencia del gen de la anemia falciforme. Sugiera un procedimiento rápido para distinguir entre el gen normal y el gen mutante. En caso de que la prueba diese resultado positivo, ¿quedaría demostrado que el mutante contiene GTG en vez de GAG? 11. Una bendición y una maldición. El poder de la PCR también puede crear problemas. Supongamos que alguien afirma que ha aislado DNA de dinosaurios utilizando PCR. ¿Qué preguntas le haría usted para determinar si es verdaderamente DNA de dinosaurio? ✓  8 12. Cuestión de precisión. La rigurosidad (p. 721) de la amplificación por PCR se puede controlar variando la temperatura a la que tiene lugar la hibridación entre los cebadores y el DNA dia-


726  41  Tecnología del DNA recombinante na. ¿Cómo se vería afectada la amplificación si se cambiase la temperatura de hibridación? Suponga que está estudiando un determinado gen de levadura (el gen A) y que quiere comprobar si existe un homólogo en humanos. ¿En qué medida le podría ayudar el control de la rigurosidad de la hibridación? ✓  8 13. Una escalera misteriosa. El patrón de un gel en el que se visualizan los productos de una PCR muestra cuatro bandas intensas. Las longitudes de los cuatro fragmentos de DNA se encuentran en una relación de aproximadamente 1:2:3:4. Se corta el gel para extraer la banda más grande y se utiliza para repetir la PCR con los mismos cebadores. De nuevo, se observa en el gel una escalera con cuatro bandas. ¿Qué es lo que indican estos resultados sobre la estructura de la proteína codificada? 14. El mejor amigo del hombre. ¿Por qué el análisis genómico de los perros resultaría particularmente útil para el estudio de los genes responsables del tamaño corporal y de otras características físicas? 15. De ratones y hombres. Se ha identificado un gen que está localizado en el cromosoma humano 20 y se quiere determinar su ubicación en el genoma del ratón. ¿En qué cromosoma habría más probabilidades de encontrar el homólogo de este gen en el ratón? ✓  8 Problema de integración de capítulos

16. Diseño de cebadores. A menudo, el éxito de un experimento de PCR depende del correcto diseño de los cebadores. Concretamente, la Tm de cada cebador debe ser aproximadamente la misma. ¿Cuál es el fundamento de este requisito? ✓  8 Problemas de interpretación de datos

17. Diagnóstico basado en el DNA. En la figura se representan los geles de secuenciación correspondientes a diversas variantes de la cadena a de la hemoglobina humana. ¿Qué tipo de cambio de aminoácido aparece en cada una de las variantes? El primer triplete codifica la valina.

DNA genómico a partir de un grupo de personas y se amplifica por PCR una región de interés incluida en este gen. En una de las muestras se obtiene el cromatograma de secuenciación que aparece en la figura inferior. Explique por qué aparecen estos resultados en la posición 49 (indicada mediante una flecha).

A T T A G

50 G N G G T A T G T A

19. En cualquier dirección excepto por el este. Se ha encontrado que una serie de personas tienen dificultades para eliminar cierto tipo de fármacos de su torrente sanguíneo. Se ha relacionado el problema con un gen X, que codifica una enzima Y. Se hicieron pruebas a seis personas utilizando diversas técnicas de biología molecular. El individuo A es un control normal, el individuo B no presenta síntomas pero alguno de sus hijos tiene el problema metabólico, y los individuos C a F muestran el rasgo. Se obtuvieron muestras de tejido de cada individuo. Tras la digestión del DNA con la enzima de restricción HindIII se realizó una transferencia Southern. También se llevó a cabo la transferencia northern del mRNA. En ambos tipos de análisis, se colocaron los geles en presencia de una sonda consistente en el cDNA de X marcado. Por último, para detectar la presencia de la proteína Y, se realizó una transferencia western con un anticuerpo monoclonal unido a una enzima. Los resultados se muestran en la figura. ¿Por qué el individuo B no presenta síntomas? Sugerir posibles defectos en el resto de los individuos. ✓  8 A

B

C

D

E

TIPO DE HEMOGLOBINA Normal

Chongqing

Karachi

Río Swan

G A T C

G A T C

G A T C

G A T C Transferencias Southern

Transferencias northern

18. Dos picos. Durante el estudio de un gen y de sus posibles mutaciones en seres humanos, se obtienen unas muestras de

Transferencias western

F


Problemas 727

Problemas para atrevidos

20. Una cassette con muchas canciones. Suponga que se ha aislado una enzima que digiere la pasta de papel y que se ha obtenido su cDNA. Se pretende producir un mutante que sea efectivo a altas temperaturas. Por ingeniería genética se ha introducido un par de lugares de restricción únicos que flanquean una región codificante de 30 pares de bases del cDNA. Proponga una técnica para generar de forma rápida muchos mutantes diferentes en esta región. 21. Terra incognita. La PCR se utiliza normalmente para amplificar un DNA que se encuentra entre dos secuencias cono-

cidas. Suponga que se quiere examinar el DNA situado a ambos lados de una única secuencia conocida. Diseñe una variante del protocolo habitual de PCR que le permita amplificar un territorio genómico totalmente nuevo. ✓  8 22. Paseo cromosómico. Sugiera un método que permita aislar un fragmento de DNA que, en el genoma, sea adyacente a un fragmento de DNA aislado previamente. Considere que se tiene acceso a una biblioteca completa de fragmentos de DNA en un vector, pero que aún no se ha determinado la secuencia del genoma que se está estudiando. ✓  8

En la dirección www.whfreeman.com/tymoczko2e se pueden encontrar lecturas recomendadas para este capítulo.


Seccion 16  
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