Page 1

LOGO

THỰC TẬP VI SINH Chương trình Đại học


NỘI DUNG CHÍNH Phần 1. CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG, THAO TÁC VÔ TRÙNG VÀ BẢO QUẢN GIỐNG VI SINH VẬT Phần 2. QUAN SÁT, PHÁT HIỆN VI SINH VẬT Phần 3. ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT


Phần 1. CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG, THAO TÁC VÔ TRÙNG VÀ BẢO QUẢN GiỐNG VI SINH VẬT Bài 1. Phương pháp khử trùng Bài 2. Kỹ thuật vô trùng Bài 3. Pha chế môi trường Bài 4. Cấy chuyền và phân lập vi sinh vật Bài 5. Bảo quản giống vi sinh vật


Phần 2. QUAN SÁT, PHÁT HIỆN VI SINH VẬT Bài 6. Phương pháp quan sát và phát hiện vi sinh vật dưới kính hiển vi Bài 7. Phương pháp nhuộm đơn và nhuộm Gram


Phần 3. ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT

Bài 8. Các phương pháp định lượng vi sinh vật


ĐÁNH GIÁ MÔN HỌC 1. 2. 3. 4.

Thực hành tại lớp: 20% Bài thu hoạch thí nghiệm vi sinh: 10% Bài tập tổng hợp: 20% Thi cuối môn học: 50%


Bài 1. Phương pháp khử trùng Nguyên tắc: Sử dụng các tác nhân lý hoá: nhiệt độ, bức xạ, lọc, hoá chất. Khử trùng môi trường, dụng cụ bằng autoclave Khử trùng dụng cụ thuỷ tinh bằng phương pháp nhiệt khô


Bài 2. Kỹ thuật vô trùng Nguyên tắc: Loại trừ vi sinh vật tạp nhiễm Dụng cụ Thiết bị hỗ trợ Thao tác


Bài 3. Pha chế môi trường Nguyên tắc: - Dinh dưỡng phù hợp - pH thích hợp - Không có chất độc hại - Vô trùng Phân loại: - Môi trường tự nhiên, tổng hợp, bán tổng hợp - Môi trường lỏng, rắn, rắn mềm - Môi trường chọn lọc, kiểm định Thực hành


Bài 3. Pha chế môi trường Môi trường Hansen: - Glucose: 50g - Pepton : 10g - K2HPO4 : 3g/l - MgSO4 : 3g/l - Agar : 20 g/l (+/-) - Nước cất đủ 1 lít pH= 6

Môi trường PGA - Glucose: 50g - Agar : 20 g/l (+/-) - Dịch chiết khoai tây/giá đủ 1 lít ( 500 g khoai tây gọt vỏ/ cắt thỏi/ nấu kỹ với 1 lít nước trong 2h. Lọc/ thêm nước cho vừa đủ 1 lít)


Bài 4. Cấy chuyền và phân lập vi sinh vật CẤY CHUYỀN GIỐNG 1. Cấy giống từ môi trường lỏng sang môi trường lỏng 2. Cấy giống từ ống thạch nghiêng sang ống thạch nghiêng 3. Cấy giống từ ống thạch nghiêng sang môi trường lỏng


Bài 4. Cấy chuyền và phân lập vi sinh vật PHÂN LẬP GIỐNG: KỸ THUẬT TẠO KHUẨN LẠC ĐƠN 1. Kỹ thuật ria 2. Kỹ thuật trải


Thao tác cấy chuyền (lỏng – lỏng)

13


Thao tác cấy chuyền (lỏng – lỏng)

14


Thao tác cấy chuyền (thạch nghiêng – thạch nghiêng)

15


Thao tác cấy chuyền (thạch đĩa – thạch nghiêng)

16


PHÂN LẬP GIỐNG Tách riêng vi sinh vật để thu giống thuần Nguyên tắc: dàn mỏng (pha loãng) hỗn hợp vi sinh vật sao cho có thể thu được khuẩn lạc thuần Thường dùng thao tác cấy ria Có thể dùng thao tác cấy trãi, đổ đĩa

17


Thao tác cấy ria (ống nghiệm-thạch đĩa)

18


Thao tác cấy ria (thạch đĩa-thạch đĩa)

19


Đường di chuyển đầu que cấy

20


Đốt nóng que cấy


Để nguội


Đưa que cấy vào trong ống giống và lấy giống


Thao tác cấy trải (cấy trang) 0.1 ml

26


Bài 5. Bảo quản giống vi sinh vật 1. 2. 3. 4.

Cấy chuyền Bảo quản giống bằng glyceron Bảo quản giống bằng phương pháp làm khô Đông khô


Bài 6&7. Quan sát và phát hiện vi sinh vật _Nhuộm Gram Quan sát dưới kính hiển vi Phương pháp nhuộm đơn Phương pháp nhuộm Gram


LOGO

Bài 8. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT


Khái niệm về định lượng vi sinh vật Định lượng vi sinh vật là xác định số lượng vi sinh vật tổng số hay số lượng vi sinh vật riêng biệt trên một đơn vị vật phẩm đem nghiên cứu (trên g hoặc ml dung dịch).


Các phương pháp định lượng

1

2 4

Phương pháp đếm Phương pháp tế bào qua MPN kính hiển vi

3

5

Phương pháp màng Phương pháp Phương pháp lọc đếm khuẩn lạc đo ATP


III.Các phương pháp định lượng

6 7

Phương pháp đo độ đục

Phương pháp xác định sinh khối

8

Phương pháp PCR


Phương pháp đếm tế bào qua kính hiển vi

Là phương pháp trực tiếp đếm số tế bào vi sinh vật có trên tiêu bản làm từ vật phẩm nghiên cứu. Có hai cách đếm trực tiếp qua kính hiển vi là đếm mẫu cố định (mẫu khô) và sử dụng buồng đếm.


Đếm bằng buồng đếm hồng cầu Nguyên tắc : - Buồng đếm là những lam kính có khắc rãnh phân thành mạng lưới, các ô vuông cực nhỏ có kích thước xác định. - Trên mỗi ô vuông giữa lam kính và lame là một thể tích xác định ,tuy nhỏ nhưng rất chính xác. - Đếm số tế bào trên các ô dưới kính hiển vi và nhân với thể tích tương ứng có thể quy ra số tế bào vi sinh vật trong một ml mẫu. Tiến hành.


Sơ đồ tiến hành Nước

Nhỏ lên hai khoang

Đậy lá kính (dùng tay ấn nhẹ)

Nhỏ lên cạnh buồng đếm

Thấm nước dư

Quan sát qua kính

Đếm số tế bào trên 5 ô lớn

Mẫu

PhaA loãng

Nước


Phương pháp đếm


Phương pháp đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu

x1

x4

Lá kính x3

Vùng chứa tế bào VSV

Cấu tạo buồng đếm hồng cầu

x2

x5

xi ∈ [50- 200]


Kết quả

a * 4000*b x= *1000 c x : lượng tế bào trong một ml a : số lượng tế bào trong 5 ô lớn. b : tỷ lệ pha loãng canh trường (nghịch đảo nồng độ pha loãng) c : số ô nhỏ trong 5 ô lớn (c=16x5=80)


Nhận xét Ưu điểm của phương pháp đếm bằng buồng đếm Nhanh chóng Đơn giản


Nhận xét Nhược điểm: 1.Không phân biệt được tế bào sống và tế bào chết. 2.Chỉ thích hợp với tế bào có kích thước lớn ( nấm men, nấm mốc.) 3.Khó đạt độ chính xác cao 4.Cần có kính hiển vi phản pha khi mẫu không được nhuộm. 5.Phương pháp này không thích hợp trong trường hợp huyền phù mật độ thấp


Phương pháp MPN Phương pháp pha loãng tới hạn còn được gọi là phương pháp sử dụng chỉ số xác suất cao nhất ( most probable number method). Trong phương pháp này, người ta sử dụng hệ số pha loãng lien tiếp cấp thập phân để pha loãng huyền phù vi sinh vật ban đầu ( hệ số pha loãng được chọn là 10o, 10-1, 10-2, 10-3…). Ứng với mỗi hệ số pha loãng, ta tiến hành cấy một lượng mẫunhư nhau vào 3, 5 hoặc 10 ống nghiệm đã chứa sẵn môi trường vô trùng thích hợp cho sự phát triển của loài vi sinh vật cần định lượng. Đem ủ tất cả các ống nghiệm sau khi cấy trong tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp. Sau một khoảng thời gian xác định, tiến hành đếm số ống nghiệm có vi sinh vật phát triển tương ứng với mỗi hệ số pha loãng.


Phương pháp MPN Để nhận biết có sự phát triển của loài vi sinh vật cần định lượng trong ống nghiệm hay không, người ta dựa vào độ đục của canh trường, sự sinh khí hoặc sinh acid làm chuyển màu môi trường. Dựa vào số ống nghiệm dương tính ở các hệ số pha loãng khácnhau, sử dụng bảng MPN, ta sẽ suy ra được kết quả. Trong bảng MPN của Mac Crady ( từng được xây dựng trên cơ sở xử lý xác suất thống kê một khối lượng lớn các kết quả thử nghiệm), kết quả được biểu diễn dưới dạng chỉ số xác suất cao nhất với mức giới hạn trên và mức giới hạn dưới, độ tin cậy 95 %.


Phương pháp MPN Ưu điểm của phương pháp MPN là cho phép chúng ta định lượng được vi sinh vật có nồng độ thấp (nhỏ hơn 100 tế bào/ ml hoặc g).


Phương pháp MPN Khi sử dụng phương pháp MPN cần biết một số giả thuyết sau: + Các vi sinh vật được phân bố một cách ngẫu nhiên trong mẫu. + Tế bào vi sinh vật tồn tại dạng riêng lẻ, không tồn tại ở dạng chùm hoặc dạng chuỗi. + Môi trường và điều kiện nuôi cấy cho phép chúng ta phát hiện được sự sinh trưởng của vi sinh vật trong các ống nghiệm cho dù mẫu cấy ban đầu chỉ chứa một tế bào.


Phương pháp MPN Có thể thực hiện phương pháp này theo hai cách: Với một nồng độ pha loãng. Với vài nồng độ pha loãng.

Phương pháp dung một loại ống nghiệm với một nồng độ pha loãng duy nhất phù hợp hơn khi mật độ vi khuẩn ước định giữa mức thấp nhất và mức cao nhất rõ rang là không chênh nhau đến 100 lần và khi mật độ vi khuẩn ước định rất thấp. Chẳng hạn khi kiểm tra mẫu nước đã thanh trùng. Trong những trường hợp khác người ta thường dung vài nồng độ pha loãng khác nhau. Phương pháp ba nồng độ được dùng phổ biến nhất.


Phương pháp MPN Tiến hành như sau: Tiến hành pha loãng mẫu với hệ số pha loãng là 10o, 10-1, 10-2, 10-3… Ứng với mỗi hệ số pha loãng, lắc đều và cấy mẫu vào ba ống nghiệm chứa môi trường dịch thể. Đặt các ống nghiệm vào tủ ấm và nuôi ở 35oC. Sau 48 giờ, đọc kết quả. Những ống nghiệm dương tính có canh trường bị vẩn đục hoặc xuất hiện hiện tượng sinh khí.


Các mẫu pha loãng


Số ống dương tính

Số ống dương tính

Khoảng tin cậy

0.1

0.01

0.001

MPN/g

0

0

0

< 3.0

0

0

1

0

1

0

Khoảng tin cậy

thấp

cao

0.1

0.01

0.001

MPN/g

thấp

cao

-

9.5

2

2

0

21

4.5

42

3

0.15

9.6

2

2

1

28

8.7

94

0

3

0.15

11

2

2

2

35

8.7

94

1

1

6.1

1.2

18

2

3

0

29

8.7

94

0

2

0

6.2

1.2

18

2

3

1

36

8.7

94

0

3

0

9.4

3.6

38

3

0

0

23

4.6

94

1

0

0

3.6

0.17

18

3

0

1

38

8.7

110

1

0

1

7.2

1.3

18

3

0

2

64

17

180

1

0

2

11

3.6

38

3

1

0

43

9

180

1

1

0

7.4

1.3

20

3

1

1

75

17

200

1

1

1

11

3.6

38

3

1

2

120

37

420

1

2

0

11

3.6

42

3

1

3

160

40

420

1

2

1

15

4.5

42

3

2

0

93

18

420

1

3

0

16

4.5

42

3

2

1

150

37

420

2

0

0

9.2

1.4

38

3

2

2

210

40

430

2

0

1

14

3.6

42

3

2

3

290

90

1000

2

0

2

20

4.5

42

3

3

0

240

42

1000

2

1

0

15

3.7

42

3

3

1

460

90

2000

2

1

1

20

4.5

42

3

3

2

1100

180

4200

2

1

2

27

8.7

94

3

3

3

>1100

420

-


3.Đánh giá : Với phương pháp ba nồng độ pha loãng ta chỉ cần lập dãy số các ống dương tính và tra theo bảng để biết giá trị MPN tương ứng của mẫu thử. Phương pháp MPN có thể dung để định lượng bất kì loại vi sinh vật nào với điều kiện phải dùng môi trường tăng sinh chọn lọc (môi trường lỏng) cho kết quả khá phù hợp, chẳng hạn BGBL kết hợp với chế độ nhiệt độ 37oC cho Coliform, 45oC cho Coliforms phân, Manitol Salt Broth cho Staphylococus…


Phương pháp gián tiếp đếm khuẩn lạc Nguyên tắc: _ Bản chất của phương pháp này là cấy một thể tích xác định mẫu huyền phù vi sinh vật lên môi trường trường thạch trong hộp petri. _ Sau một khoảng thời gian nuôi cấy, trên bề mặt thạch sẽ xuất hiện khuẩn lạc và ta có thể quan sát được bằng mắt thường. _ Dựa vào số khuẩn lạc đếm được, thể tích mẫu đã cấy và hệ số pha loãng, ta có thể suy ra số khuẩn lạc có trong 1ml mẫu khảo sát ban đầu.


Xác định số tế bào sống bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

Đổ đĩa, cấy trải


Nhận xét Ưu điểm: _ Ta định lượng những tế bào sống có trong mẫu khảo sát ban đầu. _ Được ứng dụng rộng rãi hơn các phương pháp khác, đặc biệt là để kiểm tra thực phầm,bệnh phẩm, chất lượng vệ sinh của nước. _ Độ nhạy khá cao, cho phép phát hiện tương đôi chính xác mức độ nhiêm khuẩn đối với sản phẩm. Nhược điểm: _ Thời gian dài và tốn kém chi phí hoá chất _ Nhân công nhiều hơn so với phương pháp khác


Phương pháp cấy gạt _ Chuẩn bị môi trường thạch trong erlen và đi hấp tiệt trùng. Sau khi làm nguội môi trường thạch về nhiệt độ 50oC, đổ môi trường thạch vào hộp petri vô khuẩn. Các hộp được xếp trên mặt phẳng nằm ngang cho đến khi thạch nguội. Người ta bao gói và lật úp các hộp petri lại rồi đem đi bảo quản trong tủ ở nhiệt độ phòng trong thời gian 2-3 ngày để kiểm tra độ vô trùng của môi trường. _ Ứng với độ pha loãng, lắc đều mẫu và dùng pipet vô trùng lấy chính xác một lượng thể tích mẫu cho lên bề mặt thạch hộp petri. Thể tích lấy mẫu không quá 0,1ml.


Phương pháp cấy gạt _ Sau đó dùng que cấy gạt vô trùng để dàn đều mẫu trên bề mặt thạch. Để vô trùng que cấy gạt. Ta nhúng que cấy vào dung dịch cồn 70o. Ta vẩy ráo và đưa que cấy lên ngọn lửa đèn cồn để làm cháy đi phần cồn còn đọng lại trên qua. Ngay sau đó, ta có thể sử dụng que cấy gạt để dàn đều mẫu trên bề mặt thạch. _ Chờ cho bề mặt thạch khô, tiến hành bao hộp petri, lập úp hộp và đặt chúng vào tủ ấm. Nuôi cấy trong 2-3 ngày ở nhiệt độ thích hợp. _ Đối với mỗi độ pha loãng, cần tính hành gieo cấy ít nhất là trong 2 hộp petri. Sử dụng 1 pipet vô trùng và 1 que cấy gạt cho mỗi độ pha loãng.


Phương pháp đổ hộp _ Chuẩn bị môi trường thạch và hấp tiệt trùng. Mỗi ống nghiệm chứa 25ml môi trường thạch. Trước khi đem sử dụng, đặt các ống nghiệm vào bể điều nhiệt ở nhiệt độ 50oC để thạch bên trong ống tan chảy trở lại. _ Sử dụng các hộp petri đã được vô khuẩn trước. Ứng với mỗi độ pha loãng, dùng pipet vô trùng lấy chính xác một thể tích mẫu cho vào hộp petri . Thể tích mẫu có thể dao động từ 0,11,0ml. _ Lắc đều phần môi trường trong ống nghiệm và đổ tiếp vào hộp petri. Xoay hộp để mẫu huyền phù vi sinh vật và môi trường thạch được trộn đều với nhau. _ Chờ cho thạch đông lại rồi tiến hành bao gói các hộp petri, lật úp hộp rồi đặt vào tủ ấm.


Phương pháp màng lọc Phương pháp màng lọc (Membrane Filter Method) thường được dùng để định lượng vi sinh vật (đặc biệt là vi sinh vật chỉ thị) trong mẫu nước khi tiến hành các xét nghiệm môi trường ( nơi có mật độ vi sinh vật nói chung và vi sinh vật chỉ thị nói riêng tương đối thấp). Bản chất phương pháp này là tập trung số vi sinh vật ít ỏi trong một mẫu nước có khối lượng khá lớn trên màng lọc khuẩn và định lượng chúng theo số khuẩn lạc đếm được sau khi đặt màng lọc lên môi trường thạch có thành phần dinh dưỡng thích hợp cho loại vi sinh vật cần kiểm. Dựa trên khối lượng mẫu nước ban đầu và quy ước coi mỗi khuẩn lạc được hình thành từ một vi khuẩn người ta quy ra số lượng vi sinh vật có trong một đơn vị thể tích nước.


Phương pháp màng lọc Phương pháp này thực chất là sự kết hợp của hai phương pháp vốn được sử dụng rộng rãi trong công tác kiểm nghiệm vi sinh vật. - phương pháp lọc vô khuẩn (thường được dung để lọc thanh trùng một số dung dịch kém chịu nhiệt, dễ bị biến chất hoặc thủy phân khi khử trùng ở nhiệt độ cao) - phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa.


Phương pháp màng lọc Hiện nay người ta đã chế tạo được nhiều loại màng lọc khuẩn khác nhau với kích thước lỗ vào khoảng 0.2 ÷1 µm. Những vật liệu thường được dung để chế tạo màng lọc khuẩn là sợi thủy tinh siêu mảnh, sợi amiante, sợi polypropylene, …là những vật liệu có khả năng chịu được nhiệt độ và áp suất cao của nồi hấp tiệt trùng. Màng lọc loại này thường được cung cấp trong trạng thái vô trùng.


Phương pháp màng lọc


Phương pháp màng lọc


Phương pháp màng lọc


Phương pháp đếm khuẩn lạc trên màng lọc


Phương pháp màng lọc Ở đây người ta dùng những màng lọc đã được in thành các ô vuông bằng một loại vật liệu kị nước. Những đường kẻ kị nước này có tác dụng ngăn cản sự mọc lan của các khuẩn lạc và như vậy chia bề mặt màng lọc thành những ô đều nhau có kích thước xác định. Số ô vuông có khuẩn lạc mọc được đếm và qui về số có xác suất lớn nhất (MPN) của lượng vi sinh vật có trong một thể tích mẫu theo công thức: MPN=N.ln(N/N-x) Trong đó N là tổng số các ô vuông, x là số ô vuông có khuẩn lạc mọc.


Phương pháp đo ATP Nguyên tắc: _ Adenosine-triphosphate(ATP) là chất trữ nguồn năng lượng cơ bản cho mọi cơ thể (trong mọi tế bào sống). ATP bị thuỷ phân trong vòng 2h sau khi tế bào chết. Lượng ATP trong tế bào ổn định ở 10-18 đến 10-17 mole/ tế bào tương ứng 4*104mole ATP/ 105 cfu. _ Nên xác định được hàm lượng ATP nội bào trong mẫu huyền phù vi sinh vật cho phép chúng ta phỏng đoán được hàm lượng các tế bào vi sinh vật sống có trong mẫu. _ Để xác định hàm lượng ATP nội bào, trước tiên ta cần phá vỡ thành tế bào để trích ly ATP. Người ta thường sử dụng những enzyme đặc hiệu để xúc tác phản ứng phân hủy các đại phân tử tham gia cấu tạo nên thành tế bào. Ta dựa vào phản ứng phát quang sinh học giữa ATP và luciferin, sử dụng xúc tác là luciferase để định lượng ATP.


Cơ chế phản ứng phát quang sinh học ATP

Hoạt hóa: phân tử ATP và luciferin sẽ cùng tạo phức với phân tử enzyme, sau đó ATP sẽ chuyển thành AMP và giải phóng ra pyrophosphate.

Oxy hóa: nếu có mặt oxy, luciferin sẽ bị oxy hóa tạo thành một phân tử nước.

Decarboxy hóa: ở giai đoạn này, sẽ giải phóng ra một phân tử CO2, AMP và một photon.

Cường độ ánh sáng phát ra từ phản ứng trên tỷ lệ thuận với hàm lượng ATP tham gia phản ứng. Bằng cách dựng đồ thị đường chuẩn, ta có thể định lượng hàm lượng ATP trong mẫu phân tích.


Nhận xét: Ưu điểm: _ Đơn giản _ Nhanh gọn Nhược điểm: _ Tốn hoá chất _ Chỉ đánh giá tình trạng vệ sinh bề mặt


Cách tiến hành: Xác định đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ ATP và cường độ ánh sáng phát ra từ phản ứng phát quang sinh học. _

Pha loãng dung dịch ATP chuẩn để thu được các dung dịch ATP có nồng độ thay đổi từ 10-8 đến 10-4 mol/l. _ ứng với mỗi độ pha loãng, lấy 50µl mẫu cho vào ống nghiệm đã chứa 2.5ml dung dịch biofax A2. Khuấy trộn trên máy vortex trong thời gian 30 giây. _ Lấy 200µl hỗn hợp trên cho vào một ống nghiệm khác. Thêm vào 10µl dung dịch luciferin và khuấy trộn trên máy vortex trong thời gian 30 giây. _ Đọc kết quả cường độ ánh sáng của mẫu đo. Kết quả đo được biểu diễn dưới dạng đơn vị ánh sáng tương đối. Tiến hành đọc 3 lần, mỗi lần cách nhau 10 giây. Lấy giá trị cao nhất trong ba giá trị đo đươc để tính kết quả. _ Thực hiện một mẫu đối chứng –thay dung dịch ATP bằng nước cất. Cường độ ánh sáng của các mẫu ATP chuẩn RLUATP sẽ được tính theo công thức: RLUATP= RLUATP* - RLUH2O Trong đó: RLUATP*-giá trị đo được của mẫu chứa ATP trên thiết bị đo cường độ ánh sáng. RLUH2O -giá trị đo được của mẫu nước cất trên thiết bị đo cường độ ánh sáng.


Cách tiến hành: Xác định hàm lượng ATP tổng trong mẫu huyền phù vi sinh vật

_ Lắc đều mẫu huyền phù vi sinh vật và dùng micropipet lấy 50µl mẫu cho vào một ống nghiệm đã chứa sẵn 400µl dung dịch biofax A1. khuấy trộn trên máy Vortex trong thời gian 30 giây. _ Thêm tiếp 2,5ml dung dịch biofax A2 vào ống nghiệm rồi khuấy trộn tiếp trên máy Vortex trong thời gian 30 giây. _ Lấy 200µl hỗn hợp trên cho vào ống nghiệm khác. Thêm tiếp vào 10µl dung dịch luciferin rồi khuấy trộn trên máy Vortex trong thời gian 30 giây. _ Đọc kết quả cường độ ánh sáng của mẫu đo. Tiến hành đọc 3 lần, mỗi lần cách nhau 10 giây. Lấy giá trị cao nhất trong 3 giá trị đo được để tính kết quả. _ Thực hiện một mẫu với nước cất. _ Cường độ ánh sáng của mẫu khảo sát RLUtổng sẽ là: RLUtổng= RLUtổng* - RLUH2O RLUtổng* - giá trị đo được của mẫu khảo sát trên thiết bị đo cường độ ánh sáng. RLUH2O - giá trị đo được của mẫu nước cất trên thiết bị đo cường độ ánh sáng


Cách tiến hành: Xác định hàm lượng ATP ngoại bào trong mẫu huyền phù vi sinh vật

_ Lắc đều mẫu huyền phù vi sinh vật và dùng micropipet lấy 50µl mẫu cho vào một ống nghiệm đã chứa sẵn 2,5mll dung dịch biofax A2. khuấy trộn trên máy Vortex trong thời gian 30 giây. _ Lấy 200µl hỗn hợp trên cho vào ống nghiệm khác. Thêm tiếp vào 10µl dung dịch luciferin rồi khuấy trộn trên máy Vortex trong thời gian 30 giây. _ Đọc kết quả cường độ ánh sáng của mẫu đo. Tiến hành đọc 3 lần, mỗi lần cách nhau 10 giây. Lấy giá trị cao nhất trong 3 giá trị đo được để tính kết quả. _ Thực hiện một mẫu với nước cất. _ Cường độ ánh sáng của mẫu khảo sát RLUngoại bào sẽ là: RLUngoại bào = RLUngoại bào* - RLUH2O RLUngoại bào * - giá trị đo được của mẫu khảo sát trên thiết bị đo cường độ ánh sáng. RLUH2O - giá trị đo được của mẫu nước cất trên thiết bị đo cường độ ánh sáng


Cách tiến hành: Xác định hàm lượng ATP nội bào trong mẫu huyền phù vi sinh vật _ Cường độ ánh sáng do các phân tử ATP nội bào trong mẫu huyến phù vi sinh vật được xác định bằng công thức sau: RLUnội bào= RLUtổng – RLUngoại bào _ Với giá trị RLUnội bào tính được, dựa vào đò thị đường chuẩn CATP=f(RLUATP), ta sẽ suy ra nồng độ ATP nội bào có trong mẫu khảo sát.

Định lượng vi sinh vật trong mẫu phân tích thông qua hàm lượng ATP nội bào _ Ta phải xây dựng đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa hàm lượng ATP nội bào và nồng độ tế bào hoặc biễu diễn mối quan hệ giữa hàm lượng ATP nội bào và lượng chất khô của tế bào có trong mẫu khảo sát. _ Từ đó, nếu biết được giá trị nồng độ ATP nội bào cần phân tích, dựa vào đồ thị chuẩn, ta sẽ xác định được nồng độ tế bào hoặc lượng chất khô của tế bào trong mẫu.


PHƯƠNG PHÁP ĐO ĐỘ ĐỤC Khi một pha lỏng có chứa nhiều phần tử không tan => tạo thành một hệ huyền phù và có độ đục bởi các phần tử hiện diện trong môi trường lỏng cản ánh sáng, làm phân tán chùm ánh sáng tới Tế bào vi sinh vật là một thực thể nên khi hiện diện trong môi trường cũng làm môi trường đục Xác lập quan hệ tỷ lệ tuyến tính giữa mật độ tế bào vi sinh vật và độ đục Định lượng gián tiếp thông qua độ đục Dựa vào đường chuẩn


Đo mật độ quang (OD)

Bộ phận xử lýxuất kết quả

Nguồn sáng

Dịch lỏng chứa VSV

Tế bào quang điện


PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH SINH KHỐI Mức độ hiện diện của vi sinh vật có thể được định lượng bằng sinh khối tích lũy của vi sinh vật Phương pháp này mang tính ước lượng, độ chính xác không cao


Giả sử được biết mật độ tế bào nhân giống nấm men S. cerevisiae nằm trong khoảng 2.109 -3.109 tế bào/ml. Xác định mức pha loãng thích hợp để áp dụng phương pháp định lượng bằng buồng đếm


Xác định mật độ tế bào nấm men S. cerevisiae trong giai đoạn nhân giống bằng phương pháp đếm trực tiếp ghi nhận được ở 5 ô lớn đại diện như sau: [Ô1: 74 _ Ô2: 86 _ Ô3: 88_ Ô4: 75 _ Ô5:81]. Biết nồng độ pha loãng huyền phù nấm men bia là 10-2. Hãy trình bày các bước cần tiến hành để xác định tỷ lệ tế bào sống trong huyền phù nêu trên.

313471202 thuc tap vi sinh  

vi sinh

Read more
Read more
Similar to
Popular now
Just for you