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Clonado y expresiรณn del cDNA de los factores de transcripciรณn Pax8A y C humano en bacterias

Informe de Trabajo Prรกctico Grupo 5A Integrantes: Costilla Melisa, Degiusti Bรกrbara, Fiore Ana, Gรณmez Alejandra, Rigoni Adriana


Primer Objetivo: amplificación del inserto a clonar cDNA del factor de transcripción Pax 8A por PCR

Resultado: El factor de transcripción Pax8A fue amplificado correctamente. Corroborándose, por corrida electroforética, la presencia del mismo en las 4 reacciones realizadas por este grupo de trabajo, más un tubo control negativo.


Figura 1. Corrida electroforĂŠtica en gel de agarosa 1,5%.Calles 2 a 6 pertenecen al grupo 5A. Calle 2: control negativo, calles 3 a 6 productos de amplificaciĂłn del Pax8A FotografĂ­a tomada en el transiluminador UV


Segundo Objetivo: Preparaciรณn del inserto y del vector para la clonaciรณn, por doble digestiรณn con las enzimas BamHI y EcoRI. Ligaciรณn en pGEMT y transformaciรณn de bacterias competentes.

Resultados: Luego de cultivar las bacterias en agar LB/ampicilina/IPTG/XGal, se obtuvo desarrollo de colonias blancas y azules, indicando el crecimiento de las recombinantes y no recombinantes respectivamente.


Figura 2. Placa de agar LB/ampicilina/IPTG/X-Gal. Se observa el desarrollo de colonias blancas y azules.


Tercer Objetivo: Purificación del DNA plasmídico bacteriano y caracterización del plásmido recombinante por corrida electroforética. Caracterización del mismo por digestión con enzima de restricción.

Resultado: La calidad y cantidad del plásmido purificado se controló por corrida electroforética de los plásmidos circulares y plásmidos digeridos, observándose dos bandas.


Figura 3. Corrida electroforĂŠtica en gel de agarosa al 1% . Se observa la presencia de dos bandas correspondientes al vector con y sin inserto. Chorreado de ARN en el extremo derecho de la foto


Figura 4. :Corridas electroforĂŠticas obtenidas por otros grupos


Cuarto Objetivo: Expresión recombinante en bacterias de PAX8 A y posterior visualización de proteínas totales en gel SDS-PAGE coloreado con Coomassie blue

Resultados: Obtención del gel y análisis de los resultados. (Pendiente… )


Conclusión: Se realizó el clonado del cDNA del factor de transcripción Pax8A en bacterias competentes DH5a. No se pudo evidenciar los resultados de la expresión de la proteína debido a dificultades técnicas. Queda pendiente la repetición de la corrida para evaluar la funcionalidad del factor de transcripción además de la secuenciación del gen que codifica para la misma.


Trabajo Practico de CLONADO