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Resumen: M-031

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2005

Evaluación in vitro, de la acción del formocresol sobre la actividad fagocitaria, necrosis y apoptosis en macrófagos murinos Cardoso, Maria L. - Alvarez, Mirta A. - Aguirre, Maria V. - Brandan, Nora - Lucas, Gabriela V. Cátedra de Bioquímica- Facultad de Medicina-UNNE. Moreno 1240- Corrientes ANTECEDENTES Las células macrofágicas están envueltas en un amplio espectro de reacciones de defensa. Luego de establecerse un contacto con un agente agresor, estos fagocitos actúan liberando citoquinas proinflamatorias que inician y amplifican el proceso inflamatorio(1). Los macrófagos son células que participan directamente ante cualquier estimulo físico químico o bacteriano (2), siendo elementos críticos para la respuesta a diversas agresiones, por su capacidad para la fagocitosis y su potencial en los procesos anfígenos anticuerpo (3). La capacidad de adherencia a algunos sustratos como el plástico y el vidrio, ademas de estar vinculado al desarrollo de las reacciones inflamotorias y la fagocitosis (5), permite diferenciar poblaciones macrofagicas con distinto comportamiento migratotio, de diferenciacion y muerte celular (4). Esta caracteristica puede ser alterada significativamente por algunos estímulos que activan a los macrófagos, induciendo la liberación de citoquinas proinflamatorias como son IL-1beta, IL-6, TNF-alfa(6). La liberación de citoquinas proinflamatorias a partir de los macrófagos tiene un importante efecto en el reclutamiento, proliferación y diferenciación de osteoblastos, favoreciendo la reabsorción ósea(7). Se ha demostrado que la pulpa y los tejidos periapicales inflamados contiene una gran variedad de células inmunocompetentes, con predominancia de macrófagos(9), a través de las cuales se inducen todos los estadios de lesiones periapicales (10). El formocresol es ampliamente utilizado en el tratamiento pulpar de dientes temporarios con pulpas reversible o irreversiblemente inflamadas para la realización de pulpotomias o pulpectomias. El formocresol contiene 19% de formaldehído, 35% de cresol y 15% de glicerina en un medio acuoso. El cresol probablemente cause deshidratación en los tejidos pulpares, disolución en las membranas celulares, y tal vez reduzca las propiedades irritantes del formaldehído. Concentraciones detectables de formaldehído y tricresol fueron halladas en ligamento periodontal, hueso, dentina y pulpa, posterior a la aplicación del medicamento en tratamientos de pulpotomia, demostrándose también que en altas concentraciones el formocresol es citotóxico (11- 12). La activación o no de los macrófagos, producida por la droga que se adiciona al medio de cultivo, puede alterar el índice de adherencia y la morfología celular, indicando su potencial citotóxico(8). El fundamento del presente estudio fue determinar el perfil de respuesta, in vitro, de macrófagos murinos a diferentes dosis del formocresol, analizando la viabilidad, el índice de adherencia, la morfología y la cuantificación de necrosis y apoptosis. MATERIALES Y METODOS Animales y Drogas: Se utilizaron ratones isogénicos swis CF1(26 a 28 g.), del bioterio de la Facultad de Medicina de la U.N.N.E.. Los mismos fueron mantenidos con dieta estándar y agua ad libitum. Los animales son manejados de acuerdo a la guía de cuidados y uso de animales del Instituto Nacional de Salud USA 1985. Los animales son estimulados inyectando tioglicolato (3%), via i.p.. Tres días mas tarde, son anestesiados con éter e inyectados via i.p. con solución fisiológica (0,9%), a 37ºC. Se obtiene el exudado peritoneal y se centrifuga . Las células obtenidas son resuspendidas en solución fisiológica al 0,2%. Se resuspende en alfa- medio suplementado y se realiza la viabilidad inicial, ajustando a una concentración de 1 x 106 macrófagos/ml. El formocresol se diluyo, hasta alcanzar concentraciones de 1: 10, 1: 100, 1:1000, 1:50, 1:500 y 1:5000. Ensayo de la capacidad de adherencia La cuantificación del índice de adherencia al sustrato fue realizada de acuerdo a técnica descripta previamente (4).El índice de adherencia fue evaluado a los 15’ y 30’, durante los cuales los tubos fueron incubados con diferentes diluciones de formocresol con sus correspondientes controles, a 37ºC en una atmósfera humidificada al 5% CO2 . Alícuotas de 10ul fueron tomadas de cada muestra, tiñéndose en trypan-blue para contar los macrófagos no adherentes/ml. El índice de adherencia fue calculado según la siguiente ecuación : AI= 100 – Macrófagos no adherentes/ml. x 100 Macrófagos iniciales/ml. Los resultados se expresaran como la media + SEM de los ensayos realizados por duplicado a cada tiempo experimental Determinación de la Viabilidad celular: En placas de cultivo de 24 wells, se coloco 500ul de las diluciones y suspensiones celulares a cada uno de los tiempos de incubación (15’ y 30’). La muerte celular se determino por la presencia de trypan blue citoplasmático, lo cual le confería una coloración azul. El numero total de células y el porcentaje de células no viables fue determinado usando un hemocitometro bajo microscopia óptica. La viabilidad celular será expresada como el porcentaje del número de células vivas/numero de células totales. Los resultados se expresaran como la media + SEM de los ensayos realizados por duplicado a cada tiempo del protocolo


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UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2005 Análisis morfológico de los macrófagos Para lograr la adhesión,. se colocaron cubreobjetos en placas de cultivo de 3cm, en el que fueron distribuidos suspensiones de macrófagos 1 x 106 células , e incubadas con las distintas diluciones de formocresol por 30 y 60’a 37ºC en una atmósfera humidificada al 5% CO2.Después del tiempo establecido, las placas se lavaron con solución fisiológica al 0,9% y se las tiñe con el método de May- Grunwald- Giemsa.(MGG). La morfologia fue determinada por microscopia optica. Estos ensayos se realizaron por triplicado y los resultados se expresan como la media +SEM. Determinación de Apoptosis y Necrosis El Índice de Apoptosis y necrosis fue identificado morfológicamente por microscopia óptica de macrófagos peritoneales murinos teñidos con MGG, determinando el porcentaje de células reconocidas en 500 células contadas en diferentes campos. Las células apoptoticas muestran condensación nuclear, vacuolizacion, núcleos fragmentados, membranas con burbujas pero sin perdida de integridad y formación de cuerpos apoptoticos. Las células necróticas muestran perdida de la integridad de la membrana, lisis total de las células y desintegración de organelas. Los resultados son expresados como la media del porcentaje de células apoptoticas y necróticas + SEM a cada tiempo del protocolo experimental. Análisis Estadístico Los datos fueron analizados usados utilizando el Software INSTAT y PRISM versión 2.0 (GraphPad Software, San Diego,California,USA). Un valor de p<0.05 fue considerado estadísticamente significativo. Los gráficos se obtuvieron usando el software GraphPad Prisma y Adobe Phptoshop 6.0.

RESULTADOS

Viabilidad M acrofagica (sin drogas)

Viabilidad (%)

100

**

75

50

25

** 0 0

2

6

Fig.1_ Suspensiones de celulas obtenidas del lavaje peritoneal con caracteristicas de macrofagos (1x106 cel/ml.), fueran incubados a 37ºC, a diferentes tiempos, (2,6,24 hs.) y ensayados para determinar la viabilidad por el ensayo del azul de trypan blue. A partir de las 6 hs, la viabilidad disminuye un 30%, disminuyendo a las 24 hs hasta los niveles un 10%. Los resultados se obtuvieron de 3 ensayos realizados por triplicado y se representan como la media + SEM . **p<0.01

24

Horas

Viabilidad 15'

Sobrevivencia macrofagica

75

** 50 25 0 0

70

Sobrevivencia (%)

100

Viabilidad (%)

Fig 2_ Suspension de macrofagos (1x106 cel/ml.), se incubaron con formocresol a distintas diluciones (10, 50, 100, 500, 1000, 5000), durante 15’ a 37ªC., y ensayados para determinar la viabilidad por el ensayo del azul de trypan blue. En la mayor concebntracion de la droga (1:10), se observo una disminucion de la viabilidad.(p<0.01).Los resultados se obtuvieron de experiencias realizadas por triplicado y son representadas como la media + SEM. **p<0.01

10

50

100

500 1000 5000

Formocresol (Dilucion)

60

Fig. 3_ Suspension de macrofagos (1x106 cel/ml.), se incubaron con formocresol a distintas diluciones (10, 50, 100, 500, 1000, 5000), durante 2 hs. a 37ªC. La sobrevivencia de macrofagos disminuye con las concentraciones mas elevadas de la droga (1:10, 1:50) (p<0.01). Los resultados se obtuvieron de experiencias realizadas por triplicado y son representados como la media + SEM. **p<0.01

**

50 40

**

30 20 10 0 0

10

50

100

500 1000 5000

Formocresol (diluciones)


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UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2005 Indice de Adherencia 30'

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0

**

**

**

10

100

1000

Adherencia Index (%)

Adherencia Index (%)

Indice de Adherencia 15' 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

0

*

*

*

10

100

1000

Formocresol (Dilu ciones)

Formocresol (Diluciones)

Fig. 3-4. Suspension de macrofagos (1x106 cel/ml.), se incubaron con formocresol a distintas diluciones (10, 50, 100, 500, 1000, 5000), durante 15 y 30 minutos respectivamente a 37ªC. Al realizarse el indice de adherencia se observo a 15’ un aumento en la adhesion, concentracion dependiente (1:10, 1:100),(p<0.01). A los 30’ el mayor aumento se registro en 1:100 (p<0.05). Los resultados se obtuvieron de experiencias realizadas por triplicado y son representados como la media + SEM. **p<0.01 Fig.5-6. . Suspension de macrofagos (1x106 cel/ml.), se incubaron con formocresol a distintas diluciones (10, 50, 100, 500, 1000, 5000), durante 60 y 120 minutos respectivamente a 37ºC. Al realizarse el indice de adherencia se observo

Indice de Adherencia 60'

Indice de Adherencia 120' 100

Adherencia Index (%)

Adherencia Index (%)

100

* 75 50 25 0 0

10

50

100

75 50 25 0

500 1000 5000

0

Formocresol (Dilu cion)

10

50

100

500 1000 5000

Formocresol (Dilucion)

que solo a los 60’ hubo un aumento de la adhesion en la mayor dilucion de la droga (1:1000) (p<0.05) y a 120’ no se observo variaciones, indicando que la adherencia macrofagica es concentracion y tiempo dependiente. Los resultados se obtuvieron de experiencias realizadas por triplicado y son representados como la media + SEM. **p<0.01 Ap o p to s is

**

15

**

0

10

50

**

**

**

**

100

500

1000

5000

F o r m o c r e s o l (D ilu c ió n )

Apoptosis (%)

Necrosis (%)

Ne c r o s is 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0

**

**

10

**

** 5

0 0

10

50

100

500

1000

5000

F o r m o c r e s o l (D ilu c io n )

Fig 7-8. Suspension de macrofagos (1x106 cel/ml.), se incubaron con formocresol a distintas diluciones (10, 50, 100, 500, 1000, 5000), durante 2 hs. a 37ºC. A traves de microscopio optico x 100 se observo el mayor porcentaje de necrosis a la mayor concentracion de la droga (1:10) (p<0.01). En cuanto a los valores de apoptosis encontramos un aumento significativo en las diluciones 1:50 y 1:100 (p<0.01). Los resultados se obtuvieron de experiencias realizadas por triplicado y son representados como la media + SEM. **p<0.01


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F.1

F.2

F.3

Foto 1. Exudado peritoneal murino. Control. MO. X100. Foto 2. Exudado Peritoneal. Las flechas marcan las celula apoptoticas.Dilucion 1:50 .MO x100. Foto 3. Exudado Peritoneal. Las flechas señalan las celulas necroticas. Dilucion 1:10. MO x100. Conclusiones:       

La viabilidad de los macrofagos en cultivo, se mantienen hasta las 2 hs., a partir del cual descienden alcanzando los valores minimos a las 24 hs. Cuando se incubaron los macrofagos con las diferentes diluciones de formocresol (10, 50, 100, 500, 1000, 5000), durante 15’ la viabilidad se vio afectada a la mayor concentracion de la droga. La sobrevivencia de los macrofagos se vio afectada entre las diluciones de concentraciones mas alta (1:10 y 1:50). El indice de adherencia que marca la bioactividad de los macrofagos, fue mayor entre 15’ y 30’ en las diferentes diluciones testeadas, siendo mas sensible con el menor tiempo (15’)(p<0.01). A mayor concentracion del formocresol (1:10), se produjeron los mayores porcentajes de necrosis, disminuyendo en funcion de la dosis, pero siendo significativa hasta la ultima dilucion. Cuando se identifico apoptosis las mismas alcanzaron su maximo porcentaje entre diluciones del formocresol 1:50 y 1:100, disminuyendo progresivamente en concentraciones mas diluidas. El efecto del formocresol en la bioactividad del macrofago es concentracion y tiempo dependiente.

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