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Preservación de eritrocitos y cambios físicos ocurridos durante el almacenamiento

Oscar Andrés Peñuela B, Adriana Urbina B. Internos Especiales en Investigación Fisiología del Eritrocito Humano, Unidad de Fisiología. Luis Fernando Palomino Q, MD. Profesor Asistente Unidad de Fisiología. Departamento de Ciencias Fisiológicas, Facultad de Medicina, Universidad Nacional de Colombia

RESUMEN La preservación de sangre y de sus derivados ha sido una constante en el desarrollo de los bancos de sangre modernos. Los dos métodos actualmente utilizados son la fase líquida y la criopreservación. Se revisaron las generalidades de cada uno de ellos, así como los cambios físicos ocurridos a los eritrocitos durante su almacenamiento. Palabras clave: Eritrocitos, almacenamiento, criopreservación, cambios físicos. PRESERVATION OF ERITROCITOS AND HAPPENED CAMBIOS FISICOS DURING THE STORAGE Blood and blood components preservation have been keys in the modern blood banks development. There are two methods used actually for preserving: liquid and frozen preservation. We carried out a revision about them and some physical changes during red blood cells storage. Key words: Erythrocytes, storage, frozen preservation, physical changes. INTRODUCCIÓN Hasta 1616, fecha en la que W. Harvey propuso el concepto de la circulación de la sangre, la transfusión carecía de fundamento. Cuando se aceptó que la sangre circulaba y que el espacio intravascular podía rellenarse con líquidos introducidos desde el exterior, la idea de transfusión logró arraigarse. El primer procedimiento se llevó a cabo en 1667 (1); los progresos fueron lentos por la complejidad de este enfoque, en particular la incompatibilidad entre las especies. A principios del siglo XX la transfusión como medida terapéutica seguía siendo laboriosa y riesgosa, pero durante y después de la II Guerra Mundial los avances técnicos permitieron la expansión rápida del almacenamiento y la administración de sangre. El hecho más importante fue el reconocimiento de las diferencias genéticas entre los individuos, planteado por Landsteiner a partir de 1901. El desarrollo de los anticoagulantes, los conservadores y la esterilización, posibilitó la recolección y la preservación de la sangre para ser utilizada más tarde. El empleo más reciente de los hemoderivados amplió el campo de aplicación limitado a la restauración de la volemia, al reemplazo de la mayoría de las células y muchas proteínas plasmáticas. Los adelantos continúan en especial en lo que se refiere a la utilización más eficiente de los componentes y fracciones de la sangre, la seguridad y la compatibilidad inmunológica entre el dador y el receptor para poder transfundir a todos los pacientes (2). Cuando el eritrocito pierde el núcleo y los ribosomas ya no pueden sintetizar proteínas. Al desaparecer las mitocondrias debe depender de la glucólisis anaeróbica para el suministro de energía. En el hombre, debe sobrevivir 4 meses y superar muchos kilómetros de viaje peligroso con un equipo de mantenimiento


limitado. No obstante, conserva una capacidad de reparación considerable. Puede preservar los niveles efectivos de adenosintrifosfato (ATP), nicotinamida-adenina dinucleótido (NAD) y las formas reducidas del NAD (NADH) y el NAD fosfato (NADPH), además de la composición iónica. También reduce la metahemoglobina y el glutatión oxidado, genera glutatión y sella la membrana si se lesiona. A pesar de estas y otras propiedades, llega un momento en que ya no puede sostener su existencia (3). Al parecer, la "lesión de almacenamiento" del eritrocito funciona como un fenómeno de todo o nada, de manera que hay células que sobreviven más de 24 horas y otras que no lo hacen (4). ALMACENAMIENTO DE SANGRE Y SUS DERIVADOS Para ser usados en un receptor, los eritrocitos transfundidos deben sobrevivir en la circulación y ser capaces de transportar eficientemente el oxígeno a los tejidos. La viabilidad de los eritrocitos está definida como su capacidad para circular por 24 horas después de la reinfusión; su funcionalidad está definida como su capacidad para liberar oxígeno a los tejidos de una forma normal. La preservación ideal de eritrocitos debería ser una que permita su almacenamiento por un tiempo ilimitado sin alterar su viabilidad o su función; es claro que este ideal no ha sido logrado todavía (5). Preservación líquida La hemoterapia sólo adquirió valor práctico con el advenimiento de los anticoagulantes capaces de preservar la viabilidad eritrocitaria. Antes de la II Guerra Mundial la sangre se conservaba en citrato de sodio y dextrosa (6), y los glóbulos rojos permanecían viables durante 1 semana a falta de purinas y de energía. El primero de los anticoagulantes efectivos fue el ácido-citrato-dextrosa (ACD), descrito en 1943 (7) que contenía glucosa como fuente energética y permitía el almacenamiento durante 21 días. Finch y cols (4) reconocieron que los eritrocitos que habían perdido sus compuestos de fosfato orgánico, particularmente ATP, no sobrevivían bien durante el almacenamiento. Inicialmente adicionaron adenosina como sustrato para la síntesis de ATP. Observaron que la adenina se deaminaba rápidamente a inosina y su atención se centró entonces, en este compuesto (8). Estudios posteriores (9) establecieron que, sí bien la adición de inosina mejoraba la concentración de ATP, no mejoraba los demás parámetros tenidos en cuenta para evaluar el deterioro de la célula durante el almacenamiento. Posteriormente, Nakao y cols demostraron la estrecha relación entre los niveles de ATP y el mantenimiento de la forma normal del eritrocito (10). De la misma forma, demostraron la existencia de un mecanismo intracelular de síntesis y regeneración de ATP a partir de inosina y adenina (11). Además, evidenciaron que la viabilidad e integridad de los glóbulos rojos dependía de los niveles de ATP (12). Luego Simon y cols comprobaron que la suplementación del ACD con pequeñas cantidades de adenina mejoraba la preservación y viabilidad de los eritrocitos, y que este efecto era superior al de la inosina (13). Estos estudios llevaron a la aplicación de los conservadores con adenina actuales. El descubrimiento en 1967 del papel del 2,3-DPG en la curva de disociación del oxígeno de la hemoglobina por Chanutin y Curnish (14) y por Benesch y Benesch (15), centró la atención en este compuesto. El citrato-fosfato-dextrosa (CPD) es el ACD con el agregado bifosfato de sodio (NaH2PO4H2O). Fue descrito por Gibson y cols (16) quienes demostraron que las concentraciones de fosfato y 2,3difosfoglicerato (2,3-DPG) de los eritrocitos eran más altas, la hemólisis menor y la


viabilidad después de las primeras 24 horas de la transfusión mayor comparada con el almacenamiento en ACD al cabo de 28 días. Wood y cols (17) utilizaron una solución CPD enriquecida con adenina y ascorbato con una prolongación en los niveles de 2,3-DPG y ATP y sin evidencia de toxicidad. El CPDA-1 (adenina, dextrosa, fosfato, citrato), el anticoagulante conservador estándar en este momento, permite almacenar los concentrados de glóbulos durante 35 días (18). Las soluciones en evaluación actual son el CPDA-2 y el CPDA-3, con más adenina y glucosa que el CPDA-1 (19). Los nuevos esfuerzos para mantener el 2,3-DPG en altos niveles, llevaron al desarrollo de una nueva generación de sustancias: las soluciones aditivas. El primer grupo de soluciones fue desarrollado por Wood y Beutler (20), quienes luego diseñarían una solución aditiva basada en bicarbonato denominada BAGPM (21) (bicarbonato-adenina-glucosa-fosfato-manitol). El manitol se requería para prevenir la hemólisis excesiva de los eritrocitos privados de plasma a través de un efecto osmótico al controlar su volumen (22). Solamente varios años después, cuando Högman (23) introdujo una solución aditiva simple, SAG (salina-adenina-glucosa) y subsecuentemente SAGMAN (SAG más manitol), las soluciones aditivas se usaron clínicamente a gran escala. El efecto sobre el receptor de la disminución en los niveles de 2,3,-DPG durante el almacenamiento es aún controvertido. Históricamente se ha considerado que el nivel de ATP es un indicador de viabilidad; sin embargo, aunque los eritrocitos con muy bajos niveles de ATP no pueden fosforilar glucosa y mueren, altos niveles de ATP no aseguran su sobrevida durante el almacenamiento (5). Dentro de las soluciones aditivas utilizadas actualmente se encuentran AS-1 (Adsol®), AS-3 (Nutricel®) y AS-5 (Optisol®), que permiten el adecuado almacenamiento de los eritrocitos durante 42 días (24). Recientemente han aparecido publicaciones que describen el uso de soluciones aditivas experimentales. Tal es el caso de la solución EAS-61 (25) con la cual se logró un período de almacenamiento de 9 semanas. Otra de las soluciones aditivas experimentales es EAS-64 (26), con la que se alcanzó un período de almacenamiento de 10 semanas. Los parámetros medidos al final del almacenamiento fueron mejores en comparación con los resultados obtenidos en eritrocitos almacenados en AS-1 durante 6 semanas. Finalmente, con la solución EAS-76 se alcanzó un período de almacenamiento de 11 semanas cumpliendo con los criterios de hemólisis <1% y viabilidad >75% exigidos por la Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos (FDA, por su siglas en inglés) (27). Además de estas soluciones, que han sido diseñadas p ara preservar eritrocitos que han sido recientemente recolectados, se han diseñado soluciones para restaurar los niveles depletados de ATP y 2,3-DPG de células que han sido almacenadas por varias semanas. Estas soluciones rejuvenecedoras no son ampliamente usadas por su alto costo de producción (28, 29).


Las tablas 1 y 2 demuestran algunas de las alteraciones físicas y bioquímicas ocurridas a los eritrocitos durante el almacenamiento estándar. La temperatura aceptada y en la cual la sangre es almacenada es de 4ºC ±2ºC. Otras temperaturas han sido estudiadas (30). Las temperaturas bajas proporcionan alguna mejoría de la integridad bioquímica de la sangre almacenada, pero se incrementa el riesgo de congelamiento. Las temperaturas altas son indeseables ya que la tasa metabólica de los eritrocitos almacenados se incrementa, resultando en una caída mayor del pH y en una pérdida más acelerada de 2,3-difosfoglicerato (2,3-DPG) y ATP, quizá debido al aumento en la concentración de lactato y la disminución del bicarbonato plasmático (5, 31). Adicionalmente publicaciones recientes han demostrado que la hemólisis de los eritrocitos almacenados en la solución aditiva AS-5 y expuestos a una temperatura de 25º durante 24 horas es inferior al 1%; la viabilidad de los eritrocitos almacenados en estas condiciones al cabo de 30 días se correlaciona con la obtenida en las unidades almacenadas convencionalmente 42 días después de su recolección debido a la reducci ón en la concentración de ATP eritrocitario (32). Eritrocitos congelados Los eritrocitos se pueden conservar a través de su congelación. Esta práctica ha existido por más de 50 años (33), sin embargo, no es utilizada comúnmente porque su técnica es dispendiosa, costosa y con un potencial riesgoso de contaminación bacteriana. En los diferentes métodos utilizados para criopreservar los glóbulos rojos se emplean agentes protectores como el glicerol. Cuando no se añaden dichos agentes se producen alteraciones por dos mecanismos. Durante el enfriamiento lento se destacan los efectos osmóticos vinculados con el congelamiento del agua


extracelular, que precede al del agua intracelular. De esta forma, la concentración de solutos extracelulares aumenta y crea un gradiente osmótico a través de la membrana que deshidrata a la célula, cuando el enfriamiento es rápido se forma hielo en y alrededor de las células que se destruyen. El glicerol ingresa a la célula protegiéndola en virtud de sus propiedades coligantes o fijadoras de agua. La cantidad de hielo es menor y el nivel de solutos se reduce (3). El método que usa glicerol al 40% (p/v) con almacenamiento congelado a -80ºC, aunque requiere lavado después del congelamiento, es el método más aceptado. Los eritrocitos congelados así toleran amplias fluctuaciones de la temperatura sin deterioro, con la ventaja que no se requiere nitrógeno líquido para lograr -80ºC, usándose, en su lugar, congeladores convencionales (34). La sangre es recolectada en bolsas plásticas primarias de cloruro de polivinilo (PVC) de 800 mL en CPD o CPDA-1 con un sistema cuádruple de bolsas de recolección (35). El congelamiento de los eritrocitos se puede realizar al cabo de 5 días o al final del tiempo máximo de almacenamiento, el cual depende de la solución preservativa (CPD por 7-21 días o en CPDA-1 por 7-35 días). A su vez, antes de ser congelados los eritrocitos pueden ser rejuvenecidos con una solución que contiene piruvato, inosina, fosfato y adenina (Rejuvesol®), con lo cual se incrementan los niveles de 2,3-DPG y de ATP hasta un 150% de lo normal (34). Algunos estu dios han demostrado resultados satisfactorios con eritrocitos congelados con 40% (p/v) al -80ºC durante 21 años (36). El método para lavar los eritrocitos congelados con glicerol 40% (p/v) utiliza una solución del cloruro de sodio (NaCl), glucosa y fosfato (37). La FDA permite almacenar los eritrocitos congelados con glicerol al 40% (p/v) a 80ºC hasta 10 años luego de su recolección y requiere que las células descongeladas y desgliceroladas sean almacenadas a 4ºC por no más de 24 horas porque las técnicas de congelamiento utilizan sistemas abiertos con un potencial riesgo de contaminación bacteriológica. Sin embargo, recientemente algunos estudios (38) han mostrado que es posible mantener los eritrocitos después del lavado almacenados a 4°C en solución AS-3 (Nutricell®) durante 15 días y utilizando sistemas cerrados de congelamiento, conservando una calidad aceptable determinada por los parámetros actualmente admitidos para medir el deterioro metabólico de los eritrocitos almacenados. Los eritrocitos humanos congelados con glicerol al 20% o al 40% tienen tasas de recuperación de al menos 85%, valores de sobrevida postransfusión de 85% después del lavado y almacenamiento a 4ºC por 24 horas, función transportadora de O2 normal, hemólisis mínima y no hay evidencia d e contaminación (39). La posibilidad de almacenar eritrocitos durante mucho tiempo permite a los bancos de sangre asegurar el normal suministro en épocas de escasez o emergencia. También es útil congelar eritrocitos con antígenos seleccionados para pacientes con tipos sanguíneos inusuales o múltiples anticuerpos. Además, el transporte de sangre congelada es relativamente sencillo a cualquier parte. Si bien, la reducción de las células blancas reduce la inmunogenicidad, la transmisión de citomegalovirus y el riesgo de enfermedad injerto contra huésped (40); el congelamiento no inactiva los virus de la hepatitis B, C y el VIH (41). Otros estudios (42, 43) discuten la aplicabilidad de la radiación gama sobre eritrocitos con el objeto de prevenir la enfermedad injerto versus húesped. CAMBIOS FÍSICOS Durante el almacenamiento los eritrocitos sufren una serie de cambios en sus propiedades físicas que conllevan a alteraciones en su forma y función (44). Aparición de formas anómalas y cambios en el volúmen celular


El volumen de los eritrocitos durante el almacenamiento cambia relativamente poco; su forma en cambio, sí tiene importantes modificaciones y pasa de ser un discocito a ser un equinocito o esferoequinocito. La transformación discocitoequinocito ocurre cuando el ATP intracelular se agota (10), el contenido de calcio se eleva (45) y se exponen las células a pH alto. También hay conversión discocitoequinocito cuando los eritrocitos son incubados en plasma a 37ºC durante 24 horas o es adicionado ácido oléico o lisolecitina al plasma fresco (46). Las células crenadas entonces aparecen en minutos con 10 a 30 espículas de longitud regular e igualmente distribuidas sobre la superficie. Se ha sugerido, pero no comprobado, que el mecanismo está relacionado con la lisolecitina y la enzima lecitina-colesterol acil-transferasa (L-CAT) (46). La depleción de ATP provoca conversión reversible de los eritrocitos en esfero-equinocitos espiculados; la restauración del ATP revierte el proceso (10). De otra parte, la transfor mación en discocitos-estomatocitos se produce por disminución del pH, exposición a agentes químicos, particularmente compuestos detergentes catiónicos, y aniones no penetrantes (47). Las células pierden la indentación de un lado y la depresión opuesta se acentúa. Como en los frotis fijados parece tener una boca o "estoma" en vez de un área redondeada de palidez central, se los llama estomatocitos. Más tarde se convierten en esferoestomatocitos y finalmente, en esferocitos con un hilio pequeño en el sitio del estoma previo. Estas células carecen de las espículas delicadas que caracterizan al estadio terminal del esferocítico prelítico derivado de la discocitosis-equinocitosis (3). Se ha establecido que el discocito normal representa una forma óptima para la circulación in vitro, ya que la transformación a estomatocito podría alterar el paso a través de la microcirculación (por disminución de la filtrabilidad celular), y la transformación a equinocito podría alterar el flujo en los grandes vasos (por aumento de la viscosidad sanguínea) (48). El almacenamiento de sangre reduce la deformabilidad del eritrocito por alteraciones en su morfología y aumenta su agregabilidad en virtud de la disminución del contenido de ácido siálico en la superficie, lo cual puede contribuir a desórdenes importantes en el flujo sanguíneo, especialmente en pacientes con riesgo microcirculatorio (49). Hemólisis La hemólisis de las células ocurre gradualmente durante el almacenamiento. Ocurre mucho más rápido cuando éstas son almacenadas en soluciones aditivas que en su propio plasma (5). En las soluciones aditivas, el manitol tiene un importante efecto en la prevención de la hemólisis y es uniformemente adicionado a estas soluciones por esta razón. Aunque inicialmente se pensaba que funcionaba como un sustituto osmóticamente activo de las proteínas plasmáticas, evitando que las células sobrepasaran su "volumen hemolítico crítico" éste no es aparentemente su efecto principal. Cómo funciona el manitol es aún desconocido (50). Al parecer, el equilibrio osmótico celular depende de otros factores tales como la depleción del anión polivalente 2,3-DPG durante el almacenamiento y su reemplazo por otros aniones que ejercen un importante efecto osmótico por unidad de carga negativa, la parálisis que sufre la bomba Na+/K+ por la temperatura de almacenamiento y la caída progresiva del pH que afecta el movimiento de iones y lleva a un paulatino encogimiento celular. Fragilidad osmótica La fragilidad osmótica del eritrocito es la susceptibilidad que éste tiene de hemolisarse cuando es suspendido en un medio hipotónico. La fragilidad osmótica de los eritrocitos se incrementa durante el almacenamiento (51). Dicho incremento está relacionado con los cambios en la osmolaridad interna de las células


almacenadas. El principal factor que contribuye con este cambio es la acumulación de lactato dentro de los eritrocitos. La segunda causa del incremento de la osmolaridad interna de los eritrocitos almacenados es probablemente el reemplazo del polianión 2,3-DPG por Cl-, que ejerce aproximadamente 3.7 veces más efecto osmótico (52).Ya que la membrana es poco permeable al lactato, suspender los eritrocitos en soluciones salinas provoca el influjo de agua a la célula por el efecto osmótico de este soluto (53). Sin embargo, si los eritrocitos son equilibrados en una solución salina isotónica, su fragilidad osmótica es cercana a la normal, aún después de un tiempo prolongado de almacenamiento (5). Hay si n embargo, alguna pérdida de lípidos de membrana representada por una "cola frágil" en la curva de fragilidad osmótica. Dicha población no recupera su fragilidad osmótica normal a pesar de ser resuspendidos en solución isotónica. Al parecer existe una muy pequeña correlación entre el tamaño de dicha cola y la viabilidad postransfusional (52). Durante el almacenamiento los eritrocitos se hacen menos deformables (54). Esta disminución, demostrada por ectacitometría, se ha asociado con la pérdida de lípidos de membrana (55). Sin embargo, la deformabilidad in vitro, aunque se correlaciona, no tiene el suficiente valor predictivo para predecir la viabilidad in vivo de los eritrocitos (5). Formación de células densas Tradicionalmente se ha definido a las células densas como células falciformes (hemoglobina S) deshidratadas, rígidas y con una vida media reducida. La deshidratación de las células falciformes homocigotas (SS) implica un incremento en la concentración de hemoglobina corpuscular media (CHCM). Las células SS densas son reológicamente incompetentes y contribuyen directamente a la vasoclusión. También los eritrocitos normales pueden perder progresivamente su deformabilidad durante el almacenamiento, como bien se ha demostrado por ectacitometría (54), y podrían llegar a producir vasoclusión, entre otros factores, por un incremento en la adherencia de la endotelio (56, 57). Las células SS son heterogéneas con respecto al grado de deshidratación, edad, niveles de hemoglobina F (HbF), y propiedades en el transporte de iones. Algunas células de densidad intermedia (ID) son discocitos densos, mientras que las células hiperdensas (HD) son en la mayoría tanto de las células falciformes, como de los discocitos muy den sos (58). Los eritrocitos AA, CC y SS exhiben diferentes volúmenes corpusculares, lo cual lleva a pensar que la estructura de la hemoglobina afecta la regulación del volumen celular (59). Diversas interacciones entre transportadores de cationes median la deshidratación de las células falciformes, incluyendo 1) un incremento no selectivo de la permeabilidad a cationes relacionado con alteraciones a nivel de la membrana; 2) un canal de potasio dependiente de Ca++ (Gardos), y 3) el cotransportador KCl. Los dos últimos, vías normales en células eritroides inmaduras pero hiperactivos en las células falciformes. La formación de las células ID ocurre principalmente a través del cotransportador KCl. Inhibidores del cotransportador en eritrocitos humanos como el NO3-, el DIOA y el ácido okadaico inhiben fuertemente la formación de células ID (60). También ocurre formación de células ID en eritrocitos con rasgo falciforme (células AS), con otras hemoglobinopatías (enfermedad SC y enfermedad D) e incluso en eritrocit os normales durante el almacenamiento bajo condiciones de banco de sangre (61). En general, las células falciformes tienen anormalidades severas en su membrana en virtud de la alta oxidación de sus componentes. Generan aproximadamente dos veces la cantidad de especies de oxígeno reactivas que los eritrocitos control. La razón de este incremento es el resultado de la autoxidación acelerada de la HbS a metahemoglobina, una conversión que causa liberación de Hem (62). Los niveles de glutatión reducido están disminuidos en un 20% en los eritrocitos SS, comparados con reticulocitos control, y son bajos en los eritrocitos SS de alta densidad comparados con los eritrocitos SS de baja densidad. Los niveles disminuidos de glutatión reducido se relacionan con una menor


actividad de glutatión reductasa, una mayor actividad de glutatión peroxidasa, e inhibición de la vía de las pentosas fosfato en los eritrocitos SS. De esta forma, las células falciformes tienen incrementadas las especies reactivas del oxígeno y niveles disminuidos de GSH para protegerse contra el daño oxidativo. Esta combinación es probablemente responsable de la oxidación de los grupos tiol de muchas proteínas. Experimentalmente se ha mostrado que la N-acetilcisteína (NAC) puede bloquear la formación de células densas in vitro (63). Ya que las células densas constituyen el mayor porcentaje de drepanocitos, la NAC también disminuye la formación de estos. La reducción de los drepanocitos relacionada con la NAC se acompaña de un incremento en los tioles de la ß-actina. Por lo tanto existen dos posibles mecanismos por los cuales la NAC bloquea la formación de células densas y falciformes: los canales de K+ y la ß-actina. FICHA TÉCNICA Se realizó una búsqueda computadorizada de artículos sin límite de idioma ni fecha de publicación en las bases de datos PubMedQuery, PubMedCentral e Infotrieve de MEDLINE, además en las bases de datos en CD Medical-Journals y Medical-Library, con límites de fechas 1994 a 1999 y 1986 a 1999 respectivamente. Las palabras clave fueron: "red blood cells", "preservation", "blood bank", "transfusion", excluyendo las palabras "leukocyte" y "platelets". Se obtuvieron 388 resultados. El proceso de selección de los artículos fue según la pertinencia del título de cada registro para resolver el objetivo general de la revisión. Luego de los artículos seleccionados, se procedió a obtener algunas de las referencias citadas en dichos artículos y que también resultaban pertinentes. Para la evaluación de la validez se tuvo en cuenta que todos los trabajos experimentales fueran llevados a cabo en sangre humana y que su metodología fuera adecuada para alcanzar el objetivo que plantean y además, permitiera llegar a las concl usiones propuestas. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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62306088 preservacion de eritrocitos y cambios fisicos ocurridos durante el almacenamiento  

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