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INVESTIGACIONES APLICADAS Dr. Aleida Villa Espinosa.


Introducción

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La inmunocitología son los estudios que se realizan a nivel celular empleando la reacción antígeno- anticuerpo que se enmarcan en el ámbito de la inmunopatología. •

Identificación morfológica de células eucariotas y protocariotas

Identificación y caracterización de células tumorales

Estudios del ciclo celular

Apoptosis celular

Estudios del citoesqueleto

Estudios de organelos

Carga antigénica tanto propia como extrañas

Estudios de citoquinas y otros En el campo de las enfermedades infecciosas constituye una herramienta útil para el clínico y el epidemiologo ya que amplia las posibilidades de investigación y diagnóstico de los animales vivos con pequeñas muestras en corto tiempo. Existe un gran número de moléculas para optimizar la detección de un analito particular a nivel celular. En el mismo nivel se incluyen los fluorocromos, las enzimas, la biotina y el oro entre otros.


Muestras • Fluidos corporales. • Cepillados y raspados. • Hisopos con medio de transporte.

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• Organos y fragmentos de tejidos. • Biopsias por aspiración. • Lavados • Frotis e improntas superficiales. • Extensiones sanguinéas. • Heces • Sangre entera


Fluidos corporales – Cavidad pleural, peritonial pericardio – Fluidos fetales – Fluidos sinoviales y cerebro espinales.

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– Semen, orina, leche y otros - Los fluidos de cavidades corporales se aspiran con pipeta o jeringas y se ponen en un tubo con anticoagulante. - Para fluidos cerebroespinales y sinoviales es necesario PBS, o SSF. - El semen se remite fresco o congelado. Las células somáticas portadoras de Ag se extraen del semen mediante ISM - En las células somáticas de la leche podemos estudiar las infecciones que por esta vía se eliminan. La leche no debe tener conservantes ni colorantes. - En la orina podemos encontrar células inflamatorias, neoplásicas, decamación epitelial, microorganismos. Interesa sobre todo el sedimento. - Todas las muestras se deberán recoger estérilmente si se precisa aislamiento de microorganismos


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Cepillados, raspados e hisopos con medios de transporte. •

Son adecuados para las superficies planas y las estructuras tubulares como el colon, el recto la pared vaginal y cervical, cavidad nasal y otros

Los órganos revisados durante la necopsia pueden ser muestreados con escobillones y cepillos

Cuando se realizan con espátulas y cepillos citológicos, puede recogerse gran cantidad de material que se debe transferir a frascos de pequeños volumenes contentivos de SSF, PBS, Hank’s o similar.

Los escobillones que tienen medios de transporte no nececitan otro conservante y son idóneos además para el aislamientode los microorganismos


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Organos, fragmentos de tejidos y biopsias por aspiración. •

Los órganos y fragmentos de tejidos se remiten al laboratorio refrigerados o congelados, y embalados individualmente en recipientes adecuados.

si los fragmentos de tejidos son muy pequeños deberán ponerse en un frasco con tapa contentivo de PBS, SSF o similar, nunca en formalina.

Las biopsias por aspiración son adecuadas para masas de tejidos debidamente localizadas y diagnosticadas en el animal vivo.

La biopsia por aspiración se realiza con agujas finas Nº 22 y jeringas de 5 ó 10 ml. Debe aspirarse el material dentro de la aguja nunca en la jeringa.


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Lavados, frotis, improntas superficiales y extesiones sanguíneas. •

Las células pueden exfoliarse de superficies tales como la traqueobronqueal, cavidad nasal, vagina , próstata y otros, mediante lavados con suero fisiológico estéril o similar, recogiéndose el líquido con pipetas, varillas o jeringas.

Los frotis de improntas superficiales son utiles para lesiones de tejidos blandos y la búsqueda de bacterias. Se debe escurrir el tejido sobre un porta objeto limpio, se dejan secar y se remiten al laboratorio envueltos individualmente.

Las extensiones sanguineas pueden ser finas o gruesas, Las primeras se emplean para estudiar los hematies, si se tiene práctica es ventajoso remitir los potas realizados al laboratorio. Si se sospecha de hemoparásitos se realizan de la vena marginal de la oreja preferentemente. Las extensiones gruesas sirven para estudiar las pobaciones leucocitarias. La sangre necesita anticoagulante si no se realizan en el acto de extracción.


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Sangre para cultivos de linfocitos y Heces •

Los cultivos de células mononucleares son útiles para estudiar portadores de infecciones, viremias, inmunidad celular y otros

La sangre se recoge en tubos estériles con heparina y antes de las 24 h. de extracción debe estar en el laboratorio.

Las heces son una vía importante de eliminación de antígenos, microorganismos y detritus celulares. Para la recuperación y concentración se emplea la ISM. Las muestras de heces se recogen directamente del recto y se remiten en pequeños frascos o bolsas.


Localización de antígenos intra y extra celulares Células presentadoras de antígenos. (CPA)

CPA fagocitos

Tipo celular

Localización

Monocitos Macrófagos Zona marginal de macrófagos Células de Kupffer Microglia Células de Langerhans

Sangre Tejidos Bazo y ganglios linfáticos Hígado Encéfalo Piel

Células dendríticas interdigitating Linfocitos B y T

Tejido linfoide Tejido linfoide y sitios de inmunoreacción Encéfalo Tiroide Vascular y tejido linfoide Tejido conectivo.

CPA no fagocitos

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CPA linfocitos CPA facultativas

Astrocitos Células foliculares Células endoteliares Fibroblastos


Localización de Antígenos intra y extra celulares

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Células diana de la infección. (CD) •

Son células diana de una infección aquellas donde se multiplican o replican o transportan los microorganismos.

La célula diana depende de la calidad y cantidad de los receptores específicos a un microorganismo dado o a sus antígenos.

El tropismo de un microorganismo por una célula depende del tipo celular, especie, edad, raza y especialización.

El nivel de detección de los antígenos microbianos en células dianas está relacionado con el tipo de replicación o curva de multiplicación, estructura antigénica, localización, formas clínicas y vías de eliminación.


Seroteca. Base de datos y paneles

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Anticuerpos monoclonales. (mAb) •

Nombre completo incluido nº de referencia y autor

Centro proveedor e investigador de contacto

Denominación de hibridoma

Denominación del clón

Antígenos de reconocimiento: ( Género esp., Epítopos esp., Reacciones cruzadas)

Presentación: sobrenadante de cultivos o líquido ascítico

Purificación ( preferentemente por afinidad)

Concentración en mg/ml

Clase y subclase de Ig, si es la molécula completa, Fab', Fc

Vida media en la conservación

Guardar en alícuotas en volúmenes de 10 - 20 µl en crioviales y etiquetas propias

Certificación de análisis

Referencias bibliográficas

Validación periódica en sistemas propios: titulación


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Anticuerpos policlonales •

Nombre completo, incluido código y nº de producto

Centro proveedor e investigador de contacto

Huésped

Tipo de adsorción

Especificidad: monoespecífico, reacción cruzada

Purificación: preferentemente afinidad

Clase y subclase de Ig

Guardar en alicuatas por 10- 20 µl en crioviales bien identificados con etiquetas propias

Aplicaciones

Concentración en mg/ml

Vida media y forma de conservación

Certificado de análisis

Referencias bibliográficas

Validaciones periódicas con sistemas propios.


Ejemplo de información técnica en la Seroteca

INVESTIGADORES DE CONTACTO.

CENTRO PROVEEDOR

N.H.S. Swellengrebel.

Royal Tropical Institute and WHO/FAO Collaborating Centre for Reference and reserarch on Leptospirosis.

Laboratory of Tropical Hygiene.

H. van de Kemp. Biomedical Research

MAb. Leptospira autumnalis

Clone F65C3

Grupo específico:

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serovares:autumnalis,bangkinan g, bim, bulgaria, butembo, carlos, erinac.aur, fostbragg, lambwe, mooris,mujunkumi, weerasinghe,

MAb. Leptospira canicola MAb. Leptospira icterohaemorrahagiae

Clone F 152C8 Clone F70C14

serovar: canicola serovar: icterohaemorragiae

MAb. Leptospira grippotyphosa

Clone F71C3

serovar grippotyphosa

MAb. Leptospira sejroe MAb. Leptospira australis MAb. Leptospira pomona

Clone F13A3 Clone F90C12 Clone F43C9

serovar hardjo serovar bratislava Grupo específico: pomona, mozdok, proechimys, trópica


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Anticuerpos monoclonales. EstĂĄn disponibles en el mercado, La lista puede ser tan amplia como queramos

ADV gE - gB Campylobacter fetus Enterovirus Parvo virus Pasterella toxigĂŠnica Influenza tipo A Coronavirus respiratorio PEDV Brachyspira pilosicoli Chlamydia Neospora BVD p80; p80/125; gp57 Tuberculosis RHD Visna Maedi /CAE

BHV-1 gE - gB Toxoplasma gondii Papilomavirus PRRS Rotavirus Coronavirus bovino TGE Brachyspira hyodisenteriae Lawsonia intracelularis Leptospiras BRSV PI3 Encephalitrozoon Mixomatosis Adenovirus


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Anticuerpos policlonales Brachyspira spp Paratuberculosis Listeria monocit贸genes Erysipelotrix rhusiopathiae C谩ndida albicans Clostridium novyi Clostridium sordelii Clostridium chauvoei Clostridium septicum Mycoplasmas:hyopneumoniae, hiorhinis, hyosinoviae bovis, agalactiae, ovipneumoniae arginini, capricolum, capri F38 mycoides sc y sl, putrefasciens Iowae, gallisepticum, synoviae Meliagridis, pulmonis


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Protocolo para la identificación de Antígenos en células.


Resultados de la preparaci贸n de c茅lulas aisladas

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Monocapas de c茅lulas Inmunoper贸xidasa. Controles negativos

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Puntos críticos en la inmunotinción •

Unión inespecífica de las inmiunoglobulinas ( Ig ) a los receptores FC Los receptores FC son glicoproteínas de la membrana con alta afinidad por polímeros y complejos inmunes de Ig. A veces se hace necesario bloquear los sitios reactivos de FC en los tejidos para impedir la unión inespecífica de las Inmunoglobulinas a los tejidos.

Solución: La mas frecuente es la utilización de suero norma l o emplear la fracción Fab` de las Ig y no las moléculas completas

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Enzimas endógenas La presencia de peróxidasa endógena es una causa frecuente de background.Los tejidos de mamíferos a veces exhiben actividad peróxidasa, particularmente las hemoproteínas.

Solución: La destrucción enzimática ccon peróxido de hidrógeno.

Interacción hidrofóbica: La hidrofobocidad es una propiedad que poseen muchas proteínas. Las inmunoglobulinas son paticularmente hidrofóbicas sobre todo cuando se emplean fijadores que contienen aldehidos tales como la formalina y el glutaraldehido.

Solución: Optimizar la fijación en tiempo,temperatura y pH. Emplear agentes bloqueadores antes del primer anticuerpo, buffer de baja fuerza iónica y detergentes.


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Algunos Ejemplos

Brachyspiras obtenidas por ISM e identificadas en IPX con anticuerpos monoclonales


Ejemplos Identificaci贸n de bacterias, levaduras y par谩sitos mediante IPX con anticuerpos monoclonales y policlonales

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Algunos Ejemplos Localizaci贸n de ant铆genos virales en diferentes tipos de c茅lulas mediante Inmunoper贸xidasa con anticuerpos monoclonales

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Otros métodos Para el desarrollo de la inmunocitología estamos estudiando la fluorimetría y la citometría de flujo de barrido láser.

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Inmunocitoquímica