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Licence des sciences et technologies Mention sciences de la vie

LV206 Structures et grandes fonctions métaboliques des plantes

Travaux pratiques de biologie et physiologie végétales 2007 - 2008

Services de : Biologie végétale, bât C, 1er étage, 2 séances Physiologie végétale, atrium, 2ème étage, 4 séances


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Travaux pratiques de physiologie végétale, atrium, 2ème étage Etude de la photosynthèse (TP 1 et 2) En présence d’eau et de dioxyde de carbone, les végétaux photosynthétiques sont capables de convertir l’énergie lumineuse en énergie chimique et de produire des sucres (saccharose et amidon). Ce processus nommé photosynthèse est localisé dans les chloroplastes des végétaux et s’accompagne d’une libération de dioxygène : hν 6 CO2 + 6 H2O C6H12O6 + 6 O2 L’énergie lumineuse est collectée par les pigments photosynthétiques situés dans les membranes thylacoïdales des chloroplastes, au niveau des antennes collectrices, avant d’être convertie en énergie chimique (ATP, NADPH + H+) grâce à une chaîne de transports d’électrons localisée dans les membranes (fig. 1)

Figure 1 : chaîne de transfert de électrons Dans cette chaîne de transfert d’électrons (phase primaire), le premier donneur d’électrons est l’eau et l’accepteur terminal est le NADP (fig.1). L’ATP et le NADPH produits pendant la phase primaire serviront à la synthèse de glucides via le cycle de Calvin (fig. 2). CO2

Ribulose 1, 5-biphosphate

Fixation 3-phosphoglycérate ATP

Réduction

ADP + Pi ATP

ADP + Pi NADPH + H+

Régénération

NADP+

Triose phosphate Saccharose, amidon

Figure 2 : schéma simplifié du cycle de Calvin Le processus de la photosynthèse est illustré au cours de deux séances de travaux pratiques : 1 – Etude des pigments photosynthétiques 2 – Etude de l’activité de transfert des électrons pendant la phase primaire


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TP 1 : Etude des pigments photosynthétiques de feuille d’épinard Introduction Parmi les pigments impliqués dans la photosynthèse se trouvent les chlorophylles a et b ainsi que les caroténoïdes (annexe 1). Ce sont des molécules lipophiles qui absorbent spécifiquement la lumière à certaines longueurs d'onde. Le but de cette expérience est de quantifier par une méthode spectrophotométrique les pigments photosynthétiques de la feuille d’épinard. Après une séparation de ces pigments par chromatographie, une étude comparative des spectres d’absorption de ceux-ci et la mise en évidence de la fluorescence des chlorophylles seront effectuées.

1 - Extraction des différents pigments photosynthétiques Mener l'extraction rapidement et conserver les extraits au froid et à l'abri de la lumière (papier d'aluminium) afin de minimiser les risques de dégradation des pigments. -

Laver, sécher puis peser précisément 1,2 g de feuille d’épinard. Couper le matériel végétal en petits fragments puis l’introduire dans un tube de centrifugation avec une spatule de Mg CO3.

-

Ajouter 4 mL d’acétone pour obtenir un mélange acétone/eau de concentration finale 80% si l’on tient compte de l’eau présente dans les feuilles. Ajouter ensuite 6 mL d’acétone à 80 % et broyer 2 fois 1 min à l’aide d’un homogénéisateur

-

Equilibrer les tubes deux à deux avec du sable et centrifuger 5 minutes à 7000 rpm

-

Récupérer le surnageant (culot vers le haut) dans une fiole jaugée et compléter à 10 mL avec de l’acétone à 80%. Fermer avec du parafilm et agiter.

L'extrait obtenu permettra de réaliser un spectre d'absorption des pigments totaux, de doser les différents pigments présents et de les séparer par chromatographie sur papier. Les chlorophylles a et b ainsi que le β carotène seront élués ce qui permettra d’obtenir les spectres d’absorption de ces pigments isolés.

2 - Dosage des pigments totaux L'objectif est de doser par spectrophotométrie d’absorption, les chlorophylles a et b ainsi que les caroténoïdes présents dans l’extrait. Les formules ci-dessous établies à partir de la loi de Beer-Lambert (annexe 2) permettent de calculer les concentrations en pigments : Ca = 12,7 A663 - 2,63 A645 Cb = 22,9 A645 - 4,68 A663 (3,19Ca) + (130,3Cb ) Ccar = 5 A460 200

en mg.L-1

-

Introduire 2 mL d’extrait pigmentaire dans une fiole jaugée de 20 mL et compléter avec de l’acétone à 80 %. Fermer la fiole avec du parafilm et agiter.

-

Placer une cuve en verre, qui contient le solvant d'extraction, dans le faisceau et régler le zéro de l'appareil à 460 nm. Remplacer cette cuve par une autre qui est emplie au 2/3 par l’extrait pigmentaire dilué et lire l’absorption (A).

-

Recommencer les opérations successivement à 645 nm et 663 nm. Régler le zéro de l'appareil pour chaque longueur d'onde utilisée.

Donner le principe du dosage. Exprimer les résultats en mg de pigments . g –1MF en explicitant toutes les étapes du calcul et conclure.


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3 – Séparation des différents pigments photosynthétiques par chromatographie sur papier Les pigments sont séparés par chromatographie sur papier à l’aide d’un solvant apolaire : la séparation s’effectue selon l’affinité relative des pigments vis-à-vis du solvant c’est-à-dire selon le degré d’apolarité des pigments. a – chromatographie sur papier -

Introduire dans le tube de chromatographie 10 mL de solvant de migration (acétone/éther de pétrole/dichloroéthane : 1/8,5/0,5 ; v/v/v) à l’aide du distributeur. Fermer hermétiquement le tube.

-

Tracer à l’aide d’un crayon un trait à 2 cm du bord inférieur d’une bande de papier Whatman afin que le dépôt ne soit pas en contact avec le solvant.

-

Déposer en bande fine avec une pipette Pasteur une partie de l’extrait pigmentaire non dilué sur le trait et sécher. Recommencer plusieurs fois le dépôt et le séchage jusqu’à l’obtention d’une tache très foncée.

-

Introduire le chromatogramme dans le tube entouré de papier noir puis fermer le tube. Arrêter la migration quand le front du solvant aura atteint 20 cm.

Dessiner le chromatogramme, identifier les pigments en vous aidant des formules présentées en annexe 1 et justifier leur ordre de migration. b – élution des différents pigments Découper les taches correspondantes aux Chl a, Chl b et β carotène. Introduire chaque fragment de papier dans un pilulier et ajouter de 2,5 mL d’acétone à 80 %, solvant d’élution.

4 - Spectre d'absorption des pigments purifiés et totaux Pour chaque pigment, il est possible d’obtenir grâce à un spectrophotomètre d’absorption la mesure de son absorption en fonction des longueurs d’onde comprises entre 400 et 700 nm et la représentation graphique de cette mesure se nomme « spectre d’absorption ». L'objectif de cette étude est d'obtenir les spectres d'absorption des différents pigments (Chl a, Chl b et β carotène) ainsi que celui des pigments totaux. -

Remplir au 2/3 une cuve de mesure en verre avec le solvant utilisé pour l'extraction des pigments.

-

Prélever avec un compte-goutte environ 2 mL d’extrait pigmentaire, l'introduire dans une autre cuve de verre

-

selon le spectrophotomètre utilisé, les cuves sont soit introduites en même temps (SHIMATZU) soit successivement, d’abord la cuve contenant le solvant puis celle contenant l’extrait (ULTROSPEC). Le spectre d’absorption obtenu entre 400 et 700nm résulte de la différence d’absorption entre l’extrait pigmentaire et le solvant.

Recommencer cette opération pour chaque pigment purifié et pour l’extrait de pigments totaux. 1 - Relever sous forme de tableau les différents maxima d’absorption des pigments purifiés en commençant par les longueurs d’ondes situées dans le bleu et en indiquant les couleurs balayées par ces spectres. 2 - Reporter sur le spectre d’absorption des pigments totaux les principaux maxima d’absorption des différents pigments purifiés et indiquer les pigments concernés. 3 - Justifier l’utilisation des

λ

qui ont servi au dosage des pigments.


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5 – Mise en évidence de la fluorescence des chlorophylles Exposer sous UV les extraits de chlorophylles a et b ainsi que du β carotène. Noter avec précisions vos observations et conclure.

Compte rendu : Introduction : situer rapidement la thémtique abordée en présisant l’objectif du TP Matériels et méthodes : présenter succinctement le protocole d’extraction des pigments à l’aide d’un schéma Résultats : répondre aux questions posées dans chaque sous-partie du polycopié Conclusion Annexe 1 Les pigments lipophiles appartiennent à deux groupes distincts : -

Le groupe des porphyrines auquel appartiennent les chlorophylles. Ces molécules comportent 4 pyrroles reliés entre eux par 4 radicaux méthéniques, plus un atome de magnésium. Ce noyau tétrapyrrolique porte 2 groupements carboxyliques dont l’un est estérifié par le méthanol, l’autre par le phytol. La chlorophylle a diffère de la chlorophylle b par un groupement CH3 au lieu de CHO.

-

Le groupe des tétraterpènes ou caroténoïdes. On distingue dans ce groupe les carotènes qui sont des hydrocarbures et les xanthophylles qui comportent des atomes d’oxygène dans leur molécules.

Les chlorophylles ou CHO

Les caroténoïdes

macrocycle

Isoprène

β carotène Queue phytyl


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Annexe 2 : loi de Beer-Lambert La loi de Beer-Lambert permet de déterminer la concentration d'une substance en solution qui absorbe dans le visible. A une longueur d'onde donnée (λ), on a: I A = log10 0 ou A = ε l c I où

A est l'absorption (DO) I0 et I, les intensités de la lumière incidente et transmise respectivement c, la concentration de la solution (mol.L-1 ou g.L-1) l, le trajet optique

ε,

le coefficient d'extinction molaire ou coefficient d'absorption spécifique de la solution pour une longueur d'onde donnée (mol-1. L. cm-1 ou g-1 . L . cm-1) Pour un trajet optique de 1 cm, on a donc :

c = A/ε

La concentration d’une substance pure peut donc être déterminée par la simple mesure de son absorbance à une longueur d'onde donnée si son coefficient d'extinction molaire est connu pour cette longueur d’onde. Dans le cas d'un mélange de substances en solution, les absorptions des divers constituants sont additives. Afin de mesurer la quantité de chlorophylle a, de chlorophylle b et de caroténoïdes dans l'extrait, l'absorption du mélange est enregistré à 663 nm, 645 nm et 460 nm, ce qui permet d’établir le système d'équations suivant (1) : A663 = A663 chla + A663 chlb A645 = A643 chla + A643 chlb (1) A460 = A460 car + A460 chla + A460 chlb Compte tenu de la loi de Beer-Lambert et pour un trajet optique de 1 cm, le système d'équations (1) peut s'écrire: A663 = ε663 chla Ca + ε663 chlb Cb

A645 = ε643 chla Cb + ε 643 chlb Ca

(2)

A460 = ε460 car C car460 + ε460 chla Ca + ε460 chlb Cb Les valeurs des coefficients d'absorption spécifiques ε (en.g-1 . L . cm-1) des pigments dans le solvant employé sont rapportées dans le tableau 1. pigments

Coefficients d’absorption spécifique (g-1 . L . cm-1) 663 nm

645 nm

460 nm

Chl a

82,04

17,75

3,19

Chl b

9,27

45,6

130,3

Caroténoïdes

200

Tableau 1 : coefficients d’absorption spécifiques des pigments A partir du système d'équations (2), des valeurs des coefficients d'absorption spécifiques données ci-dessus et des valeurs de A mesurées au spectrophotomètre, un système d'équations donnant les concentrations Ca, Cb et Ccar en g.L-1 peut être établi. Pour des raisons pratiques, la dimension des constantes de ces équations est ajustée (/1000) de façon à obtenir directement les valeurs des concentrations en mg.L-1 (cf encadré page 2)


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TP 2: Etude de l’activité de transfert des électrons pendant la phase primaire de la photosynthèse

Introduction Lors de la phase primaire de la photosynthèse (figure 1, page 1), une molécule d'eau est oxydée et transfère ses électrons au P680 du photosystème II, puis, à l'issue de la chaîne de transfert des électrons dans la membrane des thylacoïdes, ces électrons sont finalement acceptés par le NADP+. La réaction d'oxydation de l'eau en présence d’accepteurs artificiels d’électrons catalysée par les chloroplastes est appelée réaction de Hill : hν 2 H2O + 2 Aox

O2 + 2 AH2

L'objectif de la séance est de suivre la réaction de Hill au cours du temps sur une suspension de chloroplastes de feuilles d'épinard et en fonction de plusieurs conditions environnementales (lumière, obscurité, inhibiteur du photosystème II). Le TP s'organisera autour de deux parties : - Obtention de l'extrait enrichi en chloroplastes par la technique de centrifugation différentielle - Mesure par spectrophotométrie de la réaction de Hill.

1 - Obtention d'un extrait d'épinard enrichi en chloroplastes L'isolement de cette fraction cellulaire sera effectué au froid, à partir de feuilles d'Epinard. Une seule extraction sera faite pour l'ensemble de la salle. a - Préparation du matériel, broyage, filtration - Peser 30g de feuilles après avoir éliminé les pétioles et les grosses nervures. Les déchirer rapidement et les mettre dans le bol du broyeur contenant 100 mL du milieu de broyage (milieu B), de composition suivante : Tris HCL 0,1M (Tampon à pH 7.8) Saccharose 0,4M (ajustement de la pression osmotique) EDTA 5 mM (chélateur des ions Ca++) BSA 0,1% (rôle protecteur des membranes) - Broyer à faible vitesse, 2 fois 5 secondes. - Filtrer le broyat sur un entonnoir recouvert de gaze et de miracloth. Rincer le broyeur avec 2x 20 mL de tampon B et le filtrer également. Exprimer l'ensemble dans un bécher. - Répartir l'extrait obtenu après filtration dans quatre tubes de centrifugation. b - Centrifugations La technique de centrifugations différentielles est une méthode basée sur les vitesses inégales de sédimentation de particules différant, entre autres, par leur taille. - Equilibrer les tubes 2 à 2, et centrifuger 1 min à 2000 rpm. - Récupérer les 4 surnageants S1 dans 4 autres tubes de centrifugation maintenus au froid. - Centrifuger ces 4 tubes de surnageants S1 1 min à 5000 rpm, - Eliminer les surnageants S2 de chacun des tubes et resuspendre chaque culot C2 dans 1 mL de milieu B. Regrouper l'ensemble des suspensions dans une éprouvette et bien rincer les


7 tubes avec 2 mL de tampon B. Récupérer tous les rinçages et ajuster le volume final de l'extrait à 100 mL avec le milieu B. Homogénéiser et conserver l'extrait dans la glace.

2 - La réaction de Hill. On peut étudier la réaction de Hill in vitro en fournissant aux chloroplastes un accepteur artificiel d'électrons et de protons : le DCPIP (dichlorophénol indophénol), à la + place du NADP . Le DCPIP est bleu à l'état oxydé (il absorbe à 600 nm) et incolore à l'état réduit. Il est donc possible de suivre sa décoloration au cours du temps par spectrophotométrie à 600 nm. Une courbe d'étalonnage permettra de corréler les variations d'absorbance à 600 nm aux concentrations de DCPIP réduit lors de la réaction de Hill. a - Gamme étalon (à réaliser avant les cinétiques) La concentration de DCPIP oxydé restant lors des cinétiques de réduction sera déterminée grâce à cette gamme étalon que vous réaliserez avant les cinétiques : A partir d'une solution de DCPIP oxydé à 0,5 mM, préparer 9 cuves de spectrophotomètre contenant 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 et 800 μl de DCPIP (voir tableau I). Compléter à 4 mL avec le milieu B. Homogénéiser et lire l'absorbance à 600 nm puis tracer la courbe étalon de l'absorbance à 600 nm en fonction de la quantité de DCPIP présent dans la cuve (en nmol). Tableau I (A JOINDRE AU COMPTE-RENDU) Volume de DCPIP oxydé 0,5 mM (μL) Volume de milieu B (μL) pour avoir 4 mL final

0

100

200

300

400

500

600

700

800

Concentration de DCPIP Oxydé en nmole .mL-1 DO600 b - Détermination des conditions optimales de mesure Chaque binôme devra réaliser des dilutions à partir de la suspension plastidiale, jusqu'à obtenir une concentration de chloroplastes optimale pour les mesures (soit une absorbance de départ à 600 nm proche de 1,3 et une cinétique de réduction du DCPIP à la lumière de l'ordre de 8 à 10 minutes). Afin de déterminer la dilution à utiliser, préparer une cuve de spectrophotomètre (voir tableau II, cuve n°1) contenant, dans l'ordre d'introduction : 3 mL de tampon B 0,5 mL de DCPIP 1 pointe de spatule d'hydrosulfite 0,5 mL de suspension de chloroplastes Homogénéiser, l'introduire dans le spectrophotomètre et faire le zéro d’absorbance. Préparer une seconde cuve de spectrophotomètre (voir tableau II, cuve n°2) contenant : 3 mL de tampon B, 0,5 mL de DCPIP 0,5 mL de suspension de chloroplastes Homogénéiser et lire immédiatement l'absorbance à 600 nm. Cette valeur correspondra au temps 0 de votre cinétique. Ressortir la cuve et la placer à 20 cm de la lampe (une fiole de


8 Roux remplie d'eau froide sera interposée entre la lampe et la cuve). Refaire une mesure de l'absorbance toutes les minutes. Ne pas oublier de replacer la cuve à la lumière après chaque mesure. Si la cinétique est trop rapide (quand tout le DCPIP est réduit en moins de 4 minutes), refaire ces deux cuves en diluant l'extrait chloroplastique d'un facteur deux et ainsi de suite jusqu'à obtenir les conditions attendues (cf annexe sur les notions de cinétique enzymatique page 17). c - Effet de la lumière et d'un inhibiteur du photosystème II Les effets de la lumière ainsi que d'un inhibiteur du transfert d’électrons le long de la chaîne photosynthétique, le DCMU (3-(3,4-dichlorophényl)-1,1-diméthylurée), vont être étudiés sur la réaction d'oxydation de l'eau dans les chloroplastes. Les mesures de réduction du DCPIP seront faites avec la dilution adéquate de la suspension de chloroplastes déterminée précédemment. - Lire l'absorbance au temps 0 dès l’ajout des chloroplastes (cuves n°3 et 4) - Placer la cuve n°3 à l’obscurité et la n°4 à la lumière - Lire l'absorbance des cuves toutes les minutes après avoir agité leur contenu Tableau II : Préparation des cuves (en respectant l’ordre d’introduction):

cuves N°1 : réglage du 0 d’absorbance N°2 : activité de réduction à la lumière N°3 : activité de réduction à l’obscurité N°4 : activité de réduction à la lumière + un inhibiteur du transfert d’électrons

Milieu B (mL)

DCMU 20 μM (μL)

DCPIP chloroplastes (mL) hydrosulfite (mL) pointe de spatule

3

0,5

3

0,5

0,5

3

0,5

0,5

0,5

0,5

3

100

0,5

Compte rendu : Introduction: Situer rapidement la thématique abordée en précisant l'objectif du TP Matériels et méthodes: Présenter succinctement le protocole d’isolement des chloroplastes à l’aide d’un schéma en indiquant les contenus des différents culots et surnageants, puis, le (ou les) coefficient(s) de dilution réalisé(s) sur votre suspension chloroplastique pour effectuer les cinétiques de réduction du DCPIP. Résultats: -Tracer la gamme étalon A600 = f(concentration de DCPIP) et donner le tableau des absorbances relevées. - Pour les différentes cinétiques: * Donner le tableau des absorbances en fonction du temps. * Tracer les courbes A600= f(temps) sur la même feuille de papier millimétré. * Ecrire les deux demi-réactions ainsi que la réaction bilan décrivant l’oxydation de l’eau en présence de l’accepteur final d’électron DCPIP. * Sachant que la teneur en chlorophylle de votre extrait est d’environ 0,05 mg.mL-1 de suspension chloroplastique non diluée, calculez le nombre de μmoles de DCPIP réduit par minute et par mg de chlorophylles. Donner toutes les étapes du calcul en les explicitant. - interpréter les résultats et conclure.


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TP 3 : Détermination des paramètres hydriques initiaux des cellules végétales (potentiel hydrique, pression osmotique et pression de turgescence)

I – Définition du potentiel hydrique des cellules végétales L’équilibre hydrique des végétaux supérieurs fait intervenir de nombreux mécanismes tels que l’absorption de l’eau du sol par les racines, la circulation des sèves dans les tissus et la transpiration au niveau foliaire. Les mouvements d'eau étudiés ici sont ceux qui se déroulent à l'échelle cellulaire. Ceux qui se mettent en place à l'échelle de la plante entière seront présentés en cours et en TD. Le potentiel hydrique (Ψ exprimé en MPa) est l’énergie libre associée à une mole d’eau dans un compartiment donné hydrique. Dans une cellule, Ψ dépend de deux paramètres qui sont la pression osmotique et la pression de turgescence : - les échanges d’eau sont étroitement corrélés à l’absorption des solutés et aux différences de pression osmotique (π ) qui en résultent. Le développement de la pression osmotique cellulaire s’exerce essentiellement à partir du compartiment vacuolaire qui renferme des solutés osmotiquement actifs. Cette composante du potentiel hydrique est appelée potentiel osmotique : L-1) -

Ψs = - π et

π = RT x C (avec RT = 2,4 L.MPa.mol-1 et C en osmol .

les cellules des plantes possèdent une paroi dont les propriétés d’élasticité confèrent généralement aux liquides intracellulaires une pression supérieure à la pression atmosphérique : la pression de turgescence (P). P exprimée en MPa est définie comme étant la différence entre la pression absolue et la pression atmosphérique: P = Pabsolue - Patm

Cette composante du potentiel hydrique est appelée potentiel de pression : Ψp = P La cellule végétale en tant que compartiment hydrique est donc caractérisée par un potentiel hydrique (Ψ en MPa) qui est la résultante du potentiel osmotique et du potentiel de pression soit : Ψ = Ψs + Ψp ou

Ψ = P - π (1)

Dans l’expression du potentiel hydrique (1), l’expression -π signifie que la présence de solutés réduit le potentiel hydrique de la solution.

Remarques (cf. Cours). - Sur le plan thermodynamique, le Ψ d’un compartiment hydrique quelconque correspond à l’énergie libre associée à chaque molécule d’eau (μw), exprimée pour des raisons pratiques en unité de pression soit : Ψ = (μw - μ* ) / Vw. Le potentiel hydrique est donc le potentiel chimique volumique de l’eau. - La relation 1 montre qu’à la pression atmosphérique (P = 0), le potentiel hydrique de l’eau pure est nul et celui d’une solution est toujours négatif (puisque π est positif).


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II - But de la manipulation Il s’agit de déterminer le potentiel hydrique de cellules de parenchyme d’un tubercule de Betterave par la méthode dite “ tissulaire ” basée sur la mesure des variations de masse des cellules en réponse aux mouvements d’eau imposés. Le potentiel hydrique initial des cellules (Ψo) sera déterminé en cherchant la valeur du potentiel hydrique du milieu extérieur qui équilibre le potentiel hydrique initial des cellules. - La pression osmotique initiale du parenchyme (πo) sera également déterminée en mesurant l’abaissement du point de congélation à l’aide d’un osmomètre. - Finalement la valeur de la pression de turgescence des cellules de Betterave sera calculée et on en déduira l’état hydrique du matériel étudié

III - Déterminations de Ψo et de la plasmolyse limite A - Préparation des solutions de saccharose - Préparer dans 11 tubes à essais (préalablement numérotés) une gamme de solutions de saccharose de concentrations croissantes comprises entre 0 et 1M (0,1; 0,2; 0,3 ....1M), chaque solution ayant un volume de 20 mL. Agiter chaque tube pour homogénéiser les solutions. - Prélever 5mL de chaque solution et les verser dans les 11 petits béchers correspondants (préalablement numérotés). B - Mesure du potentiel hydrique de parenchyme de Betterave (Ψo) Lorsque des cellules sont placées dans un milieu renfermant des solutés imperméants pendant la durée de l’expérience, des échanges d’eau s’établissent entre ces cellules et le milieu extérieur, en réponse à des différences de potentiel hydrique et les variations de potentiel hydrique ΔΨ à l’origine de ces mouvements d’eau sont négatives (cf. ΔG des réactions chimiques) : L’eau se déplace donc dans le sens des potentiels hydriques décroissants (ΔΨfinal –initial < 0). Ces mouvements d’eau entre le milieu extérieur et les cellules provoquent ainsi une diminution ou une augmentation du potentiel hydrique cellulaire qui au départ de l’expérience avait une valeur Ψo. Les mouvements d’eau s’arrêtent lorsque le potentiel hydrique des cellules (ψc) devient égal au potentiel hydrique du milieu extérieur (Ψe) ; l’équilibre hydrique entre les cellules et le milieu extérieur est alors atteint. Pour déterminer le sens des mouvements d’eau entre le milieu extérieur et le tissu végétal (entrée d’eau dans les cellules ou sortie), il suffit de comparer le potentiel hydrique initial des cellules (Ψo) avec celui du milieu extérieur (Ψe) en tenant compte de leur valeur algébrique. Protocole expérimental : - des fragments de parenchyme de betterave sont découpés en forme de frites parallèlement à l’axe du tubercule après avoir éliminé les tissus de la périphérie ainsi que les tissus les plus axiaux. Elles doivent être aussi semblables que possible : 5 cm de longueur et 0,6 à 0,7 cm de côté. Déposer les frites sur un morceau de papier d'aluminium et les envelopper immédiatement afin d'éviter tout dessèchement. - Peser rapidement et précisément (à 10 mg près) chacune des 11 frites. Noter les masses initiales Mo dans un tableau. - Plonger au fur et à mesure de la pesée, les frites dans les tubes à essais. Opérer de façon régulière afin que chaque frite passe le même temps à l’air libre.


11 - Agiter toutes les quinze minutes. - Après 1 h 30 de contact avec le milieu, sécher les frites superficiellement et délicatement à l’aide de papier Joseph et les peser immédiatement au fur et à mesure. Noter la masse Mf. - Calculer les variations relatives de masse en pourcentage et porter sur un graphique ces valeurs en fonction des concentrations initiales de saccharose. - Déterminer la valeur du potentiel hydrique initial des cellules (Ψo) sachant que : Le potentiel hydrique de la solution (Ψe) dépend exclusivement du potentiel de pression étant nul (Pe = 0) Ψe = - πe

avec

πe = RT x C

πe

de la solution, le

et RT = 2,4 L.MPa.mol-1

Le potentiel hydrique initial des cellules dépend de leur état hydrique initial c’est-àdire de Po et de πo : Ψo = Po - πo C – Détermination de la plasmolyse limite - Réaliser des coupes très fines dans le parenchyme du tubercule de Betterave, puis les immerger au fur et à mesure dans les bechers contenant 5mL de solution de saccharose à 0, 0,5, 0,6, 0,7 et 1 mole.L-1. Disposer plusieurs coupes dans chaque bécher. - Au bout de 15 à 20 min observer les coupes au microscope, en présence d’une goutte de la solution dans laquelle elles ont baigné. Ne considérer que les plages fines de la préparation. - Noter jusqu’à quelle concentration de saccharose les cellules sont turgescentes et à partir de quelle concentration les cellules sont plasmolysées. La limite entre les deux états s’appelle « plasmolyse limite » (3 cellules sur 4 doivent présenter un léger décollement du plasmalemme).

IV – Détermination de la pression osmotique initiale L’osmomètre permet la mesure de l’abaissement du point de congélation d’une solution par rapport au point de congélation de l’eau distillée (fig. 1). Selon la loi de Raoult, l’abaissement du point de congélation d’une solution (Δθ en °C) est directement proportionnel à l’osmolarité de la solution (C en osmoles .L-1) Δθ = k C Etant donnée la relation directe entre Δθ et C, l’affichage des valeurs mesurées à l’osmomètre s’effectue en mosm.L-1. Protocole expérimental : -

Introduire des lamelles de betterave dans le presse-ail et presser. Récupérer environ 500 μL de suc vacuolaire dans un tube eppendorf de 1,5 mL Centrifuger à 10 000g pendant 10 min Prélever 100 μL et diluer 4 fois Introduire 100 μL d’extrait dilué dans un tube eppendorf de 1,5 mL et effectuer la mesure à l’osmomètre. Le résultat est donné en mosmol.L-1.

Calculer la pression osmotique du suc vacuolaire : πo = 2,4 C avec C en osmol.L-1


12 °C

0 temps Δθ

eau

solution

Figure 1 : determination de l’abaissement du point de congélation

Turgescence maximale

Ψ: potentiel hydrique P : pression de turgescence π : pression osmotique Ψs = - π : potentiel osmotique ou composante osmotique du potentiel hydrique

du protoplasme

Ψ=-π

Ψ=P-π

A la turgescence maximale, le potentiel hydrique de la cellule est nul (Ψcell = Ψ ext = 0). Les deux composantes P et π sont alors égales (P = π). La plasmolyse correspond à l’état de la cellule où la pression de turgescence devient nulle et par conséquent, le potentiel hydrique est égal au potentiel osmotique cellulaire (Ψcell = - π).

Plasmolyse maximale

Figure 2 : variations des paramètres hydriques de la cellule végétale en fonction de son état hydrique exprimé par le volume relatif du protoplasme (diagramme de Höfler).


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Plan de Travail : - Confection de la gamme de saccharose - Préparation des “ frites ” - Pesées initiales des “ frites ” - Préparation des coupes fines - extraction du suc vacuolaire et mesure à l’osmomètre - Observations au microscope - Pesées finales des “ frites ”

Compte-rendu Faire un compte-rendu structuré: Introduction (But de la manipulation) A - Détermination de la pression osmotique initiale de votre matériel (πo) - Principes des mesures - Calcul de la pression osmotique des cellules à l’état initial et la comparer à celle de la plasmolyse limite B - Détermination de la plasmolyse limite Dessin de cellules plasmolysée, turgescente et en plasmolyse limite C - Détermination du potentiel hydrique initial du parenchyme du tubercule de betterave - Explication de la méthode - Tableau de la composition des solutions de saccharose et des pesées - Calculer la variation relative de la masse (ΔM/Mo) en % et porter sur un graphique ces valeurs en fonction des concentrations initiales ou des potentiels hydriques initiaux des solutions de saccharose. - Décrire les résultats et interpréter les différentes parties de la courbe expérimentale. En déduire la valeur du Ψo des cellules ainsi que celui à la plasmolyse limite - Préciser sur la courbe, les mouvements d’eau, l’état des cellules (turgescence , plamolyse limite ou plasmolyse) ainsi que les valeurs de la pression de turgescence. Conclure. Conclusions Calculer la valeur de la pression de turgescence (Po) de votre matériel et en déduire l’état hydrique de ce matériel végétal


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TP 4 : Mise en évidence et régulation par la lumière de l’activité nitrate réductase dans les feuilles de Maïs

Introduction Les végétaux sont autotrophes à l’azote minéral qui est assimilé essentiellement sous forme de nitrates par les racines. L’ion nitrate est réduit en ion nitrite (NO2-) par la nitrate réductase, première étape de l’assimilation de l’azote, puis en ion ammonium (NH4+), substrat pour la synthèse des composés azotés. Le cofacteur de la nitrate réductase est le NADPH qui est oxydé en donnant les électrons nécessaires à la réduction des nitrates. Réduction :

NO3- + 2H+ + 2 e- ------------> NO2- + H2O

Oxydation :

NADPH ------------------------> NAD+ +H+ +2 e-

Réaction bilan: NADPH + NO3- + H+ --------> NADP+ + NO2- + H2O

1. But de la manipulation L’objectif de la manipulation est de mesurer in vitro l’activité nitrate réductase dans les feuilles de Maïs, et de déterminer l’influence de la lumière lors de la croissance des plantules. Les plantules utilisées ont été cultivées pendant 3 semaines sur vermiculite à 25°C, dans différentes conditions : - 16 h par jour de lumière pendant 21 jours (lot A) - 16 h par jour de lumière pendant 18 jours puis à l’obscurité pendant 2 jours (lot B)

2. Principe de la mesure in vitro de l’activité nitrate réductase Une activité enzymatique s’exprime toujours en quantité de produit apparu ou de substrat consommé par unité de temps et par unité de matière. Dans le cas de l’activité nitrate réductase, l’activité sera rapportée en nmoles de nitrites apparus par heure et par g de feuille (cf. annexe sur les notions de cinétique enzymatique page 17). Après addition d’un réactif les nitrites apparus donnent lieu à un composé coloré dont l’absorbance est mesurée à 540 nm. Pour chaque temps, on convertit l’absorbance en nanomoles de nitrites, à l’aide de la gamme étalon. La variation de la quantité de nitrites apparus en fonction du temps est tracée sur une feuille de papier millimétré et la vitesse initiale de la réaction est mesurée et calculée pour une heure. Connaissant la masse de la feuille, le volume d’extrait et la quantité d’extrait introduit dans le milieu réactionnel, on peut alors calculer l’activité enzymatique en μmoles de nitrites formés . h-1 . g-1 feuilles.


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3. Extractions et dosages 1 - Préparation des extraits protéiques Toutes les étapes se font dans la glace. Dans un mortier : - introduire une pointe de spatule de sable et une pointe de spatule de polyvinylpyrolidone. - ajouter 8 mL de milieu d’extraction (tampon Tris-HCL 25 mM pH 7,5, EDTA 1 mM, cystéine 10 mM, sérum albumine de bœuf 10 g L-1, DTT 1 mM, leupeptine 10 µM, FAD 20 µM, pH 8,5). - peser 2 g de feuilles et les mettre dans le mortier en les coupant en petits morceaux avec une paire de ciseaux. Broyer finement et rapidement. - filtrer le broyat sur une toile à bluter et rincer le mortier avec 2 mL de milieu d’extraction : le filtrat est récupéré dans un tube de centrifugation préalablement placé dans la glace. - Centrifuger les extraits à 10 000 rpm durant 20 min à 4°C. - Récupérer les surnageants dans une éprouvette, mesurer les volumes et placer les extraits dans la glace. 2 - Principe du dosage des nitrites 2 réactifs seront utilisés : le sulfanilamide et le N-1-naphtylènediamine (NED). En milieu acide, le sulfanilamide donne du sulfanilate de sodium et un ion ammonium. Les ions nitrites réagissent avec le sulfanilate de sodium en donnant un ion diazoniium qui en présence de NED donne un composé azoïque naphtalénique de couleur rose qui absorbe à 540 nm. 3 – relation entre l’absorbance et la concentration en nitrites (gamme étalon) Tableau 1 : volumes des réactifs à introduire Réactifs

Prises en mL

Tris-HCl 25 mM

3,5

3,3

3

2,5

2

1,5

Nitrates 30 mM

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

Nitrites 0,05 mM

0

0,2

0,5

1

1,5

2

- Ajouter dans chaque tube 1 mL de sulfanilamide à 1 % (dans HCl 1,5 N), agiter ; puis introduire dans chaque tube 0,3 mL de NED 0,1 % et agiter. - Attendre minimum 20 min avant de faire la lecture au spectrophotomètre à 540 nm. - Utiliser le tube ne contenant pas de nitrites pour faire le 0 d’absorbance 4 - Mesure de l’activité nitrate réductase Pour l’extrait de plantes cultivées à la lumière, préparer 6 tubes à hémolyse correspondant aux temps 0, 5, 10, 15, 20, 25 minutes et introduire dans chaque tube : - 2,5 mL de tampon Tris-HCl 25 mM, pH 7,5 - 0,5 mL de nitrate 30 mM - 1 mL de NADH 0,8 mM - Agiter et mettre au bain-marie à 30°C pendant 5 min.


16 - Déclencher la réaction enzymatique par l’introduction de 0,5 mL extrait protéique ; agiter et placer à nouveau les tubes à 30°C au bain-marie. Après chaque temps d’incubation, arrêter la réaction avec 1 mL de sulfanilamide (à 1 % dans HCl 1.5 N). Pour le temps 0, arrêter la réaction immédiatement après ajout de l’extrait protéique. A la fin de la cinétique, introduire dans chaque tube 0,3 mL de NED et agiter. Attendre au minimum 20 min avant de faire la lecture au spectrophotomètre à 540 nm ; la coloration (rose/violette) est stable par la suite. Pour l’activité nitrate réductase des plantules développées à l’obscurité, procéder de même, mais ne faire que les temps 0, 15 et 30 min. Utiliser le temps 0 de la cinétique pour faire le 0 d’absorbance (présence des cofacteurs).

Compte-rendu (à rendre en fin de séance). En quelques lignes d’introduction, rappeler le but du TP et son intérêt. Dans une deuxième partie, matériel et méthodes, résumer les techniques utilisées, en indiquant seulement les points essentiels. Dans une troisième partie : sur du papier millimétré, tracer la gamme étalon pour le dosage des nitrites et la cinétique obtenue. Ne pas oublier de donner un titre aux figures. Donner un tableau avec l’ensemble des résultats. Calculer l’activité nitrate réductase en μmoles de nitrites formés . h-1 . g-1 de feuilles pour les 2 échantillons (cf annexe page 17). Donner toutes les étapes des calculs et les justifier. Comparer les activités nitrates réductases obtenues dans les différentes conditions de culture et discuter les résultats obtenus et le protocole expérimental.


17 Rappels de cinétique enzymatique Une réaction enzymatique conduit à la formation d’un produit (P) à partir d’un substrat (S). Pour étudier cinétiquement une telle réaction dans des conditions données (quantité déterminée d’enzymes et de substrat présentes au temps 0) on peut s’intéresser à la quantité de produit (en µmoles par exemple) qui apparaît en fonction du temps d’incubation (en minutes par exemple). On peut ainsi déterminer une vitesse moyenne de la réaction enzymatique sur un intervalle de temps [t1 ;t2] qui sera tout simplement donné par : Vmoyenne = =

Pt 2 − Pt1 t2 − t1

ΔP et exprimé en µmoles de produits formés par minutes (µmoles.min-1). Δt

En réalité, comme nous le verrons par la suite, la vitesse d’une réaction enzymatique est variable sur le temps de l’expérience : elle est importante au début, ralentie, et enfin devient nulle quand le substrat est épuisé (pour une réaction totale). De ce fait plutôt que de s’intéresser à la vitesse moyenne sur un intervalle de temps [t1 ;t2], il est plus judicieux de s’intéresser à la vitesse instantanée de la réaction à chaque instant. Celle-ci est donnée par la valeur numérique de la dérivée de la fonction P = f(t) à chaque instant : Vinstantanée =

dP . On peut aussi dt

s’intéresser à la vitesse de disparition du substrat, et pour garder des vitesses positives s’intéresser à la grandeur :

dS , ce qui revient strictement au même. dt

Apparition du produit (en µmoles) en fonction du temps (min) : P = f (t) 0,5

Vf

0,45

V(3) µmoles de produit formé

0,4 0,35

V(2) 0,3 0,25 0,2 0,15

Vi 0,1 0,05 0

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

temps (minutes)

Figure 1 : Quantité de produit formé (en µmoles) en fonction du temps de réaction

Sur la figure 1 qui donne la quantité de produit formé en fonction du temps, la vitesse instantanée de la réaction est donnée par la valeur numérique

dP à chaque instant, ou encore la valeur numérique du coefficient directeur dt

de la tangente à la courbe à chaque instant. On observe que la vitesse initiale de la réaction (Vi) est la plus élevée, pendant les premiers instants de la réaction où la production de produit est linéaire. Cette vitesse diminue à mesure que le substrat s’épuise, pour devenir nulle en fin de réaction : le substrat est épuisé et pour une réaction totale, la quantité de produit formé est alors égale à la quantité initiale de substrat disponible (pour les réactions à stoechiométrie 1 :1 substrat/produit). Le plateau observé ici n’a absolument rien avoir avec un phénomène de « saturation » , il traduit tout simplement une vitesse de réaction nulle, le substrat étant épuisé. La vitesse intiale étant la vitesse maximale pour une concentration donnée en substrat, c’est celle-ci qui est prise en compte pour caractériser la cinétique de la réaction. Deux autres paramètres essentiels influencent la vitesse d’une réaction enzymatique :


18 (a) La quantité d’enzyme : pour une quantité identique de substrat initialement présent, la vitesse de formation du produit de la réaction sera d’autant plus élevée qu’il y a plus de moles d’enzyme présentes, donc mobilisables pour l’acte catalytique à un instant donné. C’est pourquoi la vitesse définie précédemment en µmoles de produit formé par minute n’a vraiment de sens que si on précise la « quantité de moles » d’enzyme présentes dans la réaction. Comme ceci est difficile à déterminer, on se rapporte par exemple à la quantité de matière fraîche utilisée dans l’expérience (celle-ci étant a priori directement proportionnelle à la quantité d’enzymes présents dans les réactions). Il convient donc de calculer la vitesse sous forme de µmoles de produit formé par minute et par gramme de matière fraîche soit en µmoles.min-1.g-1. (b) La quantité de substrat : pour une quantité d’enzyme identique, la vitesse de la réaction dépendra de la quantité de substrat initialement présente dans la réaction (figure 2). Prenons un exemple théorique. Imaginons une mole d’enzyme capable intrinsèquement de transformer une mole de substrat en une mole de produit en une minute. Un échantillon contenant 5 moles d’enzyme et une mole de substrat, formera une mole de produit en une minute. Pour deux moles de substrat, deux moles de produit seront formées en une minute et pour 5 moles de substrat, 5 moles de produit en une minute. La vitesse de réaction croît donc avec la disponibilité croissante en substrat. Cela étant, au-delà de 5 moles de substrat, seulement 5 moles de produit seront formées pendant la première minute, l’ensemble des moles d’enzyme étant mobilisé (saturées), et le substrat en excès. On parle alors de Vmax , qui est la vitesse intiale d’une réaction enzymatique, pour une concentration en enzyme donnée, et à substrat saturant.

Vitesse initiale (µmoles/min/g) en fonction de la quantité initiale de substrat 0,7 Vmax

Vitesse initiale (µmoles/min/g)

0,6

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

0

Km

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

[substrat] (mM)

Figure 2 : Variation de la vitesse initiale en fonction de la concentration initiale en substrat

C’est pour cette raison que la seule vitesse vraiment intéressante à utiliser comme paramètre de l’enzyme est la vitesse initiale à concentration de substrat saturante, c’est-à-dire la Vmax. Pratiquement cela revient à dire, que lors d’une expérience de cinétique enzymatique on se place au temps 0 en condition de substrat saturant.


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