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Métodos Rápidos para el control Microbiológico de Alimentos Vigo, 8 de septiembre del 2011 1

Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos


Necesidades en el análisis de alimentos • Contaminación microbiana: principales problemas asociados al consumo • Las toxiinfecciones alimentarias conllevan un elevado impacto económico (patógenos) • Las alteraciones de alimentos también preocupan a las industrias alimentaria (indicadores ( de calidad)) • Sistemas APPCC es la herramienta de seguridad alimentaria más reconocida • Requiere de un gran número de análisis y obtención rápida p de resultados

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Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos


Necesidades en el análisis de alimentos • • • • • • •

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Métodos Mé d cada d vez más á rápidos á id (industrias, (i d i l b laboratorios) i ) Métodos sencillos Métodos fiables Métodos reconocidos Métodos trazables Métodos sensibles Métodos económicos

Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos


Métodos tradicionales/oficiales:

• Largos Surgen los métodos alternativos (rápidos y/o • Elevada manipulación automatizados) • Tediosos

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Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos


Métodos rápidos: y uno o varios días frente a los • Disminuyen protocolos tradicionales

Métodos automatizados: • Utilización de un equipo que realiza una o varias tareas que habitualmente realiza un técnico

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Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos


Métodos Rápidos: Consideraciones generales CARACTERISTICAS DE UN MÉTODO RÁPIDO/AUTOMATIZADO IDEAL ¾Preciso ¾Rápido p yp productivo ¾Económico ¾Aceptable ¾Realización simple ¾Entrenamiento ¾Reactivos comunes ¾R ¾Reputación t ió d de lla compañía ñí ¾Buen servicio técnico ¾Requerimientos de espacio y utilidad óptimos 6

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Métodos Rápidos

Clasificación en áreas de acuerdo a lo que se busca: ¾Sistemas para facilitar la toma de muestras ¾Métodos para ayudar al procesamiento de las muestras ¾Sistemas de cuantificación microbiológica ¾Métodos para identificación y cuantificación de microorganismos ¾Sistemas especiales para análisis de muestras de aguas, ambientales y superficies ¾Sistemas de identificación mediante métodos moleculares ¾Métodos inmunológicos para detección y/o cuantificación de microorganismos ¾Otros métodos misceláneos

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Métodos rápidos para ayudar a la toma de muestras t MUESTREADORES, APLICADORES Muestreo dinámico Estandarización Concepto de trazabilidad

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Métodos rápidos para ayudar al procesamiento de la muestra DILUIDORES Estandarización Aumentan productividad Trazabilidad

PREPARADORES y DISPENSADORES DE MEDIOS DE CULTIVO

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Indicadores de calidad

Recuentos

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Métodos rápidos aplicados a Indicadores microbiológicos FILM HIDRATABLE: PETRIFILM: 3M ¾Optimizan el espacio de incubación ¾Manual ¾Algunos protocolos Express

Láminas deshidratadas que se rehidratan al inocular la muestra

¾Posibilidad de lector automático ¾Validaciones internacionales

Recuento total Enterobacterias E.coli/Coliformes Mohos y levaduras Staph. Aureus Listeria ambiental 11

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Métodos rápidos aplicados a Indicadores microbiológicos g SISTEMA TEMPO: bioMerieux •Fácil preparación de muestra Trazabilidad •Trazabilidad •Mismo protocolo para diferentes parámetros •Validaciones internacionales

•Recuento Total •Enterobacterias E t b t i Sistema totalmente automatizado NMP miniaturizado i i t i d Lectura por fluorescencia

•Coliformes E.coli •E.coli •S. Aureus •Mohos y levaduras •Bacterias Lácticas

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Protocolo de trabajo dilu ent X g (or ml)

9X ml

10-1 suspension

Sample p preparation p p Inoculation

Reading & interpretation 13

Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos Incubation


Protocolo de trabajo

+

=

dilu ent X g (or ml)

9X ml

10-1 suspension

Sample p preparation p p

WIFI

Reading & interpretation 14

Inoculation

Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos Incubation


Protocolo de trabajo

+

=

dilu ent X g (or ml)

9X ml

10-1 suspension

Sample p preparation p p

WIFI

Reading & interpretation 15

Inoculation

Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos Incubation


Protocolo de trabajo

+

=

dilu ent X g (or ml)

9X ml

10-1 suspension

Sample p p preparation p

WIFI

Inoculation

RESULTS READING REPORT Reading & interpretation 16

Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos Incubation


Métodos rápidos aplicados a Indicadores microbiológicos g SISTEMAS BASADOS EN IMPEDANCIA: BACTRAC •Fácil Fá il preparación ió de d muestra t •Lectura automática Más sencillo cuando es “mono-producto” mono producto •Más •Necesaria calibración para recuento •Esterilidad comercial (pasa/no pasa)

Recuento total E t Enterobacterias b t i E.coli/Coliformes Hongos y levaduras Staph. Aureus Ácido Lácticas

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Mide los cambios que producen los microorganismos de un cultivo que alteran las substratos cambiando su conductividad eléctrica y esto varía la impedancia

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Métodos rápidos aplicados a Indicadores microbiológicos g SISTEMAS BASADOS EN CITOMETRIA DE FLUJO AES: Bactiflow •Fácil preparación de muestra •Lectura automática •Rápido •Utilidad: Utilid d yogures, champús, h ú cremas, refrescos, zumos de frutas

Marcaje de las células, detección una una y contaje R Recuento t ttotal t l Enterobacterias Hongos y levaduras Salmonella 18

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Métodos rápidos aplicados a Indicadores microbiológicos Sembradores en espiral y lectores automáticos de colonias Deposición p automática de la muestra líquida en la superficie de un placa rotatoria de agar

•Estandarización •Eliminación de diluciones •Lectura automática Ahorro de tiempo •Ahorro •Trazabilidad

Lectores automáticos de colonias 19

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Métodos rápidos aplicados a Indicadores microbiológicos SISTEMA SimPlate: Biocontrol . Fácil de leer · Consistente y reproducible · Rápido · Fácil Fá il de d preparar · Menos interferencia · Amplio rango de conteo · Tecnología g innovadora

Placa de p plástico circular de 84 pocillos p Lectura por fluorescencia

Recuento total

El número de positivos se convierten en valores l NMP

Coliformes/E.coli Mohos y levaduras Campylobacter

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Métodos rápidos aplicados a Indicadores microbiológicos g SISTEMAS BASADOS EN ATP •Económico •Rápido Utilización en el entorno lácteo: esterilidad comercial •Utilización •Más utilizado en control de limpieza y desinfección

Mide niveles de ATP Lo relaciona con niveles de contaminación

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Pat贸genos

Ausencia/presencia

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Métodos rápidos aplicados a la detección de Patógenos g PROTOCOLOS CORTOS Salmonella: •Pre-enriquecimiento y placa

•SESAME (BIOSER)

•Manuales

•IBISA ((AES))

•Medios cromogénicos o semisólidos •Validaciones internacionales •Económicos E ó i

•SMS (AES) •SALMONELLA PRECIS (OXOID) •RAPID SALMONELLA (BIORAD) Listeria Monocytogenes:

•Salmonella •Listeria spp •Listeria monocytogenes

•ALOA ONE DAY (AES) •LISTERIA PRECIS (OXOID) •RAPID LMONO (BIORAD) •COMPASS LISTERIA (BIORAD) •CHROMOID LMONO (BIOMEREIUX)

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MĂŠtodos rĂĄpidos para el control microbiolĂłgico de alimentos


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MĂŠtodos rĂĄpidos para el control microbiolĂłgico de alimentos


Métodos rápidos aplicados a la detección de Patógenos g SISTEMAS BASADOS EN PRUEBAS ELISA:

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Métodos rápidos aplicados a la detección de Patógenos g SISTEMAS BASADOS EN PRUEBAS ELISA Si Sistema VIDAS (bi (bioMerieux) M i ) •Salmonella •Listeria Li t i spp/Listeria /Li t i monocytogenes

•Equipo automatizado

•Campylobacter py spp pp

•Tecnología ELFA (elisa+fluorescecia) e inmunoconcentración

•E.coli O157:H7

•Resultados en 16-24 horas

•Toxina Staph aureus

•Validaciones internacionales •Lectura automática, no calibración, no interpretación •Procesado de muestras: 12-30 simultáneamente cada 45 minutos

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Métodos rápidos aplicados a la detección de Patógenos g

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Métodos rápidos aplicados a la detección de Patógenos g SISTEMAS BASADOS EN ELISA Sistema TECRA (Biotrace) Salmonella Listeria spp Campylobacter spp

•Manual •Desarrollo Desarrollo de color •Resultados : 1-2 días

-

+

•Validaciones internacionales •Posibilidad de realizarlo automáticamente con el UNIQUE PLUS

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Métodos rápidos aplicados a la detección de Patógenos g SISTEMAS BASADOS EN ELISA Sistema TRANSIA (Biocontrol) Salmonella Listeria Monocytogenes Listeria spp

•Automático •Manejo de elevados volúmenes •Procesado de muestras: 93 muestras simultáneamente •Resultados rápidos: 1-2 días •Validaciones internacionales 31

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Métodos rápidos aplicados a la detección de Patógenos g SISTEMAS BASADOS EN ELISA L Lateral l fl flow Rapid test (Oxoid) VIP (BioControl) RayAl (Rayal Ltd) REVEAL (Neogen) Rapidcheck (Bioser)

•Manual •La L muestra t difunde dif d por capilaridad hacia la zona de Ac •Lectura habitual p por una línea de color •Validaciones internacionales

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Métodos rápidos aplicados a la detección de Patógenos g SISTEMAS BASADOS EN PCR

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Métodos rápidos aplicados a la detección de Patógenos g

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Métodos rápidos aplicados a la detección de Patógenos g SISTEMAS BASADOS EN Real Time PCR (BAX System: Oxoid)

•Procotolos diferentes según matriz •Validaciones internacionales Salmonella spp Listeria spp Listeria Monocytogenes

•Resultados R lt d en 24-33 24 33 h horas •Sonda Sybr Green

Campylobacter E.coli O157:H7 Enterobacter sakazakii Mohos y levaduras S.aureus

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Métodos rápidos aplicados a la detección de Patógenos g SISTEMAS BASADOS EN REAL TIME PCR (Applied Biosystem): •2 tipos de kits: Taqman y Microseq •Validaciones internacionales

Salmonella spp

•Resultados en 20-28 horas

Salmonella entérica Listeria spp Listeria Monocytogenes E.coli O157:H7 Campylobacter jejuni •Cronobacter sakazakii •E. coli O157:H7 •Listeria monocytogenes •Pseudomonas aeruginosa •Staphylococcus aureus

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Métodos rápidos aplicados a la detección de Patógenos g SISTEMAS BASADOS EN PCR (Adia food: AES) Salmonella spp

•Termociclador: Stratagen

Listeria spp

•Resultados en 19-21 horas

Listeria Monocytogenes E.coli O157:H7 E coli O157:H7 y Salmonella E.

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Métodos rápidos aplicados a la detección de Patógenos g SISTEMAS BASADOS EN REAL TIME PCR (iQ-CHECK: Biorad) •Sondas: Molecular Beacons Varios termocicladores:iCycler iQ, chrom 4, •Varios iQ 5 y miniOpticon. •En algunos software de interpretación de resultados lt d •Validación 16140

Salmonella spp y g Listeria Monocytogenes Listeria spp Campylobacter E.coli 0157:H7 38

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Métodos rápidos aplicados a la detección de Patógenos g SISTEMAS BASADOS EN REAL TIME PCR (Assurance GDS: Biocontrol) •Salmonella •Listeria spp •Listeria monocytogenes •E.coli O157:h7 •Shiga Shiga Toxin To in

•Combina concentración de muestra y detección d t ió de d DNA •Termociclador:Assurance GDS Rotor-Gene™.

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MĂŠtodos rĂĄpidos para el control microbiolĂłgico de alimentos


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MĂŠtodos rĂĄpidos para el control microbiolĂłgico de alimentos


Métodos rápidos aplicados a la detección de Patógenos g SISTEMAS DE DETECCIÓN CON FAGOS Salmonella E.coli 0157:H7

+

•Detección rápida y automática de patógenos mediante FAGOS ligada g a fluorescencia. Salmonella

+ 42

•Detección D t ió rápida á id y manual de patógenos mediante FAGOS (lateral flo ) flow) Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos


Food & envt. 225 ml of BPW + supplement (green)

41.5 +/- 1 °C 18-24 h

Heat & Go 5 min* min *Except for poultry & egg products

VIDAS UP Salmonella 48 min 43

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Identificaci贸n

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M茅todos r谩pidos para el control microbiol贸gico de alimentos


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Métodos rápidos aplicados a la identificación de microorganismos g IDENTIFICACIÓN CON SISTEMAS MINIATURIZADOS •Manual •Miniaturización de pruebas bioquímicas •Diferentes formatos: galerías, tubos de plástico,

•API: bioMerieux •BBL BBL Enterotube: BD •BBL Crystal: BD •RapID™ RapID System: REMEL

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Métodos rápidos aplicados a la identificación de microorganismos g SISTEMAS AUTOMÁTICOS DE IDENTIFICACIÓN Fenotípica: VITEK: bioMerieux •BIOLOG: AES •PHOENIX: BD •Resultados a partir de 4 horas •Combinan reacciones enzimáticas y bioquímicas

Genotípica: •MICROSEQ: C OS Q ABI 46

•Secuenciación del ARN 16 S Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos


Métodos rápidos aplicados a la identificación de microorganismos CLASIFICACIÓN FILOGENÉTICA Family

VITEK, API, BIOLOG, PHOENIX Genus

Species

Subspecies Strain

DNA sequencing MicroSeq

16S rDNA sequencing ARDRA

Riboprinter

Riboprinting tRNA PCR tRNA-PCR ITS-PCR

BioRad

PFGE, LFRFA, RLFP Multilocus Isozyme Whole cell protein profiling

ABI

AFLP RAPD APPCR

Diversilab G Genetic ti Differences: Diff Technique Discrimination:

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rep-PCR M More

F Fewer

Low

High

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Métodos rápidos aplicados a la identificación de microorganismos •Genera huellas genéticas únicas y reproducibles para cada una de las muestras •13 muestras en 4 horas

1. Extracción de ADN: Extracción de ADN a partir de cultivos aislados. 2. Amplificación mediante rep-PCR: Amplificación de muestras con la técnica rep-PCR y los correspondientes kits de identificación genética DiversiLab (DiversiLab DNA Fingerprinting kits). 3. Detección: Separación de fragmentos mediante electroforesis de microfluidos en chip (DNA LabChip Kits). 4. Análisis de datos: Análisis de los datos en tiempo real, con informes a los que se puede acceder a través de un sitio web individual y seguro.

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Métodos rápidos aplicados a la identificación de microorganismos ESPECTROMETRÍA DE MASAS

Técnica analítica para determinar la composición elemental de una muestra

El principio de MS consiste en la ionización de compuestos químicos p q para g generar moléculas cargadas g y medir su relación masa/carga (m/r)

MALDI-TOF MALDI TOF (Matrix (M t i Assisted A i t d Laser L Desorption D ti / Ionisation I i ti Time of Flight), es un tipo de espectrometría de masas que permite el screening de proteínas directamente a partir de bacterias intactas Ionization Mass Ion InletDetector Analyzer System System

Sample Under Vacuum 49

Data Analysis S System

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• Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time Of Flight. Flight MALDI is the Ionization System-TOF is the Mass Analyzer system.

1

2

3

1

Una muestra en una solución matriz absorbe energía de un haz láser. El resultados es una ionización de la muestra.

2

Todos los iones son acelerados a la misma energía cinética, entran en el tubo y son separados de acuerdo con su masa

3

Detección al final del tubo

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Métodos rápidos aplicados a la identificación de microorganismos ESPECTROMETRÍA DE MASAS

3775 3

<<C:\Dokumente und Einstellungen\m.erhard\Eigene Dateien\AnagnosTec-dc\Zwischenablage\Dokument Banner.txt>> Spec [BP = 3

5000

7000

10939 11000

11572

11 1906

10226 1

10347 9000

10 0608

9330

10 0 3000

9994

7980

20

8450 8

30

7863

40

6837 7092 7367 7

50

5931

5015

60

3581

% Intensity

70

9654

80

8744

8074

90

9453

1648.1

7075

100

13000

Mass (m/z)

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Métodos rápidos aplicados a la identificación de microorganismos ESPECTROMETRÍA DE MASAS Fungi, yeast and mycobacteria: On-target extraction addition of 1.0 µL matrix solution di t direct

solvent evaporation at room temperature Target slide

No selección previa de la colonia

Identificación en solo 2 minutos automated MS analysis

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Métodos rápidos aplicados a la identificación de microorganismos •VITEK MS RUO: bioMerieux •Maldi Biotyper: Bruker

Pow e r

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Ionis ing

V a cuum

N eg ative

Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos


MUCHAS GRACIAS POR SU ATENCIÓN

Ana María Fuertes Barrio ana-maria.fuertes@biomerieux.com

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