Issuu on Google+


Метод полимеразных цепных реакций (ПЦР) с каждым годом все шире применяется в клинической практике. В последние десять лет он перешел из разряда уникальных методов, доступных только элитным клиникам, в разряд высокоточных, но доступных исследований. Все это время за ПЦР-исследованиями шествует шлейф «мифов и преданий», распространяемых теми, кто «слышал звон, да не знает где он», т. е. людьми, не имевшими возможности на практике пользоваться ПЦР-исследованиями. Попытаемся развеять некоторые из них. Миф

Реалии

Миф

Реалии

Миф Реалии

ПЦР-исследования столь чувствительны, что дают много ложноположительных реакций, особенно при выявлении микоплазм, уреаплазм, гарднерелл и т. п. Чувствительность ПЦР — параметр вполне регулируемый, и регулируется он количеством циклов амплификации. Так, хламидии выявляются после 42-45 циклов, уреаплазмы и микоплазмы — после 30-32 циклов (что соответствует чувствительности 104 КОЕ/мл), лактобактерии — после 20 циклов амплификации (что соответствует 106 КОЕ/мл). В ПЦР-исследованиях легко возникает контаминация — перекрестное загрязнение проб от положительных образцов, что также ведет к ложноположительным результатам. Контаминация в ПЦР теоретически произойти, конечно же, может, но ее частота весьма мала. Поскольку риск контаминации был известен давно, его учли при проектировании ПЦР-лабораторий, создании аппаратуры и тест-систем.Современная ПЦРлаборатория надежно разделяет различные зоны проведения анализа, ламинарные шкафы создают чистый незагрязненный воздух, а фасованные в пробирки в заводских условиях реагенты сводят риск контаминации к минимуму. ПЦР не признан никакими нормативными документами ПЦР-исследования широко вошли в список рекомендуемых тестов в рекомендациях ЦНИКВИ в 2002 г., в рекомендациях гепатологов МЗ РФ. Большинство реагентов для ПЦР-исследований зарегистрированы и разрешены МЗ РФ.

Где же с наибольшей эффективностью работают все плюсы этого метода? 1. Диагностика инфекций, передающихся половым путем (лидер среди ПЦР-исследований). 2. Диагностика вирусных инфекций — вирусные гепатиты (А, В, С, D, E, G, TTV), ВИЧ, вирус клещевого энцефалита, инфекции, вызываемые вирусами герпеса различных типов и т. п. 3. Диагностика инфекционных заболеваний, вызываемых плохо 3


культивируемыми возбудителями — боррелия лайма, легионелла, некоторые виды сальмонелл и т. п. 4. Диагностика врожденных, генетически обусловленных заболеваний (в т. ч. еще до рождения ребенка). 5. Быстрая диагностика особо опасных инфекций. 6. Определение пола плода на ранних сроках беременности. 7. Идентификация личности. Этот список увеличивается с большой скоростью.

1. Подготовка пациента За 10 дней до взятия материала на исследование необходимо прекратить прием химиопрепаратов и лечебные процедуры. Материал для исследования у женщин следует брать перед менструацией или через 1-2 дня после ее окончания. Перед взятием материала необходимо воздержаться от мочеиспускания (в течение 3-4 часов) и половых сношений. Женщины накануне обследования не должны проводить туалет наружных половых органов и спринцевание. Исследуемый материал должен быть без примесей крови. Не следует для исследования брать свободно стекающие уретральные выделения. Секрет простаты следует брать только после окончания острых явлений простатита.

2. Особенности получения материала для ПЦР-исследований 2.1.

Особенности взятия материала из уретры перед взятием материала пациенту рекомендуется воздержаться от мочеиспускания в течение 1,5-2 часов; • непосредственно перед взятием материала наружное отверстие уретры необходимо обработать тампоном, смоченным стерильным физиологическим раствором; • при наличии гнойных выделений соскоб рекомендуется брать через 1520 мин. после мочеиспускания, при отсутствии выделений необходимо провести массаж уретры с помощью зонда для взятия материала; • у женщин перед введением зонда в уретру проводится ее массаж о лобковое сочленение; • в уретру у женщин зонд вводится на глубину 1,0-1,5 см, у мужчин — на 34 см, и затем делается несколько вращательных движений; • у детей материал для исследования берут только с наружного отверстия уретры. После взятия материала зонд переносят в упаковку зонда, либо зонд вносят в пробирку с транспортной средой и тщательно отмывают, пробирка закрывает•

4


ся и маркируется, и в таком виде доставляется в лабораторию. 2.2.

Особенности взятия материала из цервикального канала перед взятием материала необходимо удалить ватным тампоном слизь и затем обработать шейку матки стерильным физиологическим раствором; • зонд вводится в цервикальный канал на глубину 0,5-1,5 см; • при наличии эрозий цервикального канала необходимо их обработать стерильным физиологическим раствором, материал следует брать на границе здоровой и измененной ткани; • при извлечении зонда необходимо полностью исключить его касание со стенками влагалища. После взятия материала зонд переносят в упаковку зонда, либо зонд вносят в пробирку с транспортной средой и тщательно отмывают, пробирка закрывается и маркируется, и в таком виде доставляется в лабораторию. •

2.3.

Особенности взятия материала из влагалища Материал должен быть взят до проведения мануального исследования. Зеркало перед манипуляцией можно смочить горячей водой, применение антисептиков для обработки зеркала противопоказано. Влагалищное отделяемое собирают стерильным одноразовым зондом из заднего нижнего свода или с патологически измененных участков слизистой. После взятия материала зонд переносят в упаковку зонда, либо зонд вносят в пробирку с транспортной средой и тщательно отмывают, пробирка закрывается и маркируется, и в таком виде доставляется в лабораторию. 2.4.

Особенности взятия секрета предстательной железы Перед взятием секрета простаты головка полового члена обрабатывается стерильным ватным тампоном, смоченным физиологическим раствором. Секрет простаты берется после предварительного массажа простаты через прямую кишку. Врач проводит массаж с надавливанием несколькими энергичными движениями от основания к верхушке. Затем из кавернозной части выдавливается простатический секрет, который собирается в стерильную емкость (сосуды с широким горлом, пробирки). После взятия секрета простаты он должен быть доставлен в лабораторию в течение 1-3 часов. Транспортировка биологического материала должна производиться только в сумкехолодильнике. 2.5.

Особенности взятия (сбора) мочи Мочу собирают утром натощак после сна или не ранее чем через 2-3 часа после последнего мочеиспускания. При сборе мочи желательно использовать широкий сосуд с крышкой, по возможности собирать мочу сразу в посуду, в которой она будет доставлена в лабо5


раторию. Минимальный объем мочи, необходимый для проведения анализа, составляет 20 мл. Если в лабораторию доставляется не вся собранная моча, то перед тем, как часть мочи сливается в посуду для транспортировки, ее необходимо тщательно взболтать. Собранную мочу доставляют в лабораторию в течение 1-3 часов без дополнительного охлаждения. Длительное хранение мочи при комнатной температуре до исследования приводит к изменению не только ее физических свойств и к разрушению клеток, но и к размножению бактерий. 2.6.

Особенности взятия материала с конъюнктивы глаз При наличии обильного гнойного отделяемого его убирают стерильным ватным тампоном, смоченным физиологическим раствором. Соскоб берут с внутренней поверхности нижнего века движением к внутреннему углу глазной щели. При взятии соскоба необходимо придерживать веко руками, чтобы при моргании ресницы не касались зонда. После взятия материала зонд переносят в упаковку зонда, либо зонд вносят в пробирку с транспортной средой и тщательно отмывают, пробирка закрывается и маркируется, и в таком виде доставляется в лабораторию. 2.7.

Особенности взятия материала с задней стенки глотки Одноразовый зонд вводят за мягкое небо в носоглотку и проводят по задней стенке глотки. Если целью исследованию стоят миндалины, то лучше вводить зонд в лакуны миндалин и ротировать там. После взятия материала зонд переносят в упаковку зонда и доставляют в лабораторию. Либо зонд вносят в пробирку с транспортной средой и тщательно отмывают. Пробирка закрывается и маркируется. 2.8.

Особенности взятия мазка из носоглотки Взятие мазка проводится натощак или не ранее, чем через 2-4 часа после еды. При взятии материала необходимо хорошее освещение, пациент сидит против источника света, корень языка придавливают шпателем, материал берут стерильным зондом, не касаясь языка, слизистой щек и зубов. После взятия материала зонд переносят в упаковку зонда, либо зонд вносят в пробирку с транспортной средой и тщательно отмывают, пробирка закрывается и маркируется, и в таком виде доставляется в лабораторию. 2.9.

Мазки из зубодесневых карманов. Мазки из зубодесневого кармана собираются в стерильную пробирку (типа эппендорф) с физиологическим раствором. В этом случае пробирки могут хра6


ниться в холодильнике (+4… 6°С) не более 12 часов, а их транспортировка осуществляется в сумке-холодильнике. Можно брать мазки и жесткими уретральными зондами. В этом случае зонд после взятия материала помещают в его одноразовую упаковку, и в таком виде доставляют в лабораторию. 2.10. Особенности сбора слюны За 12 часов до взятия (сбора) слюны исключается прием пищи, алкоголя и лекарственных препаратов. Непосредственно перед сбором слюны необходимо исключить использование зубной пасты и удалить зубные протезы. Перед тем, как собрать слюну, необходимо почистить зубы без зубной пасты, затем хорошо прополоскать рот без использования раздражающих средств. Далее, общую слюну (смешанную) выплевывают изо рта или отсасывают со дна рта одноразовым шприцем и переносят в пробирку (типа эппендорф). Слюна может храниться в холодильнике (+4…6°С) не более 12 часов, а ее транспортировка осуществляется в сумке-холодильнике. 2.11. Венозная кровь Кровь на исследование желательно брать натощак. Венозная кровь в количестве 2-2,5 мл отбирается в стерильную пробирку объемом 5 мл. Пробирка с кровью может храниться в холодильнике (+4…6°С) не более 24 часов. Пробирку не замораживать (исследование проводится из сыворотки). Непосредственно перед взятием крови участок кожи над пунктируемой веной с особой тщательностью обрабатывается ватным тампоном с 70° спиртом, затем тампоном с 10% раствором йода от центра к периферии. Перед взятием крови дезинфицирующее средство должно испариться с поверхности кожи. Нельзя пальпировать вену в месте пункции. После взятия крови удаляют следы йода тампоном с 70° спиртом во избежание возможного воспаления кожи. Для взятия крови необходимо пользоваться шприцами для одноразового пользования либо системами вакуумного взятия крови — Vacuette, Vacutainer. Освобождение шприцев из упаковки производится непосредственно перед взятием крови.

3. ПЦР в клинической практике: диагностика ИППП Для специальностей: акушерство и гинекология, урология и андрология, дерматовенерология, педиатрия 3.1.

Урогенитальный хламидиоз 3.1.1. Краткая информация о возбудителе Урогениталыные хламидиозы по распространенности занимают важное место среди ИППП, а их последствия в виде трубного бесплодия и эктопической бе7


ременности у женщин, нарушения сперматогенеза у мужчин оказывают существенное влияние на репродуктивное здоровье населения. Наряду с характерным течением заболевания, часто встречаются атипичные и бессимптомные формы хламидийной инфекции, представляющие трудности в диагностике. Хламидии (Chlamidia)— мелкие грамотрицательные неподвижные облигатно паразитические бактерии, основными морфологическими формами которых являются элементарные (ЭТ) и ретикулярные (РТ) тельца. ЭТ хламидий обладают инфекционными свойствами, способны проникать в чувствительные клетки, где происходит их цикл развития — превращение мелких ЭТ в более крупные РТ, которые затем претерпевают деление. Хламидии имеют основные признаки бактерий: содержат ДНК, РНК и рибосомы. Все виды, входящие в семейство Chlamydiaceae, обладают сходной структурой липополисахаридного (ЛПС) антигена. Основные белковые антигены, представленные на поверхности ЭТ (белки МОМР массой 40 кД и ОМР2 массой 60 кД) также проявляют значительное структурное сходство у разных видов семейства, что зачастую затрудняет дифференциальную диагностику. Исходя из того, что виды семейства Chlamydiaceae отличаются между собой лишь различиями в нуклеотидной последовательности некоторых генов, становится очевидным, что правильная диагностика возбудителя хламидийной инфекции возможна лишь при использовании методов обнаружения генома возбудителя, т. е. ПЦР. Рис. 1. Жизненный цикл хламидий. 1) адсорбция ЭТ; 2) проникновение ЭТ в клетку; 3) реорганизация ЭТ в РТ; 4) деление РТ; 5) созревание РТ в ЭТ; 6) накопление РТ в эндосоме; 7) выход из клетки.

3.1.2. Показания для диагностики хламидий методом ПЦР: • Острая фаза заболевания. • Установление этиологии хронического инфекционного процесса урогенитального тракта, в т. ч. его верхних отделов. Возможность обнаружить единичные молекулы ДНК хламидий, не выявляемые методами прямого обнаружения антигена (культуральный, ПИФ). • Беременность с отягощенным акушерским анамнезом. 8


• •

Бесплодие неясного генеза. Контроль эффективности терапии (не ранее чем через 1 месяц после приема антибактериальных препаратов).

3.1.3. Материал для исследования: • соскоб из уретры или цервикального канала (пп. 2.1., 2.2.); • секрет предстательной железы (п. 2.4.); • осадок мочи (п. 2.5.); • соскоб с конъюнктивы (п. 2.6.); • у новорожденных в качестве материала для исследования используют соскоб с конъюнктивы глаз и задней стенки глотки (п. 2.7.); • у девочек в качестве материала для исследования используют соскоб из вульвы, у мальчиков — мочу. 3.2.

Урогенитальные микоплазмозы (уреаплазмоз) 3.2.1. Уреаплазмозы 3.2.1.1. Краткая информация о возбудителе Представители рода Ureaplasma относятся к группе урогенитальных микоплазм и обладают всеми отличительными признаками этих микроорганизмов: наименьший среди прокариот размер генома, чрезвычайно простая организация, отсутствие плотной клеточной стенки и, как следствие, выраженный полиморфизм. Уреаплазмы способны длительно персистировать на мембране эпителиальных клеток макроорганизма и локализоваться внутриклеточно. При этом, подобно другим генитальным микоплазмам, могут расти на искусственных бесклеточных питательных средах. Уреаплазмы являются условно-патогенными микроорганизмами и способны вызывать различные заболевания урогенитального тракта человека. По современной классификации, к роду Ureaplasma относят два вида: U. parvum и U. urealyticum, ранее (до 2000 г.) считавшимися двумя биоварами одного вида U. urealyticum. Из них преимущественно U. parvum способна вызывать воспалительные процессы со стороны слизистых урогенитального тракта, тогда как U. urealyticum является комменсалом в составе вагинального микробиоценоза. Уреаплазменная инфекция может сопровождаться воспалительными процессами гениталий, приводящими к бесплодию, прерыванию беременности, преждевременным родам, пренатальной патологии плода, а также вызывать уретриты, простатиты и бесплодие у мужчин. Недавно было показано, что уреаплазма является кофактором развития СПИД.

• •

3.2.1.2. Особенности течения уреаплазменной инфекции Бессимптомное протекание. Отсутствие стойкого иммунного ответа. 9


• •

Быстрая изменчивость генома, приводящая к возникновению феномена ухода от иммунного ответа Природная устойчивость к антибиотикотерапии.

3.2.1.3. Материал для исследований Наибольшую диагностическую значимость при выявлении ДНК U. urealyticum и U. parvum методом ПЦР имеют следующие биологические материалы: • соскоб из уретры (п. 2.1.); • соскоб из цервикального канала (п. 2.2.); • соскоб с задней стенки влагалища (диагностика бактериального вагиноза) (п. 2.3.); • соскоб с задней стенки глотки (у новорожденных) (п. 2.7.); • секрет предстательной железы, сперма (п. 2.4.); • осадок мочи (п. 2.5.). 3.2.2. Микоплазмозы 3.2.2.1. Краткая информация о возбудителе. Микоплазмы — микроорганизмы с наименьшим среди прокариот размером генома и чрезвычайно простой организацией. Отличаются от бактерий отсутствием клеточной стенки и, как следствие, выраженным полиморфизмом. При этом способны расти на бесклеточных питательных средах, метаболизировать ряд субстратов и обладают чувствительностью к некоторым антибиотикам. Плазматическая мембрана микоплазм содержит антигены, сходные с человеческими. Исключительно важная особенность микоплазм состоит в том, что все известные виды способны длительно персистировать на мембране клеток макроорганизма: эпителиальных, лимфоцитах, тромбоцитах и т. д. Микоплазмы способны внедряться внутрь эпителиальных клеток и локализоваться внутриклеточно, где происходит их активное размножение. M. hominis являются условно-патогенными для человека микроорганизмам. Персистируя в эпителиальных клетках и на их поверхности, микоплазмы способны вызывать различные заболевания урогенитального тракта человека: эндометриты, сальпингиты, негонококковые уретриты. У новорожденных, которые, видимо, инфицируются при прохождении родовых путей, М . hominis колонизирует чаще всего носоглотку и влагалище. У мужчин микоплазма чаще колонизирует уретру и крайнюю плоть, у женщин — влагалище, реже шейку матки и уретру. Показатели инфицированности этим видом микоплазм варьируют от 10 до 50%. Более патогенна и практически не встречается в норме M. genitalium.

• • • 10

3.2.2.2. Особенности течения микоплазменной инфекции: Бессимптомное протекание. Отсутствие стойкого иммунного ответа. Быстрая изменчивость генома, приводящая к возникновению феномена


ухода от иммунного ответа. Природная устойчивость к антибиотикотерапии.

3.2.2.3. Материал для исследований Наибольшую диагностическую значимость при выявлении ДНК М. hominis и M. genitalium методом ПЦР имеют следующие биологические материалы: • соскоб из уретры (п. 2.1.); • соскоб из цервикального канала (п. 2.2.); • соскоб с задней стенки влагалища (диагностика бактериального вагиноза) (п. 2.3.); • соскоб с задней стенки глотки (у новорожденных) (п. 2.7.); • секрет предстательной железы, сперма (п. 2.4.); • осадок мочи (п. 2.5.). 3.3.

Трихомониаз 3.3.1. Краткая информация о возбудителе Трихомоноз (трихомониаз) занимает первое место по распространенности среди инфекций, передающихся половым путем. По данным ВОЗ, примерно 170180 млн человек ежегодно заболевают трихомониазом. В целом пораженность взрослого населения в популяции составляет 8-10%. Среди лиц с воспалительными заболеваниями урогенитального тракта эта цифра составляет 32-35 %. Возбудителем заболевания является Trichomonas vaginalis, простейший одноклеточный микроорганизм, приспособившийся в процессе эволюции к паразитированию в мочеполовых органах человека. Для выживания в организме хозяина у них имеется несколько механизмов: способность проникать подобно лейкоцитам между клетками хозяина в узкие щели, фиксация на поверхности клетки трихомонады большого количества антитрипсина, с одной стороны, и протеолитических ферментов (гиалуронидаза и т. п.) — с другой. Ферменты трихомонад легко разрушают иммуноглобулины урогенитального тракта. Трихомонады фагоцитируют целый ряд других возбудителей ИППП — гонококков, хламидий, микоплазм, грибов, обеспечивая этим микроорганизмам защиту от воздействия антибиотиков. Моноинфекция трихомонадами встречается не более чем в 10% случаев. В основном трихомонадная инфекция имеет сочетанное с другими возбудителями течение. Наиболее частыми и тяжелыми осложнениями (последствиями) хронического трихомонадного поражения являются обтурационные процессы в семенных канатиках и маточных трубах. Трихомониаз — одна из основных причин трубного бесплодия. Это обусловлено тем, что в ответ на воздействие трихомонадной гиалуронидазы возникают грубые рубцы и спайки. Заражение трихомониазом происходит от больного человека. Без лечения влагалищные трихомонады не покидают организм человека и способны вызывать различные осложнения. 11


В ответ на трихомонадную инфекцию вырабатываются АТ к трихомонаде классов IgG, IgM, которые, однако, не способны осуществлять иммунную защиту, а являются лишь «свидетелями» инфекции. Трихомониаз часто протекает субъективно бессимптомно: до 61% женщин и до 83% мужчин, у которых обнаруживают трихомонады, не предъявляют никаких жалоб. При беременности, в послеродовом или послеабортном периоде, при чрезмерной сексуальной активности, на фоне приема алкоголя, снижения иммунологической реактивности скрытая форма трихомониаза может перейти в острую. Для успешной диагностики трихомониаза следует придерживаться следующих принципов [И. И. Ильин, Е. Н. Туранова, 1991]: • сочетанное использование различных способов диагностики; • неоднократные исследования изучаемого материала; • взятие материала из разных очагов (уретра, мочевой пузырь, вульва, вагина, протоки больших вестибулярных желез); • правильная техника взятия и транспортировка материала. Взятие клинического материала для выявления трихомонад осуществляют из всех возможных очагов инфекции (у женщин в начале и конце менструального кровотечения). Химическая провокация путем инстилляции в уретру и обработки цервикального канала растворами азотнокислого серебра нецелесообразна в связи с губительным действием этих растворов на влагалищную трихомонаду. Выявлению простейших в большом числе случаев способствуют повторные многократные исследования. ПЦР-исследование позволяет с высокой специфичностью обнаруживать трихомонаду в различных биологических материалах: мазках из уретры, цервикального канала, семенной жидкости, соке простаты. В настоящее время после культурального метода ПЦР — самый надежный и перспективный метод. В крупных межклинических исследованиях совпадение результатов ПЦР и культурального составило 99,7-100%. 3.3.2. Материал для исследований • соскоб из уретры (п. 2.1.); • соскоб из цервикального канала (п. 2.2.); • соскоб с задней стенки влагалища (п. 2.3.); • секрет предстательной железы, сперма (п. 2.4.). 3.4.

Диагностика бактериального вагиноза 3.4.1. Краткая информация Микробиоценоз влагалища — сложившаяся экологическая система, основная функция которой — защитная. Микрофлора влагалища способна реагировать качественными и количественными изменениями на любые физиологиче12


ские и патологические сдвиги в состоянии макроорганизма и препятствовать инвазии патогенных микроорганизмов. Ведущее место в вагинальном микробиоценозе занимают лактобактерии (80-90%), число которых может достигать 109 КОЕ/мл. Колонизируя слизистую влагалища, лактобактерии участвуют в формировании экологического барьера и обеспечивают тем самым резистентность вагинального биотопа. Нарушение нормальной микрофлоры влагалища приводит к возникновению переходного состояния — бактериального вагиноза, наиболее широко распространенного заболевания у женщин детородного возраста. Бактериальный вагиноз (БВ) — это переходное состояние вагинального биотопа, характеризующееся замещением лактофлоры G. vaginalis и условно-патогенной анаэробной флорой, в первую очередь представителями семейства Bacteroides, Mobiluncus, M. hominis и U. urealyticum. Предварительный диагноз БВ может быть поставлен при наличии у пациентки трех из четырех перечисленных ниже признаков: • наличие «ключевых» клеток при цитологическом исследовании урогенитального мазка; • рН влагалищного отделяемого >4,5; • специфический характер выделений; • положительный аминотест. Окончательное установление диагноза БВ возможно только на основании данных о состоянии микрофлоры влагалища. Комплексная диагностика состояния вагинальной микрофлоры, основанная на сочетании цитологического исследования и ПЦР анализа позволяет выявить изменения вагинальной микрофлоры, характерные для БВ: • резкое снижение количества или отсутствие лактобактерий; • увеличение количества G. vaginalis, грамотрицательных анаэробных бактерий — Mobiluncus curtissi, Bacteroides spp., а также M. hominis и U. urealyticum; • наличие «ключевых» клеток при цитологическом исследовании урогенитального мазка и наличие или отсутствие лейкоцитарной реакции. 3.4.2. Лактобактерии (Lactobacillus spp.) Лактобактерии (Lactobacillus spp.) занимают ведущее место в вагинальном микробиоценозе (80-90%) (в норме 106-109 КОЕ/мл). Колонизируя слизистую влагалища, лактобактерии участвуют в формировании экологического барьера и обеспечивают тем самым резистентность вагинального биотопа, препятствуя инвазии патогенных микроорганизмов. Нарушение нормальной микрофлоры влагалища приводит к резкому снижению титра лактобактерии или полному их исчезновению. Происходит замещение лактофлоры G. vaginalis и условно-патогенной анаэробной флорой, в первую очередь 13


представителями семейства Bacteroides, Mobiluncus, M. hominis и U. urealyticum. Выявление лактофлоры методом ПЦР позволяет оценить состояние вагинального микробиоценоза, используя принцип доказательной медицины. К примеру, выявление лактофлоры на фоне отсутствия представителей условно-патогенной флоры свидетельствует о нормальном состоянии вагинального биотопа. При обнаружении как лактобактерии, так и какого-либо другого микроорганизма можно предположить переходное состояние, тогда как отсутствие лактофлоры свидетельствует о серьезных нарушениях состояния микробиоценоза влагалища — бактериальный вагиноз или вагинит Преимущества полуколичественного определения лактобактерий методом ПЦР: 1. Быстрота получения результатов. 2. Возможность проведения комплексной диагностики (из одной пробы определяется большой спектр микроорганизмов). Чувствительность тест-системы адекватна выявлению лактобактерий в титре 106 КОЕ/мл. 3.4.3. Материал для исследования • мазок из заднего и бокового сводов влагалища (п. 2.3.). Не рекомендуется взятие мазков из цервикального канала или уретры, поскольку их микрофлора не идентична и не может характеризовать БВ, хотя и несет определенную информацию о наличии воспалительного процесса. 3.4.4. Интерпретация результатов Алгоритм интерпретации результатов комплексного лабораторного исследования биотопов влагалища представлен в таблице 1. 3.5.

Гонорея 3.5.1. Краткая информация о возбудителе Возбудителем гонореи является Neisseria gonorrhoeae — грамотрицательный диплококк, имеющий форму кофейных зёрен, обращённых своей вогнутой поверхностью друг к другу. Гонококки имеют хорошо выраженные трёхслойную наружную стенку и цитоплазматическую мембрану, цитоплазму с рибосомами и ядерной вакуолью. Гонококки обычно располагаются внутриклеточно в протоплазме лейкоцитов, обычно группами, но иногда можно видеть и внеклеточных гонококков. Исследования гонококков в последние годы указывают на изменения их биологических свойств (наличие капсул, фагосом, Р-лактамазы, снижение чувствительности к антибиотикам, появление L-форм). Гонококки поражают слизистые оболочки, в частности мочеиспускательного канала, влагалища, прямой кишки, полостей рта, носа, гортани. Процесс может распространяться на предстательную железу, семенные пузырьки, придатки яичек, яичко, семявыносящие протоки, а у женщин — на матку, яичники, маточные 14


15

Эпителиальных клеток соответственно фазе МЦ; доминирование лактобактерий, отсутствие грамотрицательной флоры.

Лейкоциты — в небольшом количестве; полное отсутствие в исследуемом материале микрофлоры при неизменных эпителиоцитах. «Kлючевые» клетки единичные в поле зрения; умеренный лейкоцитоз (15Y25 лейкоцитов в поле зрения); возрастание количества сопутствующей грамвариабельной полиморфной бактериальной флоры. Лейкоциты в умеренном количестве; присутствие бактериальной флоры в виде монокультуры или в различных морфоY и видовых сочетаниях. Большое количество лейкоцитов, макрофагов, эпителиальных клеток, выраженный фагоцитоз, морфологический пейзаж воспалительного процесса на фоне полного отсутствия лактобактерий и отсутствии явно выраженного этиотропного возбудителя.

Lactobacillus spp (Y) <106 Gardnerella vaginalis (Y) Mycoplasma hominis (Y) Ureaplasma urealyticum (Y) Moblluncus curtisii (Y) Bacteroides spp (Y)

Lactobecillus spp (Y) <106 Gardnerella vaglnalls (Y) Mycoplasma hominis чаще (+) Ureaplasma urealyticum.. чаще (+) Moblluncus curtlsil (+) или (Y) Bacteroides spp.(+) или (Y)

Lactobacillus spp (Y) <106 Gardnerella vaginalis (+) Mycoplasma hominis (+) Ureaplasma urealyticum (+) Moblluncus curtisii (+) Bacteroides spp (+)

Lactobacillus spp (Y) <106 Gardnerella vaginalis (Y) Mycoplasma hominis (Y) Ureaplasma urealyticum (Y) Moblluncus curtisii (Y) Bacteroides spp (Y)

Результат микроскопического исследования мазка

Lactobacillus spp (+) >106 Gardnerella vaginalis (Y) Mycoplasma hominis (Y) Ureaplasma urealyticum (Y) Moblluncus curtlsil (Y) Bacteroides spp (Y)

Результат ПЦРYисследования

При выявлении ИППП — СПЕЦИФИЧЕСKИЙ ВАГИНИТ

НЕСПЕЦИФИЧЕСKИЙ ВАГИНИТ

ДЕKОМПЕНСИРОВАННЫЙ БАKТЕРИАЛЬНЫЙ ВАГИНОЗ

СУБKОМПЕНСИРОВАННЫЙ БАKТЕРИАЛЬНЫЙ ВАГИНОЗ

KОМПЕНСИРОВАННЫЙ БАKТЕРИАЛЬНЫЙ ВАГИНОЗ

НОРМОЦЕНОЗ

Заключение

Норма.

Рекомендации

Таблица 1

Проведение дополнительного микробиологического исследования на наличие возбудителя (посев с выделением чистой культуры с определением чувствительности к антибиотикам), ПЦРYиследование.

Этиотропное лечение (антибактериальная терапия, направленная в основном против анаэробной флоры).

Заместительная терапия (местное лечение лактобактерином).

Наблюдение, повторное исследование через 1Y2 месяца.

Комплексное лабораторное исследование состояния биотопа влагалища.


трубы. Распространяясь по кровяному руслу, гонококки могут иногда вызывать гонококковый сепсис и метастазы в различные органы. При гонококковой бактериемии поражаются суставы, глаза, плевра, эндокард, мышцы, кости, нервы. У новорождённых поражаются глаза, развиваются конъюнктивит, кератит. 3.5.2. Материал для исследования При подозрении на наличие гонококковой инфекции исследуют: • отделяемое мочеиспускательного канала (п. 2.1.); • мазок из цервикального канала (п. 2.2.); • мазок из носоглотки (п. 2.8.); • парауретральных протоков; • большой железы преддверия влагалища; • стенок влагалища (п. 2.3.); • секрет предстательной железы (п. 2.4.); • семенных пузырьков, желез и лакун мочеиспускательного канала; • мочу (п. 2.5.); • промывные воды прямой кишки; • отделяемого с конъюнктивы глаза (п. 2.6.). 3.6.

Вирус папилломы человека 3.6.1. Краткая информация о возбудителе Вирусы папилломы человека (ВПЧ) считаются агентами, отвечающими за предраковые поражения гениталий и плоскоклеточный рак у мужчин и женщин. Папилломавирусы видоспецифичны и тканеспецифичны. У человека описано более 60 различных папилломавирусов [De Villiers E. M., 1989]. Они поражают только поверхностный эпителий кожи и слизистых. Большинство бородавок, вызванных ВПЧ, спонтанно регрессирует, но при некоторых поражениях, особенно плоского эпителия, наблюдается озлокачествление. Принято с достаточной достоверностью, что ВПЧ ответственен за развитие остроконечных кондилом и что он связан с развитием плоской кондиломы шейки матки и с цервикальной интраэпителиальной неоплазией. Различные типы ВПЧ связаны с различными видами поражений. Типы вирусов папилломы человека и вызываемые ими болезни представлены ниже [R. C. Reichman, 1987]. Тип вируса 1 2 3, 10, 28, 29 4 5,8-9, 12, 14-15, 17, 19-25, 36, 39, 40 6, 11 16

Болезни Подошвенные и ладонные бородавки Обыкновенные бородавки Плоские бородавки Подошвенные и обыкновенные бородавки Бородавчатая эпидермодисплазия Остроконечные кондиломы (генитальные


7 13, 32 16, 18

31, 33, 35 30, 45, 51, 56 26, 27 34, 37, 38

бородавки), неоплазия шейки матки, папилломатоз гортани Обычные бородавки у людей, контактирующих с мясом и животными Фокальная гиперплазия эпителия (болезнь Хека) Плоскоклеточное интраэпителиальное поражение, инвазивный рак. 99,7 % раков шейки матки ассоциировано с этими типами ВПЧ Генитальная дисплазия и карциномы Редкие формы рака, плоскоклеточные поражения полового члена Бородавки больных с ослабленным иммунитетом Отдельные случаи доброкачественных и злокачественных новообразований

Очень много данных свидетельствуют о возможной роли ВПЧ-инфекции в развитии рака у человека. Папилломавирусы чрезвычайно широко распространены и эпителиотропны. Это очень важно, так как известно, что большинство раковых опухолей человека представляют собой злокачественные образования, состоящие из эпителиальных клеток. В течение последних 10 лет установлено, что инфекция, вызванная ВПЧ, связана с развитием предраковых поражений половых органов — внутриэпителиальных неоплазий шейки матки, вульвы, влагалища, ануса, полового члена, а также плоскоклеточного рака. Описаны различные пути, объясняющие генез карциномы из вирусных папиллом шейки матки. ВПЧ инфекция очень распространена в общей популяции. При обследовании женщин студенческого возраста у 26% ВПЧ обнаружен при первичном приеме и у 46% — в последующие 3 года наблюдения. У женщин с нормальной кольпоцитологией ВПЧ выявляются в 10-25% случаев (как правило, неонкогенные типы). При измененной кольпоскопической картине и кольпоцитологии доля женщин, инфицированных онкогенными типами, достигает 32-47%. 3.6.2. Материал для исследования Материал для исследования оптимально брать при кольпоскопии с пораженных участков шейки матки и цервикального канала (п.2.2.). Допускается взятие материала без кольпоскопии из цервикального канала и уретры у женщин, и уретры и головки полового члена у мужчин.

17


4. ПЦР в клинической практике: диагностика вирусных гепатитов Для специальностей: гастроэнтерология, гепатология, инфекционные болезни 4.1.

Вирусный гепатит В 4.1.1. Краткая информации о возбудителе. Вирус гепатита В (HBV) является ДНК-содержащим вирусом, в ряду вирусных гепатитов был открыт одним из первых. Наличие четких серологических маркеров и наличие у вируса поверхностной частицы — HBsAg — существенно облегчает его диагностику. При гепатите В может происходить развитие хронического гепатита, цирроза и первичного рака печени. Кроме того, с наличием бессимптомного носительства вируса связаны трудности борьбы с этой инфекцией. О вирусоносительстве судят по обнаружению HBsAg. По данным ВОЗ, в мире проживает более 300 млн носителей вируса, из которых около 5 млн россиян. Одна из особенностей вируса гепатита В — чрезвычайно высокая инфекционность. Лабораторная диагностика острого и хронического гепатита В включает в себя определение нескольких серологических маркёров инфицирования вирусом гепатита В: HBsAg, ДНК HBV (ПЦР-исследование), HBeAg, IgM анти-НВс, антиНВс, анти-НВе и анти-HBs. Последовательное их появление и исчезновение при остром, и хроническом гепатите В позволяет судить о характере инфекционного процесса и активной репликации вируса. Длительное время считали, что только при наличии IgM анти-НВс и HBeAg имеет место активная репликация вируса гепатита В. Тестирование ДНК HBV, которое можно осуществить при помощи ПЦРисследований, выявило наличие в сыворотках крови HBsAg без HBeAg, или даже с анти-НВе-позитивной реакцией, свидетельствующей об активной репликации вируса. Секвенирование этой ДНК позволило установить существование мутантных форм вируса гепатита В, обозначенных как Pre-Core мутанты. Заболевание, обусловленное этой формой HBV, протекает тяжелее, быстро переходит в цирроз и дает худшие результаты интерферонотерапии. 4.1.2. Материал для исследования • сыворотка крови (п. 2.11.). 4.2.

Вирусный гепатит С 4.2.1. Краткая информация о возбудителе С открытием в 1989 г. вируса гепатита С (HCV) началось интенсивное изучение HCV-инфекции, являющейся основной причиной развития хронических диффузных заболеваний печени и гепатоцеллюлярной карциномы. Хроническая инфекция вируса гепатита С представляет серьезную проблему для здравоохранения во всем мире. Распространенность ее в популяции колеблется от 0.5-1% 18


(Северная Европа, Бельгия) до 4-10% (Африка, Ближний Восток, Восточная Европа, Азия). Отличительной особенностью вируса гепатита С является способность к длительной персистенции в организме, что обусловливает высокий уровень хронизации инфекции — в 50-80% случаев. Генотипы HCV имеют важное биологическое значение: их гетерогенность может определять тяжесть течения гепатита. Гетерогенность генотипов создает трудности при разработке диагностических тест-систем и профилактических вакцин. В настоящее время известно 6 основных генотипов HCV и более 80 субтипов. В разных регионах мира распределение генотипов неравномерно: в Северной Америке превалирует генотип 1а, в Северной и Центральной Европе чаще встречаются 1b, 2а, на Ближнем и Среднем Востоке — 3а. В ряде исследований показано, что генотип 1b сочетается с более высоким уровнем виремии и низким ответом на лечение α-интерфероном. Образующиеся вируснейтрализующие антитела являются высокоспецифичными и не способны нейтрализовать вновь появляющиеся вирусные варианты, что ��акже создает условия для «иммунологического ускользания» и не исключает возможности повторного инфицирования. В патогенезе поражения органов при HCV-инфекции обсуждаются прямой цитопатический эффект вируса и вызванные им иммунологические реакции, обусловливающие повреждение печени и других органов и тканей; репликация вируса вне печени — в тканях лимфоидного и нелимфоидного происхождения. Размножение вируса в иммунокомпетентных клетках (лимфоцитах) приводит к нарушению их иммунологической функции. Для диагностики HCV-инфекции используются иммуноферментный метод (ELISA) для определения антител и ПЦР. Использование ПЦР позволяет подтвердить HCV инфекцию в спорных случаях и при отсутствии антител к HCV, встречающемся в 10% случаев, в том числе при алкогольной болезни печени, у лиц, получающих иммуносупрессивную терапию или имеющих криоглобулинемию. Большое значение этот метод имеет для ранней диагностики ОВГС и HCV-инфекции у доноров, для контроля за перинатальной передачей вируса, определения показаний к противовирусной терапии и оценки ее эффективности. 4.2.2. Материал для исследования • сыворотка крови (п. 2.11.). 4.3.

Вирусный гепатит D 4.3.1. Краткая характеристика возбудителя: Вирус гепатита D (HDV, произносится как «дельта») относится к РНК-содержащим вирусам. Заражение дельта гепатитом возможно только при наличии вируса гепатита В (точнее, его поверхностной частицы — HBsAg). Это определяет 19


две основных формы инфицирования дельта вирусом: коинфицирование — одновременное заражение HDV и HBV; и суперинфицирование — заражение HDV носителя HBV («бессимптомного» носителя HBsAg или больного хроническим гепатитом В). Так же, как и при других вирусных гепатитах, большое значение для постановки диагноза и контроля заболевания имеют диагностические маркёры инфицирования. К ним относят: дельта-антиген, антитела к дельта-антигену классов IgM и IgG, тестируемые в ИФА, а также РНК HDV (определяется ПЦР). HDV может ассоциироваться с широким спектром клинических проявлений заболевания, от бессимптомного носительства до фульминантного гепатита и цирроза печени. 4.3.2. Материал для исследования • сыворотка крови (п. 2.11.). 4.4.

Вирусный гепатит G 4.4.1. Краткая характеристика возбудителя Вслед за открытием вирусов гепатитов А и В последовала идентификация возбудителей гепатитов С, D и Е. Наличие случаев заболевания, при которых не удается выявить маркеры инфицирования этими вирусами, позволило предположить существование еще нескольких вирусных гепатитов. Открытие вирусов, ответственных за развитие гепатита G, и разработка методов их выявления и тестирования маркеров инфицирования вызвали интенсивное накопление фактических данных. Дальнейший прогресс в исследовании гепатита G стал возможен лишь после разработки в 1993 г. новых молекулярно-биологических методов, т. е. ПЦР-исследований, позволяющих целенаправленно идентифицировать новые вирусы. Вирус гепатита G (HGV), так же, как и НСV, относят к семейству Flaviviridae. Геном вируса представлен одноцепочечной РНК. По своей организации геном HGV подобен РНК HCV. Основным маркером, применяемым для диагностики и изучения эпидемиологии гепатита G, является выявление РНК вируса гепатита G методом ПЦР. В отличие от гепатита С, выявление антител при гепатите G не может быть использовано для поиска вирусоносителей, а пригодно для регистрации уже прошедшей инфекции и проведения эпидемиологических исследований для оценки распространения инфекции в различных группах населения. Несмотря на пристальный интерес к проблеме гепатита G, количество работ, посвященных изучению клинических проявлений этой инфекции, ограничено. Вероятнее всего, это можно объяснить редким выявлением случаев моноинфекцнн гепатита G. Так, при анализе структуры заболеваемости острыми вирусными гепатитами в США (1982-95 гг.) из 10533 заболевших у 322 (3%) зарегистрирован острый гепатит ни А, ни Е. При исследовании на наличие РНК HGV 45 таких больных позитивный результат отмечен у 4 (9%). 20


Острый гепатит G протекает в клинически выраженной и бессимптомной форме. В качестве общей клинической характеристики могут рассматриваться умеренные показатели активности сывороточных трансаминаз. Исходами острого гепатита G могут быть: • выздоровление с элиминацией РНК HCV и появлением антител; • формирование хронического гепатита с длительным выявлением РНК HCV; • персистирующая форма гепатита G; • формирование длительного носительства HGV. Морфологические показатели хронического гепатита G очень схожи с изменениями, описанными для гепатита С. К гепатиту G может быть отнесено определение, данное доктором Weisiger — «клинически молчаливая инфекция». Различия биохимических показателей у пациентов с хроническим гепатитом в зависимости от наличия РНК HGV были зарегистрированы Соlombatto с соавт. При позитивной реакции на наличие вируса отмечалось более чем двукратное повышение активности γ-глутамилтрансферазы и щелочной фосфатазы. Эти данные позволили предположить, что увеличение активности холестатических энзимов, свидетельствующее о преимущественном поражении желчевыводящих протоков, может стать специфическим маркером гепатита G. Коинфекция вируса гепатита G с вирусами гепатита В, С и D выявляется значительно чаще, чем моноинфекция. Определение РНК HGV среди больных острым гепатитом В и С находится на уровне до 24.5% и 37.0% соответственно, а хроническим гепатитом B и С — 9.7-16.7%. Высокая частота выявления РHК HGV зарегистрирована среди больных хроническим гепатитом D — 39.9%. 4.4.2. Материал для исследования • сыворотка крови (п. 2.11.). 4.5.

Вирусный гепатит TTV 4.5.1. Краткая информация о возбудителе Новый вирус гепатита был обнаружен в 1997 г. в сыворотке пациента с инициалами Т. Т., страдавшего гепатитом неизвестной этиологии. Инициалы пациента определили название — вирус ТТ (ТТV). В дальнейшем это сокращение обрело второй смысл — вирус гепатита, передающийся с трансфузиями — Transfused Transmitted Virus (TTV). TTV относится к ДНК-содержащим вирусам (однонитевая спиральная круговая ДНК, около 3800 нуклеотидов) и, по-видимому, является членом нового семейства вирусов гепатита — Circinoviridae. Проведены обширные исследования по выявлению TTV у пациентов с заболеваниями печени, особенно неизвестной этиологии. ТТ-виремия обнаружена при фульминантной форме гепатита, хроническом активном гепатите и циррозе 21


неизвестной этиологии. У 15% больных криптогенным циррозом печени, 27% больных идиопатической фульминантной печеночной недостаточностью, у 19% пациентов, ожидающих ортотопической трансплантации печени, также находят TTV. Разноречивы данные о связи TTV с гепатоцеллюлярной карциномой. Т. Yamamoto и соавт. выявили TTV у 20 неинфицированных вирусами гепатита В и С пациентов с гепатоцеллюлярной карциномой, однако отсутствие интеграции ДНК вируса и ДНК гепатоцита авторы считают доказательством неканцерогенности TTV. При обследовании категорий населения, относящихся к группам риска (наркоманы, проститутки, гомосексуалисты), не выявлено преобладания вируса TTV (4,5-13%) по сравнению с популяционной. Хотя в эксперименте (шимпанзе) при внутривенном введении TTV развивается виремия, полагают, что распространение вируса половым путем и при внутривенном введении наркотиков не является преобладающим. Первоначально вирус был определен как гемотрансмиссивный. Однако выявление широкого бессимптомного носительства у здоровых людей, никогда не получавших трансфузий крови, и у детей поставило под сомнение исключительность парентерального пути передачи инфекции. Установлено, что вирус экскретируется желчью, выделяется из желудочно-кишечного тракта и передается фекально-оральным путем. С другой стороны, относительно низкая встречаемость TTV-инфекции в группах риска свидетельствует, что половой и инъекционный пути передачи не являются основными. ДНК TTV выявляют с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). Помимо циркулирующей в плазме крови, ДНК TTV выявлена также и в лейкоцитах. Т. Kanda и соавт. обнаружили, что 60% лиц, перенесших трансплантацию костного мозга, инфицированы TTV, тогда как среди доноров костного мозга TTV-позитивны лишь 10%. Полагают, что TTV реплицируется в основном в гемопоэтических клетках и не является причиной повреждения гепатоцитов. Даже при высоком уровне трансаминаз крови не всегда удается обнаружить повреждения ткани печени при моно-TTV-инфекции. Выделено 6 генотипов (G1…6) вируса гепатита TTV, при этом не определено каких-либо географических различий между генотипами вируса. Наиболее распространены генотипы G1-3. Генотип G1а и G2а чаще встречается при заболеваниях печени. По предварительным данным, разрушение TTV происходит при пастеризации в течение 10 ч при 60°С, и TTV обнаруживается лишь у 0,5% больных гемофилией, получающих только термически обработанные концентраты факторов свертывания. Предстоит уточнить, насколько эффективны методы обеззараживания гемокомпонентов в отношении TTV. 4.5.2. Материал для исследования • сыворотка крови (п. 2.11.).

22


5. ПЦР в клинической практике: диагностика хеликобактерной инфекции Для специальности: гастроэнтерология 5.1.

Краткая характеристика возбудителя Helicobacter pylori (HP) — грамотрицательная скрученная S-образная бактерия. Одна из главных микробиологических характеристик Н. pylori — ее способность производить большое количество уреазы. Данный микроорганизм существует под слоем желудочной слизи, где он защищен от кислой среды, создаваемой желудочным соком. Н. pylori играет важную роль в патогенезе гастрита и других заболеваний пищеварительной системы. В настоящее время является общепризнанным, что большинство случаев эрозивных гастритов и язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки связано с хеликобактерной инфекцией. Этот микроорганизм может повреждать эпителиальные клетки, вызывая воспалительные процессы, что при отсутствии соответствующего лечения способствует развитию хронического атрофического гастрита. У большинства больных в процесс вовлекается антральный отдел и тело желудка, постепенно развиваются атрофия желез, фиброзирование и кишечная метаплазия. Аутоиммунный механизм развития гастрита также инициируется геликобактерной инфекцией. Н. pylori была обнаружена в 95-100% случаев гастрита типа В и в 90-95% случаев язвы двенадцатиперстной кишки. Кроме того, установлено, что Helicobacter pylori является основным фактором риска развития лимфомы и рака желудка. Этот микроорганизм не является облигатным патогеном, то есть инфицирование далеко не всегда сопровождается развитием клинически выраженного заболевания. Основными путями передачи инфекции являются оро-оральный и фекально-оральный. Особое внимание уделяется оро-оральному пути передачи, поскольку хеликобактер прекрасно выживает и размножается в зубодесневых карманах полости рта инфицированных людей. Накоплены достаточно надёжные данные о распространении инфекции НP среди населения земного шара. Установлено, что интенсивность эпидемического процесса определяется общим социальным и гигиеническим уровнем населения. В развивающихся странах уже к 20-летнему возрасту инфицированность населения НР может достигать 90%, а в высокоразвитых она, как правило, не превышает 30-50%. Исследования последних лет показали, что развитие гастрита и язвы желудка связано, в первую очередь, с колонизацией слизистой оболочки токсикогенными штаммами Н. pylori, в то время как колонизация нетоксикогенными штаммами только в небольшом проценте случаев приводит к развитию заболеваний. Токсикогенность штаммов обусловлена продукцией вакуолярного цитотоксина, синтез которого связан с продукцией белка с молекулярной массой 120000128000, кодируемого геном CagA (Cytotoxin associated gene А). 23


Для определения наличия НР в организме обследуемых лиц разработано большое число инвазивных и неинвазивных методов. Из инвазивных методов диагностики чаще всего применяются быстрый уреазный тест, морфологический и бактериологический методы, фазово-контрастная эндоскопия; из неинвазивных — ряд дыхательных тестов на уреазу и серологические методы, в которых определяют специфические к НР антитела, относящиеся к иммуноглобулинам классов A, G и М. Простое определение антител в сыворотке крови не дает информации о том, что она вызвана наличием токсикогенных штаммов бактерий, поэтому принято определять количественно антитела к белку цитотоксичности. ПЦР-диагностика, безусловно, играет важную роль в быстрой идентификации цитотоксических штаммов H. pylori. Для диагностики можно использовать как биопсийный материал, так и мазки из зубодесневых карманов, что делает эту диагностику уникальной. Однако в настоящее время нет ещё единого мнения о том, сочетание каких методов выявления НР является оптимальным для диагностики вызываемой ею инфекции. 5.2.

Материал для исследования В качестве материала удобнее всего брать мазки из зубодесневых карманов, реже берут слюну. Если есть возможность — для диагностики берут биоптат из антрального отдела желудка. При контроле за эффективностью терапии берут биоптаты из тела желудка не ранее чем через 4 недели после окончания курса эрадикационной терапии.

24


6. ПЦР в клинической практике: диагностика внутриутробных инфекций Для специальностей: педиатрия, неонатология Цитируется по: «Диагностика внутриутробных инфекций у новорожденных детей методом полимеразной цепной реакции». Методические рекомендации для врачей. / Под ред. А. П. Помогаевой. — Томск, Новосибирск. — 2001. — 38 с. Верификация возбудителей инфекционных заболеваний в педиатрической практике определяет тактику лечения пациента. Представление о некоторых видах бактерий как о непатогенных недопустимо, когда речь идет о плоде или новорожденном (Дэвис П. А., Готефорс Л. А., 1987). Наиболее распространены среди патогенов, вызывающих развитие внутриутробных инфекций у новорожденных детей, вирус простого герпеса (ВПГ), цитомегаловирус (ЦМВ), вирус гепатита В (ВГВ), а также возбудителей хламидиоза (Chlamydia trachomatis), микоплазмоза (Mycoplasma hominis) и уреаплазмоза (Ureaplasта urealyticum). 6.1.

Диагностическое значение выявления ДНК вируса простого герпеса в неонатальном периоде Герпес является самой распространенной хронической вирусной инфекцией человека, существующей в организме преимущественно в латентной форме и протекающей у беременных женщин в бессимптомной форме. Из семейства герпесвирусов патогенными для человека являются вирусы простого герпеса типов 1 и 2, а также вирусы герпеса 3 (вирус ветряной оспы — герпес зостер), 4 (вирус Эпштейна-Барр) и 5 (вирус цитомегалии). Наибольшее значение по распространенности и тяжести вызываемых ими поражений имеют вирусы простого герпеса. Фактическая частота неонатального герпеса остается неясной, от показатели смертности детей при герпетическом поражении в этом возрастном периоде очень высоки. Возможно трансплацентарное проникновение ВПГ в организм плода. Внутриутробный герпес часто сопровождается рождением недоношенного ребенка, при этом ВПГ обычно вызывает клинически выраженное заболевание новорожденных. По клиническим проявлениям выделяют диссеминированную (генерализованную) и локализованную (кожную, глазную, оральную, энцефалитическую, с поражением печени) формы герпеса. Кроме этого, поражение кожи при внутриутробном герпесе может проявляться в виде буллезного эпидермолиза. У доношенных детей, выделяющих ДНК ВПГ из крови, при рождении отмечается синдром нарушенной адаптации, хроническая внутриутробная гипоксия плода, аспирация околоплодных вод. Ухудшение состояния происходит в течение первых-вторых суток жизни и сопровождается развитием СДР, ранним по25


явлением желтухи (до II-III степени), умеренной гепатомегалией, развитием симптомов интоксикации и нарушениями гемоликвородинамики. Впоследствии развивается пневмония со среднетяжелым или тяжелым течением. У недоношенных детей, выделяющих ДНК ВПГ из крови, состояние при рождении тяжелое или очень тяжелое. В клинической картине преобладают выраженный СДР, нередко требующий проведения искусственной вентиляции легких, желтуха, изменения со стороны нервной системы, проявляющееся в повышенной возбудимости, отказе от еды, судорогах, гипертензионно-гидроцефальном синдроме. В дальнейшем у таких детей могут отмечаться тяжелая энцефалопатия с развитием микроцефалии или гидроцефалии, отставание в психическом развитии и явления детского церебрального паралича. Сочетанная детекция ВПГ и ЦМВ клинически проявляется в раннем неонатальном периоде развитием двусторонней пневмонии, но течение заболевания носит затяжной, вяло текущий характер. Нередко родители обращаются к врачу после 1 месяца жизни с жалобами на длительно текущую желтуху, срыгивания, недостаточную прибавку в весе. Сочетание ВПГ и ЦМВ представляет собой пример развития сочетанных инфекций, когда один из возбудителей препятствуют развитию другого. Манифестация инфекционного процесса может произойти при присоединении бактериальной инфекции. 6.2.

Диагностическое значение выявления ДНК цитомегаловируса в неонатальном периоде ЦМВ наиболее часто вызывает перинатальную вирусную инфекцию и встречается приблизительно у 1% всех инфицированных внутриутробно новорожденных (Adler S. P., 1992). Наиболее тяжелыми отдаленными последствиями ЦМВИ являются врожденные пороки развития, глухота и умственная отсталость, а также развитие хронических заболеваний легких. Вирус переносится при тесном контакте с инфицированными выделениями, а также трансплацентарно, через половые контакты, при переливании крови и пересадке органов. ЦМВ имеет широкое распространение в популяции: антитела к вирусу обнаруживаются у 50-85% людей (Raynor B. D., 1993). Подобно ВПГ, ЦМВ способен реактивироваться и вызывать рецидив инфекции. ЦМВ может проходить через плаценту в любой период беременности. Первичное инфицирование матери во время беременности вызывает наиболее тяжелое течение врожденной ЦМВИ. Врожденная инфекция, вызванная рецидивом заболевания, протекает менее тяжело, но приблизительно у 10% детей развиваются поздние осложнения. Популяционный скрининг беременных не дает желаемых результатов в диагностике ЦМВИ, так как современные лабораторные методы не дифференцируют первичную и вторичную инфекции. Беременность может быть фактором риска для реактивации латентн��й ЦМВИ. Серонегативные беременные женщины имеют высокий риск развития первичной ЦМВИ с последующим внутриутробным инфицированием плода. Да26


же если имеются антитела к ЦМВ, это не предотвращает развития внутриутробной инфекции. Инфицирование в первом триместре беременности ассоциируется с врожденными аномалиями центральной нервной системы и чувствительных нервов. Инфекция новорожденных может развиваться при непосредственной контаминации в материнских родовых путях и при инфицировании через грудное молоко. Возможно инфицирование новорожденных ЦМВ при переливании крови или использовании донорского молока. Внутриутробная ЦМВИ проявляется мультисистемным поражением, вызывающим значительную тяжесть заболевания и смертность. Клиническое обследование наиболее часто выявляет петехии, гепато- и спленомегалию, пневмонию и неврологические нарушения с дальнейшей задержкой психомоторного развития. Часто появляются интракраниальные кальцификаты, гипоплазия мозжечка, перивентрикулярная лейкомаляция, внутрижелудочковые кровоизлияния, гидроцефалия, порэнцефалические кисты, микроцефалия. Для лабораторных показателей характерно увеличение активности трансфераз, конъюгированная гипербилирубинемия и тромбоцитопения. Белок в спинномозговой жидкости повышен, что ассоциируется с поражением нервной системы и потерей слуха. Одновременное выделение ДНК ЦМВ из крови и мочи сопровождается особенно тяжелым течением заболевания с цианозом кожных покровов, СДР, желтухой и гепатоспленомегалией, поражением центральной нервной системы. При выявлении ДНК ЦМВ только в крови или только в моче состояние детей расценивается как средней степени тяжести, клинические симптомы аналогичны описанным выше, течение заболевания характеризуется монотонностью и торпидностью к проводимой терапии. При развитии клинической картины ЦМВИ у новорожденных детей не следует исключать вероятность постнатального инфицирования, особенно при отсроченной реализации инфекции или одновременном течении соматического заболевания. ЦМВИ часто комбинируется с другими бактериальными и вирусными заболеваниями. В частности, сочетание ЦМВИ и хламидийной инфекции проявляется рождением недоношенного ребенка, вялым течением пневмонии и желтухой II-III ст., сохраняющейся в течение первого месяца жизни. При одновременном выделении ДНК ЦМВ и микоплазмы состояние может оставаться средней степени тяжести и не требует длительного пребывания ребенка в стационаре. В клинической картине преобладают пневмония и перинатальная энцефалопатия. 6.3.

Диагностическое значение выявления ДНК хламидий в неонатальном периоде Chlamydia, подобно вирусам, являются облигатными внутриклеточными паразитами, их выживание зависит от внутриклеточного роста и размножения, а их 27


жизнедеятельность может протекать в любых клетках организма-хозяина. Chlamydia представляют собой неподвижный грамотрицательный организм и занимают промежуточное место между бактериями и вирусами. Из трех видов возбудителей, относящихся к роду Chlamydia, C. trachomatis передается половым путем и вызывает заболевания новорожденных. Хламидиоз занимает ведущее место среди урогенитальных инфекций и характеризуется широкой распространенностью, субъективно асимптомным течением, многоочаговостью поражения, склонностью к диссеминированию. Вероятность передачи хламидийной инфекции ребенку от больной матери составляет 40-70%. Принято считать, что клинически у новорожденных заболевание проявляется в виде конъюнктивитов, назофарингитов, бронхитов, пневмонии, гастроэнтеритов, проктитов, вульвитов, уретритов, а также менингитов, миокардитов и реактивных артритов. При детекции ДНК хламидий заболевание часто сопровождается быстрым развитием СДР на фоне мекониальной аспирации, что можно объяснить не только химическим характером поражения респираторной ткани загрязненными околоплодными водами, но и большим количеством возбудителя, проникшем непосредственно в легкие новорожденного ребенка. У детей, аспирировавших околоплодные воды, и у недоношенных новорожденных дыхательные расстройства в клинической картине заболевания выступают на первый план: одышка, участие вспомогательной мускулатуры в акте дыхания, мелкопузырчатые хрипы в легких. У наименее зрелых недоношенных детей заболевание протекает по типу СДР, требующего оксигенотерапии. Течение заболевания осложняется длительным сохранением фетальных шунтов и нарастанием сердечно-легочной недостаточности. В настоящее время признана роль С. trachomatis в развитии неонатальной пневмонии. Приобретение этого микроорганизма происходит во время прохождения плода через родовые пути. Позднее развитие пневмонии, вызванной C. trachomatis, может быть связано с относительно низкой вирулентностью. Отмечены случаи развития хламидийного конъюнктивита у новорожденных, извлеченных путем кесарева сечения, что свидетельствует о возможной трансмембранной или трансплацентарной передаче инфекции. Инфекция, вызванная C. trachomatis, сопровождается развитием затяжной пневмонии с выраженной дыхательной недостаточностью (до III ст.), нарушениями гемоликвородинамики, желтушным окрашиванием кожных покровов. В случаях проведения ИВЛ для ПЦР-диагностики могут использоваться трахеобронхиальные аспираты. Наличие ДНК C. trachomatis в трахеобронхиальных аспиратах отражает развитие пневмонии. Характерно течение двусторонней пневмонии и перинатального поражения центральной нервной системы, гнойного конъюнктивита, кардиопатии, реже фетального гепатита. 28


Диагноз хламидийной инфекции не всегда устанавливается своевременно, что приводит к неадекватной терапии и формированию персистирующей или латентной инфекции, способствующей развитию вторичного иммунодефицита и аутоиммунных заболеваний. По данным литературы известно, что латентное течение хламидийной инфекции у ребенка не исключает возможность продуктивной репродукции хламидий в клетках и тканях ЦНС и экстраневрально, следствием чего может явиться развитие астеновегетативного синдрома, судорожных и ликвородинамических нарушений. Для общего анализа крови характерны анемия, тромбоцитопения, лейкопения, эозинофилия, моноцитоз. Выделение ДНК C. trachomatis из мочи сопровождается протеинурией, лейкоцитурией, цилиндрурией, десквамацией почечного эпителия. При одновременном выявлении ДНК C. trachomatis и M. hominis течение беременности часто сопровождается угрозой прерывания в течение всего гестационного периода. В первую неделю жизни развивается двусторонняя мелкоочаговая пневмония, конъюгационная желтуха (II ст.), кардиопатия, перинатальное поражение центральной нервной системы. 6.4.

Диагностическое значение выявления ДНК микоплазм и уреаплазм в неонатальном периоде В последние годы в отечественной и зарубежной литературе появились сообщения о внутриутробной микоплазменной инфекции, которая чаще проявляется в виде пневмоний, но может носить и генерализованный характер. Существует связь инфицирования микоплазмами со спонтанными абортами, преждевременными родами, а также с малой массой тела детей при рождении. Микоплазмы широко распространены в природе и некоторые их виды патогенны для человека (M. pneumoniae, M. hominis, Ureaplasma urealyticum). Микоплазмы не окрашиваются по Граму, окрашиваются по Гимзе и характеризуются выраженным полиморфизмом (кокки, палочки, нитевидные формы). U. urealyticum представляет собой Т-группы штаммов микоплазм, образующих маленькие колонии в среде с добавлением мочевины. Диагностика микоплазм с использованием ПЦР позволяет установить этиологическое и патогенетическое значение микоплазм в патологии неонатального периода. Статистически выявлена значительная связь между уровнем колонизации U. urealyticum и M. hominis и преждевременными родами, а также дородовым (более 24 часов) излитием околоплодных вод. При этом несколько чаще колонизация отмечается у детей, перенесших эпизоды апноэ. В целом, внутриутробная инфекция микоплазменной этиологии характеризуется средне тяжелым течением с постепенным нарушением состояния ребенка и развитием СДР, вялотекущей пневмонии, гнойного конъюнктивита, реже — гнойного омфалита, желтушности кожных покровов, нарушений гемоликвородинамики различной степени выраженности, кардиопатией. 29


U. urealyticum признана важным потенциальным патогеном недоношенных новорожденных, рожденных через естественные родовые пути. В то же время указывается, что неонатальная колонизация не связана с низким гестационным возрастом, малым ростом и весом при рождении. Инфицирование беременных женщин U. urealyticum ассоциируется с неблагоприятным исходами беременности, такими как ранние выкидыши, мертворождение, недоношенность, неонатальная заболеваемость и смертность. Существуют следующие пути передачи U. urealyticum от матери к новорожденному ребенку: 1) внутриутробно трансплацентарно через материнскую кровь или вторично восходящим путем из родовых путей; 2) в родах при прохождении через родовые пути; 3) постнатально по горизонтальному пути, возможна нозокомиальная передача. Частота вертикальной передачи увеличив��ется при хориоамнионитах, особенно если U. urealyticum выделяется из амниотической жидкости. Инфекция, вызываемая U. urealyticum, играет важную роль в развитии ранней бронхолегочной дисплазии у недоношенных детей и других хронических заболеваний легких даже после лечения сурфактантом. U. urealyticum может вызвать неонатальную бактериемию, пневмонию и менингиты, а также остеомиелит. Клинически уреаплазменная пневмония у недоношенных часто сочетается с болезнью гиалиновых мембран, лейкопенией, тромбоцитопенией и развитием СДР. При сочетании ДНК U. urealyticum и M. hominis диагностику инфекционного процесса могут затруднять врожденные пороки развития. 6.5.

30

Материал для исследования В неонатологии для исследования на ВУИ рекомендуется исследовать: • сыворотку крови (п. 2.11); • мазок с задней стенки глотки (п. 2.7.); • слюна (п. 2.10.); • моча (п. 2.5.).


Ваши пациенты могут сдать или оплатить материал, взятый Вами для ПЦРHисследований в ООО «МДЦ ДНКHДиагностика»

НАШИ ПРОЦЕДУРНЫЕ КАБИНЕТЫ РАСПОЛОЖЕНЫ: 1. ул. Энтузиастов

ост. авт. № 39

ул. Солнечная поляна, 41 (пересечение ул. Солнечная Поляна и ул. Энтузиастов). Тел. 48Y41Y01. Проезд авт. №№ 1, 18, 39, 60; марш. такси № 54 до остановки «Детский сад».

дом 39

ул. Солнечная Поляна

дом 41

БМК ул. Кулагина, 10 (3 этаж)

пр. Калинина

пYка ГБ №5

2. ул. Кулагина (б. Полевая), 10 , поликлиника горбольницы № 5 (б. пYка РТП), 3 этаж. Проезд авт. №№ 2, 3, 21, 37; марш. такси №№ 42, 76; трам. №№ 3, 4.

ул. Кулагина (Полевая)

авт. №№ 2, 3, 21, 37

Мост

Дополнительную информацию вы можете получить по тел. 48Y41Y01


book