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專題報導 畜產生物科技

動物 基因轉殖

基因轉殖動物除可改進家畜生產性能及增強家畜抗病力外, 並可作為研究人類疾病、基因調控機制和 探討基因功能性的素材。將基因轉殖動物的產物如 乳汁純化,可以生產高價位的醫藥蛋白; 或者更進一步將基因轉殖動物作為生產人類所需 醫藥產品的工廠,或異種器官移植的器官來源。

■沈朋志


經由遺傳工程技術,透過人為方式,將外源遺傳基因殖入或將特定的基因組(去 氧核醣核酸,DNA)序列刪除或更改的動物,均稱基因轉殖動物。目前將外源基因轉 殖至動物染色體,以產製基因轉殖動物的方法有數種,包括原核顯微注射法、胚幹細 胞載體法、精子載體法、反轉錄病毒感染法及體細胞核轉置法等。其中以顯微注射法 應用最廣,而體細胞核轉置法最具研究發展潛力。

原核基因顯微注射法 自從一九八○年代起,以原核基因顯微注射法成功產製基因轉殖動物以來,經過 不斷地研究創新,證實此一方法不但有效且具穩定性,故已被廣泛應用。 使用原核基因顯微注射法的優點甚多,包括外源基因在宿主動物染色體上的整合 效率較高,且被轉殖的基因可保有其整套的序列。由此產生的基因轉殖動物,其所有 的組織和細胞中,被嵌入的外源基因仍可正常地經由生殖細胞系傳承給子代。 然而,應用顯微注射法亦有缺點,例如需具備嫻熟靈巧的顯微操作經驗。以豬胚 為例,豬胚因含有許多不透明的脂肪物質,需經遠心分離處理,並在顯微鏡下將胚旋 轉至適當角度,顯露其細胞核後才能注入基因,因此其顯微操作速度緩慢。更重要的 是外源基因注入胚原核後,係以隨機方式嵌入體基因組DNA中,是以原核顯微注射法 無法掌握基因嵌插情形。 具有純熟的顯微注射與胚移置技術的操作者,進行小鼠的基因顯微注射,其外源 基因整合成功的機率約為24∼31%。 極體

A

透明帶 原核

B

C

原核顯微注射法 將外源基因藉由微針注入受精卵的雄原核或雌原核中而完成。A:微針進入原 核,分別為雄原核及雌原核。B:將DNA溶液注入雄原核。C:將DNA溶液注入雌原核。


經感染後,再繼續其體外成熟及受精培養。體

反轉錄病毒感染法

外受精後的早期胚培養至囊胚期階段,再移置

此法的原理乃是利用反轉錄病毒具有感染

於受胚牛的子宮中,結果順利生下四頭小牛。

宿主細胞,並將其DNA嵌入細胞染色體DNA中

經分析證實四頭小牛均為基因轉殖動物,出生

的能力。當反轉錄病毒侵入細胞後,反轉錄病

動物的轉殖效率達100%。

毒的單股RNA鏈即反轉錄為雙股的DNA,進而 嵌入DNA中成為前驅病毒,前驅病毒可以整合

胚幹細胞法 胚幹細胞係源自囊胚期之內細胞群細胞,

到宿主染色體中任意位置。 本法的主要步驟係將選殖的基因,先行嵌

經體外株化後所建立的細胞系,此類細胞具全

入一適當的反轉錄病毒載體,然後再將此等帶

能性分化能力或多分化潛能。當株化後的胚幹

有該選殖基因的反轉錄病毒載體,與透明帶已

細胞或內細胞群的細胞團注入早期囊胚腔後,

被移除的4∼8細胞階段胚,在體外共同培養16

可與宿主的內細胞群發生嵌合,並參與宿主細

∼24小時,以便將外源基因帶入胚的基因組

胞的分化,發育成胚體的各部組織。設若此等

中。

注入的胚幹細胞,能成功地參與性腺分化,則

本法的最大優點乃一次可同時處理數目眾 多的胚,且只要實驗室中具備反轉錄病毒操作

可成為生殖細胞系的成員,使此等源自胚幹細 胞的遺傳物質得以傳承至其後裔。

經驗者,即可輕易完成。惟其最大缺點在於常

目前已有多種外源基因轉殖至胚幹細胞的

會產生鑲嵌體的後代,且所產生的基因轉殖仔

方法可供選擇,例如化學藥劑誘導法、生物媒

鼠,其外源基因在生殖細胞系中被傳承之比

介法及物理或機械處理法,藉此產生嵌合胚。

率,較利用顯微注射法產製者為低。

經由此等嵌合胚所產生的嵌合體動物,經過迴

利用反轉錄病毒法針對哺乳動物做基因轉

交配種後,可獲得真正的基因轉殖動物。

殖,在一九九八年即有成功的先例。利用體外

應用胚幹細胞融合法進行基因轉殖的基本

經16∼17小時培養的成熟牛卵母細胞,以顯微

前提,首需建立有效的胚幹細胞系,且此等幹

注射方式將反轉錄病毒顆粒注入卵黃膜間隙,

細胞在生殖細胞系中亦需具有高傳承率。目前

(A)

二細胞期胚

體外培養

胚移置

體外培養

胚移置

反轉錄病毒

(B) 反轉錄病毒

體外受精

成熟卵母細胞

反轉錄病毒感染法 將二細胞期家畜胚(A)或經體外培養成熟的家畜卵母細胞,以顯微注射方式將反轉錄病毒顆粒注入卵黃膜間 隙,經感染後,再分別經歷體外培養(A)或體外授精及體外培養(B) ,使其培養至囊胚期階段,再移置於受胚母畜的子宮中。

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科學發展

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畜產生物科技

織專一性的基因轉殖動 基因轉染

物,再將其與該指定位置 基因轉殖動物配種,以生 產組織專一性基因轉殖及

基因篩選

剔除的動物。

胚幹細胞 細胞注入

精子載體法 本法於一九八九年, 由義大利科學家勒維特雷

胚移植

諾(Marialuisa Lavitrano) 開創成功。他先將小鼠精 子與外源基因於體外共同

囊胚 胚幹細胞法 將源自內細胞群已株化之胚幹細胞,經外源基因轉染及含外源基

培養,令該外源基因與精

因細胞株之篩選後,再將含有外源基因之胚幹細胞株注入囊胚之囊腔中,以

子相結合後,再以此等帶

產製嵌合胚。其後再移置入受胚動動物之生殖道內,產製嵌合動物,藉以生

有外源基因的精子,進行

產基因轉殖動物。 

體外受精,將外源基因成 為止,在小鼠方面已成功建立許多良好的胚幹

功帶入受精卵的基因組中。

細胞系,且已用之多年;然而,源自家畜胚的

一九九九年,斐瑞(Anthony Perry)利用

幹細胞,則仍未能有效建立。在應用胚幹細胞

小鼠卵母細胞的細胞質內單一精子注射技術,

進行基因定位或剔除時,可將外源基因以同源

證實了外源基因可藉由精子頭部作為載體,達

重組的方式,植入胚幹細胞的基因組內,再依

到基因轉殖的目的。最近,在魚、小鼠、豬和

前述方法注入囊胚腔中;或配合先行育成具組

牛的身上,亦陸續用精子載體法,成功產下基

體外授精 基因轉染

顯微注射

精子載體法 將精子與外源基因於體外共同培養,令該外源基因與精子相結合後,再以此等帶有外源基因的精子,進行體外受精, 將外源基因成功帶入受精卵的基因組中。 

科學發展

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李 男 提 供

究瓶頸。

因轉殖子代。

體細胞核轉置技術,一般除應用於複製人

體細胞核轉置法

類所需的特殊種源動物外,在畜產上也可用以

早期複製同源家畜個體的研究,偏重於以

複製相同遺傳背景的高產性能家畜。若進一步

胚葉細胞當供核者的核轉置技術,然而欲獲得

配合分子生物學及遺傳工程技術,將可取代原

為數眾多的同源個體仍有其限制。近年來,為

核顯微注射技術及胚幹細胞法,生產基因轉殖

加速畜群的遺傳改進及提高家畜生產效益,胚

動物。

的無性增殖及

一九九七年許尼克(Angelika Schnieke)等

基因轉殖技術

人首先在體細胞核轉置技術結合分子生物學及

漸受重視。

李 男 提 供

一九九

體外進行綿羊胎兒纖維母細胞的初代培養,再

七年,威瑪特

將綿羊β乳球蛋白啟動子與人類第九凝血因子

( Ian Wilmut)

和抗新黴素基因構築成的融合基因,轉染送入

將成年綿羊的乳

胎兒成纖維母細胞中,同時在體外培養期間以

腺上皮細胞,以

新黴素篩選,挑選出帶有外源基因的細胞作為

逐漸降低培養液中

供核細胞,配合血清飢餓法調控,進行核轉置

血清含量的方式,

動物的產製。

將供核細胞之細胞

結果在五頭出生存活的仔綿羊中,經DNA

周期回歸至G0期

分析證實五隻皆帶有該外源基因,基因轉殖的

後,成功獲得核轉置羔

效率達到100%;相較於以原核顯微注射法產製

綿羊——桃麗。因此,已分

基因轉殖羊的效率(4.35%)高出了許多。使用

化的細胞核,亦可經由卵母

未經血清飢餓法調控細胞周期的胎牛成纖維母

細胞的孕育而調控至分化前的

細胞當作供核細胞,配合細胞轉染技術,也成

狀態,此創舉突破了家畜體細

功地產下基因轉殖犢牛和山羊。

胞核轉置及基因剔除技術的研

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科學發展

遺傳工程技術方面有了突破性的發展。他先在

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以供核體細胞株為載體進行家畜的基因轉


專題報導

畜產生物科技

基因轉染與篩選

細胞冷凍 繼代培養

耳朵細胞

飢餓培養

供核細胞的基因轉染法 先在體外進行山羊耳朵纖維母細胞的初代培養,再將外源基因送入耳朵纖維母細胞中,同時於體外培養期 間以新黴素篩選,於體外即挑選出帶有外源基因的細胞作為供核細胞,配合血清飢餓法調控,進行核轉置動物的產製。

殖,若先在體外進行基因轉殖後的 細胞篩選,則能有效提升產製效 率,未來將可利用此法進行基因定 位及剔除的工作,有助於做最適當 的基因調控。

成熟卵子

近年來,國內外分子生物學、 基因工程及基因轉殖技術的研發,

胚培養與移植

均已達純熟的階段,台灣亦已建立 完整之技術平台,可供基因轉殖動

耳朵細胞

去核處理

物的研究。惟目前被選殖及構築的 基因,其調控機制與功能性的了解 仍占人類整體基因中的少數。其中 具有經濟價值,並可於家畜獲得適

核轉移

當表現,如提高家畜生產性能及抗

利用核轉置技術產製基因轉殖動物 將帶有外源基因的供核細胞,注入成熟的卵內,把經

病力者為數尚少。所幸,近年來動

核轉置後的複製胚,於體外培養一天後予以移置受胚羊體內,以生產基因轉殖山羊。

物、植物、甚至人類等的基因組譜 定序工作,均在全球各地陸續展開,並持續解 密中。相信在人類及其它生物基因的奧祕逐漸 被解開後,將有更多具經濟價值的標的基因能 被人類應用。

沈朋志 行政院農業委員會畜產試驗所

科學發展

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基因轉殖技術  

0430網頁製作課程練習用

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