Issuu on Google+

Informe de actividades desarrolladas en el Instituto de Ciencias Agropecuarias (ICAP) de la UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE HIDALGO (MÉXICO) TÉCNICAS PARA EL AISLAMIENTO Y PRODUCCIÓN MASIVA DE NEMATODOS ENTOMOPATÓGENOS In vitro OBJETIVO GENERAL Lograr el establecimiento de un proceso de fermentación líquida en matraz para la producción de los nematodos entomopatógenos, Heterorhabditis sp. (H1) y Steinernema sp. (S1)

OBJETIVOS ESPECÍFICOS   

Aislar los simbiontes bacterianos de H1 y S1. Evaluar el desarrollo de los nematodos y sus bacterias simbiontes en una dieta artificial en cultivo sólido. Seleccionar un medio de cultivo líquido y condiciones de operación apropiados para la producción de los nematodos entomopatógenos en matraz.

METODOLOGÍA Ubicación Los experimentos fueron establecidos en el laboratorio de biotecnología agroalimentaria del Instituto de Ciencias Agropecuarias (ICAP) de la Universidad Autónoma del Estado de Hidalgo. Tulancingo, Hidalgo, México. Aislamiento y conservación de Photorhabdus sp. y Xenorhabdus sp. El aislamiento de las bacterias Photorhabdus sp. y Xenorhabdus sp., simbiontes de los nematodos entomopatógenos (NEPs) H1 y S1 se logró siguiendo el método establecido por Martínez Rodríguez (2008). Para ello se trabajó en cabina de flujo laminar con observación en estereoscopio. El procedimiento para cada especie inició con una suspensión de juveniles infectivos (JI) con 8 días de emergencia, de la cual fueron transferidos 40 μL a un portaobjetos estéril, con ayuda de un asa bacteriológica se extrajeron individualmente 20 JI, que fueron ubicados en una gota de cloro al 7.5 % (p/v). Transcurridos 10 min se extrajeron nuevamente para ser enjuagado en dos gotas de agua destilada estéril. Se tomaron nuevamente los JI y se colocaron en una gota de medio de cultivo líquido CST (ver anexo 1), en la cual se maceraron con un bisturí para ser transferidos a tres cajas Petri que contenían cada una 8 mL de medio TSB, las cuales fueron selladas con parafilm (Fig. 1). Las cajas de Petri se incubaron a 30°C, durante 30 h, evaluándose el aumento de la turbidez del medio (lo cual indica un aumento en la biomasa bacteriana). Al tornarse turbio el cultivo, se tomó una alícuota y se estrió en cajas de Petri con medio NBTA (ver Anexo 1) las cuales se incubaron a


30°C durante 40 h. Los cultivos en placa fueron monitoreados para determinar la fase del simbionte bacteriano. La fase I se caracteriza por la absorción del azul de bromotimol, ocasionando que las colonias bacterianas se tornen entre verde y azul oscuro. Para el caso de la fase II, las bacterias no absorben colorantes y reducen el cloruro de trifenil tetrazolio del medio NBTA, generando colonias rojas (Akhurst, 1980).

10 min NaOCL 7%

Figura 1. Esquema para el aislamiento de bacterias simbiontes de nematodos entomopatógenos. Para el almacenamiento y conservación de cada uno de los especímenes bacterianos se tomaron 5 colonias con 40 h de crecimiento en medio NBTA bajo condiciones asépticas y fueron sembradas individualmente en matraces Erlenmeyer de 250 mL, conteniendo cada uno 50 mL de CST. Los matraces se llevaron a incubación por 24 h a 30 0C en un agitador orbital (150 rpm). Se midió el pH a las 0, 24 y 30 h, en cada medición se descartaron los lotes que no se ajustaron a una tendencia general de alcalinización. Después de 30 horas de incubación fueron seleccionados matraces con pH ≥ 8 y se les adicionó 15 mL de glicerol estéril, se mezcló y dosificó en viales de 2 mL, enseguida se refrigeraron por 1 h a 7 0C, posteriormente fueron llevados a un congelador durante 2 h a -14 0 C, finalmente se almacenaron en un ultra congelador a -80 0C (Martínez-Rodríguez 2008). De cada uno de los matraces seleccionados se estriaron 2 cajas de NBTA y se incubaron a 28 0C durante 24 h, confirmando que el cultivo se encontraba axénico y en fase I. Desarrollo de los nematodos en medios sólidos. El establecimiento y desarrollo de H1 y S1 en cultivo sólido, permitirá determinar su respuesta a un medio artificial de producción. Para esto se evaluaron dos medios nutritivos reportados en la literatura. Medio ANH (Agar Nutritivo-Hígado): Hígado de pollo (10% p/v), agar nutritivo (2,3% p/v), aceite de maíz (2,0 % v/v) y Medio 2: Extracto de levadura (2,3% p/v), yema de huevo (1,25 % p/v), NaCl (0,5 % p/v), aceite de maíz (2% v/v), agar nutritivo (2,3% p/v). Los medios se evaluaron


en experimentos separados, para cada uno se utilizaron 10 cajas Petri plásticas estériles y 5 mL de medio por caja. Se realizaron dos peticiones en el tiempo. La inoculación de los cultivos solidos se realizó en condiciones asépticas; activando la bacteria –un vial de conservación- en 20 mL de medio CST, contenidos en un matraz Erlenmeyer de 250 mL y cerrado con un tapón de algodón (Fig. 2B). El matraz se incubó a 30 0C y agitación de 150 rpm durante 24 h. Transcurrido este tiempo se midió el pH y se inoculó cada caja Petri con 200 µL del caldo fermentado, después de 48 horas se inocularon los nematodos, en una concentración de 220 JI por caja Petri. Todos los JI utilizados fueron previamente desinfestados, para esto se tomó una suspensión de nematodos y se re suspendió en una solución de Thimerosal al 0.2 % (p/v ) durante una hora y agitación de 150 rpm, para luego enjuagarlos 2 veces con agua destilada estéril. Después de 6 días de haber inoculado los medios con los nematodos, se ubicaron las cajas Petri en trampas White (Fig. 2), lo que permitió recuperar y cuantificar los JI Se realizaron observaciones diarias identificando estados de desarrollo y cuantificación de JI producidos por unidad de volumen de cada medio sólido evaluado.

Figura 2. Medio solido produciendo JI de Heterohabditis sp. en trampa White. Evaluación y selección de medios líquidos en matraz Los medios nutritivos evaluados en los cultivos sólidos se modificaron como dietas líquidas. Se establecieron dos sistemas; envases para conserva de 80 mL (Fig.3A) y matraces Erlenmeyer de 500 mL (Fig. 3B), para el primero se agregaron 20 mL de medio de producción, y al segundo 50 mL del mismo medio, en ambos casos el inoculo bacteriano se adicionó al 5%, v/v, el cual se activó 24 h antes, siguiendo la metodología descrita para el cultivo sólido. La inoculación de los nematodos se realizó a las 24 y 48 horas después de haber inoculado con la bacteria, el proceso se estableció a 27 0C y 150 rpm. Cada factor a evaluar se estableció como ensayo independiente en el tiempo.


Los cultivos fueron monitoreados cada 48 horas, se definieron como variables de respuesta; estados de desarrollo, pH y el rendimiento de JI al final del proceso.

A

B

Figura 3. Recipientes evaluados para la producción de nematodos entomopatógenos en medio líquido. A); recipientes cilíndricos de vidrio de 80 mL; B) Matraces Erlenmeyer de 250 mL.

RESULTADOS Aislamiento y conservación de Photorhabdus sp. y Xenorhabdus sp. La técnica utilizada para aislar las bacterias simbiontes de H1 y S1 permitió generar cultivos axénicos y aislados en fase I. Para el caso de H1 fue necesario repetir el procedimiento tres veces, en el primer ensayo no se observó crecimiento bacteriano (turbidez) 48 horas después de haber sido inoculadas las tres cajas de Petri. En un segundo ensayo se aumentaron de 20 a 40 JI en el procedimiento de maceración, 30 horas después de la inoculación se observó turbidez en las tres cajas de Petri, se procedió a estriar 5 cajas de NBTA y 36 horas después se observó crecimiento bacteriano en fase I (Figs. 4 A-B), se identificaron colonias de color “verde oliva”; inmediatamente se procedió a inocular 5 matraces conteniendo CST, 24 horas después se registraron valores de pH por debajo de 7, por lo que fueron descartados. Un tercer ensayo consistió en inocular nuevamente 5 matraces con colonias provenientes del anterior aislamiento en NTBA. Para este último se registraron valores de pH que variaron entre 7,40 y 7,78 (Tabla 1), se seleccionaron los lotes con pH 7,78 y 7, 68 para dosificarlos en viales de conservación.


A

B

D

C

Figura 4. Aislamiento de Photorhabdus sp. A) Vista general del crecimiento en fase I; B) colonia en fase I; C) colonia con desarrollo intermedio fase I-II D) colonia en fase II. Tabla 1. Variación del pH en medio de cultivo CST como respuesta al crecimiento de Photorhabdus sp. Mediciones realizadas al tiempo 0, 24 h y 30 horas después de la inoculación. Repetición (Matraz) 1 2 3 4 5

0h 7,28 7,28 7,28 7,28 7,28

pH 24 h 7,50 7,40 7,20 7,05 7,16

30 h 7,55 7,68 7,40 7,78 7,40

Para el aislamiento de Xenorhabdus sp. no se realizaron variaciones a la técnica, bastó un montaje para obtener colonias aisladas en fase I. el crecimiento en las cajas con NTBA se observó a las 24 horas después de la siembra. Las colonias expresaron una coloración azul intenso (Figs. 5 A-B). En el crecimiento bacteriano a escala de matraces se obtuvieron valores de pH entre 7,44 y 7,62 (Tabla 2), todos fueron dosificados en viales de conservación.


A

B

C

D

Figura 5. Aislamiento de Xenorhabdus sp. A) Vista general del crecimiento en fase I; B) colonia en fase I; C) colonia con desarrollo intermedio fase I-II D) colonia en fase II. Tabla 2. Variación del pH en medio de cultivo CST como respuesta al crecimiento de Xenorhabdus sp. Mediciones realizadas al tiempo 0, 24 h y 30 horas después de la inoculación. Repetición (Matraz) 1 2 3 4 5

0h 7,33 7,33 7,33 7,33 7,33

pH 24 h 7,35 7,28 7,24 7,34 7,19

30 h 7,57 7,44 7,51 7,53 7,62

Evaluación de medios solidos Se realizó un experimento cualitativo previo a la evaluación de los medios solidos descritos en la metodología, para esto se utilizaron 5 cajas de Petri con medio NTBA por espécimen bacteriano y se permitió su crecimiento durante 48 horas (Figs. 6 A-C), transcurrido este tiempo se inocularon con su respectivo nematodo (100JI por caja de Petri) y se evaluó cada 24 horas durante 7 días.


Como patrón de conducta se observó que los JI exploraron todo el medio y se ubicaron en las zonas colonizadas por la bacteria. Ambos nematodos presentaron diferenciación 24 horas después de inoculados en el medio, transcurridas 96 horas se observaron adultos y J1 de Heterorhabditis sp. y en el caso de Steinernema sp. fueron observados solo adultos a las 120 horas. Los adultos de S1 copularon pero no generaron descendencia, caso contrario ocurrió con Heterorhabditis sp.

Figura 6. Desarrollo de NEPs en NBTA. A) crecimiento de Photorhabdus sp. de H1, B) Adultos y J4 de Heterorhabditis sp., C) crecimiento de Xenorhabdus sp., D) j4 de S1. En las evaluaciones de desarrollo de Heterorhabditis sp. sobre medios nutritivos se encontró que, 30 horas después de inocularse con Photorhabdus sp. el medio se tornó rojo oscuro (Fig. 7B). A las 96 horas se observó desarrollo del 100% de la poblacion en estado adulto (Fig. 8). El medio Agar Nutritivo-Hígado presentó el mayor rendimiento de JI (Fig. 9A), se registró una produccion acumulada de 60000 JI por caja petri, la emergencia se inició al 7 dia y finalizó al dia 17. El medio 2 (M2) presentó menor rendimiento (41000 JI por caja), la emergencia inicio al dia 8 y terminó al dia 17.


Figura 7. Medio de cultivo solido ANH (Agar Nutritivo-Hígado) despues de 48 de inoculado con: A) Xenorhabdus sp. B) Photorhabdus sp. Los medios inoculados con Xenorhabdus sp. no presentaron variacion en el color (Fig.6B). El rendimiento de JIs con ambos medios fue inferior en contraste al obetenido con Heterorhabditis sp. La mayor produccion se obtuvo con el medio agar nutritivo-Hígado, se registraron valores de 37600 JI por caja (Fig. 9B), la emergencia inició el día 10 y finalizó el dia 18. Para el M2 se obtubo un rendimiento de 25700 JI por caja. La primera emergencia ocurrio al dia 9 y culmino al dia 18.

Figura 8. Estados de desarrollo de Heterorhabditis sp. en cultivo solido.


Juveniles Infectivos (JI)

Producción de JI Heterorhabdits sp. 20000 15000 10000

Agar-nutritivo Higado

5000

M2

0 0

3

6

9

12

15

18

Dias de inoculacion con JI

Juveniles Infectivos (JI)

Produccion de JI Steinernema sp. 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0

Agar-nutritivo Higado M2

0

3

6

9

12

15

18

21

Dias de inoculacion con JI

Figura 9. Producción acumulada de JI en diferentes medios solidos A) Heterorhabditis sp., B) Steinernema sp. Evaluación de medios líquidos El primer experimento consistió en evaluar el desarrollo de Heterorhabditis sp. y Steinernema sp. en 8 matraces Erlenmeyer de 250 mL, a cada uno se adicionó 50 mL de medio a base de hígado (MH) y se inocularon con 1500 JI/mL. Los matraces se cerraron con tapones de algodón y se incubaron a 27 OC y 150 rpm. En ambas especies se encontró mortalidad del 100 % de los JI a las 36 h de incubación, el pH en todas las unidades experimentales fue inferior a 7. Por lo que se descartaron y se procedió a repetir el ensayo. La primera evaluación del segundo ensayo se realizó a las 24 horas. Se encontró supervivencia del 65 % de los JI de Heterorhabditis sp. y 90% para Steinernema sp. A las 48 horas se observaron


nematodos muertos diferenciados (J4) y supervivencia del 5 y 10 % de JI para Heterorhabditis sp. y Steinernema sp. respectivamente. El experimento se descartó y se estableció un nuevo ensayo. Un tercer ensayo tuvo como finalidad aumentar el intercambio de gases, para esto se utilizaron 6 matraces de 500 mL, a los cuales se les adicionó 50 mL del medio 2 y se inocularon con 2500 JI/mL. Cada matraz se cubrió con una almohadilla de algodón soportada sobre una base de lámina de aluminio (Fig. 9A). Durante el tiempo de crecimiento de la bacteria (48 h) se incubó a 30 oC y 150 rpm, después de inocular con los JI se ajustaron las condiciones a 26 OC y 140 rpm.

B

A

Figura 9. Medio liquido de producción M2. A) Matraz de 500 ml con tapa de algodón, B) Adulto Hermafrodita de Heterorhabditis sp. La diferenciación de los JI de Heterorhabditis sp. en J4 fue observada a las 24 horas después de inoculados en el medio y la supervivencia fue del 95%. 48 horas después el 47% de la población inicial se encontraba en J4. A las 144 horas el 41 % de la población se encontró en estado adulto (Tabla 3), los cuales no generaron descendencia (Fig.9B). Tabla 3. Desarrollo de Heterorhabditis sp. en medio liquido de producción M2. Estadio de desarrollo JI J4 Adultos Total

% 24 h 65 30 95

48 h 23 47 70

96 h 5 9 48 62

144 h 41 45


El desarrollo de Steinernema sp. inició 24 horas después de la inoculación, el 50% de la población se diferenció a J4. Después de 48 horas el 52% de la población se encontró en J4. A las 96 horas el 20% se desarrolló en adultos. A las 144 h se observó 12% de adultos viables y 192 horas después se contabilizaron 32 J1/mL, los cuales no continuaron su desarrollo. Tabla 3. Desarrollo de Steinernema sp. en medio liquido de producción M2. Estadio de desarrollo JI J4 Adultos Total

% 24 h 24 50 74

48 h 14 52 66

96 h 5 34 20 59

144 h 12 12

El último experimento consistió en evaluar el desarrollo de Steinernema sp. en recipientes cilíndricos de vidrio con capacidad de 80 mL, a cada uno se le adicionaron 20 mL del medio 2. Cada recipiente se cubrió con una almohadilla de algodón soportada sobre una base de lámina de aluminio. Los tratamientos fueron: JI desinfestados con Thimerosal al 0,2% y JI lavados con agua destilada estéril, en una concentración de 2000 JI/mL y se incubó a 27 0C y 130 rpm. De cada tratamiento se realizaron cuatro repeticiones. Fue necesario repetir el ensayo tres veces debido a la evaporación de los medios, como consecuencia de la Humedad relativa que oscilo entre 25 y 30%. Para ello, en el tercer experimento se ubicaron matraces con agua, lo que permitió mantener la HR en 50%. Las evaluaciones se realizaron cada 48 h después de haber inoculado los medios con los JI, en la primera evaluación, el tratamiento de JI lavados con agua estéril presentó sobrevivencia del 20% y pH promedio de 6,9, enseguida fueron descartados. Se observó desarrollo de protozoarios. El tratamiento de JI desinfestados con Thimerosal presentó supervivencia del 45% y pH promedio de 7,6. En la segunda evaluación (96 h) se observó perdida hasta de un 60% de volumen por cada recipiente, el tratamiento de JI lavados con agua estéril presentó mortalidad del 100% y pH de 6,4. El tratamiento con los JI desinfestados con Thimerosal presentó 15% de nematodos adultos. En la última evaluación, a las 144 h se presentó evaporación total en 3 de las 4 repeticiones, por lo que se evaluó una sola unidad experimental con pérdida del 85% del volumen. Se pudieron contabilizar 58 J2 y 11 J3 vivos. CONCLUSIONES La metodología propuesta para el Aislamiento de los simbiontes bacterianos de Heterorhabditis sp. y Steinernema sp. permitió generar aislados axénicos y en fase I. Se lograron conservar los especímenes bacterianos en abastos de conservación.


Los medios solidos evaluados permitieron el desarrollo y reproducción del complejo nematodobacteria, el medio agar nutritivo-hígado permitió la mayor producción de JI. EL desarrollo de los nematodos entomopatógenos en los medios líquidos pudo ser afectado por la disposición de oxígeno en los matraces cerrados con tapones de algodón y la baja humedad relativa para el caso de matraces cerrados con almohadillas de algodón. El medio 2 permitió el desarrollo de los nematodos, no obstante el rendimiento fue bajo.


ANEXO 1 MEDIOS DE CULTIVO Medio de cultivo NBTA.  Agar nutritivo (2,3% p/v). DIBICO ®  Azul de Bormotimol (0,0025 p/v). SIGMA®  Cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio. (0,004% p/v). SIGMA®  Agua estéril destilada. Preparación de 1 L: En un recipiente de 2 L vaciar el agua estéril y destilada, agregar el agar nutritivo y el azul de bromotimol, agitar hasta homogenizar, enseguida medir el pH y ajustarlo con NaOH a 8. Autoclavar durante 15 minutos, dejar en reposo hasta que la temperatura del medio de cultivo descienda a 45 0C y adicionar en cabina de flujo laminar 1 ml de Cloruro de Trfenil Tetrazolio en solución al 4% (p/v), previamente estéril (filtrado en bomba de vacío) finalmente se sirve en cajas de Petri y se deja solidificar. Ajustar el pH a 8,1 con NaOH. Medio de cultivo CST.  

CALDO SOYA TRIPTICASEINA (3,0% p/v). BD BIOXON® Agua estéril destilada.

Medios solidos de producción. ANH (Agar Nutritivo-Hígado)    

Hígado de pollo (10% p/v). Aceite de maíz (2,0 % v/v) Agua destilada estéril. Agar nutritivo (2,3% p/v). DIBICO ®

Medio 2.     

Extracto de levadura (2,3% p/v). BD BIOXON® Yema de huevo (1,25 % p/v). NaCl (0,5 % p/v). Aceite de maíz (2% v/v). Agar nutritivo (2,3% p/v). DIBICO ®


Medios líquidos de producción. Medio 1.     

Hígado de pollo (10% p/v). Caldo nutritivo (0,8 % p/v). BD BIOXON® Aceite de maíz (4,0 % v/v) Caldo nutritivo (0,8 % p/v). BD BIOXON® Agua destilada estéril.

Medio 2 (Surrey & Davies 1996):    

Extracto de levadura (2,3% p/v). BD BIOXON® Yema de huevo (1,25 % p/v). NaCl (0,5 % p/v). Aceite de maíz (4% v/v).

Observaciones: Todos los medios de cultivo fueron esterilizados a 15 lbf/in2 durante 15 min en autoclave automática


LITERATURA CITADA MARTÍNEZ RODRÍGUEZ, A. 2008. Aislamiento y producción masiva de simbiontes bacterianos de nematodos nativos del estado de Hidalgo con potencial para el control de plagas agrícolas. Universidad Autónoma del Estado de Hidalgo, Tulancingo de Bravo, Hidalgo, México. Tesis de pregrado. AKHURST, R. J. 1980. Morphological and functional dimorphism in Xenohabdus spp., bacteria symbiotically associated whit the insect pathogenic nematodes Neoaplectana and Heterorhabditis. J. Gen. Microbiol. 121: 303-309.


03 informe pasantía cams