AUTOINMUNIDAD EN LA DIABETES MELLITUS PERSPECTIVA DESDE EL LABORATORIO Mª Teresa Herrera del Rey Unidad de Gestión Clínica de Laboratorios HH.UU Virgen del Rocío Sevilla
CLASIFICACIÓN ETIOLÓGICA DE DIABETES MELLITUS I ) Diabetes tipo 1: A. Inmunomediada B. Idiopática II ) Diabetes tipo 2 III) Otros tipos específicos: 1.- Defectos genéticos de la función de la célula β (MODY, mitocondrial) 2.- Defectos genéticos de la acción de la insulina 3.- Enfermedades del páncreas exocrino 4.- Endocrinopatías 5.- Inducida por fármacos 6.- Infecciones 7.- Formas no comunes de diabetes inmunomediada 8.- Otros síndromes genéticos asociados ocasionalmente con diabetes IV ) Diabetes gestacional
DIABETES TIPO 1 AUTOINMUNE
LADA (Latent Autoimmune Diabetes in Adults) En 1998 se presentan los resultados del estudio UKPDS: Seguimiento de 5000 pacientes con DM tipo 2 durante 20 años. Relación entre control intensivo de glucemia y morbi-mortalidad. HALLAZGO: 7.5-10% de los pacientes diagnosticados de DM tipo 2 presentaron autoanticuerpos positivos ( anti- GAD e IA-2 ), no obesos y con pocas manifestaciones de síndrome metabólico.
Edad < 50 años Síntomas agudos IMC<25 Anti- GAD positivos Requieren insulina
IS DIABETES MELLITUS A CONTINUOUS SPECTRUM? Is diabetes mellitus a continuous spectrum? Brooks-Worrell B, Palmer JP. Clinical
Chemistry February 2011 vol. 57 no. 2 158-161
Debido a los descubrimientos de los últimos años, se propone un cambio en el esquema de la clasificación tradicional de la diabetes.
T1D onset <10 years
T1D adult onset
Autoimmune phenotypic T2D
Tradicionalmente: Edad de inicio Síntomas hiperglucemia Cetosis Obesidad Necesidad de tratamiento con insulina
Nonimmune phenotypic T2D
Age-related deterioration of glucose tolerance
Actualmente: el sistema inmune juega un papel importante en la DM 2, con similitudes y diferencias entre DM 1 y DM2.
PREDICCIÓN RIESGO DIABETES
• Marcadores genéticos Sistema de antígenos humanos
HLA: DR3/4 y DQ2/8 (2,4% desarrollan ICAs + antes de los 5 años) (No defecto genético sino variantes de genes) • Pruebas metabólicas Test tolerancia glucosa Hemoglobina glicosilada (>6,5%) • Medición de autoanticuerpos
AUTOANTICUERPOS EN LA DIABETES ANTI ISLOTES PANCREÁTICOS (ICA) ANTI INSULINA
ANTI GLUTAMATO DESCARBOXILASA (GADA) ANTI TIROSINA FOSFATASA (IA-2)
TRANSPORTADOR ESPECÍFICO DE Zn T8
ANTICUERPOS CONTRA ANTÍGENOS DEL CITOPLASMA DE LAS CÉLULAS DE LOS ISLOTES PANCREÁTICOS (ICA) • Descubiertos en 1974 (Bottazzo et al. Lancet) • Positivos en aprox. 80% pacientes con diabetes mellitus (DM) tipo1 recién diagnosticada
• Disminuyen conforme merma el funcionamiento de los islotes
• Tipo IgG
Inmunofluorescencia indirecta (IFI) Conjugado anti-hIgG / fluorocromo
Luz UV
Analito Ej.: ICA Tejido Ej.: Pรกncreas
Islotes
Acinos
Detecci贸n de ICA mediante inmunofluorescencia indirecta sobre un corte de p谩ncreas.
ANTI INSULINA IAA • Anticuerpos
frente a la insulina (previo a la
administración de insulina) Palmer et al (1983) describieron la presencia de anticuerpos contra la insulina en el 50% de pacientes de diagnóstico reciente (RIA) • Su frecuencia estaba asociada a la edad:
niños, sobre todo menores de 10 años (RIA)
ANTI INSULINA IAA • Informes contradictorios sobre su prevalencia y valor pronóstico que parecen debidos a la diferente metodología utilizada para su medición
• Los que se miden por RIA se encuentran más vinculados a la enfermedad
• Los que se miden por ELISA no sirven para el diagnóstico de la Diabetes Mellitus, sí para el
diagnóstico de las hipoglucemias autoinmunes.
ANTI DESCARBOXILASA DEL ÁCIDO GLUTÁMICO (GAD) • Específicos contra enzima glutamato
decarboxilasa, síntesis del neurotransmisor inhibidor ácido gamma-amino-butírico (GABA)
• Dos genes GAD: GAD1: se traduce en proteína GAD67 (islotes de ratón)
GAD2 (cromosoma 10): proteína GAD65 (islotes cél. β humanos)
ANTI DESCARBOXILASA DEL ÁCIDO GLUTÁMICO (GAD) • Más del 70% de los pacientes de reciente diagnóstico tienen niveles positivos después 10 años
• El GAD debe ser considerado como la primera herramienta de screening.
• En DM tipo 2 distinguen a los pacientes que necesitan insulina (LADA) (Van Deutekom y cols.
Diabet Med.2088;25:117-25)
ANTI TIROSINA FOSFATASA DE MEMBRANA IA-2 ICA-512 Glicoproteína transmembrana perteneciente a la
familia de las proteínas tirosina fosfatasa, localizada en los gránulos secretores densos de las células
endocrinas secretoras de proteínas y las neuronas Favorece unión de los gránulos secretores al cito-
esqueleto: activa transporte celular y la exocitosis
ANTI TIROSINA FOSFATASA DE MEMBRANA IA-2 •Son los de mayor valor predictivo positivo (VPP) •Su presencia en la fase preclínica en niños predice progresión a diabetes clínica (Grise y cols. Diabetologia 2010; 53:517-524) •Método de determinación: RIA y ELISA
Inmunoanálisis con reactivos marcados RIA heterogeneo competitivo - Con compuestos radiactivos: IRMA heterogeneo no competitivo - Con enzimas: Enzimoinmunoanálisis
Peroxidasa, fosfatasa alcalina, Glucosa 6-fosfato, deshidrogenasa, B- galactosidasa... Ventajas ELISA
Disponibles comercialmente
Se pueden conjugar por técnicas simples
Tienen varios sustratos
No se utiliza radiactividad (problema de desechos,etc)
En nuestro laboratorio realizamos como apoyo al diagnóstico del debut diabético:
Ac. Anti GAD Ac. IA-2
Método de determinación mediante ELISA en microplaca. Analizador Triturus (Grifols)
450 nm
ELISA IA-2
A - [C] Streptavidina -
IA2 - biotina
Peroxidasa
TMB
IA-2
Incubaci贸n 16-20 h
Lavado
Lavado
MODELOS ELISA ELISA convencional
aELISA (amplificado) Conjugado anti-rIg / peroxidasa
Sustrato tetra metil bencidina (TMB)
anti-IgG humana conjugado con peroxidasa
Ag absorbido a la superficie
Mab anti-IgG humana
Analito: IAA INSULINA MATRIZ Pocillo de la micro placa
Determinación de GADA Marcación de la Trx-GAD recombinante con biotina ELISA Ag-específico (Ae-ELISA) Expresión de Trx-GAD en E. coli
Obtención de la fracción intracelular soluble
*
Trx-GAD-biotina
Biotinilación
Avidina-Px
*
Purificación Thio-Bond Resin
Trx-GAD-biotina GADA Trx-GAD
Trx-GAD
Se utiliza como LIGANDO un CONJUGADO GADA65-BIOTINA (IA-2-BIOTINA)
Transportador de Zn T8
Función: transportar zinc desde el citoplasma de las células beta al interior del gránulo de secreción
Es el principal autoantígeno descubierto en los
últimos 10 años
Transportador de Zn T8
Específico de células beta Aporta información complementaria al
resto de los autoanticuerpos, aumentando el porcentaje de detección
Método de determinación: RIA y ELISA
IAA: RESULTADOS DISCORDANTES ENTRE RIA Y ELISA
“ La comparación frecuente de los méritos relativos de los
métodos radiactivos y enzimáticos es básicamente errónea, ya que los principios que rigen estos ensayos son diferentes” R. Ekins, 1980
OBJETIVOS
Conocer la prevalencia de auto-anticuerpos antiGAD, anti-IA-2 y anti-insulina en el debut de la diabetes mellitus en nuestro medio, medidos mediante técnica ELISA. Valorar su papel como apoyo diagnóstico.
MATERIAL Y METODOS • Estudio
•
•
• •
observacional descriptivo para determinación de prevalencia y valoración de pruebas diagnósticas Muestra 111 pacientes debut diabético: 61 DM tipo 1 (incluye 12 casos DM tipo LADA (Latente Autoinmune del Adulto), 50 DM tipo 2. Grupo control de 64 personas no diabéticas. Enzimoinmunoanálisis en micro placa: Glutamic Acid Decarboxylase (GAD) Autoantibody ELISA kit from RSR (RSR Limited), IA-2 Autoantibody ELISA versión 2 kit from RPR y AESKULISA Insulin-G (AESKU DIAGNOSTICS) para IAA. Criterio (+): GADA >5 U/ml, IA-2 >7,5 U/ml e IAA >15 U/ml. Análisis estadísticos mediante paquete PASW Statistics versión 18.
RESULTADOS
RESULTADOS PREVALENCIA AUTOANTICUERPOS EN DIABETES MELLITUS DE INICIO Figura 1. Grรกfico de frecuencias 80,0 70,0 60,0 50,0 % 40,0 30,0 20,0 10,0 0,0
DM 1
DM 2
Control
Anti-GAD
78,7
2,0
7,8
Anti-IA2
31,7
4,0
3,1
IAA
10,3
6,0
1,7
RESULTADOS VALORES MEDIANAS AUTOANTICUERPOS Muestra
GAD
IA2
IAA
Gráfico 2. Medianas
Medianas (U/ml)
Percentil 25-75
Control
2.59
1.88 – 3.54
100
DM 1
108.00
4.56 – 304.00
80
DM 2
1.84
1.54 – 2.64
Control
5.16
4.56 – 5.70
DM 1
6.05
5.28 – 264.50
DM 2
5.21
4.73 – 5.73
Control
2.22
1.39 – 4.05
DM 1
3.17
2.04 – 5.75
DM 2
3.72
1,69 – 5.84
120
60
40
20
0 CONTROL DM 1 DM 2
GAD
IA2
IAA
2,58 108 1,83
5,16 6,05 5,26
2,22 3,17 3,84
GAD
IA2
IAA
Control - DM 1
P< 0.0001
P< 0.0001
P = 0.0309
Control - DM 2
P = 0.0176
P = 0.3269
P = 0.0196
DM 1 - DM 2
P< 0.0001
P = 0.0002
P = 0.5850
RESULTADOS CURVAS ROC (RECEIVER OPERATING CHARACTERISTICS)
CONCLUSIONES La diabetes Mellitus tipo I es una enfermedad asociada a fenómenos de auto inmunidad humoral y celular que pueden ser detectados tanto en el momento del diagnóstico clínico como mucho tiempo antes. La predicción de riesgo de diabetes incluye la combinación de marcadores genéticos, pruebas metabólicas y medición de auto-anticuerpos. Los auto anticuerpos son de gran utilidad como marcadores precoces de enfermedad y como apoyo diagnóstico.
CONCLUSIONES Los informes contradictorios sobre su prevalencia parecen debidos a los distintos procedimientos utilizados para su análisis. Las técnicas ELISA, de fácil realización están sustituyendo a los métodos RIA, salvo en el caso de IAA, donde ELISA no alcanza la sensibilidad de RIA. En nuestro estudio, la prevalencia de GAD (+) en el debut diabético es alta, y su determinación se ha mostrado eficaz para el diagnóstico de MD tipo 1. También lo son, aunque en menor medida IA-2. La determinación conjunta de GAD e IA-2 incrementa la probabilidad de diagnóstico. Los anticuerpos IAA no tienen valor como marcador en el diagnóstico y tipificación de diabetes mellitus
Momento actual
El GAD es el parámetro más fiable para el apoyo al diagnóstico de la DM I y LADA. 78% positividades en el debut de la DM I IA-2: nuestra técnica por ELISA RSR junto con Medipan son las técnicas más utilizadas.
Los laboratorios Royal Devon and Exeter NHS utilizan técnicas ELISA RSR para IA-2 y GAD. Estamos trabajando en mejorar la especificidad y la sensibilidad de los ensayos IA-2. Estamos inscritos en un programa internacional de controles, puestos en marcha a partir de Enero 2013 dentro de la estandarización de los anticuerpos.
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