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SECRETARÍA DE EDUCACION PÚBLICA

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE CONKAL

INFORME DE AÑO SABÁTICO PRÁCTICAS DE LABORATORIO: BIOQUÍMICA CARRERA INGENIERÍA EN AGRONOMÍA NOMBRE: RITA PETRONA ARZÁPALO MARÍN

Agosto 2012

Km. 16.3 Antigua Carretera Mérida –Motul, Conkal, Yucatán Tels. 01 (999) 9-12-41-30, 9-12-41-31, 9-12-41-35 y 9-12-41-83 www.itconkal.edu.mx

ÍNDICE DE PRÁCTICAS

Práctica

Página

1

Determinación del pH y preparación de soluciones amortiguadoras

1

2

Propiedades anfotéricas de los aminoácidos

14

3

Mecanismos de transporte de la membrana plasmática

19

4

Reacciones enzimática

25

5

Fosforilación oxidativa en hígado de rata

40

6

Fotosíntesis

47

7

Aislamiento y determinación de propiedades químicas y físicas

58

de las proteínas 8

Determinación de las propiedades químicas de los carbohidratos

72

9

Aislamiento de glucógeno en el hígado

82

10

Aislamiento y propiedades físicas y Químicas de los lípidos

88

11

Aislamiento de ácidos nucleicos

98

i

ÍNDICE DE CUADROS

Nombre de cuadro

Página

Cuadro 1

Patrones de amortiguadores de fosfato

2

Reactivos para la activación de la amilasa salival

31

3

Determinación del volumen de enzima

33

4

Determinación del tiempo de reacción de la enzima

34

5

La influencia del PH en el color del extracto de la col morada

37

6

Efecto de la ureasa de soya en la urea

38

7

Componentes para medio de incubación

43

8

Determinación de fosfato y captación de oxígeno

45

9

Calibración de DCFIF

53

10

Actividad fotoquímica

54

11

Reactivos para la exposición a la luz

55

12

Inhibición por DCMU

56

13

Curva de concentración de proteínas por espectrofotómetro

69

14

Determinación de la pureza del glucógeno

85

15

Identificación de esteroles mediante la prueba de Lieberman

94

9

ii

UNIDAD I PRÁCTICA 1

Determinación del pH y preparación de soluciones amortiguadoras Objetivos: Relacionar la ionización del agua con el pH de los sistemas biológicos Preparar experimentalmente diferentes soluciones amortiguadoras Establece la relación entre el pH y un amortiguador Introducción: El agua tiene muchas funciones en la célula y ejerce una gran influencia en la estructura y el comportamiento en todas las biomoléculas. Actúa como solvente y estabilizador de temperatura, pero también es una molécula reactiva. El agua es una molécula dipolar no lineal, puede formar grandes redes de puentes de hidrógeno, sea consigo misma o con otras moléculas polares; el agua disuelve muchos tipos de biomoléculas incluidas las que son iónicas y polares o neutras La reacción más importante del agua es la ionización reversible para formar iones hidronio (H3O) e hidroxilo (OH), la capacidad

del agua para ionizarse

es

fundamental para la vida Por ejemplo: un cambio mínimo de la concentración de este ión en la sangre se acompaña de alteraciones en la composición química de la

propia sangre, de

cambios notables de ciertos fenómenos fisiológicos como la respiración y también de trastornos de la conducta. También puede alterar la eficacia de las enzimas como catalizadores, la mayor parte de los microbios requieren una determinada concentración de iones

hidrógeno para el crecimiento celular y optima división 1

celular Según definiciones de Brônsted - Lowry, se llama ácido a un cuerpo que tiende a perder protones y base a un cuerpo que tiende a ganar protones. El Producto iónico del agua. Ionización del agua Una de las propiedades más importantes del agua es su capacidad para actuar como un ácido o como una base, La fuerza de un ácido se define por su pKa, el logaritmo negativo de su constante de disociación ( pKa = ─ log Ka) Sólo las moléculas o iones anfipróticos pueden sufrir auto protolisis. En presencia de un ácido el agua actúa como base, mientras que en presencia de una base el agua actúa como un ácido. No es sorprendente por lo tanto que en agua pura una molécula pueda donar un protón a otra en una reacción en la cual el agua actúa tanto como ácido como base al mismo tiempo. Así, el agua pura se encuentra

auto

ionizada auto protolisis) en una pequeñísima proporción según el proceso reversible: H2O + H2O ↔OH- + H3O+ En una reacción de transferencia de un protón desde una molécula de agua otra; el ión hidronio H3O+ cuando está solvatado (en disolución acuosa, hidratado) se llama ión hidronio H3O+(aq). La reacción se puede escribir de forma sencilla utilizando la concentración de iones hidrógeno H+ H2O↔OH- +H+ (Mckee 2003) La constante de equilibrio para este equilibrio químico a una determinada temperatura es

2

Kc = _[OH] [H]+___ [H2 O] Teniendo en cuenta que la concentración molar del agua pura es [H2O]=55.5M (moles/litro) (calculada a partir de su densidad y masa molar [H2O=(1000g/L)(1mol/18.0g)=55.5g/L, y la concentración de iones hidrógeno, a la temperatura estándar de 25ºC(298K) es sólo de

10-7M , es decir una cantidad

despreciable frente a 55.5 M se puede considerar que la molaridad del agua es una constante que puede ser incorporada en una constante “mayor” que incluya también a Kc y que es conocida como producto iónico del agua, Kw = Kc [H2O]. El valor de Kw (el subíndice

proviene de water palabra en inglés que significa agua) se calcula

teniendo en cuenta que las medias experimentales de la extensión de la disociación de las moléculas de agua las cuales muestran que la concentración de H+ (en forma de iones hidronio) en agua pura es de 1.0x10-7 M a 25 ºC. Ya que la reacción de disociación del agua produce igual concentración de iones H+ que iones hidroxilo OH- concentración molar de OH- en agua pura será también de 1.0x10-7 .Esto es: [H+] = [OH- ] = 1.0x10-7 M a 25ºC> Luego: Kw = [H+] [OH- ] = (1.0x10-7 ) (1.0x10-7 ) = 1.0-14 Producto iónico del agua Este valor se mantiene constante, siempre que la temperatura sea de 25 ºC, no importa que otras sustancias estén presentes en la disolución. La relación entre las moléculas de agua disociadas frente a las no disociadas es aproximadamente de 2 x109, un número muy pequeño:

3

1.0x10-7 M / 55.5 M =1.8x10-9 Hay dos aspectos importantes en la dinámica del equilibrio de la disociación del agua. Primero, las reacciones directa y reversa son rápidas; las moléculas de H2O, iones H3O+

y

OH- se convierten rápidamente por transferencia protónica de una

especie a otra. Segundo la posición del equilibrio está desplazado hacia la izquierda de la ecuación, en

cualquier instante dado sólo una pequeña fracción de las

moléculas de agua están disociadas en H3O+ y OH-. La mayoría de las moléculas de agua están sin disociar. Así se puede distinguir las soluciones acuosas como ácidas, neutras y básicas por los valores relativos de la concentración de iones hidronios

H3O+ y iones hidroxilo

OHConcepto y escala de pH La acidez de una disolución está determinada por la concentración de iones hidronios H3O. Pero las concentraciones de iones hidronios en las disoluciones pueden cubrir un intervalo enorme. Desde una disolución de 1M de NaOH hasta otra de 1M de HCl, la variación es de uno a cien billones. Por otra parte, se trata de números muy pequeños que tiene que ser expresados como potencias negativas de 10, de manejo poco práctico. Con el fin de expresar estas concentraciones de una forma más sencilla que evitase manejar potencias negativas, el químico danés Sörensen (1868-1939) introdujo en 1909 el concepto de pH que se define como el logaritmo decimal cambiado de la concentración de iones hidronio: pH = ─ log [ H3 O+ ] O expresado simplemente así: 4

pH = ─ log [ H+]

El símbolo pH proviene de la expresión francesa puissance d’hydrogene

(potencial

de hidrógeno”), puesto que el pH es función lineal del potencial electroquímico de la disolución medido a través de un electrodo especial llamado electrodo de hidrógeno. Es evidente que la definición se puede deducir fácilmente de la igualdad [H3O+] = anti log (─pH] = 10pH Así una disolución será: Neutra cuando su pH = 7 Esto es pH = log1/1.0x10-7 = log (1.0x10 = log1.0 + log 1.0+ log7 ) = 0+7=7 Ácida cuando sea inferior a 7. pH< 7 Básica cuando sea superior a 7. pH>7 Para que tenga un valor práctico, la escala ordinaria de pH se establece convencionalmente en un extremo muy básico representado por una disolución M de hidróxido sódico, al que correspondería un pH =14, y un extremo muy ácido ejemplificado en una disolución de 1M de ácido clorhídrico HCl, cuyo pH = 0 Análogamente se define el pOH como pOH= ─ log[OH] Si se toman logaritmos en los dos miembros del producto iónico del agua, se llega a la relación: pH + pOH=14 pKw = pH +pOH

5

Ecuación de Henderson-Hasselbalch La ecuación de Henderson-Hasselbalch es una fórmula química que se utiliza para calcular el pH, de una solución buffer, o tampón, a partir del pKa (la constante de disociación del ácido) y de las concentraciones de equilibrio del ácido o base conjugada.

S es la sal o especie básica

A es el ácido o especie ácida

Harper 2004

Experimento Medición de pH 1ª parte. •

Método colorimétrico, con este trabajo el alumno adquiere habilidad con la

técnica general comparativa visual que aplicará en otras prácticas 2ª parte.

6

Mitad del grupo inicia la primera parte del experimento y la otra mitad la segunda parte; si se suministran los materiales se terminan simultáneamente las dos series de trabajo.

Este experimento consiste en preparar una serie de tubos con diferente pH y en utilizarlos como patrones coloreados para medir el PH de algunas soluciones problemas. Los estudiantes trabajan en equipo de dos.

Método colorimétrico: Preparación de soluciones patrones amortiguadoras con diferentes pH Materiales

Reactivos

11 tubos de ensayo de 15x180 mm

Fosfato monobásico de potasio 0.1M (KH2 PO4 )

Pipeta graduada de 5 ml

Hidróxido de sodio 0.1N

2 pipetas graduadas de 1 ml

Agua destilada Azul de bromotimol en frasco gotero Acetato de sodio 0.1 M ácido acético

0.1M

Hidróxido de amonio 0.1 Cloruro de amonio 0.1

1.-Prepara una serie de tubos de ensayo de 15x180 mm 2.-Adiciona a cada tubo 5.0 ml de fosfato monobásico de potasio KH2 PO4 0.1 M 7

3.-Agrega con exactitud las cantidades de hidr贸xido de sodio de acuerdo al cuadro1 4.-Agrega agua destilada de acuerdo al cuadro 1 5.- A帽ade exactamente cinco gotas de indicador de azul de bromotimol a cada tubo

8

Cuadro1. Patrones de amortiguadores de fosfato pH

KH 2PO4 0.1 M (ml)

NaOH 0.1 M (m

H2O (ml)

6.0

5.0

0.56

4.44

6.2

5.0

0.86

4.14

6.4

5.0

1.26

3.74

6.6

5.0

1.77

3.23

6.8

5.0

2.36

2.64

7.0

5.0

2.95

2.05

7.2

5.0

3.49

1.51

7.4

5.0

3.93

1.07

7.6

5.0

4.27

0.73

7.8

5.0

4.52

0.48

9

Objetivo: con esta práctica desarrolla habilidades para el uso del potenciómetro para medir el pH en diferentes muestras problemas. El método potenciométrico de determinación del pH se basa en la medición de fuerzas electromotrices de las pilas voltaicas, preparadas a partir de las disoluciones a investigar y de electrodos especiales. Se denomina pila voltaica al aparato en que

la energía química se convierte en eléctrica. Se denomina fuerza electromotriz (f.e.m.) la máxima diferencia de potenciales entre los electrodos de una pila voltaica en las condiciones reversibles de su trabajo. El método se caracteriza por una gran precisión en la determinación del pH de cualquier líquido. Para la determinación de los potenciales de electrodo o la concentración de iones en la disolución se emplean los electrodos estándar con una magnitud conocida del potencial de electrodo. En función de tales electrodos de referencia se usan los electrodos de hidrógeno, de calomelanos y de quinhidrona. Electrodo de hidrógeno. El electrodo de hidrógeno consta de una placa de platino saturada de hidrógeno molecular y sumergido en una solución que contiene iones de hidrógeno: En este sistema el platino desempeña el papel de conductor de electrones y de portador de hidrógeno. Una parte de las moléculas de hidrógeno que se encuentran en la placa de platino, se disocia en la disolución suministrando cationes de hidrógeno. Si la concentración de iones hidrógeno en la solución es igual 1 ion- g/1 y la presión del hidrógeno molecular es 0.101 MPa (mega pascal) entonces el electrodo de hidrógeno se denomina normal. El potencial de un electrodo normal de hidrógeno es igual a cero. 10

Materiales

Reactivos

Potenciómetro

KCl cloruro de potasio

Pipetas Pasteur

Soluciones estándar de pH: 4,7,y10

Probeta graduada 250 ml

Ácido bórico al 0.1M

Vasos de precipitado 250 ml (2)

Solución NaOH 10 M

Piseta

HCl concentrado

Agitador magnético

Ácido acético

Espátula

Acetato de sodio

Matraces aforado de 250 ml

EDTA KH2PO4 K2HPO4 Leche Jugos

El electrodo del pH metro siempre debe estar sumergido en solución de KCl o agua destilada. Enjuagar el electrodo con agua destilada y secar. Ajustar el pH metro primero a 7, después a 4 y finalmente a 10 con soluciones reguladoras comerciales. Entre cada pH enjuagar con agua destilada y secar Determinar el pH de varias muestras como leche, refrescos, jugos, refrescos etc.

11

Cuestionario: 1. -¿Porqué el pH del potenciómetro se ajusta primero a pH 7 y no a 4 ó 10? 2.-Porqué el electrodo se tiene que mantener en una solución de KCl saturado 3.-Si quisieras preparar un buffer de fosfatos de potasio pH 11, que sales seleccionarías 4.- ¿El buffer de acetato de sodio que preparaste está a un pH que se puede considerar adecuado para servir como solución reguladora? 5.- En la preparación del acetato de sodio, cual es el ácido y cuál es la base conjugada. :

¿Cuál es el pH de una solución cuya concentración de ion hidrógeno es de 3.2x10-4 mol/L? Bibliografia Mckee Trudy., Mcke J. (2003) Bases moleculares de la vida. McGraw-Hill. Interamericana p 77-87. Harper.2004 Bioquímica ilustrada 16ª ed. Manual Moderno p 5-13 Rendina, G. (1974) Técnicas de Bioquímica aplicada. Editorial Interamericana 1ªedición al español p 9-23

12

Informe

Apellido Paterno

Apellido Materno

Nombre

NĂşmero de mesa:___________ Fecha___________ NĂşmero de estudiantes_____

Entrada

Desarrollo

Informe

Definitiva

13

PRÁCTICA. 2

Propiedades anfotéricas de los aminoácidos Objetivo: Con el

uso

de materiales volumétricos y

pH metro

medirá

las

reacciones de neutralización acido –base y diferencia las estructuras y propiedades de los aminoácidos formadores de proteínas Introducción Los aminoácidos componentes de las proteínas son alfa-aminoácidos. Por lo tanto, están formados por un carbono alfa unido a un grupo carboxilo, a un grupo amino, a un hidrógeno y a una cadena (habitualmente denominada Radical) de estructura variable, que determina la identidad y las propiedades de los diferentes aminoácidos; existen cientos de cadenas R por lo que se conocen cientos de aminoácidos diferentes, pero sólo 20 forman parte de las proteínas (Harper 2004) Los aminoácidos se disocian en soluciones acuosas dando

iones dipolares o

Zwiterions (o sea iones dobles). Las curvas de titulación muestran que un aminoácido da lugar a dos fenómenos de disociación, que corresponden a los dos grupos disociados.

Con la curva se

establece el pK’ de cada grupo funcional. (Mathews 2005) En la curva se observa que el aminoácido tiene un punto que se comporta como una sal neutra. Para este valor de pH, la carga neta sobre el aminoácido es nula. Este punto se llama punto isoeléctrico. Los dos grupos disociables tienen su carga completa, de signo opuesto en cada caso.(Mckee 2003) 14

En la práctica se considera que el punto isoeléctrico se encuentra a la mitad entre los dos puntos de mayor capacidad amortiguadora.

Materiales

Reactivos

Balanza analítica

Aminoácidos: glicina, histidina, ácido glutámico, lisina al 1M

pH metro

NaOH 1M

Barra y agitador magnético

HCl 1 M

Bureta

Standares para calibrar el pH metro de 4, 7,10.

Pinza para bureta Soporte Espátula Vasos

de precipitado de 100 ml

(8piezas) Pipeta graduada de 5, 10 Papel higiénico Papel aluminio

Se

trabaja en dos grupos

El primer grupo trabaja la titulación con acido clorhídrico HCl: 1. mide 10 ml de aminoácido 0.1M para titular 15

2.-Ajusta el pH metro 3.- añade 0.3 a 0.5 ml de ácido clorhídrico 1M 4- Agita y medir pH se anota el pH inicial y el volumen de ácido añadido 5.- Añade otra vez ácido gota a gota 0.3 a 0.5 ml y otra vez lee el pH y el consumo de ácido así sucesivamente hasta llegar a pH 1.

El segundo grupo Titula con NaOH 1 M Para titular con NAOH se procede de la misma forma solo se sustituye el ácido por la base NaOH Se termina la titulación cuando se llegue a pH aproximadamente 13.

-Mathews, C.K., Van Holde K.E. and Ahern K.G. 2000. Biochemistry. Third edition. Addison Wesley Longman Inc. USA. 147-150 Harper.2004 Bioquímica ilustrada 16ª ed. Manual Moderno .17-23 Mckee Trudy., Mckee J. (2003) 81-87. Rendina, G.(1974) técnicas de bioquímica aplicada. Interamericana 31-36

16

Informe Apellidos Maternos

Nombres

Apellido Paternos

Número de mesa:______ Fecha_____________ Número de estudiantes_____

Entrada

Desarrollo

Informe

Definitiva

Complete el siguiente cuadro con la información deseada relacionada con el aminoácido que se tituló Nombre del aminoácido

Clasificación del aminoácido

Concentración

17

Escribe la fórmula Usa papel milimétrico para realizar ambas curvas, recorta y anexa el informe en el espacio a continuación.

Con Ácido

Con Base

Dentro de las gráficas ubica los pK, el punto isoeléctrico

y las fórmulas de la

sustancia química deseadas.

18

UNIDAD II PRÁCTICA 3 Mecanismos de transporte de la membrana plasmática

Objetivo: Comparar la Difusión, Osmosis, y Diálisis como procesos bioquímicos mediante el cual las moléculas transportan a través de las membranas celulares.

Introducción: (Mathews 2005)Las

membranas de las células vivas son estructuras complejas

compuestas de lípidos, carbohidratos y proteínas. La estructura básica de las membranas es la bicapa de fosfolípidos que contiene proteínas, según el modelo de Mosaico Fluido o mosaico de los fluidos. Es semipermeable, se encarga de separar el líquido intracelular del líquido extracelular y de regular el transporte de estos, e impide el paso de sustancias grandes como lípidos y proteínas, permite el paso de carbohidratos oxígeno, dióxido de carbono, agua glicerol

entre otros. El transporte

celular ocurre

por

proceso activos y

pasivos. El transporte pasivo. Es un proceso de difusión de sustancias a través de una membrana. Se produce siempre a favor del gradiente es decir de donde hay más hacia al medio donde hay menos concentración. Este transporte puede darse por:

19

Difusión simple a través de bicapa, así entran moléculas lipídicas como las hormonas esteroideas, anestésicos como el éter y fármacos liposolubles y sustancias apolares como el oxígeno y el nitrógeno atmosférico. Algunas moléculas polares de muy pequeño tamaño molecular como el agua, el etanol bióxido de carbono y glicerina. La difusión del agua se llama ósmosis. Difusión facilitada. Permite el transporte de pequeñas moléculas polares como aminoácidos, monosacáridos, que al no poder atravesar la bicapa lipídica requiere, que proteínas tras membranosa faciliten su paso su paso. A estas proteínas se les conoce como proteínas transportadoras o permeasas, que al unirse a la molécula a transportar sufre un cambio en su estructura que arrastra a dicha molécula al interior de la célula. Transporte activo: en este proceso también intervienen proteínas de membrana, pero con la variante que necesitan energía, en forma de ATP para transportar las moléculas al otro lado de la membrana. Se produce cuando el transporte se realiza en contra del gradiente electroquímico. Como ejemplos de transporte activo tenemos la bomba de sodio/potasio, requiere de una proteína transportadora que bombea Na+ al exterior y K+ al interior. Esta proteína actúa contra el gradiente por la actividad como ATP asa ya que rompe el ATP para obtener energía necesaria para el transporte Por este mecanismo, se bombea 3Na+hacia el exterior y 2 K+ al interior, con la hidrólisis acoplada de ATP. El transporte activo de Na+ y K+ tiene gran importancia para los organismos. Las células animales gastan más del 30% del ATP que producen y las células nerviosas más del 70% para bombear estos iones (Lenhinger 2003) 20

Materiales y Equipo

Reactivos

Microscopio

Sangre

Porta y cubreobjetos

Alcohol antiséptico

Tubos de ensayo

Solución de almidón 5%

Papel milimétrico

Solución de lugol

Gradilla para tubos de ensayo

Soluciones hipo, iso e hipertónica de cloruro de sodio

Lancetas estériles

Solución de permanganato de potasio 0.5 M

Vaso de precipitado de 250 ml Papel celofán Algodón

Dicromato de potasio al 0.5 M violeta de genciana Suero Ringer 0.9% Gotero Hojas de lirio Tejido de cebolla

Experimento Se trabaja por pareja siguiendo el mismo procedimiento sólo se cambia los reactivos: Una pareja trabaja con permanganato de potasio. 21

Otra pareja trabaja con dicromato de potasio Y la tercera pareja trabaja con violeta de genciana. Difusión -.Coloque en tres tubos de ensayo 5 ml de agua destilada, a igual temperatura. -.Agregue en cada tubo un número de gotas de permanganato de potasio en la siguiente forma: -. Al tubo Número 1 se le adiciona una gota -.Al tubo Número 2 se le adiciona tres gotas -.Al tubo Número 3 se le adiciona cinco gotasMide el tiempo de difusión en cada caso, para ello anote el tiempo inicial cuando se agregó el colorante y el tiempo final en que se difundió totalmente. La diferencia entre ambos es el tiempo de difusión. Ahora se repite el trabajo con la variable de temperatura, el agua que se distribuye en los tubos debe estar a punto de ebullición Haga las dos gráficas en papel milimétrico de concentración (número de gotas) contra tiempo de difusión.

Osmosis 1.-actividad Deposite un pedazo de epidermis de cebolla en un portaobjeto Adicione tres gotas de solución hipotónica de cloruro de sodio póngale el cubre objeto y observe en el microscopio con menor a mayor aumento. Dibuje

22

¿Según el concepto de osmosis en qué sentido se debe fundir el agua? 2ª.-actividad Deposite un pedazo de epidermis de hoja del lirio en un portaobjeto Adicione tres gotas de solución hipertónica de cloruro de sodio Póngale el cubre objeto Observe en el microscopio con menor a mayor aumento. Que cambios observas en el citoplasma de las células

Que nombre recibe este fenómeno Diálisis Elabore una bolsa con papel celofán (tubo de diálisis) En la bolsa de celofán vierta solución de almidón al 5% Luego amarre el extremo de la bolsa Coloque la bolsa dentro de un tubo de ensayo con agua destilada Después añada lugol al agua del tubo de ensayo

Registra la coloración. Bibliografía Mathews, C. K., Van Holde K.E. and Ahern K.G. 2005. Biochemistry. Third edition. Addison Wesley Longman Inc. USA.p359-364 Stryer, L. 2003. Bioquímica. 5ª edición. Editorial Reverte. Barcelona España. P 345-363 Lehninger, A. 2003 Bioquímica ed. Omega. P-309-313

23

Informe

Apellido Paterno

Apellido Materno

Nombre

NĂşmero de mesa:___________ Fecha___________ NĂşmero de estudiantes_____

Entrada

Desarrollo

Informe

Definitiva

24

Práctica 4 Reacciones enzimática Objetivo: Predecir los mecanismos enzimáticos de hidrólisis, oxido reducción,

y actividades

enzimáticas

Introducción Las enzimas se consideran

de

mucha importancia

biológica como agentes

universales de toda actividad metabólica celular. Hoy en día la enzimología ocupa una posición importantísima en la investigación médica, biológica e industrial. Las mediciones se han vuelto herramienta diagnóstica en la práctica médica. Por ejemplo las metástasis de un cáncer de próstata aumenta la cifra sanguínea de fosfatasa ácida; la alteración de fosfatasa alcalina reflejan cambios de formación de huesos y fenómenos de destrucción ósea cuando aumenta la transaminasa oxalacética - glutámica y la deshidrogenasa láctica, se piensa en infarto al miocardio y en lesión hepática. La transaminasa de glutamato se relaciona con hepatitis viral aguda, la ∞- amilasa con la pancreatitis y fosfatasa alcalina con diversas enfermedades óseas, ictericias, neoplasias hepáticas y mieloma múltiple. También se ha demostrado que gran variedad de agentes quimioterapéuticos ejercen sus efectos a través de la inhibición de ciertas enzimas.

25

En la investigación industrial, utilizan enzimas en la producción a gran escala de sustancias bioquímicamente importantes, en la fijación de nitrógeno de la atmósfera, y en el desdoblamiento o la síntesis del productos `petrolífero Para comprender la eficacia de las enzimas como catalizadores biológicos, en condiciones óptimas aceleran de 108

a 10

11

veces una reacción respecto a la

velocidad que mostraría sin enzimas. La velocidad de una reacción puede ser regulada por inhibición por sustrato o producto. Los reguladores catalíticos llamados cofactores enzimáticos pueden ser iones mono y divalentes como ejemplo: K+, moléculas orgánicas

Na,

+

Mg++ ,

Ca++

Fe++ y porfirina, o

complejas denominadas coenzimas como por ejemplo los

dinucleótidos de nicotinamida y adenina, o de flavina y adenina. La Unión Internacional de Bioquímica estableció la clasificación y nomenclatura sistemática para las reacciones catalizadas por enzimas. Unidad enzimática se define como la cantidad capaz de catalizar la transformación de un µmol de sustrato por minuto en condiciones estándar de 30ºC. Existen dos casos especiales: 1.-Cuando el sustrato es un biopolímero en el cual es atacado por más de un enlace, se emplea en lugar de un µmol

un µequivalente del grupo atacado.

2.- En el caso de las reacciones biomoleculares, la base de la valoración es un µmol de sustrato A ó B, pero si A=B, como cuando la reacción tiene lugar dos moléculas idénticas la base utilizada debe ser 2 µmoles

de A. De esta forma todos los casos

se toman como índice de rapidez de la reacción un ciclo de la misma.

26

Existen varias formas de observar las reacciones enzimáticas y se pueden medir de las siguientes formas: 1.-La desaparición del sustrato 2.- la cantidad de producto formado 3.-Los cambios físicos de los grupos prostéticos o las coenzimas durante la catálisis.

Reacciones: hidrolíticas de la amilasa. Nombre sistemático: 1,4- glucano-4-glucano hidrolasa. Se obtiene α amilasa de la saliva, y del páncreas del hombre,

y de los microorganismos Pseudomonas y

Aspergillus. Existen dos grandes grupos de amilasas α y β. Las amilasas

β hidrolizan

rápidamente la porción amilósica del almidón hasta maltosa. Rompen enlaces α 1,4 glucano

de polisacáridos eliminando unidades sucesivas de maltosa a partir del

extremo no reductor de la cadena, Las reacciones de α amilasa son más lenta que las amilasas β. La saliva producida por las glándulas submaxilar, sublingual y parótida y también por las glándulas que se encuentran en las mucosas de la boca, garganta y esófago, contiene aproximadamente 99.5 por 100 de agua; la sustancia sólida es amilasa salival (ptialina), varias proteínas (una de las cuales es la mucina, una glicoproteína, varios iones inorgánicos como Ca++, Na+, K+, Mg++, Cl_, HCO3_ y fosfatos y compuestos orgánicos como aminoácidos urea, ácido Úrico y colesterol.

27

Materiales y equipo

Reactivos

Vaso de precipitado de 250 ml

Parafina

Tubo de celofán para diálisis

Solución de yodo 0.01 M

Embudo

Solución de NaCl 0.1 M

Pipeta de 10 ml

Agua destilada

Vaso de precipitado de 1000 ml

Solución de sulfato de sodio Na2 SO4 0.1M

Placa de calentamiento con agitación

Saliva dializada diluida

Termómetro

Saliva inicial diluida

Tubos de ensayo de 18x150 mm

Solución de Almidón soluble al 1%

Pipeta de 5 ml 2 Probetas de 250 ml Vidrio de reloj o portaobjeto con depresión

Metodología: Los alumnos trabajan en grupos de dos durante todo el experimento. Recolección de saliva El voluntario se enjuaga cuidadosamente la boca con agua, mastica un pequeño pedazo de parafina para estimular la producción de saliva. La saliva de colecta en un vaso de precipitado. En ciertas personas, la saliva presenta una actividad de amilasa muy débil o nula; no hay razón de preocupación.

28

Comparación de la actividad de la amilasa de la saliva dializada y no dializada Medir el H2 O2 no atacado mediante titulación por permanganato

Dializar Se toma un segmento de tubo para diálisis de 12.5 cm, se cierra amarrando un extremo. Con un embudo se vierten cinco mililitros de saliva en la bolsa y se cierra el extremo superior, la bolsa se sumerge en 400 ml de agua destilada y se espera una hora o más para que tenga tiempo para la diálisis. A los 20 y 40 minutos se cambia de agua y por ratos se agita con cuidado la bolsa dializadora. Pruebas preliminares con saliva no dializada Para conocer en forma aproximada la actividad de la amilasa en la saliva problema. Es conveniente establecer la dilución necesaria para hidrolizar el almidón hasta el punto acromático. Se alcanza este punto cuando al añadir saliva a la solución de yodo ya no produce coloración en un lapso de cinco minutos a 37 ºC. Procedimiento Se incuban durante dos minutos a 37 ºC unos 10 ml de solución de almidón al 1%. En un tubo de ensayo de 18x 150 mm. Se añade 2 ml de saliva diluida 20 veces con agua destilada, se homogeniza, y se incuba a 37ºC Cada 30 segundos se hace la reacción con el yodo de la siguiente forma, toman tres gotas y lleva a la placa para unirlo a las dos gotas de yodo al 0.01 M. Se toman datos hasta que prueba del almidón con el yodo sea negativa. Si el tiempo de incubación para que la prueba acromática es de tres minutos o menos se repite diluyendo más la saliva inicial y se repite todo el proceso hasta 29

encontrar la dilución que en estas condiciones, permita alcanzar el punto acromático en tres a ocho minutos. Cuando el tiempo lo permite se continua con la prueba dializada.

Activación de la amilasa salival Una vez terminada la diálisis se vierte cuidadosamente el contenido de la bolsa en una probeta graduada. Se añade agua destilada hasta obtener la dilución equivalente a la que permitió obtener el punto acromático. Se pasan 5 ml de saliva inicial a una probeta graduada y se prepara una dilución equivalente. Homogenizar las soluciones. Se prepara la serie de cinco tubos de acuerdo al cuadro de activación de la amilasa salival con excepción de la saliva, se añade la saliva después de la incubación de cinco minutos a 37ºC y toma como tiempo cero cuando se agrega en la forma indicada en el cuadro 2. A intervalos de un minuto se toman tres gotas de cada mezcla y se prueba con el yodo estableciendo el tiempo necesario para que cada mezcla llegue al punto acromático

30

Cuadro 2. Reactivos para la activaci贸n de la amilasa saliva Reactivos

Almid贸n al

Tubo 1 ml.

10

Tubo 2 ml.

10

Tubo 3 ml. Tubo 4 ml.

10

10

Tubo 5 ml.

10

1 por 100

Cloruro de Sodio

1

1

Na Cl 0.1M

1

Agua (H2O)

1

Destilada

1

Sulfato de Sodio Na2 SO4 0.1 M

Saliva dializada Diluida

Saliva inicial

2

2

2

2

2

Diluida

驴Qu茅 permite concluir este experimento respecto a las propiedades de esta enzima? 31

¿De qué manera afecta la diálisis de la saliva a la capacidad de hidrolizar

el

almidón?

Parte B Catalasa

Nombre sistemático: oxido-reductasa de peróxido de hidrógeno. Peso molecular 250 000. La catalasa es una enzima que s encuentra en todas las células vivas (con algunas excepciones, por ejemplo, los microorganismos anaerobios),pero es abundante en la sangre y el hígado. De

estos dos tejidos, se obtuvo en forma

cristalina. La enzima es muy específica y no actúa sobre ningún otro sustrato natural distinto del H2 O2 H2 O2 ↔ H2 O + ½ O2. El peróxido de hidrógeno es un producto de varias oxidaciones celulares, y se piensa que la catalasa de las células permite evitar la acumulación de H2O, la catalasa es una de las enzimas más poderosas que se conocen, y su número de reposición es de 5x106 a 0ºC. Materiales

Reactivos

Soporte universal

Peróxido de hidrógeno H2 O2

Pinzas

Acido sulfúrico H2SO4 2N

Bureta de 50 ml

Permanganato de Potasio 0.1 N

Pipetas de 1, 5,10 ml

Soluciones amortiguadoras de fosfato 0.02M

32

Matraz E.

Hielo

Embudo

Agua destilada

Cronómetro

Sangre humana Hígado de res o rata Riñón de res o rata

Metodología Determinación del volumen de Enzima catalasa Cuadro 3. Determinación del volumen de enzima Matraz

H2O2 ml.

H2O ml.

H2SO4

Enzima

H2SO4

T=min

ml.

T=min

1

.5

8.0

3

0.5

-

2

1.5

8.0

-

0.5

3

3

1.5

7.5

3

1.0

-

4

1.5

7.5

-

1.0

3

5

1.5

6.5

3

2.0

-

6

1.5

6.5

-

2.0

3

7

1.5

5.5

3

3.0

-

8

1.5

5.5

-

3.0

3

9

1.5

4.5

3

4.0

-

10

1.5

4.5

-

4.0

3

33

En los matraces con número impar se le añade acido sulfúrico en el tiempo cero antes Numere los matraces Añade peróxido de hidrógeno la enzima y agua En todos los matraces se le agrega la enzima, en los matraces con número par no añada acido sulfúrico y ponga a funcionar el cronómetro homogenizando Espere el tiempo indicado (1 minuto) para añadir el ácido sulfúrico. Mezcle y titule con permanganato Evaluación Hacer la gráfica representativa del número de moles de H2O2 descompuesto por minuto en función del volumen de enzima de la catalasa empleado. En base a la gráfica el grupo escogerá el volumen de enzima de la catalasa que usará en el siguiente experimento.

Determinación de tiempo de Reacción Cuadro 4. Determinación del tiempo de reacción de la enzima Matraz

H2O2 ml.

H2O ml.

Enzima

T(minutos) H2SO4

1

1.5

8.0

X

-

-

2

1.5

8.5x

X

1

3

3

1.5

8.5-x

X

2

3

4

1.5

8.5-x

X

4

3

5

1.5

8.5-x

X es el volumen de la enzima elegida en la experiencia anterior

34

El ácido sulfúrico se agrega después de transcurrido el tiempo programado a partir de de la adición de la enzima excepto en el matraz número uno. Titule el H2O2 presente en el matraz. Haga una gráfica que represente la cantidad de moles de H2O2 descompuestos en función del tiempo de incubación y en base a ello elija el tiempo de incubación que empleará en experimentos posteriores.

Ureasa Introducción La ureasa consta de seis subunidades estructurales iguales. Es una enzima muy específica, que existe

en varios tejidos vegetales, semillas, microorganismos e

invertebrados por ejemplo el haba de soya. Esta enzima cataliza la siguiente reacción: Urea +H2O →CO2 + 2NH3 La ureasa se utiliza como catalizador en laboratorios clínicos para la medición cuantitativa de la urea. Las investigaciones sobre la ureasa también permitieron deducir un principio de las reacciones enzimáticas que es la función de los grupos sulfidrilo en estas catálisis. La ureasa tiene tres o cuatro grupos sulfidrilos activos. Catalizar la urea a bióxido de carbono y amonio con acción de la ureasa

35

Materiales

Reactivos

Pipeta de 1 ml

Urea (fertilizante de pura urea) al 10%

6 tubos de ensayo

Acido cítrico al 10%

Gradilla

Bicarbonato de sodio al 10%

Licuadora

Indicador de repollo morado

Papel filtro

Enzima preparada con granos de soya secos

Embudo

Agua destilada

Vaso de precipitado de 250 ml

Col morada Granos de soya

Procedimiento: Preparación de enzima 1.-Remojar las semillas (1 g) por lo menos una hora (de preferencia toda la noche) 2.-Desintegrar las semillas (licuar) con 10ml de agua por cada gramo de soya, el agua del remojo puede usarse. 3.-Filtrar la mezcla con papel filtro en un embudo 4.-conservar el filtrado que contiene la enzima ureasa. Preparación de indicador 1.- Cortar dos hojas de col morada, colocarlas en un vaso de precipitado, adicionar 200 ml de agua recién hervida y remoje las hojas. 2.-Después de cinco minutos, decantar el líquido, tirar las hojas. 3.- conservar el líquido que es el indicador de pH

36

Experimento Probar el comportamiento de la soluci贸n indicadora con diferentes pH

Cuadro 5. La influencia del pH en el color del extracto de la col morada tubo

indicador

Ac.citrico

Bicarbonato

ml.

Gotas

gotas

1

3

2

3

3

3

Agua

2 2 2

Homogenizar, observa y registra los datos

Experimento

Cat谩lisis de la urea con la ureasa de soya Para inducir la actividad de la enzima ureasa de soya se sigue los pasos indicados en la tabla siguiente

37

Cuadro 6. Efecto de la ureasa de soya en la urea tubo

indicador

Urea ml

Ureasa

ml.

1

2

2

-

2

2

2

2

3

2

_

2

Observar los colores y olores de las mezclas, registrar datos de tiempo cero y a los 3 minutos. Interpretar los resultados.

Bibliografía Mathews, C.K., van Holde K.E. and Ahern K.G. 2000. Biochemistry. Third edition. Addison Wesley Longman Inc. USA.

Rendina, G. (1974) Técnicas de Bioquímica aplicada. editorial Interamericana 1ªedición al español Stryer, L. 1995. Bioquímica. Cuarta edición. Editorial Reverte. Barcelona España.

38

Informe

Apellido Paterno

Apellido Materno

Nombre

Número de mesa:___________ Fecha___________ Número de estudiantes_____

Entrada

Desarrollo

Informe

Definitiva

Diseña una tabla para presentar los resultados Anexe las gráficas realizadas y pegue en el espacio a continuación Interprete sus resultados experimentales sea breve y ordenado

39

PRÁCTICA 5 Fosforilación oxidativa en hígado de rata Objetivo: Aislar mitocondrias y por reacciones de oxido reducción determinar la presencia de fosfato y la respiración Introducción La fosforilación oxidativa es un proceso metabólico que utiliza energía liberada por la oxidación de nutrientes para producir adenosín trifosfato (ATP). El mecanismo de la fosforilación oxidativa se explica mediante la teoría quimiosmótica de Mitchell que plantea que la energía proveniente de la oxidación de los sustratos en la cadena respiratoria está vinculada a la translocación de iones hidrógeno (protones H+ ) desde dentro hacia fuera de la membrana mitocondrial interna. La diferencia de potencial electroquímico que resulta de la distribución asimétrica de los iones hidrógeno se utiliza para impulsar el mecanismo con el que se forma el ATP ( Harper 2004) La síntesis de ATP como consecuencia del paso de electrones de un sustrato al oxígeno, a lo largo de la cadena de citocromos portadores, recibe el nombre de fosforilación oxidativa o aerobia. (Mackee 2003) Existen sustancias que pueden desacoplar la fosforilación; o sea permite que haya oxidación en los sustratos, pero inhiben la fosforilación, como algunos nitro fenoles y halo fenoles, colorantes como el azul de metileno, el Ca+2 y los antibióticos como la aureomicina y la gramicidina, son agentes desacoplantes muy eficaces. La hormona tiroidea también puede desacoplar las fosforilaciones; quizá esta propiedad esté relacionada con su papel regulador del metabolismo. (Stryer 2003) 40

El potencial redox de las formas oxida y reducida del azul de metileno (AM+2H ↔ AM.2H) es parecido al complejo ubiquinona CoQ +.2H ↔ CoQ. 2H. Por lo tanto, el azul de metileno puede competir muy favorablemente con la ubiquinona por los equivalentes reductores y en este caso es posible que se utilicen dos caminos de flujo de electrones a partir de glutamato. Durante la respiración activa la respiración aeróbica compite ventajosamente con el azul de metileno y por consiguiente el colorante solo se decolora parcialmente, hasta que haya reaccionado todo el oxígeno, en este momento el azul de metileno se decolora completamente porque la cadena respiratoria deja de funcionar, si se agrega un agente des acoplador como el 2,4dinitrofenol, la velocidad de respiración se aumenta y el cambio de color ocurre más rápido. El cianuro bloquea el flujo de electrones inhibiendo la citrocromo oxidasa, la cual actúa al final de la cadena. En presencia de cianuro el azul de metileno se decolora muy rápido, pero no pierde totalmente el color, ya que el colorante es oxidado fácilmente por el oxígeno molecular que aún se encuentra presente.

Materiales

Reactivos

Homogenizador axial eléctrico y con Rata motor Ultracentrifuga refrigerada

Hielo

Baño maría a 37ºC con agitador

Dinitrofenol 5mmol/l

Papel filtro

Azul de metileno 25mmol/l

Vaso de precipitado de 100

Cianuro de potasio (veneno) 20mmol/l

41

Balanza

Sacarosa

1mol/litro

que

contiene

MgCl a 25 mmol/l Tubos de ensayo

Ácido tricloroacético 100mg/l

Pipeta graduada de 1 ml

Parafina líquida

Tubos para centrifuga

Cilindro de nitrógeno

Nevera

Glutamato de hidrógeno y sodio 0.2 mol

Recipiente como contenedor de hielo

Medio de incubación(sacarosa 300 mmol /l, EDTA 0.5mmol/l Glucosa KH2PO4 EDTA ATP NAD Albúmina de suero bovino Hexocinasa

Metodología Preparación de medio de incubación Mezcla los reactivos de acuerdo al cuadro 8

42

Cuadro 7. Componentes para medio de incubación Reactivos

mmol/l

Glucosa

150

KH2PO4

50

EDTA

3

NAD

0.2

ATP

3

Albumina de suero

bovino

Hexocinasa

mg/ml

-

2.5

-

0.5

Prepara la mezcla con las cantidades

de soluto necesarias, pero con menos

cantidad de agua, seguidamente con un hidróxido se ajusta el PH a 7.4 y completa el volumen hasta obtener el volumen para obtener las molaridades. Añade el ATP y es convertido a ADP por la enzima hexocinasa. EDTA remueve metales pesados que pueden encontrarse como contaminantes de los reactivos de los reactivos. NAD se incluye para suplir cualquier pérdida que ocurra al aislar las mitocondrias. Albúmina de suero de bovino remueve a los desacopladores de la fosforilación oxidativa tales como ácidos grasos de cadena larga, que puedan acumularse en mitocondrias aisladas. Aislamiento de mitocondrias: Las soluciones y aparatos requieren refrigeración de 4ºC

43

Mata una rata por dislocación de cuello, sangrarla y rápidamente extrae el hígado. Lava el tejido con el medio de sacarosa previamente enfriado con hielo para remover la sangre. Con ayuda de papel filtro eliminar el exceso de humedad y transferir el hígado previamente pesado a un vaso de precipitado. Agrega 10 ml de medio de sacarosa, por cada gramo de hígado, homogenice en el homogenizador coaxial a 2400 rev/min, mueva el vaso de arriba abajo por 8 a 10 veces Centrifuga con refrigeración la suspensión a 600 g durante 10 minutos Separa el líquido (contiene mitocondrias) consérvalo en hielo El sólido (contiene núcleos y partículas celulares) se re suspende con la mitad de volumen de medio de sacarosa y se centrifuga con refrigeración a 600g durante 10 minutos El líquido de esta centrifugación de une con la anterior y se centrifuga con refrigeración nuevamente a 8000g durante 10 min Al final de la centrifugación las mitocondrias se encuentran en el sedimento. Prepara cinco tubos, dos para la determinación de fosfato y los otros tres tubos para la captación de oxígeno (respiración) los reactivos se deben adicionar de acuerdo al orden del cuadro 8 y por cada reactivo mezclar fuertemente. Lleva los tubos 1,2 a incubar a 37ºC en el minuto cero, se agrega la suspensión de las mitocondrias. Se mezcla fuertemente y de inmediato Determinación de la presencia de fosfato: Toma 0.2 ml de muestra y se llega a dos mililitros con agua destilada Agrega 0.2 ml de azul de metileno y observa

44

A cada cinco minutos se hace la prueba para determinar la presencia de fosfato hasta la ausencia de color del azul de metileno. Respiración Agrega sin agitar, 2 ml de parafina líquida a los tubos 3 ,4 y 5 e incube a 37ºC, observa los cambios con relación al tiempo (cuadro) Cuadro 8. Determinación de fosfato y captación de oxígeno Fosfato Reactivos

Respiración

Tubo1

Tubo2

Tubo

Tubo4

Tubo5

ml

ml

ml

ml

ml

de 1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

Glutamato de sodio 0.2mol/l

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

2,4dinitrofenol 5mmol/l

-

0.1

-

0.1

-

Azul de metileno 0.25g/l

-

-

0.2

0.2

0.2

Cianuro de potasio 50mmol/l

-

-

0.1

-

-

Sacarosa 1mol/l que contiene Mgcl2

0.6

0.6

0.6

0.6

0.6

Suspensión mitocondrial (lava dos veces 0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

Solución de sacarosa como medio incubación

con medio de incubación)

Bibliografía Harper 2004 Bioquímica ilustrada 16ªed. Manual Moderno p105-111 Stryer, L. 2003. Bioquímica. 5ª edición. Editorial Reverte. Barcelona España. P 345-363 McKee, T, Mackee, J. (2003) Bioquímica McGraw-Hill.Interamer

45

Informe

Apellido Paterno

Apellido Materno

Nombre

Número de mesa:___________ Fecha___________ Número de estudiantes_____

Entrada

Desarrollo

Informe

Definitiva

Observa las reacciones, toma datos, interprétalos y regístralos.

46

Practica 6 Fotosíntesis

Objetivo: aislar cloroplasto para la réplica de reacciones fotoquímicas y determinar el comportamiento inhibitorio de DCMU 3(3,4 diclorofenil) 1,1-dimetil urea (herbicida). Se trabajara con tres muestras maíz, frijol y espinaca, los alumnos se organizan en parejas con muestra diferente. Introducción La fotosíntesis es la transformación de energía solar en compuestos orgánicos en presencia de los pigmentos en las plantas son compuestos solubles en solventes no polares y se localizan formando complejos pigmentos- proteína, en la lipídica de las membranas tilacoidales de los cloroplastos (MacKee 2003)

El proceso incluye la oxidación del agua, el desprendimiento de oxígeno y la reducción de CO2 a azúcar H2O +CO2

CH2O +O2

La reducción del CO2, incluye una serie de reacciones complejas que clasificarse en dos grupos: a) Las reacciones de luz transporte de electrones e- acoplada

(absorción y transferencia de energía,

a la formación de compuestos de alta energía:

ATP y NADP). b) Reacciones bioquímicas (ciclo de Calvin ). Ambas reacciones ocurren en el estroma o región acuosa que rodea a los tilacoides. El cloroplasto es responsable de colectar la energía lumínica por dos sistemas: Fotosistema I (PS I; P700) y el fotosistema II (PSII; P680).En estos sistemas se encuentran pigmentos especializados para la absorción de luz: Clorofila ( a, b) y carotenoides , la mayoría 47

de estos pigmentos sirven de antena, colectando la radiación y transfiriendo por resonancia la energía a los centros de reacción donde se llevan a cabo las reacciones químicas que almacenan esta energía. Las funciones de los centros colectores de luz tiene tres funciones que contribuyen a la utilización del quantum de luz para producir intermediarios químicos de alto estado energético. 1.-Absorción de luz: la energía del fotón es capturada por el pigmento antena y el electrón es excitado 2.-Transferencia de energía: la energía de excitación se

transfiere a través la antena hacia los centros de reacción por resonancia, con lo cual se excitan los electrones e-

3.-Transferencia del electrón : el e- excitado

pasa desde el centro de reacción hacia un aceptor químico y el centro de reacción oxidado es reducido por un nuevo e- proveniente de moléculas orgánicas, inorgánicas o del agua

La radiación absorbida es utilizada para iniciar la

transferencia de e- desde los fotosistemas hacia una serie de compuestos actúan como donadores y aceptores. Los dos fotosistemas y la cadena transportadora de e- forman una secuencia que se conocen como esquema z de la fotosíntesis. El aceptor final es el NADP+ que se reduce a NADPH. La energía radiante también es utilizada para generar un gradiente de protones que sirve para la síntesis de ATP. La etapa lumínica, se desencadena cuando el fotosistema I (PS I) absorbe un fotón, este PS I emite un electrón que es aceptado por una proteína, la Ferredoxina. Este fotosistema queda por lo tanto con carga positiva. La ferredoxina ahora reducida, transporta electrones al NADP+ el cual, juntamente con H+ provenientes de la fotooxidación del H2O, es reducido a NADPH.(Matheus 2005)

Por otro lado, el PS II también es excitado por la luz y sus electrones son llevados a un nivel de alta energía donde son aceptados sucesivamente por una cadena 48

transportadora específica. Finalmente los electrones son aceptados por el PS I que había quedado positivo, restituyendo así su estado inicial. El flujo de electrones desde el PS II al I es un transporte exergónico, esta energía se emplea para bombear H+ a través de la membrana tilacoidal hacia el interior de ésta. Los H+ regresan luego desde el interior hacia el estroma a través de canales especiales de la membrana del tilacoide formados por los complejos CF0 Y CF1. (Boyer 2001) Mientras tanto el PS II que había quedado con carga positiva, para recuperar su estado inicial, promueve la oxidación (fotólisis) del H2O y capta sus electrones, quedando así restituida su carga eléctrica. Se producen H+ que, contribuyen a la reducción de la coenzima NADPH. El O2 que resulta de la oxidación de la molécula de H2O, se libera al medio. La PEP caboxilasa posee mayor afinidad por el CO2 que las RUDP carboxilasa o Rubisco (enzima que cataliza la incorporación del CO2 a la ribulosa di P). Incluso a bajas concentraciones de CO2, la enzima funciona rápidamente para fijarlo al PEP. En comparación con la Rubisco, fija el CO2, más pronto y a niveles más bajos, manteniendo más baja su concentración dentro de la hoja. Esto provoca que se cree un gradiente de concentración entre las células y su medio ambiente. Por lo tanto cuando la planta abre sus estomas el CO2 difunde rápidamente con gran eficiencia al interior de la hoja. En consecuencia las plantas C4 poseen una gran venta en las regiones cálidas y áridas. Resumiendo, la función del C4 es aumentar la cantidad de CO2 incorporado a la atmósfera, en condiciones bajo las cuales no puede intervenir eficazmente la ribulosa difosfato (C3). La síntesis de glúcidos a partir del CO2 fijado vía C3, o vía C4, se realiza a través del ciclo de Calvin. 49

En la experimentación la mezcla que se obtiene de la extracción de tejido foliar con solventes orgánicos, contiene clorofila a, b y carotenoides; debido a la diferencias estructurales existentes entre estos pigmentos, tienen distintos espectros de absorción de luz, la clorofila a y b tienen máximo de absorción de luz en la zona azul y roja del espectro, los carotenoides solo absorben en la zona azul. Si se le suministra donadores y aceptores de electrones apropiados. como los colorantes azul de metileno ó rojo de metilo (aceptor), acido (donador). El colorante conserva el color cuando está oxidado y en la forma reducida se transforma en incoloro .Una característica más de la clorofila es la reacción de sustitución del átomo de magnesio del anillo porfirínico por otros átomos; ejemplo la clorofila puede dar lugar al pigmento feofitina (coloración parda) cuando en medio ácido, se sustituye el átomo central del magnesio por los protones del ácido. El restablecimiento de la coloración verde se puede lograr con el desplazamiento del protón por otro metal diferente al magnesio, es decir con el restablecimiento de un metalorgánico

Metodología (Todos los materiales y soluciones deben conservar y trabajar en frío)

50

Materiales Hojas de: espinacas, Maíz y frijol

Reactivos Medio de maceramiento (Tris- HCl 40mM (pH8.0), NaCl 350 mM)

pH metro,

Medio de re suspensión (Tris HCl 40 mM(pH 6.8),NaCl 350mM

Fotocolorímetro

DCFIF al 0.01% (2,6-diclorofenol indofenol)colorante

Termómetro

DCMU 3(3,4diclorofenil) 1,1-dimetil urea (herbicidas)

Fuente de luz

Balanza

Cubeta de vidrio

Hielo

3 Pipetas graduadas de 1 ml 3Pipetas graduadas de 10 ml Tubos de ensayo 33 1 Licuadora Gasa Centrífuga, tubos 10 tubos para centrifugar Papel de aluminio Varilla de vidrio

Se analizan hojas de espinaca, maíz y frijol Aislamiento de cloroplastos

51

Procedimiento (Todos los materiales y soluciones deben conservar y trabajar en frío) Se analizan hojas de espinaca, maíz y frijol Lava y seca las hojas con papel filtro Elimina la nervadura central Pesa 20 g de hojas por muestra corta en pedazos de aproximadamente un cm por lado Licua 20 g de muestra con 50 ml de solución de maceración a baja velocidad 10 segundos, a baja velocidad y por 20 segundos a alta velocidad Filtra a través de cuatro capas de gasa dentro de un tubo de centrífuga. Centrifuga a 4000rpm por cuatro minutos Descarta el líquido Re suspende el líquido en 50 ml de solución de re suspensión (Tris-HCl 40mM PH 6,8), NaCl 350mM) agitando suavemente con un hisopo. Esta preparación consiste principalmente de cloroplasto tipo II (sin envoltura y sin estroma) Todo el trabajo se lleva a cabo a 4ºC Para continuar los trabajos experimentales se requiere hacer una curva de calibración

52

Curva de calibración con DCFIF (colorante) Se trabaja con solución madre de DCFIF (colorante) al 0.01%(g/ml) prepara diluciones de acuerdo al cuadro 10 Cuadro 9. Curva de calibración de DCFIF Reactivo

Tubos (ml) 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1 1

DCFIF

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

0

0.9

0.8

0.7

0.6

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

0

1

0.001

0.002 0.003 0.004 0.005 0.006 0.007 0.008 0.009 0.01

0.01%(g/ ml) Agua destilada Dilución total

Para obtener la curva de calibración del fotocolorímetro con DCFIF (colorante) con una serie de diez tubos con diversas concentraciones como se aplica en el cuadro anterior y como blanco se usa solo agua. Posteriormente se lee con densidad óptica a 610 nm de cada tubo. Elabora una grafica de Densidad óptica contra µm de DCFIF. e interpreta los resultados.

53

Medición de la actividad Fotoquímica Efecto de la concentración de cloroplastos Prepara dos tubos forrados con papel aluminio y se procede de acuerdo al siguiente cuadro

Cuadro 10. Actividad fotoquímica Reactivos

Tubos (ml) 1

Suspensión

2

3

4

de 0.3

0.5

0.3

DCFIF 0.01%

0.3

0.3

-

Medio de

9.4

9.2

9.7

0.5

cloroplastos

9.5

suspensión

Determina la cantidad de DCFIF reducido de la siguiente forma Ajusta la absorvancia a 0% con el blanco correspondiente. Mide la DO inicial de los tubos a 610 nm. Quita el papel aluminio y coloca los tubos en la gradilla que se encuentra entre hielo, cuida que la temperatura del baño no exceda A 15ºC Ilumina a 180µM m-2 S-1 (radiación fotosintética activa RFA) por 15 minutos exactos Coloca nuevamente el papel aluminio y mide la absorbancia final a 610 nm

54

Calcula la diferencia ∆DO=DO inicial ─ DO final Compara los datos obtenidos con la gráfica de la curva de calibración Determina los µM de DCFIF que se redujeron Efecto del tiempo de exposición Se prepara la serie de tubos como sigue Cuadro 11. Reactivos para la exposición a la luz

Reactivos

Tubos (ml) 1

Suspensión

2

de 0.3

0.5

0.3

0.3

de 9.4

9.2

3

4 0.3

0.5

9.7

9.5

cloroplastos

DCFIF 0.01% Medio suspensión

Determine la cantidad de DCFIF reducido de la siguiente manera: Mida la DO inicial de los tubos a 610 nm, recuerde llevar la absorbancia a 0% con tubos control (tubo 3 y 4) Los tubos se exponen a intensidades lumínicas 40 y 180µM m-2 s-1 durante los siguientes minutos: 1, 5, 15, 20, 25. Al término de cada tiempo se hace la lectura en el fotocolorímetro. Al concluir con las lecturas exprese los resultados como µM de DCFIF reducidos utilizando la curva de calibración. 55

a) Efecto inhibitorio del DCMU (3-(3,4diclorofenil)1-1dimetil urea El DCMU (3-(3,4diclorofenil)1-1dimetil urea es muy tóxico, no se debe pipetear con la boca. Cuadro 12. Inhibición por DCMU Reactivos

Tubos ml 1

2

3

4

de 0.3

0.5

0.3

0.5

DCFIF 0.01%

0.3

0.3

DCMU

1

1 9.7

9.5

Suspensión cloroplastos

Medio

de 8.4

8.2

suspensión

Haga la lectura inicial con el ajuste de equipo con los tubos control Ilumina a 180µm en m-2 s-1 durante 15 minutos y se lee de nuevo Utilizando la curva de calibración expresa los resultados como µM de DCFIF reducido y calcule el % de inhibición

Bibliografía Mathews, C.K., van Holde K.E. and Ahern K.G. 2005. Bioquímica 3ª ed Pearson.p 665-696. McKee, T., McKee J. 2003 Bioquímica McGraw-Hill. Interamericana 417-444 Boyer, R. 2001Conceptos de Bioquímica ed. Thomson p 512-

56

Informe

Apellido Paterno

Apellido Materno

Nombre

Número de mesa:___________ Fecha___________ Número de estudiantes_____

Entrada

Desarrollo

Informe

Definitiva

Los resultados del trabajo Investiga diversos herbicidas que destruyen las plantas inhibiendo el transporte electrónico. Y explica el mecanismo de acción. De los herbicidas que presentas determina cuál, si es que hay alguno que sea tóxico para el ser humano y otros animales. Las reacciones efectuadas, los datos obtenidos, interpretación y conclusiones.

57

Unidad III Práctica 7

Aislamiento y determinación de propiedades químicas y físicas de las proteínas Objetivos: Aislar proteínas de diferentes fuentes: músculo, leche, albúmina y semillas Comprobar pruebas físicas y químicas de las proteínas mediante pruebas de laboratorio

Introducción Las proteínas son biopolímeros de L- α aminoácidos de alto peso molecular. En la naturaleza se encuentran veinte aminoácidos diferentes que integran las proteínas. Los aminoácidos al unirse integran una notable complejidad en formas y variedad de dimensiones. Las proteínas son componentes esenciales de todas las células vivas, su misión en el organismo es de dos tipos: una de tipo estructural, formando parte del organismo y la otra de tipo funcional. Por ello no existe un sistema universal para su clasificación, pueden clasificarse de acuerdo a su composición, a sus propiedades físicas, su estructura tridimensional , función biológica y solubilidad en soluciones salinas acuosas u orgánica.(Stryer 2003). Las proteínas solubles en agua o en soluciones salinas diluidas pueden dividirse en dos grandes grupos, albúminas y globulina, según el efecto que ejercen las sales neutras sobre su solubilidad. 58

Las albúminas son muy solubles en agua o soluciones acuosas de fuerza iónica baja, pero precipitan con soluciones de fuerzas iónicas altas de sales neutras. Las globulinas son insolubles en agua pura, pero pueden disolverse en soluciones salinas por efecto de fuerzas iónicas bajas de sales neutras, es posible producir una nueva precipitación salina con una fuerza iónica

mucho mayor. Efecto de la

temperatura sobre la solubilidad. Algunas proteínas no presentan cambio de solubilidad por debajo de 35ºC; otras se hacen más solubles, o menos solubles para temperaturas inferiores a 35ºC. En cambio

la todas

las

proteínas sufren un

fenómeno de desnaturalización cuando la temperatura pasa de 35ºC y la alteración es total al llegar a 80ºC. Efectos de la constante dieléctrica sobre la solubilidad. Ciertas sustancias orgánicas como los alcoholes, éteres y cetonas,

reducen las

constantes dieléctricas de las soluciones acuosas de proteínas, disminuyen también su afinidad por el solvente haciendo que las proteínas se disuelvan menos. Inversamente, los solventes orgánicos como el dimetilsulfóxido y la formamida que elevan las constantes dieléctricas de las soluciones acuosas, también aumentan la solubilidad de las proteínas. (Mathews 2005). Experimento Este experimento consta de tres partes: En la primera parte se hace el aislamiento de proteína La segunda parte consiste en hacer pruebas de solubilidad de las proteínas aisladas En la tercera parte llevan a cabo el análisis cuantitativo de proteínas por el método de Biuret. El trabajo se distribuirá en cuatro equipos:

59

El equipo 1 prepara miosina de músculo estriado de conejo El equipo 2 Caseína de la leche El equipo 3 albúmina cristalina de huevo El equipo 4 prepara globulina cristalina a partir de semillas de calabaza. Las proteínas aisladas por cada equipo deben ser en soluciones de l al 3 Extracción de miosina en músculo de conejo:

Materiales

Reactivos KCl 0.6M

Balanza Probetas 250

Agua destilada

Vaso de precipitado de 500 y de 1000 ml Embudo Tela de gasa Centrífuga con refrigeración Contenedores para centrifuga de 250ml

Metodología -Por cada 30 g de músculo molido, (puede ser con ayuda de mortero) -Añade 100 ml de solución salina de extracción (KCl al 0.6M previamente enfriada) 60

-Suspende el tejido en solución de extracción en un vaso grande de precipitado - Agita durante 20 minutos con varilla de vidrio _Adiciona 300 ml de agua destilada fría. - Mezcla y filtra con gasa (varias capas) -Diluye a un litro. Deja reposar en refrigeración una noche -Centrifuga durante cinco minutos a 13000 rpm -Suspende de nuevo la miosina en KCl 0.6 M bajo la forma de 0.5 por 100. -Conserva el líquido sobrenadante transparente en refrigeración que servirá para el análisis cuantitativo. . Experimento

Aislar caseína de la leche por punto isoeléctrico. La caseína (del latín caseus, queso) fosfoptroteína predominante de la leche y queso, no precipita con el calor. Precipita por la acción

de la renina (enzima

proteolítica presente en el estómago de terneros) para formar la paracaseína. La enzima tripsina reduce la caseína a un hidrolizado fosfato llamado peptona. El punto isoeléctrico (PI) de la caseína es de 4.6. a este pH, la caseína se encuentra en su punto de menos solubilidad debido a

reducciones de repulsiones

intermoleculares, por lo que precipita. El producto final se obtiene en forma de caseinato de sodio, después de neutralizar la caseína con hidróxido de sodio. (Rendina 1974)

61

Materiales

Reactivos

Vaso de precipitado capacidad litro

500 ml de leche descremada

Matraz E. capacidad litro

Agua destilada

Potenciómetro

HCl al 2%

Filtro Buchner

Soluciones Buffer para calibrar el pH metro

Papel filtro triple espesor

AgNO3 1%

Agitador magnético

Alcohol etílico al 95%

Centrífuga

Éter

Contenedor para centrífuga de 250 ml

NaOH 0.01N

Metodología -Diluir 500 ml de leche descremada con 1.5 litros de agua de la llave - Adiciona aproximadamente 50 ml de HCl al 2% hasta que llegue a pH 4.8 medido con pH metro -Agita 10 minutos -Deja sedimentar 30 minutos -Decanta Volumen aproximado de un litro -Decanta de nuevo. -Filtra la caseína con buchner de diámetro grande y papel filtro triple eliminar toda el agua -El sólido se transfiere a un vaso de precipitado de un litro

62

-Prepara una suspensión de la caseína en 150 ml de agua destilada y se lava hasta ausencia de iones cloruro. -Prueba la desaparición de iones de cloruro con AgNO3 al 1 % -Agita fuerte con un agitador o se utiliza centrífuga con recipiente de 250 ml para obtener el precipitado. -El residuo transfiérelo a un vaso y suspéndelo con 75 ml de alcohol etílico al 95% se agita durante cinco minutos. (repite este paso). -Extrae dos veces de la misma manera que la anterior, con única la diferencia que se usará éter, cada vez con 75 ml. -Filtra y se seca. -Con el producto obtenido, prepara una solución al 1% en NaOH 0.01N -Etiqueta, y refrigera

Experimento Aíslar albúmina de la clara de huevo por precipitación con sulfato de amonio. La clara de huevo contiene poli péptidos con características de glicoproteínas que integran una estructura bien organizada, gelatinosa y espesa. Actividad biológica: la finalidad es proteger al embrión cuando el huevo está fecundado, ya que actúa evitando que los microorganismos se desarrollen.

63

Materiales

Reactivos

Vaso de precipitado de 100 ml y

Acido acético 1N

Varilla de vidrio

Sulfato de amonio

Embudo

Acetona

Gasas Matraz E. 250 ml Baño de hielo Centrífuga Celdas para centrifuga Pipeta de 5 ml Embudo Buchner Balanza

-Separa la clara de la yema evitando que se rompa la yema -Transfiere la clara en una probeta, medir el volumen - Adiciona la decima parte de volumen de ácido acético 1N - Agita fuerte con la varilla de vidrio para acelerar el paso por la gasa -Filtra la albúmina acidificada a través de cuatro capas, agitando con varilla -Añade un volumen igual de la solución de sulfato de amonio amortiguado y agita -Deja reposar la solución durante 15 minutos en baño de hielo -Centrifuga

a 3000 rpm durante 10 minutos para separar la ovoalbúmina y ovo

mucina -El sobrenadante contiene la albúmina, añade pequeñas cantidades de solución de sulfato de amonio. Se notará una ligera turbidez que desaparecerá al agitar. Siga 64

vertiendo sulfato de amonio y agite hasta que la turbidez ya no desaparezca, agrega un poco más para permitir que la albúmina precipite. -Deja la mezcla a temperatura ambiente durante aproximadamente dos horas -Elimina el sobrenadante por centrifugación -Suspende la albúmina en 5 ml de acetona y recupera filtrando en embudo buchner Nota: Se puede conservar en forma de sólido seco (se puede secar extendiendo en papel aluminio y dejar hasta secarse por completo. -otra forma se vuelve a suspender la albúmina con solución bajo la forma de 1% en cloruro de sodio al 0.9%.

Obtención de globulina en semillas de calabaza Las semillas de calabaza contienen albuminoides, lecitina, globulina, sacarosa, fitina, y aceite constituido por glicéridos de los ácidos oleico, linólico, esteárico y palmítico, incluso algún aceite esencial, diversos fermentos. Pequeñas cantidades de algún alcaloide, vitaminas, sustancias de tipo hormonal, proteínas y aminoácidos, así como algunas sustancias poco conocidas en detalle. (Rendina 1974)

65

MATERIALES

REACTIVOS

50 gramos de semilla de calabaza NaCl al 10% (recién molida) Vaso de precipitado de 250 ml Termómetro Baño maría Embudo de cristal Tela de gasa Papel filtro Matraz E. de 500 ml Probeta de 500 ml Agitar eléctrico con calentamiento Balanza

Metodología - Coloca

los 50 g de semillas de calabaza recién molidas en un vaso de precipitado.

-Adiciona 200 ml de NaCl (cloruro de sodio) al 10% -Calienta a temperatura cerca de 50ºC durante una hora -Agita frecuente. - Después calienta a baño maría a 70ºC (no rebasar esta temperatura) - Filtra en dos capas de gasa - Si es necesario calienta y filtra de nuevo hasta tener líquido transparente. - Obtenido 100ml de filtrado

66

-Pásalo

al matraz de litro,

agrega 400 ml de agua destilada a temperatura de

60ºC y mantenerlo a la misma temperatura por 30 minutos. -Etiqueta y conservarlo para la siguiente sesión. -Separa las dos fases puede ser por centrifugación Con el sólido

haces la prueba de biuret con la dilución al 1% en NaCl

a la

concentración de 10%.

Análisis cuantitativo de proteínas por método Biuret El método Biuret es colorimétrico que permite determinar la concentración de proteínas de una muestra mediante espectroscopía ultravioleta visible a una longitud de onda de 540 nm para detectar el ion cu++ El amoniaco y sus derivados, incluyendo a los aminoácidos, forman iones complejos con Cu++ y otros iones metálicos. El ión de cobre y amonio Cu (NH3)4++ Además de estos complejos de cobre con aminoácidos, existen iones complejos más complicados a base de cobre y péptidos o proteínas, en los cuales el Cu++ se une con varios grupos péptidos. Estos complejos de cobre aparecen de manera especial en las soluciones alcalinas y muestran color rosa a violeta muy distinto de los complejos azules simples de tipo amonio y cobre. Las sustancias que tienen poseen dos enlaces peptídicos o más, por ejemplo los péptidos y las proteínas, se pueden identificar alcalinizando una solución de la muestra y añadiendo pequeñas cantidades de Cu++. La aparición de un color rosa o violeta se considera resultado positivo; un color azul, como el que podría dar un aminoácido simple, no debe confundirse con una prueba de biuret positiva.

67

Materiales

Reactivos

6 tubos colorimétricos

NaOH

Espectrofotómetro

Patrón Albúmina

Balanza

Agua destilada

Matraz de litro ml

CuSO4 5H2 O

Matraz de 500 ml

EDTA 2H2O

Probeta de 500 ml

NaCl Desoxicolato de sodio Yoduro de sodio Reactivo de Biuret

Preparación de reactivo de Biuret:

En un matraz aforado de un litro con 500 ml de agua destilada disuelve: 1,5 g deCuSO4 5H20 1,0 g de yoduro de sodio 6,0 g de EDTA. 2H20. Adiciona 300 ml de NaOH 2,5 mol/L Lleva a un litro con agua. Curva de calibración -Se requiere una solución patrón de albúmina a la concentración de 1g/L en NaCl al 0.9% como patrón primario contiene 1mg/ ml de albúmina -prepara una serie de seis tubos y adicionar los reactivos respetando el orden de la cuadro 14 y el reactivo Biuret de último.

68

- El blanco es el que contiene todos los reactivos pero excluye a la proteína y sirve para calibrar el equipo. -Espera unos 30 minutos -Lee en el espectrofotómetro a 540 nm

Cuadro 13. Curva de concentración de proteínas por espectrofotómetro

Tubo

REACTIVOS

1

2

3

4

5

6

Albúmina 1mg/ml , ml

0.1

0.2

0.5

1.0

1.4

Desoxicolato de sodio al 0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

10%, ml

NaCl al 0.9% ml

1.4

1.3

1.2

0.9

0.4

-

Reactivo Biuret ml

1.5

1.5

1.5

1.5

1.5

1.5

69

CALCULOS: Proteínas totales g/L = Am-Ap XCp, donde Am =absorbancia de la muestra Ap = absorbancia del patrón Cp = la concentración del patrón g/L.

Si se usa blanco de muestra, El cálculo se realiza de la siguiente manera: Proteínas totales: g-l = _(Am - Abm) X Cp, Ap Cp=concentración del patrón en g/L

Con cada extracto de proteína obtenido de: Musculo Leche Clara de huevo

Bibliografía Rendina, G. (1974) Técnicas de Bioquímica aplicada. editorial Interamericana 1ªedición al español p 46-53 Mathews, C.K., van Holde K.E. and Ahern K.G. 2005. Bioquímica 3ª ed. Pearson. Stryer, L., Berg,J., Tymoczko J. (2003) Ed. Reverte, Quinta Edición.p 329-

70

Informe

Apellido Paterno

Apellido Materno

Nombre

Número de mesa:___________ Fecha___________ Número de estudiantes_____

Entrada

Desarrollo

Informe

Definitiva

Reporte Las reacciones efectuadas, los

datos obtenidos, interpretación graficas y

conclusiones. Construir la gráfica de concentración de la albúmina

Calcular la cantidad de proteínas totales en cada muestra

71

PRACTICA 8 Determinación de las propiedades químicas de los carbohidratos Objetivos: -Verificar la solubilidad de los carbohidratos. -Identificar la presencia de carbohidratos en una solución con la reacción de Molisch -Comprobar la especificidad de cetosas con la reacción de Selliwanoff -confirmar que la reacción Bial es característica de las aldopentosas -Demostrar el poder reductor de los monosacáridos mediante la reacción de Benedict

Introducción Los carbohidratos conocidos como azucares, glúcidos, hidratos de carbono son las biomoléculas más abundante en la naturaleza, están representados por la fórmula estequiométrica

simple

(CH2O)n,

con

estructura

de

polihidroxialdehidos

ó

polihidroxicetonas. Existen tres grupos de carbohidratos: monosacáridos, disacáridos y polisacáridos. Los sacáridos desempeñan una gran variedad de funciones en los organismos vivos. El principal ciclo energético de la biosfera depende de en gran parte del metabolismo de los carbohidratos. Los animales obtienen carbohidratos ingiriendo plantas o

animales.

La oxidación de los hidratos de carbono es el

principal proceso de generación de energía del metabolismo. (Boyer 2001) En los animales, la digestión del almidón empieza en la boca con la acción de α amilasa que se secreta en la saliva, la enzima rompe enlaces α(1→4), en el intestino, la digestión continúa, por la α amilasa secretada por el páncreas (Mathews 2005) 72

Se trabaja en equipo de dos personas para determinar algunas propiedades de los carbohidratos Experimento Solubilidad de los carbohidratos Los carbohidratos son en general más solubles en agua y solventes inorgánicos y menos solubles o insolubles en solventes orgánicos. Materiales

Reactivos

Tubos de ensayo

Agua destilada

Pipetas graduadas de 5 ml

HCl 5% NaOH 5% Etanol Cloroformo Carbohidratos:

Glucosa,

fructosa,

xilosa etc. Metodología Etiquetar los tubos Colocar aproximadamente 15 a 20 mg de cada uno de los carbohidratos en tubos etiquetados y observe su solubilidad en agua, en solución alcalina, solución ácida, etanol y cloroformo añadiendo 2 ml de solvente. Observa y concluye.

73

Experimento 2 Determinación de la presencia de glúcidos con las siguientes pruebas: Prueba de Molisch El ácido sulfúrico es utilizado como agente de deshidratación. El proceso consiste en la formación de un producto de condensación color púrpura, que se obtiene al reaccionar el hidrato de carbono en el medio ácido con el reactivo de Molisch que contiene α-naftol Materiales

Reactivos

Tubos de ensayo

Carbohidratos

al

5%:

glucosa,

arabinosa, fructosa, sacarosa Pipetas graduadas de 5 ml

Azúcar problema: Jugos, gatorade, almidón etc.

Balanza

H2SO4 α naftol 10% Alcohol etílico 95% Agua destilada

Preparación del reactivo de Molisch: disolver 10 g de α-naftol en 100 ml de alcohol etílico (95%). Metodología Etiqueta los tubos Añade dos gotas del reactivo (inclinando los tubos de ensayo durante la adición) 74

Deposita lentamente en cada tubo, a lo largo de su pared, 2 ml de ácido sulfúrico concentrado Agita ligeramente

Observa los cambios que se presentan en la inter fase entre las dos

disoluciones.

Experimento Prueba de Seliwanoff para las cetosas Las cetosas se deshidratan más rápidamente que las aldosas, dando derivados furfural que se condensan con resorcinol para formar un compuesto coloreado, por lo tanto debe evitarse un calentamiento prolongado que ocasionaría la deshidratación de las aldosas. Materiales

Reactivos

Tubos de ensayo

Resorcinol

Pipeta de 5 ml

HCl

Pipeta de 1 ml

Agua destilada

Baño de agua caliente

Solución

Carbohidratos

al

1%:

fructosa, glucosa etc. Probeta de 250 ml

Reactivo de Seliwanoff: Disolver 0.7g de resorcinol en 100 ml de HCl concentrado. Agregar agitando 100 ml de agua destilada. Conservar en frasco ámbar.

75

Procedimiento: -Etiqueta los tubos -Coloca 2ml de reactivo de Seliwanoff -Adiciona 2 gotas de carbohidrato al 1% al tubo correspondiente -Calienta en baño de agua caliente a ebullición hasta aparición de color verde con las pentosas. Rojo o pardo para las hexosas

Prueba de Benedict

Algunos azúcares tienen la propiedad de oxidarse en presencia de agentes oxidantes suaves como el ion Fe3+ o Cu2+. Esta característica radica en la presencia de un grupo carbonilo libre, el cual es oxidado y genera un grupo carboxilo. Por lo tanto, aquellos azúcares con un grupo carbonilo libre son llamados azúcares reductores y aquellos en los que el grupo carbonilo se encuentra combinado en unión glicosídica se conocen como azúcares no reductores. Existen varias reacciones químicas que permiten determinar si se está en presencia de un azúcar reductor o no. La prueba de Benedict es una de ellas. Materiales

Reactivos

Balanza

Agua destilada hervida fría

Matraces E. graduado de 250 ml

NaCO3 Anhidro

Matraz aforado de litro

Citrato de sodio

76

Pipeta graduada de 10 ml

CuSO4 5H2O

Baño de agua caliente

Soluciones

de

diferentes

carbohidratos

al

1%(glucosa,

lactosa, galactosa, xilosa, fructosa, sacarosa. Almidón al 1%preparado con agua caliente

-Reactivo de Benedict: Consta de 3 soluciones: Pesa 100 g de NaCO3 anhidro y disuelve en 200 ml de agua destilada hervida. Pesa 173 g citrato de sodio y disuelve en 200 ml de agua destilada hervida. Pesa 17.3 g de CuSO4.5H2O y disuelve en 300 ml de agua destilada hervida. Mezcla las tres soluciones cuando estén frías. Afora a 1 l con agua destilada hervida y fría.

Metodología -Etiqueta los tubos de ensayo - Transfiere a cada tubo 2 ml de reactivo Benedict - Agrega dos gotas de carbohidrato diferente en cada tubo -Calienta a baño de agua hirviendo de 5 a 50 minutos La prueba es positiva si se produce un precipitado amarillo, verde o rojo. Toma datos de tiempo y los cambios y concluye.

77

Hidrólisis del almidón Esta práctica tiene como objetivo demostrar que efectivamente los polisacáridos como el almidón están compuestos de monosacáridos unidos por enlaces glicosídicos. α (1→4), el almidón está constituido de un solo tipo de monosacáridos, la glucosa. Las propiedades del almidón son diferentes a las de la glucosa como observará mediante la hidrólisis del almidón para generar glucosa. Este polisacárido es hidrolizado en sus constituyentes monosacáridos, por la acción de ácidos diluidos. La hidrólisis del almidón se puede evidenciar con dos pruebas:

-Desaparición del color característico de la prueba del yodo. - Aparición de glucosa, un azúcar reductor. Materiales

Reactivos

Tubos de ensayo

Solución de almidón al 1%

Baño de agua caliente

HCl

Pipetas

Iodo KI al 2% Benedict NaOH al 1.6%

Solución de almidón: 1 g de almidón disolver en agua fría, después agregar agua caliente y llegar a 100 ml

78

Solución de Iodo: fundir 1g de iodo en un poco de solución de KI al 2% ya disuelto se adiciona más de la solvente hasta llegar a 100 ml. Procedimiento: _Coloca 10 ml de solución de almidón al 1% en un tubo de ensayo _añade 1ml de HCl concentrado _Agita con mucho cuidado _Calienta en baño de agua a ebullición _Haz la prueba del iodo y la de Benedict

Prueba de Iodo:

-En un tubo de ensayo poner 2 ml de agua destilada -Añade 0.5 ml de almidón -Agrega una gota de solución de iodo -observa los cambios Nota: la primera prueba de iodo se hace la solución de almidón antes del HCl y después cada 15 minutos se toma muestra de la solución a hidrolizar Para observar la hidrólisis y para confirmar la presencia de glucosa se hace la prueba de Benedict.

Toma notas para concluir.

79

Bibliografía Mathews, C.K., van Holde K.E. and Ahern K.G. 2005. Bioquimica 3ª ed Pearson. P 527-535 Boyer,R. 2001Conceptos de Bioquímica ed. Thomson p 204-233 Angulo U, Y. Bioquímica Manual de laboratorio . Universidad de costa Rica 1999

80

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Apellido Paterno

Apellido Materno

Nombre

NĂşmero de mesa:___________ Fecha___________ NĂşmero de estudiantes_____

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Desarrollo

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Definitiva

Reporte: Los resultados del trabajo

81

PRACTICA 9 Aislamiento de glucógeno en el hígado Objetivo: Extracción de glucógeno de hígado de cerdo

y cuantificación por

gravimetría Medición de la pureza del glucógeno por la reacción de antrona. Introducción El glucógeno es el hidrato de carbono de almacenamiento de energía de los vertebrados. Se encuentra abundantemente en las células hepáticas y musculares. El glucógeno puede constituir hasta el 8-10% de peso seco de las células hepáticas y el 2-3% de las células musculares. El glucógeno muscular es una fuente disponible de glucosa para la glucólisis en el propio músculo. El glucógeno hepático sirve para el almacenamiento y la exportación de glucosa para conservar la glucosa sanguínea entre las comidas. El glucógeno se sintetiza por medio de glucogénesis, a partir de la glucosa. Se degrada por una vía diferente conocida como glucogenólisis. En el hígado se forma glucosa y en el músculo lactato debido respectivamente, a la presencia o ausencia de la glucosa 6 fosfatasa. Aislamiento de glucógeno de hígado:

82

Materiales

Reactivos

Baño de agua hirviendo

Hígado de animal

Baño de hielo

Solución de hidróxido de potasio 30%

Centrífuga

Solución de tricloroacético al 10%

Balanza

Disolución de sulfato de sodio al 15%

Estufa a 35º

Etanol al 95%

Colorímetro

Regulador de fosfato 0.02M PH 7

Agitador

NaCl 0.005 M

Tubos de vidrio

Antrona 0.2% en acido sulfúrico

Tubos

de

centrífuga

cónicos

de

plástico con tapón Guantes de látex Pipetas automáticas de 0.1 y 1.0 ml Portapipetas Papel filtro Pipetas de 1 y 5 ml

Reactivos: Solución amortiguadora de fosfato sódico 0.2 M; NaCl 0.005M pH 7.0 NaHPO4

1.70 g

NaH2PO4

1.59 g

NaCl

0.39 g

H2O

1 afora a litro

83

Metodología:

Coloca 15 ml de solución de hidróxido de potasio al 30% en un matraz E. Pesa 20 g de hígado e introducir al matraz E. Calienta en baño de agua hirviendo, agitando con mucho cuidado durante 30 -40 minutos hasta digestión completa. (que no queden partículas en suspensión) Enfría el tubo con agua corriente Agrega 1.0 ml de solución saturada de sulfato de sodio y se homogeniza Deja reposar 5 minutos Precipita el glucógeno que se encuentra en la solución adicionando 35 ml de etanol al 95% se agita y dejar en baño de hielo durante 5 minutos. Pasa la solución a tubos de centrífuga cónicos de plástico con tapón, y se centrifuga a rpm durante 5 minutos. Pasa la solución a tubos de centrífuga de plástico y se centrifuga a la velocidad de 5000 rpm durante 5 minutos. Se desecha el sobrenadante y se coloca el tubo invertido sobre el papel filtro. Añade 25 ml de tricloroacético al 10% al matraz, para disolver el precipitado agitando fuertemente Centrifuga de nuevo 5 minutos a 5000 rpm elimina el precipitado Transfiere el sobrenadante a un matraz E. conteniendo 50 ml de etanol al 95%, .deja reposar 5 minutos para que precipite el glucógeno. Pesa tubos de centrífuga vacío y anotar el peso Marcarlos e identificarlo de acuerdo a su peso. 84

Transfiere la solución a tubos de centrifuga previamente pesados y centrifugar 5 minutos a 5000 rpm Al finalizar la centrifugación se obtiene el glucógeno en forma de sólido exento de sustancias contaminantes. Transfiere el glucógeno a un vidrio de reloj previamente pesado Seca en la estufa a 35ºC. También puede deshidratarse en una campana a unos 20 25 cm de una luz infrarroja.

Determinación de la pureza del glucógeno obtenido Preparación de reactivos: Pesar 9 mg de glucógeno obtenido, disolverlo en 100 ml de regulador de fosfato que contenga NaCl. Prepara tres tubos de ensayo como se describe en la tabla 14 Cuadro 14. Determinación de la pureza del glucógeno Tubo Reactivos Glucosa 9mg% Agua Glucógeno 9mg% Antrona 2g/H2SO4

1 ml.

2

3 ml.

ml.

1

--

--

--

--

1

--

1

--

5

5

5

Preparados los tubos, se sumergen en baño con agua hirviendo durante 5 minutos. Enfría en baño de hielo (con precaución) Mide la absorbancia a 620 nm ajustando a cero con el tubo 3 que lleva agua (blanco) 85

Cálculos: Para % de glucógeno obtenido

%de glucógeno= A620 nm glucógeno

X 100.

A620nm glucosa

Cálculos del rendimiento de glucógeno en hígado

Glucógeno puro (mg) =

mg precipitado x % glucógeno 100 mg

Rendimiento= mg de glucógeno puro.

= mg de glucógeno puro /g de hígado

g de hígado muestra

86

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Reporte Calcular: -El porcentaje de glucógeno obtenido -La pureza de glucógeno obtenido. -Rendimiento total de glucógeno expresado en mg de glucógeno por g de tejido (muestra).

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Unidad IV Práctica 10 Aislamiento y propiedades físicas y Químicas de los lípidos Objetivo: Extracción de lípidos en tejido vegetal y animal Comprobar la presencia de los lípidos en las extracciones

Introducción: Muchas de las propiedades importantes de los lípidos derivan del hecho de que estas sustancias son anfipáticas, esto es, contienen regiones hidrófobas y regiones hidrófilas.( Mathews 2005) Los lípidos polares como los glicerofosfolípidos y esfingolípidos, se combinan, se combinan con moléculas de proteínas para construir las membranas biológicas. Su estructura química les provee de una cabeza polar y una no polar. (Boyer 2000) Los esteroides una clase especial de lípidos, tienen un sistema de anillos fusionados característicos. El esteroide más conocido es el colesterol, hormonas sexuales, abunda en las membranas pero también es un precursor biosintético importante de las hormonas esteroideas . Determinados derivados de los esteroles glucósidos por ser tóxicos protegen a las plantas. (Lehninger 2003) Lo lípidos son biomoléculas que se extraen de las células empleando solventes no polares como hexano, metanol y éter di etílico. Los extractos de sustancias vegetales en diversos solventes son usadas para reconocer pequeñas diferencias de

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composición química y de estructura molecular entre estos compuestos. Para estos fines se utilizará hojas de espinaca y zanahorias.(Carey 2006) Los terpenos son lípidos que incluyen a todas moléculas que se biosintetizan a partir de isoprenos .Los terpenos de importancia en las plantas y animales incluyen al limoneno, β caroteno, ácido giberélico, licopeno etc. Muchos de estos compuestos le dan color y olor a las plantas.

Metodología

En este experimento la mitad de la clase, en grupos de dos estudiantes procederá a la extracción de pigmentos de hojas de espinaca y los grupos de la otra mitad lo harán con la cerebro de pollo.

Precaución.- Los solventes a usar en estas actividades soy muy inflamables, por lo que no se debe utilizar mechero o llama directa, se emplea baño a vapor.

Materiales

Reactivos

Balanza

Agua destilada

Tijeras

Alcohol metílico

Vaso de precipitado de 250ml

Éter di etílico

Baño de hielo

Éter metílico

Placa de calentamiento

Éter de petróleo

Embudo de separación de 500ml

NaCl

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Termómetro

KOH

Matraz E. de 500ml

Nitrato de potasio al 2%

Matraz de fondo redondo

Colesterol certificado

Pipeta de 5 ml Bomba de filtración con trampa de Agua Papel filtro

Extracción de carotenoides en hojas de espinaca Pesa dos gramos de hojas de espinaca sin tallos y nervaduras Transfiere pequeños fragmentos de la espinaca en un vaso de precipitado con 100 ml de agua hirviendo durante dos minutos. El vaso se pone a baño de hielo hasta enfriar Extrae los pedazos de tejido y transfiérelos en 100 ml solución hirviente (de alcohol metílico al 90% + 10 % de éter di etílico). Se repite el paso anterior con la solución de alcohol metílico70% +30% de éter metílico. Une las dos soluciones alcohólicas en embudo de separación Añade 100 ml de éter de petróleo entre 20 y 40ºC Agrega 100 ml de solución saturada de cloruro de sodio y agitar. Espera que las capas se separen. Separa la fase inferior. Obtener la fase superior, lavando el embudos dos veces con dos 100ml de agua destilada cada vez. 90

La parte verde se vierte por la parte superior del embudo en un matraz de fondo redondo y se evapora a sequedad al vacío sin pasar de 40ºC. se requiere una bomba de filtro con una trampa de agua. Disolver el sólido en un ml de éter de petróleo Si fuera necesario consérvalo en frasco oscuro y en lugar frío. Pero de preferencia termina las actividades con las reacciones siguientes.

Extracción de lípidos complejos en cerebro de pollo:

Materiales

Reactivos

Mortero con pistilo

Éter etílico

Placa de calentamiento

Acetona

Balanza

Alcohol al 95%

Matraz

Cloroformo metanol 1:1

Pipetas

Ácido sulfúrico

Bomba de filtración

α -naftol al 5% en etanol

Embudo Buchner

Anhídrido acético

Matraces de fondo redondo

Acido Nítrico

Cerebro de pollo

Molibdato de amonio

Papel filtro

Carbonato de sodio al 2%

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Extracción de Colesterol: fracción 1 -Pesa el cerebro de un pollo -Colócalo en el mortero -Adiciona 100 ml de acetona -Homogeniza durante un minuto y transferirlo en un vaso de precipitado lavando el mortero con 25 ml aproximadamente de acetona. -Deja en reposo por cinco minutos -filtra con embudo Buchner y lavar el sólido con 50 ml de acetona, todo este líquido constituye la fracción 1 El sólido sirve para preparación de las fracciones 2 y 3 -Evapora la acetona en un matraz de fondo redondo con calentamiento en baño de vapor (roto vapor). -Enfría la solución y recoja el colesterol bruto en el embudo Buchner -Recristaliza

el colesterol, disolviéndolo en 5 ml de alcohol caliente, filtrando la

solución en caliente y dejar enfriar el filtrado. -Calienta en baño de calentamiento hasta evaporación del alcohol - Seca el colesterol cristalizado al aire, pesa

y conserva

para su

identificación.

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Extracción de lecitina y cefalina fracción 2

-Transfiere el precipitado (insoluble en acetona) que está en el papel filtro a un vaso de precipitado de 400 ml y extrae tres veces con éter etílico utilizando 50 ml cada vez. -Para hacer las extracciones, deja el sólido en éter 4 a 5 minutos, agitando algunas veces. -filtra y conserva el precipitado para la fracción 3

-Concentra los extractos etéreos, hasta el volumen de 50 ml. -Coloca el extracto concentrado sobre 50 ml de acetona y agita - Obtén el precipitado por filtración con embudo Buchner (FRACCION 2)

-Descarta el filtrado y pesa el sólido en un vaso de precipitado de 50 ml previamente tarado, calcula el peso en mg. -Disuelve el precipitado en una mezcla acetona-metanol (3:1) -Consérvalo para la caracterización.

Extracción de Fosfatidos de esfingosina y glucósidos de esfingosina preparar la fracción 3 -. Agrega 50 ml de etanol hirviendo al residuo insoluble en éter, obtenido al preparar la fracción 2 - Filtra la suspensión en caliente y elimine el precipitado - Enfría el filtrado y obtén el sólido resultante de la filtración al vacío (fracción 3) 93

-Coloca el precipitado en un vaso de 50 ml previamente tarado y calcula el peso con precisión en mg. -Disuelve

el precipitado en cloroformo-etanol (3:1) y tape el frasco para la

caracterización.

Análisis cualitativo para la identificación de lípidos Prueba

de

Lieberman:

las

sustancias

que

tienen

como

núcleo

el

ciclopentanopehidrofenantreno, como el colesterol y el fitosterol dan una coloración verde característica, la prueba se llevará como sigue.

Cuadro15. Identificación de esteroles mediante la prueba de Lieberman

Reactivos

Tubos

1

2

3

Cloroformo ml

1

1

1

Colesterol certificado mg

0

0.5

0

Muestra mg

-. Mezcla el contenido de los tubos 2 y 3 para que el sólido se disuelva, -. Añade 1ml de anhídrido acético a cada tubo y agitar -. Adiciona 0.5 ml de H2 S O4 concentrado a cada tubo y mezclar 94

-.Homogeniza suavemente -.observa los cambios de coloración.

Prueba de fusión para determinar lecitinas y Cefalinas Esta prueba sirve para comprobar presencia de fósforo inorgánico, las sustancias orgánicas también dan positiva por un precipitado amarillo de fosfomolibdato de amonio, la reacción es la siguiente: HPO4-2 + 12MoO4-2 + 23 H+ + 3NH4+ → (NH4)3 PO4 12MoO3 +12H2O Molibdato de amonio

Fosfomolibdato de amonio

1.-Numera dos tubos de ensayo de ensayo 2.- El tubo 1 servirá de blanco 3.- En el tubo 2 transfiere 0 .5 g de muestra (fracción 2) 4.- Añade a cada tubo 1 ml de una de mezcla de carbonato de sodio al 2% y nitrato de potasio al % (con la proporción 2:1) 5.- Agrega 1 ml de agua caliente± 80ºC. 6.- Mezcla y deja en reposo durante 10 minutos 7.-Añade 0.5 ml de ácido nítrico concentrado. 8.-Mezcla y calienta suavemente a la llama sin Hervir. 9.- Añade 0.5 ml de molibdato de amonio, mezcla y observa.

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Prueba para Fosfatidos de esfingosina y glucósidos de esfingosina: La prueba para determinar la presencia de glucósidos se corre la reacción de Molish de la forma siguiente:

Reactivo de Molish: Disuelve 0.5 g de α-naftol en 10 ml de etanol 95%. Almacenar protegido de la luz, a temperatura ambiente. 1.- Vierte en un tubo de ensayo 0.5 g de la muestra (fracción 3). 2.-Usa un tubo como blanco 3.-Agrega a ambos tubos 0 .5 de reactivo de Molish y agita 4.- Con sumo cuidado, deja

resbalar por las paredes un ml de ácido sulfúrico

concentrado No agitar. 5.- Observa la aparición de un anillo rosado Registra las observaciones, fundamenta cada reacción y concluye

Bibliografía Boyer,R. 2001Conceptos de Bioquímica ed. Thomson p247-260 Carey,F. Química orgánica 2006 Mc Graw Hill 6ª edición p1081-1094 Lehninger, A. 2003 Bioquímica ed. Omega 285-314 Mathews, C.K., van Holde K.E. and Ahern K.G. 2005. Bioquímica 3ª ed Pearson. P 394- 396

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Informe

Apellido Paterno

Apellido Materno

Nombre

NĂşmero de mesa:___________ Fecha___________ NĂşmero de estudiantes_____

Entrada

Desarrollo

Informe

Definitiva

Reporte: Registra las observaciones, fundamento de cada reacciĂłn y concluye

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Practica 11 Aislamiento de ácidos nucleícos Objetivos: Extraer ADN y RNA de tejidos vegetal y animal Cuantificar el ADN y el RNA obtenido de los tejidos vegetal y animal Determinar presencia de ADN por el método de Difenilamina Determinar la presencia de RNA por el método de Orcinol

Introducción: Los ácidos nucleícos se encuentran en el núcleo, mitocondria y citoplasma, se conocen dos grupos de ácidos nucleicos: RNA (ácido ribonucleico y ADN (ácido desoxirribonucleico).La hidrólisis controlada de RNA y ADN producen nucleótidos, si la hidrólisis se continúa se producen nucleósidos y finalmente fosfatos, azúcares y bases púricas y pirimidícas.(Mckee 2003) La función biológica de los ácidos nucleicos es fundamental: el ADN está asociado con el material genético de las células se puede encontrar en una sola hebra en algunos microorganismos o formando parte de núcleo-proteínas de los cromosomas en organismos superiores. Almacena información genética y sirve de molde para la síntesis de proteína. Se encuentra en su mayoría en el núcleo y en poca cantidad en mitocondria y cloroplastos. El RNA participa en la síntesis de proteína y se distribuye en toda la célula, mayormente en el citoplasma en forma soluble o formando parte de los ribosomas (Mathews 2005)

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El protocolo básico de aislamiento de ADN consiste en homogenizar después se trata con solventes orgánicos, y por tratamiento de centrifugación se obtienen los ácidos nucleícos.(Stryer 2003)

Materiales

Reactivos

Tejidos vegetales: cebolla, espinaca, SDS tomate etc.

dodecil

(detergente

sulfato

iónico)

ó

de

sodio

detergente

Tejido animal: hígado de rata, pollo lavavajilla bazo etc. Mortero con pistilo

Agua destilada

Vidrio de reloj

Alcohol etílico de 96º

Vaso de precipitado de 250 y 500ml

NaCl 1N

Centrífuga con tubos

NaOH 4% en agua

Pinzas para tubos de ensayo Baño de agua a ebullición Baño de hielo Gradilla Pipetas de 5 y 10 ml Papel filtro Embudo Gasa Tubos de ensayo de plástico Frasco de boca ancha

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Probeta de 100 ml Varilla de vidrio Balanza

Extracción de ADN Pesa 10 gramos de muestra vegetal o animal Tritura durante 10 a 15 minutos en el mortero agregando poco a poco 70 ml de NaCl 1N Distribuye la solución en tubos de plástico centrifuga 10 minutos a 2500 rpm. Decanta el líquido en la probeta Agrega de 40 a 50 ml de detergente iónico SDS u otro, homogeniza por inversión y mucho cuidado y sin fuerza ( no formar espuma).7.-Añade 5 ml de alcohol de 96º resbalando por las paredes Agita suavemente la interface con la varilla de vidrio para que forme el precipitado de ADN. Que se enrolla en la varilla 9.-Deja reposar 10 minutos 10.-Pesa un papel filtro 11.-Coloca el ADN en el papel previamente pesado, 12.-Deshidrata y pesar 13.-Calcula el rendimiento 14.-Conserva el ADN para la prueba de Difenilamina.

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Determinación del ADN por la reacción de difenilamina Cuando se trata ADN con difenilamina en condiciones ácidas se forma un compuesto azul. Esta reacción la dan en general las 2-desoxipentosas. En solución ácida la cadena

lineal

de

una

desoxipentosas

se

convierte

en

la

forma

β-

hidroxilevulinoaldehido altamente activa y que reacciona con difenilamina para dar un complejo azul. En el ADN únicamente reacciona la desoxirribosa del nucleótido de purina. La cuantificación de los ácidos nucleicos se puede hacer mediante la Materiales

Reactivos

Tubos de ensayo

NaOH 4% en agua

Pipetas de 5 ml

Reactivo de difenilamina

Baño de agua a ebullición Gradilla Varilla de vidrio Balanza Probeta de 50 ml

Prepara Reactivo Difenilamina: .-Disuelve 0.1gramo de difenilamina en 100ml de ácido acético glacial -Agrega 2.5 ml de ácido sulfúrico concentrado Este reactivo debe ser recién preparado

Reacción de Difenilamina 1.-Toma una pequeña cantidad del precipitado deshidratado de ADN 101

2.-Colocalo en un tubo de ensayo 3.-.Disuelve con 1 ml de NaOH al 4% 4.-Añade 1 ml de reactivo de difenilamina 5.-Calienta a baño de agua a ebullición durante 15 -20 minutos La aparición de coloración azul indica la presencia de ADN.

Aislamiento de ARN de Saccharomyces (levadura) Materiales

Reactivos

Mortero y pistilo

Fenol 90%

Tubos de ensayo

Acetato de potasio 20%

Pipetas de 5 y 10 ml

HCl para ajustar pH

Centrifuga con tubos de plástico

Etanol absoluto

Embudo

Éter etílico

Pipetas Pasteur

Cloruro férrico (FeCl36H2O)

Vaso de precipitado de 250 ml

HCl concentrado

Tela de gasa

Orcinol

Matraz E. de 125 ml

Levadura

Papel filtro Baño de hielo Agitador magnético Balanza Extracción de ARN de Saccharomyces (levadura) 1.- Pesa 3 g de Saccharomyces seca

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2.-Homogeniza la levadura en un matraz con 8ml de agua destilada durante un minuto 3.-Deja reposar durante 15 minutos a 37º 4.- Agrega 10 ml de fenol 5.-Agita mecánicamente la suspensión 30 minutos a temperatura ambiente 6.-Centrifuga en frío a 4000 rpm durante 15 minutos para romper la emulsión 7.-Con ayuda de la pipeta Pasteur separa la fase superior y transferirla en otro tubo y tirar el precipitado 8.-Centrifuga el líquido a 10 000 rpm, 15minutos en centrífuga refrigerada para separar la proteína desnaturaliza. 9.-Decanta el líquido en un vaso de precipitado y medir el volumen obtenido 10.- Adiciona por cada 10 ml de líquido, 1ml de acetato de potasio al 20% (pH 5) 11.-Enfria en baño de hielo 12.-Agrega alcohol absoluto en relación de 2 ml por cada ml medido (para precipitar el ARN 3.-Reparte en tubos de ensayo y centrifugar a 2000 rpm durante 5 minutos 14.-Elimina el líquido, lava el precipitado con 5ml de una mezcla de etanol-agua a la concentración de 3:1 15.-Centrifuga a 2000 rpm por 5minutos 16.- Tira el sobrenadante y lavar de nuevo con etanol absoluto

y centrifuga

5

minutos a 2000 rpm 17.-Deshecha el líquido y re suspende el precipitado con 1ó 2ml de éter etílico 18.- Transfiere el precipitado en un papel filtro previamente pesado 19.-Deja secar al aire 103

20.-Pesa y calcular el rendimiento de ARN Conserva el polvo de ARN para la prueba de orcinol

Determinación del ARN por la reacción de Orcinol La ribosa en medio ácido se deshidrata originando furfural, es una reacción general para las pentosas y la formación del furfural es cuando se calienta la pentosa con ácido clorhídrico concentrado. El orcinol reacciona con el furfural en presencia de cloruro férrico como catalizador, dando una coloración verde que demuestra la presencia de ARN

Preparación de reactivo Orcinol: Disuelve 0.1g de cloruro férrico en 100 ml de HCl concentrado y agrega 3.5 ml de orcinol al 6% en alcohol. Prueba de Orcinol: 1.-Mezcla 2 ml de ARN con 3 ml de reactivo de Orcinol 2.- Calienta en baño de agua a ebullición por 20 minutos 3.-Observa el color si es verde indica la presencia de ARN.

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Bibliografía McKee. Mackee,J. (2003) Bioquímica McGraw-Hill.Interamericana. p 574-5 Mathews, C.K., van Holde K.E. and Ahern K.G. 2005. Bioquímica 3ª ed. Pearson. p 913 -926

Stryer, L. 2003. Bioquímica. Cuarta edición. Editorial Reverte. Barcelona España. 77-98

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Informe

Apellido Paterno

Apellido Materno

Nombre

NĂşmero de mesa:___________ Fecha___________ NĂşmero de estudiantes_____

Entrada

Desarrollo

Informe

Definitiva

Registra los datos obtenidos en forma de tabla, fundamenta y concluye.

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manualbioquimicaritaarzapalo