ЦИТОГЕНЕТИЧНО ПРОУЧВАНЕ НА СЛУЧАИ С МУЛТИПЛЕН МИЕЛОМ Л. Митев Военномедицинска академия - София
Дефиниция Мултипленият миелом представлява В- клетъчно заболяване, което се характеризира с клонална пролиферация на миеломните клетките в костния мозък.
Честота 10-15% от всички онкохематологични заболявания
Фиг.№1 Нормално развитие на плазматичните клетки
Диагностични критерии 1. Наличие на М-протеин в серума или урината. 2. Наличие над 10% клонални плазматични клетки в КМ 3. Лабораторни находки за органно засягане: - хиперкалциемия - бъбречна недостатъчност - анемия - костни лезии
Електрофореза на серум с М-градиент
Имунофиксация на серум
Фиг. №2 Електрофоретично доказване и типизиране на мултипления миелом
Имунофенотипизиране
1. Положителна експресия на CD79a, VS38c, CD138 и CD38. 2. Негативна експресия на CD19 и CD45 на миеломните клетки за разлика от нормалните плазмоцити. 3. Аберантна експресия на CD56, CD117, CD52, CD10, циклин Д1, както и на миелоидни и моноцитни антигени.
Генетични нарушения Цитогенитични нарушения Бройни аномалии 67-90% – анеуплоидни клонове
► Хипердиплоидни. Асоциирани са с ниска честота на преобразования в 14q32. Срещат се при възрастни пациенти с IgG k.
► Не хипердиплоидни (хиподиплоидни, псевдодиплоидни и близотетраплоидни). Асоциирани са с висока честота на преобразувания в 14q32 и 13q-. Срещат се при по-млади пациенти с IgA λ. най- чести тризомии: +3, +5, + 7, +9, +11, +15, +19 най- чести монозомии: -13, -14, -16, и -22.
и 21.
Структурни аномалии ► Преобразувания в локуса на тежките имуноглобулинови вериги 14q32 - 55-70 %
► Делеция на 13q (15%) или монозомия на 13 (85%) –30-50 %
► Преобразувания на хромозома №1 – 30-40%
► Преобразувания на c-MYC локуса - 15-44%
- 11q13 -- циклин D1 (15(15-18%) - 16q23 – C-MAF (5%) - 4p16.3 – FGFR3/MMSET (15%) - 6p21 – циклин D3 (3%) - 20q11 – MAFB (2%)
Минимален делеционен район 13q 13q-14. 14. Вероятно засягане на гена RB
- на късото рамо: рамо: делеция на 1p111p11-21 и транслокации - на дългото рамо: рамо: дубликации в q12q12-22 и q31q31-42
Въвлича се предимно в транслокации. транслокации. Характерен е за напредналите стадии на заболяването. заболяването. ПоПо- често се засяга c-MYC и попо-рядко N-MYC.
FGFR3/MMSET
D3 D1 c-MYC
C-MAF IgH
MAFB
Фиг. №3 Локализация на генетичните нарушения на ММ в човешкия геном
Прогностични субгрупи ► С добра прогноза - хипердиплоиден кариотип - t(11;14) - t(6;14)
► Високо рискови нарушения - Не хипердиплоиден кариотип - 13q-/-13 и нарушение на хромозома №1 - t(4;14) – инхибитор на FGFR3 - t(14;16) и t(14;20) - 17p-, p53 инактивация
Молекулярни нарушения Мутация на KRAS и NRAS
40% при новодиагностицирани 64-70% в терминалните стадии. Причинява интерлевкин 6 независим растеж чрез MAPK път.
Фиг. №4 Активационна мутация на MAPК път
Молекулярни нарушения Делеция на 17p13 и мутация на p53 Мутация (5%) или делеция (10%) на р53 (17p-). Характерна е за терминалните фази на заболяването и е асоциирана с лоша прогноза, хиперкалциемия, често екстрамедуларна прогресия на заболяването и наличие на циркулиращи плазматични клетки.
Фиг. №5 Инактивационна мутация на пътя на RB1 и p53
Молекулярни нарушения - дерегулация на NF-kB
Амплификации на позитивни или делеция на негативни регулатори довежда до хиперактивация на NF-kB (50%).
bortezomib
Фиг. №6 Активационни мутации на пътя на NF-kB
Усилена апоптоза
RAS(MAPK)
Потискане C-myc
NF-kB
Циклин D123
? Rb/p53 Малигнена клетъчна пролиферация
Активиран Блок на апоптозата
Малигнена трансформация прогресия на заболяването
Фиг. №7 Връзка между биохимичните пътища на RAS, циклин D, Rb/p53 и NF-kB при ММ
Методи за изследване 1. Конвенционален цитогенетичен анализ (n=25) 2. Флуоресцентна in situ хибридизация със следните комбинирани локус - специфични сонди (n=7): - 11q23/13q14, 19q13/17p13, 15q22/6q21 - 14q32 сплит проба - двуцветна двойнофузионна проба за t(11;14) 3. Молекулярен анализ на KRAS и BRAF с PCR в реално време на принципа на алел специфична амплификация (n=10).
Таблица №1 Генетични находки при пациентите с мултиплен миелом №
Име
Пол/ Възраст
Киничен стадий
Кариотип
FISH
КRAS
I Пациенти с нормален кариотип 1
К.Н.Г.
М/56
46,XY[20]
-
2
А.Д.А
М/69
46,XY[30]
-
3
Г.Х.
М/55
IIA
46,XY[30]
-
4
Д.Д.
М/46
IIA
46,XY[15]
-
5
Х.М.
М/50
IIB
46,XY[18]
-
6
И.Д.
М/76
IIB
46,XY[20]
-
7
M.В.З.
Ж/73
46,ХХ[5]
-
8
П.С.М.
М/45
46,XY[11]
-
9
Р.М.Ж.
Ж/46
46,XX[9]
-
10
Й.М.М.
Ж/77
46,XX[15]
-
11
М.В.И.
М/56
III
46,XY[15]
-
(+)
12
В.И.С.
Ж/54
III
46,XX[25]
+19q(12%) 17p- (4%)
(-)
13
Р.В.П.
Ж/61
46,ХХ[8]
-
(+)
14
И.Д.М.
М/54
46,XY[15]
11q- (10%) 13q- (6%)
15
И.Н.К.
М/67
-
-
16
Д.Б.Д.
Ж/69
-
13q 13q-(90%)
17
Й.Ц.М.
Ж/47
-
-
(-)
18
К.Н.Д.
Ж/69
-
-
(+)
19
Д.Б.Д.
Ж/69
-
-
(-)
20
Л.Й.Д.
М/45
-
-
(-)
21
А.Н.Р.
Ж/50
-
-
(-)
II
III
(-)
Таблица №1 №
Име
Пол/ Възраст
Киничен стадий
Кариотип
FISH
КRAS
II Пациентни с патологичен кариотип Пациенти с единична аномалия 22
Х.Х.
М/77
IIB
46,XY,-7[20]
-
23
C.Г.С.
М/57
IIIA
46,XY[20]
-
24
Н.Д.Н
М/61
III
46,XY,t(11;14)(q13;q32)
25
К.К.
М/76
IV
46,X,-Y[4]/ 46,XY[16]
-
26
A.Ф.
М/60
IIB
46,XY,der(10)t(9;10)(10pter->10q25.2::9q13-->9qter) [8]/ 46,XY[40]
-
27
Д.К.
М/68
IIB
46,XY,t(8;15)(q24.1;p12)[20]/ 46,XY[5]
-
2RG1R1G
Пациенти с комплексен кариотип 28
К.Ш.
М/56
IIIB
46,XY,+3,-14,der(16)(q11)[15]/ 46,XY[20]
-
29
Ц.Н.П
Ж/44
III
46,ХХ[46]/46,X,-X,del(1)(p13p22),+3,+5, t(X;9)(q13q34),12p+,-13[4]
-
30
Г.Н.
М/65
IIIB
46,X,der(Y)t(y;1)(1qter->1q12::Yq12->Ypter),+3,-13, -14,t(17;18)(p11;p13)[10]/ 46,XY[10]
-
31
С.Н.
Ж/54
IIIB
76,X,-X,del(X)(q22),+i(1)(q10),idic(1;1)(1qter->cen>1p32::1p32->cen->1qter),+2,+del(2)(p11)x3, -4,+del(6)(q16)x2,+der(7)t(7;?)(q32;?),+10,+11,+12, +13,+14,+15,-16,-19,-20,-21,-22[20]
-
32
И.К.И
М/68
88,XXYY,+del(1)(q23),+der(1)t(1;?)x2,del(1)(p22?)x2,+2,+ 2,+3,+4,+4,+5,+5,+6,+6q,+8,+8,+9,+10,+10,+11, +11,+12,rob.t(13;15),13q+x2,+15,-16,+17,+19,+19, +20,+20,+21,+21,+22,+22,+6mor,+dmin
-
(-)
1
2
6
13
19
3
7
14
20
4
8
9
10
16
15
21
11
17
5
12
18
22 X
Фиг. №8 G – лентуван кариотип показващ 43,Х,-Y,-5,-21
Фиг. №9 G-лентуван кариотип показващ t(11;14)(q13;q32)
A
Б
Фиг. №10 Флуоресцентна in situ хибридизация на костен мозък с двуцветна двойнофузионна проба специфична за BCL1/IGH t(11;14)(q13;q32) A) Метафазна пластинка показваща положителен сигнал за BCL1/IGH (1G/1R/2F) Б) Интерфазни ядра показващи положителен сигнал за BCL1/IGH (1G/1R/2F)
Фиг. №11 G – лентуван кариотип показващ 46,XY,+3,-14,del(16)(q11)
Фиг. №12 G – лентуван кариотип показващ 46,X,der(Y),t(Y;1),+3,-13,-14,t(17;18)
1
2
6
7
13
19
14
20
4
3
8
9
10
15
21
11
16
22
5
17
12
18
X
Фиг. №13 G – лентуван кариотип показващ 45,X,-X,del(1)(p11p22),+3,+5,9q+,+10,12p+,-13,-21,-22
2
1
3
7
6
13
14
19
20
8
4
9
16
15
21
10
22
5
11
17
12
18
X
Фиг. №14 G – лентуван кариотип показващ 46,X,-X,del(1)(p11p22),+del(3)(q12),4q-?,+5,9q+,-13,-20,+fr
1
19
2
6
7
13
14
20
3
8
15
9
4
10
11
5
12
16
17
18
21
22
X
Фиг. №15 G – лентуван кариотип с 76 хромозоми и комплексено нарушение включващо и аномалии на хромозома №№1 и 6
Фиг. №16 Частичен G-лентуван кариотип, показващ idic(1;1)
Фиг. №17 G – лентуван кариотип с 89 хромозоми и комплексено нарушение включващо и аномалии на хромозома №№1 и 6
Фиг. №18 G – лентуван кариотип с 83 хромозоми и комплексено нарушение включваща и аномолия на 6q
Фиг. №19 Флуоресцентна in situ хибридизация показваща 13q- (2G1R)
Фиг. №20 Флуоресцентна in situ хибридизация показваща 11q- (1G2R)
Фиг. №21 Флуоресцентна in situ хибридизация показваща +19q (3G2R)
Фиг. №22 Флуоресцентна in situ хибридизация показваща +19q13 в интерфазно ядро (3G2R) и нормална находка на метафазна пластинка за 19q13/p53 (2G2R)
Фиг. №23 Флуоресцентна in situ хибридизация показваща +19q13 и 17p- в интерфазно ядро (3G2R) и нормална находка на метафазна пластинка за 19q13/p53 (2G2R)
100 80 60
60 40 Положителна контрола Муттация на KRAS Негативна контрола
20
30
0
Пациент с мутация на KRAS в кодон 12
Честота на KRAS мутацията
Фиг. №24 Мутации на KRAS
30
100
25
80 20
60
86%
93%
27
15
40
10
20
5
7
0
1
0
14%
7% с 17p-
без 17p-
2 с 17p-
без 17p-
Фиг. №25 Честота на 17p- при мултиплен миелом
120
46%
100 54%
80 60 40 20
43%
58%
Единични аномалии
Коммплексни аномалии
0 ЦГА
FISH+KRAS
Фиг. №26 Честота на цитогенетичните аномалии и комплексните нарушения
6 4 2 0
1q
13q-
1p
-13
+3
6q-
17p11q- 14q
19q+
Др.
Фиг. №27 Разпределение на цитогенетичните находки спрямо броя на пациентите
10 8 6 4 2 0 1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
Х
Фиг. № 28 Разпределение на структурните аномалии по хромозоми
Y
Фиг. №29 Локализация на местата на счупвания в човешкия геном при настоящото проучване
Изводи 1. Мултипленият миелом включва различни субгрупи с диагностично и прогностично значение, което изисква диференциран терапевтичен подход. 2. Флуоресцентната in situ хибридизация и молекулярният анализ на KRAS повишават възможностите за откриване на клонални нарушения. 3. На основата на нашето проучване и данните от научната литература предлагаме следния минимален панел за генетично субкласифициране на мултипления миелом:
1q21/1p36 t(14;16) 14q32
t(11;14) t(4;14)
13q14/p53
KRAS Диагностичен алгоритъм за субкласифициране на ММ