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Freskaleche S.A Planta de Bucaramanga

Manual de Limpieza, Desinfección, Esterilización y Preparación de Medios de Cultivos Ayleen P. Delgado S. Est. Bacteriología y laboratorio clínico Universidad de Santander

Leyla Perea Jefe de control de calidad Freskaleche S.A Planta de Bucaramanga

2011

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NOTA ACLARATORIA Este documento es una publicaciรณn exclusiva de Freskaleche S.A, todos sus derechos estรกn reservados. Este documento no puede ser citado o utilizado para reproducciรณn o traducciรณn, parcialmente o en su totalidad; no puede ser usado con propรณsitos comerciales. Las opiniones expresadas en este documento son responsabilidad exclusiva de los autores. Freskaleche S.A.

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CONTENIDO pág. GLOSARIO INTRODUCCIÓN CAPÍTULO I LIMPIEZA 1.0 DEFINICIÓN 1.1 OBJETIVOS DE LA LIMPIEZA 1.2 LIMPIEZA DEL MATERIAL 1.2.1 Recepción 1.2.2 Clasificación 1.2.3 Procedimiento de lavado 1.2.3.1 Lavado del material metálico 1.2.3.2 Lavado del material de polietileno, goma, plástico, látex y vidrio 1.3 PASOS PARA GARANTIZAR LA EFICIENCIA EN LA LIMPIEZA 1.3.1 Descontaminación 1.3.2 Lavado del material 1.3.2.1 Lavado manual 1.3.2.2 Materiales para el lavado 1.3.2.3 Insumos para el lavado 1.3.3 Calidad del agua 1.4 SECADO 1.5 VALIDACIÓN DE LA LIMPIEZA CAPÍTULO II DESINFECCIÓN 2.0 DEFINICIÓN 2.1 NIVELES DE DESINFECCIÓN 2.2 TÉCNICA BÁSICA DE LA DESINFECCIÓN DE ALTO NIVEL (DAN) 2.2.1 Materiales para el usuario 2.2.2 Materiales para el procedimiento 2.2.3 Procedimiento 2.3 MÉTODOS DE DESINFECCIÓN 2.3.1 Físicos 2.3.2 Químicos 2.4 FACTORES QUE AFECTAN EL PROCESO DE DESINFECCIÓN CAPÍTULO III ESTERILIZACIÓN 3.0 DEFINICIÓN 3.1 MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN 3.2. CALOR AL ROJO 3.3 ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO 3.3.1 Tipos de estufas o pupineles 3.3.1.1 Estufa de convención por gravedad 3.3.1.2 Estufa de convención mecánica 3.3.2 Indicación del material a esterilizar por calor seco 3.3.2.1 Carga 3.3.2.2 Tiempo y temperatura de carga 3.3.3 Principios operacionales

8 8 8 8 9 9 10 10 11 12 13 13 13 14 14 15 15 16 17 17 17 17 17 18 19 20 20 21 27 29 29 29 29 30 31 31 31 32 32 32 33

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3.3.4 Validación del proceso de esterilización por calor seco 3.3.4.1 Técnica y material 3.4 ESTERILIZACIÓN A VAPOR 3.4.1 Tipos de esterilizadores a vapor 3.4.1.1 Olla a presión 3.4.1.2 Autoclaves con eliminación del aire por desplazamiento de la gravedad 3.4.2 Indicaciones del material a esterilizar por autoclave 3.4.3 Factores que afectan la esterilización por autoclave 3.4.4 Validación del proceso de esterilización por calor húmedo 3.4.4.1 Técnica y material CAPÍTULO IV PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO 4.0 IMPORTANCIA 4.0.1 Utilización y almacenamiento del agua 4.0.2 Pesaje y rehidratación 4.0.3 Disolución y dispersión 4.0.4 Medida y ajuste de pH 4.0.5 Vertido 4.1 ESTERILIZACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO 4.1.1 Esterilización por calor húmedo 4.1.2 Monitoreo 4.2 ALMACENAMIENTO DE LOS MEDIOS DE CULTIVO EN CAJAS DE PETRI 4.3 INCUBACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO 4.4. ELIMINACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO 4.5 CONTROL DE CALIDAD DEL PRODUCTO TERMINADO 4.5.1 Control de calidad físico-químico 4.5.2 Control de calidad microbiológico 4.6 CRITERIOS MÍNIMOS PARA ASEGURAR UN CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO REFERENCIAS

33 34 35 35 36 37 39 39 40 40 46 46 46 47 47 48 48 49 49 49 50 51 51 52 52 52 53 56

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GLOSARIO

Ácido peracético: Agente químico capaz de esterilizar los objetos. Amonios Cuaternarios: Son detergentes catatónicos eficaces contra bacterias vegetativas y algunos hongos, aunque no contra las mycobacterias o esporas. Antisepsia: Proceso que destruye la mayoría de los organismos patógenos ubicados sobre superficies animadas. Antiséptico: Agente químico que inhibe el desarrollo de los microorganismos, o los destruye, y que es usado sobre tejido vivos. Área de recepción y limpieza: Zona donde los elementos reusables (instrumental, equipos, etc.) son recibidos, registrados y sometidos a un proceso de limpieza. Área de esterilización: Zona donde se ubican las autoclaves por vapor, estufas de calor seco y todo otro equipo esterilizador. Área de almacenamiento de material esterilizado: Zona donde los materiales ya esterilizados son estacionados previamente a su distribución. Bactericida: Método o agente químico capaz de matar o destruir bacterias. Bacteriostático: Método o agente químico capaz de inhibir el crecimiento bacteriano, pero no necesariamente de matarlas. Biocarga: Es el número y tipo de microorganismos viables presentes en un elemento determinado. Bioenzim: Detergente Enzimático Desincrustante es un detergente neutro concentrado, que ha sido formulado para el lavado en profundidad de material e instrumental médico quirúrgico, equipos de endoscopía, material de laboratorio y en general todo el material hospitalario crítico y menos crítico, previo a la etapa de desinfección de alto nivel o esterilización. Biofilmes: Películas de bacterias o de otros organismos microbianos, que se adhieren a las superficies. Cleanset P-24: Desengrasante bactericida industrial Cloruro de benzalconio: es un desinfectante, bactericida e inhibidor de la actividad viral Contaminado: Se refiere a toda superficie, animada o inanimada, que se sabe aloja microorganismos

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Descontaminación: Es el proceso de remoción de los microorganismos patógenos, de los objetos y equipos, haciéndolos a éstos seguros para su manipulación. Desinfección: Es el proceso por el cual se mata o se destruye la mayoría de los microorganismos patógenos, con la excepción de las esporas. Desinfección de Alto Nivel: Proceso de desinfección que mata bacterias vegetativas, bacilos tuberculosos, hongos, virus, pero no necesariamente un alto número de esporas bacterianos. Desinfección de Nivel Intermedio: Proceso de desinfección que mata bacterias vegetativas, la mayoría de los hongos, los bacilos tuberculosos, y la mayoría de los virus. No mata esporas bacterianas resistentes. Desinfección de Bajo Nivel: Proceso que mata la mayoría de las bacterias vegetativas, algunos hongos, algunos virus, pero no mata Mycobacterias ni esporas bacterianos. Desinfectante de amplio espectro: Desinfectante que tiene actividad contra una amplia variedad de microorganismos. Esporicida: Agente químico capaz de matar esporas, especialmente esporas bacterianas. Esterilización: Proceso por el cual se destruye todo tipo de microorganismos. Esterilizadora de vapor: Esterilizadora que expone los objetos a vapor bajo alta presión. Fenestrada: Adjetivo utilizado para la descripción de objetos "agujereados". Gas de óxido de etileno: Gas tóxico altamente inflamable capaz de esterilizar un objeto. Glutaraldehído: Agente químico capaz de esterilizar objetos. Inocuidad: Es la condición de los alimentos que garantiza que no causaran daño al consumidor cuando se preparen y /o consuman de acuerdo con el uso al que se destinan. Limpieza: Proceso que elimina la suciedad orgánica e inorgánica, o cualquier otro material extraño. Verificador de control de esterilización: Método que determina si un proceso ha sido completado; no indica si los objetos sometidos a este método están estériles.

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INTRODUCCIÓN

La limpieza, desinfección, esterilización y preparación de medios de cultivos son procesos de rutina en los laboratorios, siendo parte fundamental para evitar la contaminación de medios, cultivos, materiales, etc. Las fallas en estos procedimientos aumentan la probabilidad de contaminación tanto de la muestras objeto de análisis como de los medios de cultivos preparados. Dada la importancia que posee la calidad y confiabilidad de los resultados en un laboratorio de microbiología de alimentos, es necesario estandarizar estos procesos, garantizando así los resultados emitidos. La estandarización y validación de los procedimientos anteriormente mencionados depende de un conjunto de variables como: los diferentes agentes químicos empleados según las áreas y la capacitación del personal, entre otros. Un primer paso en la mejora de estos procesos, es la elaboración de normas que sirvan de guía para el desarrollo de este cambio, así como la adecuada preparación y formación del personal responsable. Este manual se realiza con la finalidad de ofrecer los lineamientos, recomendaciones y fundamentos basados en las normas vigentes, necesarias para cumplir con la tarea de cambio, y dirigido a todas las personas que se encuentran implicadas.

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CAPITULO I LIMPIEZA

1.0 DEFINICIÓN

Es la remoción mecánica de toda materia extraña en el ambiente, en superficies y objetos utilizando para ello el lavado manual o mecánico. Normalmente se usa agua y detergente para este proceso. El propósito de la limpieza es disminuir el número de microorganismos a través de arrastre mecánico y no asegura la destrucción de éstos. (1) A continuación se establecen las recomendaciones para la limpieza profunda del material con acumulación de suciedad, materia orgánica y otros residuos.

1.1 OBJETIVOS DE LA LIMPIEZA • • • • •

Eliminar la suciedad y todo el polvo visible del material. Disminuir la carga microbiana de los mismos para hacer segura su manipulación. Evitar las incrustaciones en el material como restos de cinta, algodón y residuos de agar. Asegurar las condiciones de limpieza para el proceso de esterilización. Garantizar el re-uso de artículos no críticos que son sometidos apenas a la limpieza.

1.2 LIMPIEZA DEL MATERIAL

Los siguientes son los pasos que se deben seguir para la limpieza del material contaminado en el laboratorio:

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a. Recepción

b. Clasificación

c. Procedimiento del lavado

Figura 1. Diagrama general del procedimiento de lavado. 1.2.1 Recepción La recepción se realiza en la zona sucia o zona roja a través de una puerta con su ventana de paso, por la que la persona encargada de esta actividad recibirá los materiales e instrumentales, que serán verificados en número, estado, procedencia y anotados en el registro respectivo.

Figura 2. Área de recepción del material para lavado.

1.2.2 Clasificación

La clasificación se realiza según el tipo de material, éste será clasificado de acuerdo al tipo en: Metálico: tijeras, asas, cucharas, pinzas, cuchillos. Plástico: botellas, tarros para esterilizar, puntas azules y amarillas. Vidrio: cajas de petri, pipetas, frascos Scot de 100, 250, 500 y 1000 ml, erlenmeyers 1000 y 250 ml, vasos de precipitado.

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CLASIFICACIÓN DEL MATERIAL PARA LAVADO

Metálico

Plástico:

Vidrio

Cubetas, tijeras, asas, cucharas, pinzas, cuchillos,

botellas, tarros para esterilizar, puntas azules y amarillas.

Cajas de petri, pipetas, frascos scot, erlenmeyers, vasos de precipitado.

Figura 3. Diagrama de clasificación del material para lavado.

1.2.3 Procedimiento del lavado del material clasificado

Para este paso es necesario tener en cuenta el material a lavar:

1.2.3.1

Lavado del material metálico

Metal - material inoxidable (tijeras, asas, cucharas, cuchillos, pinzas etc.) 1. Retirar toda la cinta antes de colocar la cubeta en la poza si el lavado es manual. 2. Enjuagar con abundante agua eliminando todo residuo de la solución de detergente. 3. Realizar un último enjuague. 4. Secar los materiales con un paño limpio. (pinzas, tijeras, etc.) 5. Revisar minuciosamente el instrumental de todo equipo que se decepcione de acuerdo a la descripción. (verificando el número de piezas y estado). 6. Ir abriendo las pinzas e instrumental en bandejas fenestradas o en recipiente de plástico fenestrado. 7. Al término, colocar la bandeja en la poza de lavado dentro de un recipiente o lavatorio que contenga el detergente enzimático para su descontaminación durante 5-10 minutos. 8. Después de los 5 minutos llevar la bandeja fenestrada al chorro de agua para eliminar el máximo de residuo orgánico y proceder al lavado

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manual escobillando las cremalleras y los espacios internos de las pinzas. 9. Una vez terminado el periodo de lavado manual, todos los materiales irán a la mesa de pre-secado y escurrido, luego ellos se pasarán por la ventana de paso para su preparación, mantenimiento y empaque.

1.2.3.2

Lavado de material plástico y vidrio:

1. 2. 3. 4.

Retirar restos adheridos a las superficies si los hubiera (residuo de cinta). Sumergir en detergente enzimático. Dejar remojando durante 10 a 15 minutos. Retirar y enjuagar con abundante agua y si es posible utilizar corrientes a presión de agua. 5. Realizar último enjuague con agua. 6. Colocar a escurrir y pre-secar al medio ambiente y luego si es posible utilizar fluido de aire comprimido.

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PROCEDIMIENTO DEL LAVADO DE MATERIAL Material metálico. Retirar toda la cinta antes de colocar la cubeta Enjuagar con abundante agua eliminando todo residuo de la solución de detergente. Realizar un último enjuague. Secar los materiales con un paño limpio. (pinzas, tijeras, etc.) Revisar el instrumental (Verificando el número de piezas y estado).

Material de plástico y vidrio. Retirar restos adheridos a las superficies. Sumergir en detergente enzimático. Dejar remojando durante 10 a 15 minutos. Retirar y enjuagar con abundante agua Realizar un último enjuague con agua.

Colocar la bandeja en la poza de lavado dentro de un recipiente que contenga el detergente enzimático para su descontaminación durante 5-10 minutos.

Colocar a escurrir y pre-secar al medio ambiente

Llevar la bandeja fenestrada al chorro de agua para eliminar el máximo de residuo Proceder al lavado escobillando las cremalleras y los espacios internos de las pinzas. Terminado el periodo de lavado, todos los materiales irán a la mesa de pre-secado y escurrido, luego se pasarán por la ventana de paso para su preparación, mantenimiento y empaque.

Figura 4. Diagrama de procedimiento de lavado del material clasificado.

1.3 PASOS PARA GARANTIZAR LA EFICACIA EN LA LIMPIEZA Los pasos para garantizar la eficacia en la limpieza de material son: •

La descontaminación.

Lavado de material.

Calidad del agua.

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1.3.1 Descontaminación Es un proceso físico o químico, que sirve para reducir el número de microorganismos de un objeto inanimado dejándolos seguros para su manipulación. El término se aplica a artículos contaminados durante el procesamiento de las muestras o a residuos orgánicos (2). Al utilizar el remojo en solución de detergente enzimático como el cleanset p-24 y el bioenzim, detergente enzimático desincrustante utilizados en Freskaleche , por 5 minutos en un recipiente de plástico, antes de iniciar la limpieza manual o automática se estaría realizando la descontaminación, el remojo se debe llevar a cabo en una bandeja o recipiente fenestrado (coladera), luego se pasará el material por el chorro de agua logrando así la liberación y disminución de la carga microbiana o materia orgánica, para que el operador pueda continuar el proceso de lavado.

1.3.2 Lavado del material

En cuanto al lavado existen tres tipos manual, mecánico y mixto, pero para nuestro laboratorio solo aplica el lavado manual, porque no hay maquinas que realicen este trabajo.

1.3.2.1

Lavado manual

Es un procedimiento realizado de manera directa para la remoción de la suciedad, por fricción aplicada sobre la superficie del material, utilizando una solución detergente, cepillo y agua. Es bastante usual y por ello hay que tener en cuenta, la prevención del riesgo ocupacional y los accidentes cortopunzantes, mediante la protección individual de operario, con el uso de mandil impermeable, lentes, guantes y mascarilla; los lavaderos o pocetas de lavado deberán cumplir con especificaciones técnicas tales como: profundidad (40 a 50 cm.), los caños o piletas deben tener forma recta y horizontal como se observa en la figura 5 (3).

Figura 5. Área de lavado para el material. 13

1.3.2.2

• • • •

Materiales para el lavado

Equipo de protección personal, (mascarilla, lentes, delantal impermeable y guantes). Cepillo y escobillas de cerdas de diferentes tamaños. Recipiente con detergente enzimático. Recipientes fenestrados (coladeras) de diferentes tamaños.

Figura 6. Materiales para el lavado en el laboratorio.

1.3.2.3

Insumos para el lavado

Los detergentes son compuestos que permiten variar la tensión superficial del agua y son los causantes de la humectación, penetración, emulsión y suspensión de la suciedad. Su estructura está compuesta por dos partes: una hidrófila (afinidad con el agua) y otra lipofílica (afinidad con aceites), lo que permite formar puentes de agua y aceite, ayudando a remover la suciedad. (4)

Figura 7. Detergente enzimático Cleanset P-24 y Bioenzim. 1.3.3 Calidad de agua

En muchos lugares, el agua contiene minerales disueltos, calcio por ejemplo. Si éste es el caso, se dice que es agua dura. Al hervir este tipo de agua, los minerales se depositaran en el interior del recipiente del esterilizador y sobre el 14

elemento calefactor, formando una capa. Esta capa está compuesta de un tipo de piedra caliza que no es un buen conductor del calor, reduciendo así la eficacia de la autoclave, por que necesitará producir más calor y así se consumirá más energía o gas. También se acumulan depósitos minerales sobre las válvulas, que pueden dejar de funcionar a consecuencia de ello. Lo ideal es usar agua destilada o agua desmineralizada en las autoclaves. También puede ser utilizada el agua preparada mediante el proceso denominado osmosis inversa que es proceso a alta presión en donde se forza el paso del agua por medio de la estructura molecular de una membrana llamada de osmosis inversa. La membrana separa los minerales y agentes contaminantes, incluyendo las sales, los virus, pesticidas y otros materiales, pero permite el paso de las moléculas de agua. Esta agua no contiene minerales disueltos. El agua que no contiene minerales o sólo una pequeña cantidad de ellos, se llama agua blanda. El agua blanda y en especial, el agua desmineralizada o destilada, no causará depósitos de calcio (5).

1.4 SECADO

El secado del material, instrumental y otros artículos es parte fundamental durante el proceso de limpieza, se debe tener en cuenta el grado de humedad de los artículos antecediendo a la esterilización, debido a que si no se lleva adecuadamente este paso podría interferir este proceso. El secado puede ser manual o automático; el secado manual, se realiza en este laboratorio, con un paño o con aire comprimido. Secar bien el equipo a mano con paños suaves de tela muy absorbente o de fibra de celulosa, cuidando de que no queden pelusas o hilachas sobre la superficie e interior de los materiales. En la actualidad se cuenta con cámaras especiales para secado de material tubular y corrugados en un ciclo que puede durar aproximadamente 25 minutos a 2 horas, dependiendo del tipo y la cantidad de materiales a secar. Debe tenerse en cuenta la conexión específica para diferentes lúmenes. En la cámara de secado se pueden colocar materiales de diferentes lúmenes teniendo en cuenta que tengan las mismas características.

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Figura 7. Secado manual del material.

1.5 VALIDACION DE LA LIMPIEZA

La validación del proceso de limpieza se presenta de modo subjetivo, por no ser posible visualizar el bioburden (definido como el número y tipo de microorganismos viables que un artículo puede contener luego de la limpieza), de cada artículo en los procedimientos de limpieza. Por ello es importante adoptar la estandarización de protocolos para garantizar la validación de este proceso (6). En los protocolos debe incluirse la dilución de los productos de uso, tiempo de inmersión, modo de enjuague y desmonte o desarme de los artículos e instrumentales. Una parte importante para la validación es la inspección visual, después del procesamiento el operario debe observar atentamente la presencia de cualquier suciedad, particularmente en las cremalleras, para ello consideramos el uso de una lupa. Otro requisito indispensable durante la validación de la limpieza es la instalación de sistemas de irrigación de agua, con lúmenes o lavados con dispositivos a presión en la zona sucia, sin ellos no se podría llevar a cabo una buena limpieza.

Figura 8. Inspección del material lavado. 16

CAPITULO II DESINFECCIÓN

2.0. DEFINICIÓN

La desinfección es el proceso físico o químico por medio del cual se logra eliminar los microorganismos de formas vegetativas en los objetos inanimados, sin que se asegure la eliminación de esporas bacterianas. En todo artículo semicrítico, que no pueda ser esterilizado deberá llevarse a cabo la desinfección de acuerdo al criterio de indicación. (7)

2.1. NIVELES DE DESINFECCIÓN

Desinfección de alto nivel (DAN): Es realizada con agentes químicos líquidos que eliminan a todos los microorganismos. Como ejemplos: el orthophthaldehído, el glutaraldehído, el ácido peracético, el dióxido de cloro, el peróxido de hidrógeno y el formaldehído, entre otros. Desinfección de nivel intermedio (DNI): Se realiza utilizando agentes químicos que eliminan bacterias vegetativas y algunas esporas bacterianas. Aquí se incluyen el grupo de los fenoles, el hipoclorito de sodio, la cetrimida y el cloruro de benzalconio. Desinfección de bajo nivel (DBN): Es realizado por agentes químicos que eliminan bacterias vegetativas, hongos y algunos virus en un período de tiempo corto (menos de 10 minutos). Como por ejemplo, el grupo de amonios cuaternarios. (8)

2.2 TECNICA BASICA PARA LA DESINFECCION DE ALTO NIVEL (DAN)

2.2.1 Materiales para el usuario •

Mandil impermeable, mascarilla, lentes protectores y guantes.

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Figura 9. Elementos de bioseguridad. 2.2.2 Materiales para el procedimiento • • • • •

Dos contenedores de la forma y tamaño ideal de los artículos (uno con tapa). Agua estéril, cantidad necesaria. Solución Glutaraldehído al 2%. Paños o gasas estériles Campo o contenedor estéril

Figura 10. Materiales de uso en el proceso de desinfección.

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2.2.3 Procedimiento • • • • • • • • • • •

Sumergir en detergente enzimático por 5 minutos (de acuerdo a la recomendación del fabricante). Aspirar la solución por todos los lúmenes del artículo. Realizar limpieza mecánica o manual, observando cuidadosamente el artículo. Utilizar escobillas apropiadas para la limpieza de los lúmenes. Enjuagar con abundante agua. Secar. Sumergir completamente el artículo en la solución de Glutaraldehído al 2% durante 20 minutos. (En contenedor con tapa). Aspirar la solución desinfectante dentro de los lúmenes o canales. Enjuagar utilizando agua estéril todo el artículo teniendo sumo cuidado para evitar contaminación. Secar con paños o gasa estériles. Guardar y almacenar el artículo en un protector o contenedor estéril.

DESINFECCION DEL MATERIAL

Sumergir en detergente enzimático por 5 minutos.

Realizar limpieza manual, observando cuidadosamente el artículo

Utilizar escobillas apropiadas para la limpieza de los lúmenes.

Enjuagar con abundante agua.

Secar cuidadosamente con un paño seco.

Sumergir completamente el artículo en la solución de Glutaraldehído al 2% durante 20 minutos.

Vertir la solución desinfectante dentro de los lúmenes o canales.

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Enjuagar con agua estéril todo el artículo con sumo cuidado para evitar contaminación.

Secar con paños o gasas esteriles

Guardar y almacenar en un protector o contenedor esteril

Figura 11. Procedimiento de desinfección del material.

2.3 METODOS DE DESINFECCION La desinfección es uno de los procedimientos más antiguos, fue utilizada en un primer momento para eliminar microorganismos de ambiente e higienizar las manos. Existen dos métodos de desinfección: los físicos y los químicos. (9) 2.3.1 Métodos físicos 

Pasteurización

Utilizado originalmente por Louis Pasteur. Con este proceso se realiza la DAN y por el cual el agua es llevada a 77º C de temperatura durante aproximadamente 30 minutos. Así, destruye todos los microorganismos excepto las esporas bacterianas. (9) 

Hervido

Este método utiliza el agua hirviendo a temperaturas muy altas para lograr la desinfección. Para una DAN, se hierven los instrumentos en un recipiente con tapa de 15 a 20 minutos contabilizando el tiempo desde que el agua rompe el hervor. Los objetos deben estar cubiertos por completo con el agua durante el hervido, y no se debe añadir ningún otro elemento mientras esté hirviendo. El fuego debe ser suave, por que el fuego alto hace rebotar los objetos, disminuye el nivel de agua y consume más gas.

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Se recomienda usar tiempos más prolongados para lugares de gran altura sobre el nivel del mar. Se seca al aire o con una toalla esterilizada antes de volver a utilizar los materiales o almacenarlos. Este método no se utiliza en el medio hospitalario. (9) 

Radiación ultravioleta (UV)

Mecanismo de acción: El principal mecanismo del efecto letal de la luz UV sobre las bacterias, se atribuye a su absorción por el ADN y el resultante daño de este. Así, provocan la formación de uniones covalentes entre los residuos de pirimidina adyacentes pertenecientes a la misma cadena, lo que provoca la formación de dímeros de pirimidina de tipo ciclobutano. (9) Exposiciones prolongadas produce alteraciones en la forma del ADN e interfiere en el apareamiento normal de las bases. El resultado final es la inhibición de la síntesis de ADN y secundario a esto, inhibición del crecimiento y la respiración, Además, provoca queratoconjuntivitis en profesionales expuestos a la radiación. (9) Aplicaciones: Estas radiaciones pueden producirse artificialmente con lámparas de vapor de mercurio. Son igualmente efectivas para grampositivos y gramnegativos. Su principal uso es para esterilizar el aire y superficies, ya que no penetran en sólidos y lo hacen pobremente en líquidos. (9)

2.3.2 Métodos químicos Es el más utilizado en nuestro laboratorio, existen múltiples agentes germicidas en forma líquida. Este método requiere muchos controles en su ejecución. Por ser un método realizado en su mayoría de forma manual, todas las etapas del protocolo recomendado por el fabricante y validado deben seguirse celosamente. Las fallas en el proceso de desinfección pueden dar lugar a complicaciones infecciosas. Los principales desinfectantes utilizados en el ámbito son: orthophthaldehído, glutaraldehído, cloro y compuestos clorinados, formaldehído, peróxido de hidrógeno, ácido peracético, fenoles y amonios cuaternarios. (9) 

Orthophthaldehído:

Este agente químico es nuevo y se usa para la desinfección de alto nivel (DAN). Corresponde al grupo de aldehídos inorgánicos y contiene benzenocarboxialdehído de 1,2. (9)

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 Mecanismo de acción: Su acción es por alquilación de los componentes celulares y actúa directamente sobre los ácidos nucléicos.  Espectro: Los estudios han demostrado su excelente actividad microbicida y una mayor actividad frente a mycobacterias que el glutaraldehído. Es micobactericida y virucida.  Ventajas y desventajas: La principal ventaja es que posee una excelente estabilidad en un amplio rango de pH (3-9) y por lo tanto no requiere de activación. o Presenta además una excelente compatibilidad con cualquier material o artículo y cuenta con indicadores químicos. No es carcinogénico, pero se recomienda utilizarse en áreas ventiladas ya que todavía no se ha determinado si puede producir irritación en los ojos y orificios nasales. Por ahora, el alto costo parece ser la desventaja principal para su uso.  Indicaciones de uso: El tiempo que se requiere para la DAN, varía según los siguientes estándares y fabricantes: o o o o

Estándar americano (FDA) (10 a 12 minutos a 20° C.) Estándar en Canadá (10 min.) Estándar en Europa (5 min.) En nuestro medio se recomienda utilizarlo 10 a 12 minutos.

 Concentraciones de uso: Está indicado en una concentración del 0.55%. La solución tiene una duración de 14 días de reúso, y dos años de vida útil. 

Glutaraldehído:

Es un compuesto del aldehído y se presenta en soluciones acuosas, ácidas y alcalinas. Las soluciones ácidas no son esporicidas, pero utilizando un agente alcalinizante como activador este producto se torna esporicida. Tiene pH alcalino, una vez activado, sufre una drástica disminución de la activación a partir de los 14 días. Existen formulaciones que permiten producir una mayor vida útil por 28 días. (9)  Mecanismo de acción: Su acción es consecuencia de la alquilación de componentes celulares alterando la síntesis proteica de los ácidos ADN y ARN.  Espectro: Es esporicida.

bactericida,

fungicida,

virucida,

micobactericida

y

 Ventajas y desventajas: No es corrosivo. Para DAN (45 minutos) a temperatura ambiente tiene actividad germicida en presencia de materia

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orgánica. La gran desventaja del glutaraldehído es su toxicidad, ya que una vez activado suelen producir vapores irritantes para las mucosas, el sistema respiratorio y la piel. Por ello, debe utilizarse en ambientes muy ventilados y con equipos de protección personal. Actualmente existen cabinas para DAN que protegen al operador.  Indicaciones de uso: Está indicado para la DAN cuando la esterilización no es posible. También en el uso de artículos o materiales de metal como son las espátulas.  Concentraciones de uso: En nuestro medio contamos con una solución al 2%. Se requiere de 45 minutos para hacer DAN a una temperatura de 20°C.  Existen otras formulaciones de Glutaraldehído en concentraciones que varían entre 2.4% a 3.4%. En Europa existen concentraciones de 1.5% con tiempos mayores de inmersión. El valor límite del umbral (VLU/ valor de exposición) del glutaraldehído es de 0.02 ppm. a 0.05 ppm., en 8 horas de trabajo. 

Cloro y Compuestos Clorados:

Los desinfectantes basados en el cloro generalmente están disponibles en forma líquida como hipoclorito de sodio (lejía), o sólida como hipoclorito de calcio (dicloroisocianurato de sodio). (9) 

Mecanismo de acción: Su acción produce inhibición de las reacciones enzimáticas, desnaturalización de las proteínas e inactivación de los ácidos nucléicos.

Espectro: Virucida, fungicida, bactericida (micobactericida).

Ventajas y desventajas: Su acción es rápida, de bajo costo y de fácil manejo. Tiene propiedades desodorizantes y actividad microbicida atribuible al ácido hipocloroso no disociado. La disociación de este ácido, y por consiguiente la menor actividad, depende del pH, su eficiencia disminuye por el aumento del pH. Tiene actividad corrosiva, se inactiva en presencia de materia orgánica, produce irritación de las mucosas, se polimeriza por los rayos de sol y necesita estar protegida en envases opacos. o Las soluciones de cloro no deben conservarse en envases destapados por más de 12 horas debido a la evaporación del producto activo, haciendo que las concentraciones de cloro disponible disminuyan de 40% a 50%.

Concentraciones de uso: La concentración mínima para eliminar las mycobacterias es de 1000 ppm (0.1%) durante 10 minutos. No deben

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sumergirse objetos por más de 30 minutos debido a su actividad corrosiva. o Se recomienda además, el enjuague abundante para evitar irritación química debido a los posibles residuos. o Es importante señalar que existen muchos factores que afectan la estabilidad del cloro, tales como la presencia de iones pesados, pH de la solución, temperatura de la solución, presencia de biofilmes, presencia de materias orgánicas y radiación ultravioleta. Fórmula para preparar una solución de hipoclorito: CC = Litros de agua x ppm / Concentración de compra Donde: CC: centímetros cúbicos de hipoclorito de sodio a agregar a la preparación Litros de agua: cantidad de solución final a preparar. Ppm: partes por millón (concentración final a preparar). Concentración de compra: • Casera 5.25%. • Concentrada 10%. • Piscinas 12% Concentraciones de uso en el ámbito del laboratorio: 10.000 ppm = 1% = Concentración para desinfección de derrames, previa limpieza. 5.000 ppm = 0.5% = Desinfección de materiales, previa limpieza. 1.000 ppm = 0.1% = Desinfección de áreas críticas, previa limpieza. 100 a 500 ppm = 0.01 a 0.05% = Desinfección de áreas no críticas. 

Formaldehido:

El formaldehido es una solución acuosa con olor penetrante que se polimeriza, formando un depósito blanco dentro de los recipientes, cuando se encuentra a altas concentraciones, y sobre los artículos tras una inmersión prolongada (incluso en concentraciones más bajas como la formalina del 37% al 40 %).(9)  Mecanismo de acción: Produce inactivación de microorganismos por alquilación del grupo amino y sulfhidrilo de proteínas y del anillo nitrogenado de bases púricas lo que hace alterar la síntesis de los ácidos nucléicos.  Espectro: Bactericida (micobactericida), fungicida, virucida y esporicida.

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 Desventajas: Presenta olor desagradable, además de irritar las mucosas. Se considera potencialmente carcinogénico. Al utilizarse deben tomarse las precauciones de exposición ocupacional.  Indicaciones: Su uso está limitado a filtros y conservación de piezas de anatomía patológica. Debido a su efecto tóxico e irritante, desde 1996 la formalina bajo cualquier presentación, está excluida de la lista de desinfectantes en los Estados Unidos de Norteamérica. 

Peróxido de hidrógeno:

El Peróxido de Hidrógeno es un agente oxidante utilizado para DAN. (9)  Mecanismo de acción: Su acción antimicrobiana se ejerce por la producción de radicales libres hidroxilos que dañan las membranas lipídicas, el DNA y otros componentes celulares.  Espectro: Bactericida (micobactericida), fungicida, virucida y esporicida en concentraciones del 6% al 7%.  Ventajas y desventajas: No daña lentes ni artículos de plástico. Es oxidante para artículos metálicos. Presenta toxicidad ocular y también puede producir colitis pseudomembranosa por mal enjuague en la DAN.  Indicaciones de uso: Está indicado en el uso de DAN por su compatibilidad con este material.  Concentraciones de uso: Su presentación varía entre 3% a 7.5%. Para realizar la desinfección de alto nivel la indicación es de 6% a 7.5% durante 30 minutos.  La solución puede reutilizarse durante 21 días. 

Ácido Peracético:

 También denominado ácido peroxiacético es un agente oxidante que actúa de manera similar al peróxido de hidrógeno. (9)  Mecanismo de acción: Actúa por desnaturalización de las proteínas alterando la permeabilidad de la pared celular.  Espectro: Bactericida, fungicida, virucida y esporicida.

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 Ventajas y desventajas: La mayor ventaja de este elemento es que no produce residuos tóxicos y tampoco necesita activación. Puede corroer cobre, bronce o hierro galvanizado. Esta corrosión puede ser controlada con aditivos del pH. o Produce toxicidad ocular e irritación de las mucosas.  Indicaciones de uso: Existen formulaciones asociadas con el peróxido de hidrógeno que son indicadas para el reprocesamiento de material.  Concentraciones de uso: En concentraciones bajas de 0.1% a 0.2% en un tiempo entre 10 a 15 minutos, tiene rápida acción contra microorganismos (incluyendo las esporas). La solución tiene una duración de 14 días. 

Fenólicos:

Los derivados fenólicos comúnmente encontrados como principio activo de las formulaciones son: el ortho-fenil-fenol y el ortho-benzil-para-clorofenol. Los compuestos fenólicos son producidos a través de la sustitución de uno o dos átomos de hidrógeno aromático de fenol con un grupo funcional (alquil, fenil, benzil, halógeno). (9)  Mecanismo de acción: En altas concentraciones rompen la pared celular penetrando la célula y precipitando proteínas citoplasmáticas. En bajas concentraciones, causan la muerte de microorganismos por inactivación de las enzimas de la pared celular.  Espectro: Bactericida (micobactericida), fungicida y virucida. Tiene poca acción en los virus pequeños como echovirus, poliovirus, coxsackievirus. Los fenólicos se inactivan ante la presencia de materias orgánicas.  Desventajas: Los fenólicos pueden ser absorbidos por los materiales porosos, tales como el plástico, dejando residuos que producen irritación en las mucosas de quien los maneja.  Indicaciones de uso: Los derivados fenólicos están indicados principalmente en la desinfección de artículos no críticos y en superficies lisas. Su uso no es indicado en artículos semicríticos debido a la ausencia de datos sobre su eficacia germicida. Asimismo, su utilización está contraindicada en la limpieza de incubadoras y otras superficies. o Hoy en día y debido a su baja eficacia y a los riesgos descritos, prácticamente no tiene indicaciones de uso en el medio de laboratorios.  Concentraciones de uso: Las concentraciones varían según la presentación del producto.

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Amonios cuaternarios:

Los compuestos más usados son cloruro de alquil- dimetil-benzil-amonio, cloruro de alquil-didecildimetil-amonio, y el cloruro de dialquil- dimetil-amonio. (9)  Mecanismo de acción: Su acción se debe a la inactivación de enzimas productoras de energía, a la desnaturalización de las proteínas celulares y a la ruptura de la membrana celular.  Espectro: Fungicida, bactericida y virucida sólo contra los virus lipofílicos. No es esporicida, ni micobactericida, ni tampoco presenta acción sobre los virus  hidrofílicos.  Ventajas y desventajas: Constituye un buen agente para la limpieza debido a su baja toxicidad. Los restos de gasa y algodón pueden afectar su acción.  Indicaciones de uso: Por su baja toxicidad puede ser utilizado para la desinfección de superficies y mobiliario.  Concentraciones de uso: Las concentraciones de uso varían de acuerdo con la combinación de compuestos de amonio cuaternarios en cada formulación comercial.

2.4 FACTORES QUE AFECTAN EL PROCESO DE DESINFECCION 1. Cantidad y ubicación de los microorganismos. Cuanto mayor es la biocarga, mayor es el tiempo que un desinfectante necesita para actuar. Por ello, es fundamental realizar una escrupulosa limpieza de las superficies de los instrumentos, más aún, cuando estos tienen componentes múltiples y deben ser desarmados y limpiados pieza por pieza. 2. Resistencia de los microorganismos al agente químico. Se refiere principalmente al espectro de acción que tiene el método o agente utilizado. 3. Concentración de los agentes. Se relaciona con la potencia de acción de cada uno de los agentes para que produzcan la acción esperada. Las concentraciones varían con respecto a los agentes desinfectantes y en algunos casos pueden relacionarse con un efecto deletéreo sobre el material (corrosión).

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4. Factores físicos y químicos. Algunos desinfectantes tienen especificadas la temperatura ambiente a la que deben ser utilizados para su efectividad. El pH favorece la actividad de los desinfectantes. 5. Materias orgánicas. La presencia de materias orgánicas como suero, sangre, pus, materia fecal u otras sustancias orgánicas, pueden inactivar la acción de algunos desinfectantes comprometiendo su efectividad. 6. Duración de la exposición. Cada método de desinfección y cada agente tiene un tiempo específico necesario para lograr el nivel deseado. 7. Presencia de materiales extracelulares o biofilmes. Muchos microorganismos producen masas gruesas de células y materiales extracelulares o biofilmes que generan una barrera contra el proceso de desinfección. Por tal razón, los desinfectantes deberán saturar antes a los biofilmes, para poder eliminar a los microorganismos allí presentes.

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CAPITULO III ESTERILIZACIÓN

3.0 DEFINICIÓN

La esterilización es el proceso de eliminación de toda forma de vida, incluidas las esporas. Es un término absoluto que implica pérdida de la viabilidad o eliminación de todos los microorganismos contenidos en un objeto o sustancia, acondicionado de tal modo que impida su posterior contaminación. Se trata de un término probabilístico, de modo que tras un adecuado proceso de esterilización, se debe llegar a una probabilidad de encontrar microorganismos igual o menor que una unidad contaminada en un millón de unidades sometidas a un proceso de esterilización. (11) Existen varios métodos de esterilización, detallados a continuación.

3.1 METODOS DE ESTERILIZACIÓN Los métodos utilizados corrientemente en los laboratorios microbiológicos son:  Calor al rojo (flameado).  Calor seco (aire caliente).  Vapor a presión (esterilización en autoclave). NOTA: En Este Manual nos enfocaremos solo en los métodos utilizados en el laboratorio de microbiología de Freskaleche S.A Planta De Bucaramanga. La incineración es también un método de esterilización, pero se aplica fuera del laboratorio para la eliminación final de los desechos producidos en él y se considera por separado. (11)

3.2 CALOR AL ROJO (FLAMEADO) Los instrumentos tales como las asas y alambres de siembra y varillas secas se esterilizan calentándolas en la llama de un mechero bunsen hasta que se ponen al rojo. Los microincineradores se recomiendan para esterilizar asas de inoculación contaminadas con material muy infeccioso para evitar el riesgo de chisporrotear partículas contaminadas sobre las zonas de alrededor. (11)

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Figura 12. Esterilización del asa bacteriológica.

3.3 ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO La esterilización por calor seco produce desecación o deshidratación de la célula eliminando el contenido del agua, produciendo niveles elevados de electrolitos, fusión de membranas. Estos efectos se deben a la transferencia de calor desde los materiales a los microorganismos que están en contacto con éstos. La acción destructiva del calor sobre proteínas y lípidos requiere mayor temperatura cuando el material está seco o la actividad de agua del medio es baja. Se aplica en un horno calentado eléctricamente que se controla mediante termostatos y que está provisto de un gran ventilador circulante que asegura la uniformidad de la temperatura en todas las partes del contenido. Los equipos modernos disponen de controles electrónicos que pueden llevar la temperatura al nivel requerido, mantenerla en ese punto durante un tiempo establecido previamente y desconectar seguidamente la corriente. En algunos modelos se incorpora una cerradura solenoide para impedir que la estufa sea abierta antes de que se complete el ciclo. Este dispositivo salvaguarda y protege al personal de quemaduras accidentales. El material que puede esterilizarse por este método incluye placas de petri, matraces y pipetas de vidrio y objetos de metal. Pueden adquiriese de diversos proveedores cajas y cilindros metálicos que almacenan convenientemente el material de vidrio durante la esterilización y lo conservan estéril hasta su utilización. (11) NOTA: Todo material resistente al calor e incompatible con la humedad debe ser esterilizado por calor seco.

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3.3.1 Tipos de estufas o pupineles Existen dos tipos de estufas, que comúnmente se utilizan: • •

Estufa de convección por gravedad. Estufa de convección mecánica (circulación de aire forzado).

3.3.1.1

Estufa de convección por gravedad

Está compuesta por una cámara revestida de resistencia eléctrica en su pared interior, posee un canal u orificio de drenaje de aire en la pared superior, la circulación depende de las corrientes producidas por la subida de la temperatura y el choque con las diferencias de temperaturas, por ello su proceso es más lento y menos uniforme. (11)

Figura 13. Estufa de convención de gravedad. 3.3.1.2

Estufa de convección mecánica

Este equipo posee un dispositivo que produce un rápido movimiento de volumen grande de aire caliente, facilitando la transmisión del calor directamente a la carga o paquete, se utiliza menos tiempo y tiene un equilibrio térmico. (11)

Figura 14. Estufa de convención mecánica disponible en el laboratorio.

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3.3.2 Indicaciones del material a esterilizar por calor seco La recomendación para la esterilización de ciertos materiales deriva de su facilidad de penetración en sólidos, líquidos no acuosos y cavidades cerradas. Su comportamiento con el metal es menos corrosivo pero más oxidante. Por otra parte, no erosiona el vidrio como lo hace el vapor. (11) 3.3.2.1 Carga El aire no es un buen conductor del calor, por lo que las estufas deben cargarse sin apretar el contenido, de forma que queden abundantes espacios para permitir que circule el aire caliente. (11) 3.3.2.2 Tiempos y temperaturas de carga Cuando se calculan los tiempos de funcionamiento para el equipo de esterilización por aire caliente, deben considerarse tres períodos: El período de ascenso de la temperatura, que es el tiempo necesario para que toda la carga alcance la temperatura de esterilización; puede llevar alrededor de 1 hora. (11) Los períodos de mantenimiento a las diferentes temperaturas de esterilización recomendadas por el Medical Rescarch Councill que son 160ºC durante 45 minutos, 170ºC durante 18 minutos, 180ºC durante 7 1/2 minutos y 190ºC durante 1 1/2 minutos. · El período de enfriamiento, que se realiza gradualmente para prevenir la rotura del material de vidrio como consecuencia de un descenso demasiado rápido de la temperatura. Este período puede llevar 2 horas. (11) Los siguientes instrumentos, materiales y sustancias pueden esterilizarse en calor seco:    

Instrumentos cortantes y de acero inoxidable (tijeras, pinzas) Agujas, jeringas de cristal, tubos, pipetas de vidrio, Polvos estables al calor Líquidos y sustancias liposolubles e hidrófugas tales como aceites, silicona, parafina, vaselina, cremas y polvos de talco.

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Figura 15. Relación Tiempo Temperatura para esterilización Es importante señalar que el tiempo de exposición debe ser contabilizado después que se ha alcanzado la temperatura requerida y no desde la carga del esterilizador porque puede requerirse un tiempo prolongado para alcanzar la temperatura de esterilización. (11)

3.3.3 Principios operacionales A fin de evitar que ocurran fallas en el proceso de esterilización por calor seco es importante tener en cuenta los siguientes factores: 1. Validación del equipo y calibración de los instrumentos, solicitado al fabricante en una carta indicando el punto más frío durante las variaciones de temperatura dentro de la cámara del esterilizador. 2. Una esterilización será eficiente cuando el punto más frío registre 170 C en exposición por dos horas, además de utilizar Indicadores biológicos. 3. Selección del material desde el punto de vista de conductibilidad térmica. No esterilizar ni utilizar textiles, ni papel. 4. Distribución de la carga, con espacio suficiente cada paquete para una buena circulación ideal, además de observar que los paquetes no toquen las paredes. 5. Utilizar empaques adecuados como por ejemplo cajas metálicas, papel aluminio y frascos de vidrio refractario. (11) 3.3.4 Validación del proceso de esterilización por calor seco NOTA: Asegurar que la esterilización por calor seco sea adecuada, segura y efectiva. 33

El proceso de validación por medio del cual se muestra con evidencia la esterilización por este método, garantiza que ello se realice siempre de una misma forma y con calidad. La finalidad es garantizar que se cumplan los parámetros preestablecidos para esterilizar por medio del calor seco. 3.3.4.1 Técnica y material − Calidad del equipo: instalaciones eléctricas (voltaje), estructura, dimensión, ventilación. − Calidad de operación: manual de operación, instrucciones de mantenimiento, relación de repuestos más comunes, servicio técnico. − Calidad del desempeño: parámetros físicos, tipos de empaques, tipos de carga. Registros de cargas: tipos de materiales, cantidad, volumen, disposición de materiales y capacidad. Indicadores químicos. (11) ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO Instrumentos cortantes, de acero inoxidable y vidrio cajas de petri, pipetas de vidrio, erlenmeyers, tijeras, cuchillos. Colocar los indicadores químicos al material a esterilizar. Deben cargarse sin apretar el contenido, de forma que queden abundantes espacios para permitir que circule el aire caliente. Contabilizar el tiempo de esterilizacion de 2 horas, luego de alcanzar la temperatura requerida . La temperatura de esterilización por calor seco debe permanecer entre 160°C - 170°C Trascurrida las 2 horas requeridas, se procede al el período de enfriamiento. Se realiza gradualmente para prevenir la rotura del material de vidrio. Retirar del horno y almacenar. Figura 16. Proceso de esterilización por calor seco.

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3.4 ESTERILIZACIÓN A VAPOR. NOTA: Todo material resistente al calor, compatible con humedad debe ser auto clavado. La esterilización a vapor es el procedimiento de esterilización más común y es el método de preferencia excepto para los materiales que no pueden resistir el calor y la humedad creada por el proceso. El equipo a utilizarse se denomina autoclave, esterilizadores de pre vacío y autoclaves instantáneas. El mecanismo de acción del calor húmedo es por desnaturalización de las proteínas. La autoclave tiene la ventaja de producir un elevamiento de temperatura en forma rápida, con cortos tiempos de esterilización y no dejar residuos tóxicos en el material. (11) La eficiencia del vapor como agente esterilizante depende de: • • • •

El contenido en humedad El contenido en calor La penetración La Mezcla de vapor y aire u otras impurezas que pudiera contener.

Una buena esterilización por autoclave depende de la eliminación de todo el aire de la cámara y de la carga, y los materiales que van a esterilizarse deben colocarse sin apretar. Los artículos limpios pueden ponerse en cestillos de alambre, pero el material contaminado (cultivos desechados) debe estar en recipientes de fondo sólido en una altura no mayor de 8 cm. Deben dejarse grandes espacios de aire alrededor de cada recipiente y ninguno debe estar cerrado. (11)

3.4.1 Tipos de esterilizadores a vapor: Únicamente deben usarse autoclaves diseñados para trabajo de laboratorio y que puedan recibir carga mixta. Las autoclaves de carga porosa y los esterilizadores de líquidos embotellados son raramente satisfactorios para el trabajo de laboratorio. (11) Existen dos variedades de autoclave de laboratorio:  

El tipo de olla a presión. Los modelos de desplazamiento de la gravedad con descarga automática de aire y vapor condensado.

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3.4.1.1 Olla a presión Se utilizan todavía en muchas partes del mundo. El tipo más común es un aparato para agua hirviendo a presión. Tiene una cámara vertical de metal provista de una tapa metálica fuerte que se aprieta y cierra herméticamente mediante un aro de goma. Se disponen en la tapa una espita para la salida del aire y del vapor, un indicador de presión y una válvula de seguridad. El agua del fondo de la autoclave se calienta mediante mecheros de gas exterior, un calentador eléctrico de inmersión o un serpentín de vapor. (11)

Grafica 17. Autoclave olla a presión

Figura 18. Componentes del Autoclave •

Instrucciones para el funcionamiento.

1. Debe haber agua suficiente dentro de la cámara. Se carga la autoclave y se aprieta la tapa manteniendo la espita de descarga abierta. 36

2. Se ajusta seguidamente la válvula de seguridad a la temperatura requerida y se conecta la fuente de calor. 3. Cuando el agua hierva, fluirá vapor por la espita de descarga, arrastrando con él el aire existente en la cámara. 4. Se deja que salgan libremente el aire y el vapor hasta que se haya eliminado todo el aire. 5. Puede comprobarse que se ha eliminado fijando un extremo de un trozo de tubo de goma a la espita de descarga e introduciendo el otro extremo en un cubo u otro recipiente similar que contenga agua. 6. El vapor se condensa en el agua y las burbujas de aire salen a la superficie; cuando se ha eliminado todo el aire de la cámara, cesa el burbujeo en el cubo. 7. Cuando se ha alcanzado esta fase, se cierra la espita de descarga de aire vapor y se quita el tubo de goma. 8. La presión del vapor se eleva en la cámara hasta que la presión deseada, generalmente 1,054 kg/cm2, se alcanza y fluye vapor por la válvula de seguridad. 9. Cuando la carga ha alcanzado la temperatura requerida, se mantiene la presión durante 15 minutos. 10. Al término del período de esterilización, se apaga el calentador y se deja que la autoclave se enfríe. Se abre la espita de descarga de aire vapor muy lentamente una vez que el indicador de presión ha llegado a cero (presión atmosférica). 11. Si la espita se abre demasiado pronto, cuando la autoclave está todavía bajo presión, cualquier líquido que haya en su interior (medios de cultivo líquido, etc.), hervirá de forma explosiva e incluso pueden explosionar las botellas que contengan líquidos. 12. Se deja que el contenido se enfríe. Según la naturaleza de los materiales que se están esterilizando, el período de enfriamiento necesario puede ser de varias horas para que los grandes frascos de agar se enfríen hasta 80ºC y puedan cogerse con la mano sin riesgo.

3.4.1.2

Autoclaves con eliminación del aire por desplazamiento de la gravedad.

Estas autoclaves están por lo general dispuestas horizontalmente y son de forma rectangular, permitiendo que la cámara se cargue más fácilmente. Puede

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utilizarse un sistema de bandejas y carretilla, revestido de una camisa. Autoclaves similares pueden construirse sin camisa. La puerta debe tener un mecanismo de seguridad que impida pueda ser abierta mientras la cámara está bajo presión. La camisa que rodea a la autoclave está compuesta de una pared externa que encierra un espacio estrecho alrededor de la cámara, que se llena con vapor a presión para mantener la pared de la cámara templada. El vapor penetra en la camisa desde la fuente principal que se halla a alta presión, a través de una válvula que reduce la presión hasta el nivel de funcionamiento. La presión de funcionamiento se mide en un indicador de presión independiente fijado a la camisa. Esta camisa tiene un drenaje independiente para eliminar el aire y la condensación. El vapor penetra en la cámara de la misma fuente que suministra el vapor a la camisa. Se introduce de forma tal que es desviado hacia arriba y llena la cámara desde la parte superior hacia la inferior, impulsando así al aire y al condensado a fluir en el fondo de la cámara por el desplazamiento de la gravedad. El desagüe está provisto de filtros para impedir que se obture por residuos. El desagüe lleva generalmente un termómetro para registrar la temperatura del vapor que fluye. La temperatura registrada por el termómetro del desagüe es generalmente inferior a la de la cámara. La diferencia debe determinarse mediante ensayos con termopares. También cuenta con una válvula sensible al vapor. La válvula automática de vapor o «sensible al vapor» está diseñada para asegurar que únicamente se retiene dentro de la cámara vapor saturado y que el aire y el líquido condensado, se eliminan automáticamente. Recibe el nombre de near −to−steam sensible al vapor porque se abre si la temperatura desciende unos 2ºC por debajo de la del vapor saturado y se cierra alrededor de los 2ºC por encima de la temperatura del vapor saturado. El sifón funciona por expansión y contracción de un fuelle metálico que abre y cierra una válvula. El desagüe descarga en un embudo, de tal forma que hay una separación entre el desagüe y el embudo. Esta disposición asegura que no retrocederá agua contaminada desde la tubería a la cámara. (11) •

Instrucciones para el funcionamiento

1. Si la autoclave está provisto de camisa, esta camisa debe llevarse a la temperatura de funcionamiento en primer lugar. 2. Se carga la cámara, se cierra la puerta y se abre la válvula de vapor, dejando que la corriente de vapor entre la parte superior de la cámara. 3. El aire y el agua de condensación fluyen a través del desagüe del fondo. 4. Cuando el termómetro del desagüe llegue a la temperatura requerida, debe dejarse un tiempo adicional para que la carga alcance dicha temperatura.

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5. Este tiempo debe determinarse inicialmente y periódicamente para cada autoclave, como ya se indicará más adelante. Salvo que se haga esto, es poco probable que la carga se esterilice. 6. Se prosigue el ciclo de la autoclave para el tiempo de mantenimiento. Cuando se ha completado, se cierran las válvulas de vapor y se deja que la autoclave se enfríe hasta que el indicador de temperatura señala 80ºC. 7. No debe abrirse la autoclave hasta este momento. 8. Al principió sé «entreabrirá» o abrirá muy ligeramente y se mantendrá en esa posición durante varios minutos para permitir que salga el vapor y se enfríe posteriormente la carga.

3.4.2 Indicaciones del material a esterilizar por autoclave 

Textiles (algodón, hilo, fibras sintéticas, etc.): el apresto del tejido puede dificultar el paso del vapor y la succión por la bomba de vacío, por lo que se recomienda, en el caso de la ropa nueva, su lavado previo a fin de disminuirlo.

Metales (instrumentales, lavatorios, semilunas, tambores, etc.): el material metálico requiere un lavado y secado previo a la esterilización.

Vidrios o cristal: en algunas ocasiones es preferible su esterilización por calor seco, pero es factible hacerlo también por vapor saturado.

Líquidos (agua destilada y soluciones farmacológicas): como norma general se tendrá en cuenta que el llenado del recipiente no debe sobrepasar los 2/3 de su capacidad total.

Gomas y plásticos termo resistentes: el material debe estar limpio y seco, a fin de asegurar la eliminación de materia orgánica. (11)

3.4.3 Factores que afectan la esterilización por autoclave − Eliminación incompleta del aire en el esterilizador: Disminuye la temperatura y afecta la esterilización. Las burbujas de aire atrapadas en los paquetes actúan impidiendo la difusión y expansión del vapor. Esto ocurre por fallas en las bombas de vacío o en las autoclaves de desplazamiento por gravedad por eliminación incompleta del aire. − Vapor sobrecalentado: El vapor sobrecalentado puede afectar el poder microbicida debido a que pierde humedad y actúa en ese caso sólo como aire caliente. Esto puede ocurrir porque el vapor no está en contacto con el agua desde la cual se forma. Es totalmente seco y no puede ser utilizado en autoclaves. Su temperatura sube rápidamente.

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− El vapor saturado: Puede sobrecalentarse por una rápida reducción de la presión (más de 50% de una vez) manteniéndose mayor presión y temperatura en la camisa que en la cámara. Otro motivo es por re secamiento producido por su paso a través de materiales que tienen menos de 50% de humedad relativa (como es el caso de algunos textiles que se almacenan a altas temperaturas). − Preparación del material: La preparación del material en relación con tipo de artículos, empaque o envoltura, tamaño y disposición al interior de la cámara también son factores importantes en la esterilización porque pueden afectar la eliminación del aire, la difusión del calor, vapor y el precalentamiento de la cámara. (11) 3.4.4 Validación del proceso de esterilización por calor húmedo NOTA: La esterilización por calor húmedo sobre presión debe ser validada para garantizar la seguridad, adecuación y efectividad del proceso. La validación del proceso de esterilización, mostrará con evidencia la esterilización por este método, garantizando que ello se realice siempre de una misma forma y con una misma calidad. La finalidad es garantizar los parámetros preestablecidos para esterilizar por medio del calor húmedo. 3.4.4.1 Técnica y material Un problema muy frecuente en nuestro medio posiblemente por el costo es el mantenimiento preventivo, ya que lo más común es esperar que la máquina falle. Esta validación se realizará verificando la calidad de los siguientes elementos: − Ambiente: se verificarán las instalaciones dentro del área física (estructura, dimensión, climatización, necesidad de instalación de redes de vapor, aire comprimido), instalación hidráulica, dureza del agua, instalaciones eléctricas, voltaje, dispositivo de protección, instalación con fuente propia y calidad del vapor. − Equipamiento: se verificará la estructura de instalación de la autoclave, adaptación física, armonía, ventilación próxima a las puertas de la autoclave, distancias mínimas entre paredes y equipo para mantenimiento. − Operación: se debe verificar la existencia de un manual de operación, una relación de repuestos más comunes, servicio técnico registrado, comprobante de certificación de funcionamiento.

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− Desempeño: se realiza mediante la evaluación de la eficacia y eficiencia. En Autoclaves de pre vacio se chequearan 3 ciclos con test de Bowie & Dick, seguidos de 3 ciclos completos con testeo químico y biológico durante 3 días consecutivos con carga. En Autoclaves gravitacionales el test se realizara con la cámara vacía. − Indicador Biológico: Se utiliza el indicador biológico 1262 Attest (tapón marrón), fabricado para 3M ESPE, está diseñado para el control de procesos de esterilización con vapor. La presencia de esporas de Geobacillus stearothermophilus se detecta a simple vista por un cambio de color (el medio cambia a amarillo). El cambio a color amarillo indica que se ha producido un fallo en el proceso de esterilización. La lectura final de un resultado negativo (el medio permanece morado) se hace después de 48 horas de incubación del indicador. Frecuencia del control: Para mejorar el rendimiento del proceso de esterilización, los indicadores biológicos Attest deben colocarse en una bandeja o en un paquete de prueba adecuado, que represente el mayor desafío al proceso, y deben usarse para el control de cada carga. Cuidado: Hay una ampolla de cristal dentro del frasco de plástico del indicador biológico. • La compresión o la manipulación excesiva del indicador biológico antes de que se enfríe puede provocar la explosión de la ampolla de cristal. • utilice guantes y gafas de protección al extraer extraiga el indicador biológico del esterilizador. • utilice gafas de protección al comprimir el indicador biológico. • Sujete el indicador biológico por la tapa al romperlo y presionar su contenido. • No rompa la ampolla de vidrio con los dedos. • No haga rodar el indicador biológico entre los dedos para humedecer la tira de esporas. Precauciones: No use el indicador biológico 1262 Attest para el control de: 1. Ciclos de esterilización con vapor por gravedad a 132°C, durante al menos 3 minutos.

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2. Esterilizadores con calor seco, vapores químicos, óxido de etileno u otros procesos de esterilización a baja temperatura. Instrucciones para el uso: 1. Identifique el indicador biológico Attest anotando en la etiqueta del indicador el esterilizador, el número de la carga y la fecha de procesamiento. 2. Coloque un indicador biológico Attest en forma horizontal o con el tapón hacia arriba en una bandeja o en un paquete de prueba adecuado (de acuerdo con las prácticas recomendadas), para cargas 3. Coloque la bandeja o paquete de prueba en una carga completa en el área más difícil de penetrar por el agente esterilizante . Ésta se encuentra generalmente en el estante inferior, cerca de la puerta y sobre el desagüe. 4. Procese la carga como de costumbre. 5. Después de completar el ciclo y usando gafas de seguridad y guantes, abra totalmente la puerta del esterilizador durante un mínimo de 5 minutos antes de retirar el indicador biológico Attest. 6. Cuando el indicador biológico no esté incluido en un paquete de prueba u otro material de empaquetado que absorba calor, retire el indicador biológico del esterilizador y deje enfriarlo durante al menos 10 minutos antes de romperlo. 7. Cuando el indicador biológico esté contenido en un paquete de prueba u otro material de empaquetado que absorba calor, debe retirarse del esterilizador y dejarlo abierto durante 5 minutos para disipar el calor antes de retirar elindicador biológico. Después deje que el indicador biológico se enfríe fuera del paquete de prueba durante al menos 10 minutos antes de romperlo. 8. Compruebe el indicador químico que está en la etiqueta del indicador biológico. Un cambio de color de rosa a marrón confirma que el indicador biológico ha sido expuesto al proceso de esterilización al vapor. Este cambio de color no indica que el proceso fuera suficiente para conseguir la esterilidad. Si el indicador químico no cambió, revise el proceso de esterilización. 9. Usando gafas de seguridad, rompa e incube el indicador biológico a 56 ± 2°C.

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10. Incube al menos un indicador biológico Attest sin procesar (control positivo) cada día que incube un indicador procesado. El indicador del control positivo debe tener la misma fecha de fabricación y el mismo número de lote que el indicador procesado que se encuentra en la incubadora. 11. Escriba una “C” y una fecha en la etiqueta del indicador para control positivo. Active e incube el control a 56 ± 2°C. 12. Incube el indicador biológico procesado y el indicador usado como control durante 48 horas a 56 ± 2°C . 13. Un color amarillo en el indicador procesado demuestra crecimiento bacteriano y por lo tanto, un fallo en el proceso de esterilización. Si no hay cambio de color, el proceso de esterilización fue adecuado. El resultado final negativo se hace después de 48 horas de incubación. El indicador usado como control positivo debe mostrar un cambio de color a amarillo para que los resultados del indicador procesado sean válidos. 14. Registre los resultados del indicador biológico procesado y del control. Siempre pruebe el esterilizador y no lo use hasta que el resultado del indicador biológico sea negativo. Eliminación: Deseche los indicadores biológicos Attest usados, se esteriliza cualquier indicador biológico positivo en esterilizadores por vapor asistidos por vacío a 121°C durante al menos 15 minutos, 132°C durante 4 minutos o en un esterilizador por vapor con desplazamiento del aire por gravedad a 132°C durante 10 minutos. Almacenamiento y caducidad del producto: A. Almacene los indicadores biológicos Attest en condiciones ambientales normales: 15-30°C, 35-60 % de humedad relativa. B. No guarde estos indicadores biológicos esterilizantes u otros productos químicos.

cerca

de

agentes

C. Los indicadores biológicos Attest tienen una caducidad de 24 meses Ninguna persona está autorizada a facilitar ninguna información que difiera en algún modo de la información suministrada en esta hoja de instrucciones. Nota: • Las pruebas de tipo Bowie & Dick son tests que se realizan para controlar la bomba de vacío del autoclave para constatar la no presencia de burbujas de aire en el mismo

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• Si el test de Bowie & Dick indicara algún problema, el esterilizador debería ponerse fuera de servicio, hasta que se repare el problema de esterilización. • Los test de Bowie & Dick se presentan habitualmente en el mercado bajo la forma de una hoja desechable (que debe ser usada en el interior de un paquete de toallas, cuya preparación se encuentra específicamente normada) o de un paquete desechable, también conocido por su nombre en inglés “Test Pack” (el uso de este paquete preparado de control es equivalente al armado del paquete de toallas recomendado por las Normas AAMI).

Figura 19. Indicador para uso en ensayos específicos (Clase 2: según clasificación IRAM 37101-1 / ISO11140-1), Para uso en equipos de Vapor asistidos por bombas de vacío.

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PROCESO DE ESTERILIZACIÓN EN AUTOCLAVE Colocar el material a esterilizar dentro del autoclave tarros scot,tarros de plastico, puntas azules y amarillos. El material debe colocarse correctamente dentro del equipo para que permita la correcta distribución del vapor de agua. Colocar la ampolla del indicador biológico en el lugar que se considere más difícil que llegue el vapor. Esperar que se alcancen los 121ºC y comenzar a contar el tiempo de esterilización por 15 min. Cuando termine el tiempo de esterilización, apagar el autoclave. Esperar que bajen la presión y la temperatura del equipo para abrirlo y retirar el material. Retirar el indicador biológico e incubarlo bajo las condiciones que señale el fabricante. Esperar que el material alcance la temperatura ambiente antes de almacenarlo. Después del periodo de incubación observar las características del indicador biológico. Figura 20. Proceso de esterilización por autoclave.

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CAPITULO IV PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO

4.0 IMPORTANCIA

La importancia que tiene la calidad en la elaboración de los medios de cultivo deshidratados así como su preparación, conservación y uso, es el punto de partida para lograr que los resultados de los estudios microbiológicos sean confiables. Se recomienda un especial cuidado en la preparación de los medio de cultivo por ser uno de los pasos fundamentales para un buen resultado de un examen microbiológico. Se deben respetar las buenas prácticas de laboratorio y seguir las instrucciones del fabricante para el manejo y preparación de medios deshidratados y otros componentes, particularmente aquellos que tengan materiales peligrosos, como: sales biliares (que pueden producir irritación de las vías respiratorias cuando son inhalados, se plantea incluso que un contacto prolongado con la piel, genera rash cutáneo), y otros agentes selectivos. Es necesario documentar todos los datos relevantes como: peso, volumen, pH, fecha de preparación, condiciones de esterilización y operario. Cuando se trate de medios preparados con componentes individuales se recomienda seguir exactamente la formula y registrar todos los detalles como se indico anteriormente, además de la identificación completa como código y número de lote de todos los componentes que se use. (12)

4.0.1 Utilización y almacenamiento del agua

Se recomienda utilizar agua destilada o agua con calidad equivalente, es decir, libre de sustancias que puedan inhibir o influenciar el crecimiento de microorganismos en condiciones de ensayo. Si el agua destilada se prepara con agua clorada, se recomienda neutralizar el cloro antes de destilarla.´ El agua destilada se debe almacenar en recipientes fabricados preferiblemente con materiales inertes como vidrio neutro y polietileno libre de cualquier sustancia inhibitoria. Para considerar que el agua destilada es de buena calidad, es aconsejable que esta tanga una resistividad no inferior a 300.000 Ωcm. (12)

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Figura 21. Zona de almacenamiento de agua.

4.0.2 Pesaje y rehidratación Para la preparación del medio de cultivo, se pesa cuidadosamente la cantidad adecuada del medio deshidratado (teniendo cuidado de no inhalar el polvo, especialmente cuando el medio contiene sustancias tóxicas) y agregarle progresivamente la cantidad necesaria de agua, evitando que se formen grumos. (12)

Figura 22. Pesaje y rehidratación del medio de cultivo.

4.0.3 Disolución y dispersión Se debe disolver el medio deshidratado rápidamente mezclando de forma instantánea y repetidamente y llevarlo al calor si es necesario hacerlo. Los medios que contienen agar se deben dejar hidratar antes de calentar y luego mezclar para disolver, cuando el medio se prepare con componentes individuales, es aconsejable agregar cada componente por separado y esperar su disolución total antes de completar el volumen definitivo. (12)

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4.0.4 Medida y ajuste del pH El pH se mide con un medidor y si es necesario se ajusta. Cuando el medio se prepara con componentes individuales, para que después de esterilizar y enfriar a 25º C el medio tenga el pH requerido ±0,2 unidades de pH, normalmente se ajusta con una solución de aproximadamente 40 g/l (cerca de 1 mol/l) de Hidróxido de sodio (NaOH) o aproximadamente 36,5 g/l (cerca de 1 mol/l) de acido clorhídrico (HCl) si así se requiere. (12)

Figura 23. Medida y ajuste del pH para el medio de cultivo. 4.0.5 Vertido El medio disuelto se debe verter en recipientes adecuados con un volumen 1, 2 a 3 veces superior al del medio para evitar su derrame al someterlo a la esterilización. Nota: Es importante verificar siempre el estado de limpieza de la cristalería empleada, la presencia de residuos de detergentes u otras sustancias químicas o biológicas en los mismos puede ocasionar alteraciones en la preparación. (12)

Figura 24. Vertido de los medios de cultivo.

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4.1 ESTERILIZACIÓN

4.1.1 Esterilización por calor húmedo

La esterilización por calor húmedo se hace en una autoclave o preparador de medio. La operación en la autoclave demora, generalmente, 15 min a 121º C. cuando los volúmenes son superiores a 1000 ml, se adapta el ciclo de esterilización. En todos los casos se recomienda seguir las instrucciones especificadas en la norma internacional, nacional o las instrucciones del fabricante. Es necesario monitorear el comportamiento de la autoclave para asegurar que alcanza la temperatura deseada en condiciones típicas de carga. Es esencial controlar la eficiencia de la esterilización con el uso de la cinta indicadora. Después de calentar, se enfría el medio para evitar el exceso de ebullición. Esto es importante con medios sensibles como el utilizado para el aislamiento de bacterias del género Enterobacteriaceae. (12)

Figura 25. Preparación de los medios de cultivo para llevar a la autoclave.

4.1.2 Monitoreo Después de esterilizar, hirviendo, filtrando o en el autoclave, se recomienda monitorear todos los medios, con respecto al pH, el color, la esterilidad y la consistencia. (12)

Figura 25. Control de esterilidad para los medios del cultivo 24 horas después de su preparación. 49

4.2 PREPARACION Y ALMACENAMIENTO DE LOS MEDIOS EN CAJAS DE PETRI. Después de esterilizar el medio de cultivo, se vierte en las cajas de Petri utilizando una zona estéril mediante la utilización de mecheros preferiblemente de gas hasta obtener un espesor no inferior a dos mm, para cajas de 9 cm se requiere normalmente 15 ml. Se deja enfriar y solidificar el agar colocando las cajas de Petri tapadas, en una superficie horizontal fría. El medio solidificado, se guarda en condiciones que eviten modificaciones en su composición, en un sitio oscuro y/o en el refrigerador de 4ºC a 12ºC, en bolsas cerradas, durante una semana como máximo, o como indique el fabricante o la norma específica. Las cajas se deben rotular en la base, con la fecha de preparación y/o la fecha de vencimiento y la identificación del medio preparado o mediante códigos que cumplan este requisito. La vida útil de las cajas llenas, aumentará si se guardan en bolsas plásticas selladas y con el medio hacia arriba para evitar condensaciones además deben estar frías antes de colocarlas en las bolsas. No es aconsejable secar la superficie de las cajas de agar antes de guardarlas en frío, en general, para inocular un medio de cultivo sólido, se deben secar preferiblemente retirando las tapas y con la superficie del agar hacia abajo, en un horno a temperatura entre 25ºC y 50ºC, o en una cámara de flujo laminar, hasta que desaparezcan las góticas de la superficie del medio, se aconseja no secar demasiado. (12)

Figura 26. Procedimiento de preparación y almacenamiento de los medios de cultivo.

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4.3 INCUBACIÓN Es recomendable incubar las cajas en pilas de no más de 6 unidades, solo en el caso de utilizar jarras anaeróbicas se pueden apilar más de 6, dejar espacio para que circule el aire y se equilibre la temperatura de incubación tan rápido como sea posible. Cuando el medio sea líquido, el tiempo necesario para alcanzar la temperatura de incubación depende de varios factores: el volumen, la carga, el recipiente, la clase de incubadora. (12)

Figura 27. Incubación de los medios de cultivo. 4.4.

ELIMINACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Se recomienda eliminar tanto los medios contaminados como los que no se hayan utilizado en forma segura, de acuerdo con las regulaciones locales o nacionales. Estos deben ser esterilizados en el autoclave por 40 min a 120 ºC, desechar su contenido los sólidos van a la basura y los líquidos se vierten a la poceta, luego el material es dirigido a la zona de lavado donde se procederá al los procesos de desinfección, lavado y esterilización, Mencionados en los capítulos anteriores. (12)

Figura 28. Medios de cultivos para desechar.

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4.5 CONTROL DE CALIDAD DEL PRODUCTO TERMINADO

En la mayoría de los laboratorios no se presta mucha atención al comportamiento de los medios de cultivo y por ende se pueden obtener resultados que no sean del todo correctos. Para su control, es necesario realizar una prueba de productividad donde se determine el rendimiento, la recuperación, el crecimiento de un microorganismo que habitualmente se desarrolla en un medio de cultivo y la selectividad o supresión del crecimiento del microorganismo que se espera sea inhibido en el medio. Normalmente se determina con controles positivos la productividad y no la selectividad. En ocasiones, por costos, algunos laboratorios trabajan con medios de cultivo con fecha de vencimiento ya expirada y/o alteradas. (12) 4.5.1 Control de calidad Físico – Químico

Es aconsejable que los ensayos incluyan como mínimo las siguientes condiciones: • •

Valoración de pH medido entre 20ºC y 25ºC Mediante observación: la cantidad de llenado y/o espesor de la capa, color, calidad, presencia de artefactos ópticos, estabilidad, consistencia y humedad del gel.

4.5.2 Control de calidad Microbiológico

Los ensayos deben incluir lo siguiente: • • •

Esterilidad: Se aconseja que se compruebe la esterilidad de una cantidad de medios por cada lote. Microorganismos de ensayo: Se prueba la característica del medio con cepas positivas robustas, con característica típicas. Se debe usar un agar de referencia que puede ser Agar Infusión Cerebro Corazón (BHI), Agar Tripticasa de Soya (TSA o CASOY) o Agar Estándar para conteo en placa (SPC). El espesor de la capa de agar debe ser de unos 4 mm y estar bien secas (pre incubados a 35ºC por 2 horas o 55ºC por 10 minutos máximo). Todos los medios de cultivo selectivos utilizados durante el trabajo ordinario deben ir acompañados de un control positivo microorganismo(s) que se desea(n) recuperar o microorganismo(s) deseado(s)- y otro negativo -microorganismo(s) que se desea(n) inhibir total o parcialmente- llamado interferente.

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Los medios no selectivos deben ir acompañados de un control positivo. Todos los medios de cultivo de cada lote adquirido por el laboratorio deben ser probados para demostrar su capacidad de reproductibilidad, selectividad y estabilidad. Las cepas de control se usan para determinar la eficiencia de los medios de cultivo sintéticos y semisintéticos deshidratados, estas cepas son cultivos de un microorganismo conocido y certificado por alguna entidad o laboratorio conocido, como American Type Culture Collection (ATCC, USA) que cuenta con la colección más amplia de bacterias, hongos y levaduras patógenas y no patógenas o la National Collection of Type Cultures (NCTC, Gran Bretaña), la cual produce una colección de bacterias en general. Otras colecciones de cepas son: DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganisman., hongos y bacterias no patógenas). NCIB (National Collection of Industrial Bacteria: Bacterias no patógenas). NRRL (Northern Regional Research Laboratory ARS Culture Collection: Microorganismos de importancia agrícola). (12)

4.6 CRITERIOS MÍNIMOS PARA ASEGURAR UN CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS DE CULTIVO

Para asegurar un control de calidad de los medios de cultivo es necesario seguir las recomendaciones siguientes: • • • • • • • •

A cada lote se le deben realizar pruebas de funcionalidad del medio preparado para confirmar que es satisfactorio y que cumple con las especificaciones para el propósito señalado. El laboratorio deberá tener un criterio serio para la compra de medios de cultivo, así como para su almacenamiento y conservación. Realizar un procedimiento operativo estandarizado para la preparación, manipulación y conservación de cada medio de cultivo. Desarrollar o implementar métodos y procedimientos para verificar la esterilidad, pH, capacidad de crecimiento, pruebas de funcionalidad (productividad, selectividad y estabilidad), etc. Seleccionar los microorganismos de prueba (cepas control) de acuerdo con el tipo de medio a evaluar. Implementar un programa definido para la esterilización, eliminación y disposición final de los medios de cultivos usados. Utilizar agua destilada o desmineralizada para la preparación de medios de cultivo que satisfagan las exigencias requeridas. Preparar y aplicar un programa de supervisión de la calidad del agua destilada, comprobar que no contenga trazas de compuestos inhibidores o bactericidas, control de pH, minerales, etc.

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• • • •

• •

• • • •

Utilizar para la preparación, medios de cultivo, equipo, materiales, reactivos, que cumplan con los requisitos de calidad adecuados. Conservar y registrar los resultados de las pruebas control. Cuando no se conozca la fecha de vencimiento de un medio de cultivo lo ideal es descartarlo, pero en el caso donde que deba ser usado para cualquier ensayo, se debe valorar primero su funcionalidad. Los medios de cultivo deshidratados deben contar con una hoja de registro que contenga mínimo la siguiente información: nombre, marca, número de lote, fecha de adquisición, fecha de apertura, fecha de vencimiento, número de codificación, datos de preparación, indicador biológico usado para su control, resultados de los controles de calidad, nombre del preparador y observaciones. Los medios de cultivo son higroscópicos (esto es que al ser deshidratados ganan humedad del medio ambiente con facilidad), por lo tanto deben mantenerse bien cerrados para evitar cambios a nivel de pH, alteraciones del color, de las sustancias que los componen, de la solubilidad, etc. Deben almacenarse a temperatura ambiente (entre los 15ºC a 25ºC), en ambiente seco y libre de luz, así como boca abajo para evitar la entrada de aire sobre los mismos. Los medios de cultivo preparados deben almacenarse a temperaturas entre los 12ºC a 15ºC por 1 o 2 semanas, para prolongar su periodo de uso los medios pueden ser almacenados en refrigeración cuidando siempre que la temperatura no sea inferior de 0ºC ya que se desestabiliza el gel. En cualquier caso, deben protegerse de la luz. Los medios de cultivo y los reactivos se deben almacenar en frascos color ámbar u oscuros cuando así lo indiquen los fabricantes, y después de preparados se deben proteger de la luz ya sea envolviendo el frasco en papel aluminio, otro papel o medio oscuro, o depositándolos en un cuarto oscuro. Si un medio o reactivo cambia de color o se hidrata, se deben dar de baja. No mezclar lotes de producto. Para ajustar el pH de un medio no se deben emplear ácidos o bases débiles sino fuertes como el ácido clorhídrico (HCl) y el Hidróxido de Sodio (NaOH) 0,1 N. Todos los lotes deben cumplir con la prueba de esterilidad para verificar que pueden ser usados sin problemas de contaminación. (12)

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PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO PESAJE Y REHIDRATACIÓN Pesar cuidadosamente la cantidad adecuada del medio deshidratado y agregarle progresivamente la cantidad necesaria de agua DISOLUCIÓN Y DISPERSIÓN Disolver el medio deshidratado rápidamente mezclando de forma instantánea y repetidamente y llevarlo al calor si es necesario hacerlo

MEDIDA Y AJUSTE DEL pH El pH se mide con un medidor y si es necesario se ajusta. Vertido El medio disuelto se debe verter en recipientes adecuados con un volumen 1, 2 a 3 veces superior al del medio para evitar su derrame al someterlo a la esterilización. ESTERILIZACIÓN Se hace en un autoclave, 15 min a 121º C. MONITOREO Monitorear todos los medios, con respecto al pH, el color, la esterilidad y la consistencia. INCUBACIÓN Incubar tan rápido como sea posible durante 24 horas a 37ºC CONTROL DE CALIDAD DEL PRODUCTO TERMINADO Control de calidad Físico – Químico Valoración de pH medido entre 20ºC y 25ºC Mediante observación: la cantidad de llenado y/o espesor de la capa, color, calidad, presencia de artefactos ópticos, estabilidad, consistencia y humedad del gel. CONTROL DE CALIDAD MICROBIOLÓGICO Esterilidad y Microorganismos de ensayo Figura 29. Proceso para la preparación de medios de cultivo y control de calidad.

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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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MANUAL PARA PROCEDIMIENTOS